Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als

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Summary

Wir haben eine Hirnschnittmodell, das verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität-vermittelten-Hirn-Verletzungen beteiligt untersuchen entwickelt. Diese Technik erzeugt lebensfähigen reifen Hirngewebe und reduziert die für Experimente erforderlichen Tiernummern, unter Beibehaltung der neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Fächer teilweise intakt.

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Skelding, K. A., Arellano, J. M., Powis, D. A., Rostas, J. A. Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke. J. Vis. Exp. (84), e51291, doi:10.3791/51291 (2014).

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Abstract

Untersuchen molekularen Mechanismen neuropathologischen Bedingungen beteiligt sind, wie Schlaganfall, kann schwierig sein, wenn Sie ganze Tier-Systeme. Als solche primären oder "neuronale-like"-Zellkultursysteme werden üblicherweise verwendet. Während diese Systeme sind relativ einfach zu verarbeiten und sind nützlich Modellsysteme, bei denen verschiedene funktionelle Ergebnisse (wie Zelltod) können leicht quantifiziert werden, wobei die Ergebnisse untersucht und Wege in kultivierten unreifen Neuronen (wie Exzitotoxizität-vermittelten Zelltod Wege) sind nicht notwendigerweise die gleichen wie die in reifen Gehirns beobachtet, oder in intakte Gewebe. Daher besteht die Notwendigkeit, die Modelle, bei denen zelluläre Mechanismen in reifen Nervengewebe untersucht werden entwickeln. Wir haben ein in vitro-Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Vielzahl von molekularen Wege in intakte Nervengewebe zu untersuchen entwickelt. Die hier beschriebene Technik nutzt Ratte Rindengewebe, aber diese Technik angepasst werden, um Gewebe zu verwendenaus einer Vielzahl von Arten (wie z. B. Maus, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn) oder Hirnregionen (zB Hippocampus, Striatum, etc.). Zusätzlich kann eine Vielzahl von Reizen / Behandlungen verwendet werden (zum Beispiel excitotoxisch Verabreichung von Inhibitoren, etc.). Abschließend kann die hier beschriebene Hirnschnittmodell verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermittelten Exzitotoxizität beteiligt Gehirnverletzung zu untersuchen.

Introduction

Die häufigste Form des Schlaganfalls ist ischämischen Schlaganfall, die, wenn eine zerebrale Blutgefäß wird verschlossenen auftritt. Die Gewebe, die aus Ischämie Aufhören des Blutflusses führt verursacht verbreitet Depolarisation von Membranen, die Freisetzung von exzitatorischen Neurotransmittern und anhaltende Erhöhung von intrazellulärem Calcium, was zu der Aktivierung von Zelltod führt Pfade 1. Dieser Prozess wurde "Exzitotoxizität" bezeichnet, und ist ein gemeinsamer Weg in neuronalen Tod beteiligt durch eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Schlaganfall 2 hergestellt. Die Hemmung der Signalwege in Exzitotoxizität und anderen neuronalen Zelltod Kaskaden ist ein attraktiver Ansatz zur neuronalen Schäden nach Schlaganfall zu begrenzen.

Die Ermittlung der genauen molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität und ischämischen Schlaganfall beteiligt, kann schwierig sein, wenn Sie ganze Tier-Systeme. Als solche primären embryonalen und "neuronale-like '(zB neuroblastoma und Adenokarzinom immortalisierten Linien) Zellkultursysteme werden oft verwendet. Die Hauptvorteile dieser Modelle sind, dass sie leicht zu handhaben, relativ kostengünstig, und Zelltod kann leicht gemessen und quantifiziert werden. Allerdings kann Signalwege von den Kulturbedingungen verwendet, 3,4, und unreife Nervenzellen verändert und verewigt Linien können verschiedene Rezeptoren exprimieren und Signalmoleküle im Vergleich zu Hirn 5-8 reifen. Weiterhin kultivierten Neuronen erlauben nur die Prüfung von einem Zelltyp (oder zwei, wenn eine Co-Kultur-System verwendet wird), wohingegen intakte Hirngewebe ist heterogen, mit einer Vielzahl von Zelltypen, die miteinander interagieren. Organotypischen Kultursysteme (dünne Explantate des Hirngewebes) eingesetzt, und diese Modelle ermöglichen die Untersuchung von heterogenen Populationen von Zellen, wie sie in vivo gefunden. Jedoch kann nur eine begrenzte Menge an Gewebe von jedem Tier bei der Verwendung dieser Technik erhalten werden, können Scheibennicht so lange wie immortalisierte Zelllinien gezüchtet werden, und mittel-bis langfristige Kultur kann in Veränderungen der Signalwege und Rezeptoren in den Scheiben führt. Während reifen Gehirn kann verwendet werden, um organotypischen Slices erzeugen, sind Scheiben aus unreifen Gehirn empfänglicher für Kultur und sind häufiger eingesetzt. Es besteht daher die Notwendigkeit, die Modelle, die nachahmen oder darstellen intakten reifen Gehirn, die einfach zu bedienen sind, in der neuronalen Signalwege untersucht werden können zu entwickeln.

Hierin wird ein in vitro-Technik, die intakte Nervengewebe, die verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der Zelltod aufzuklären nach einer exzitatorischen oder ischämischen Insult beschrieben. Diese Technik reduziert die Anzahl der benötigten Tiere, ein Experiment durchzuführen, ist reproduzierbar und erzeugt lebensfähigem Gewebe, die in einer ähnlichen Weise metabolisch größer organotypischen Scheiben verhält. Zusätzlich wird die neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Zusammenarbeitmpartment bleibt teilweise intakt. Die physiologische Puffer verwendet wird, erlaubt die Zellmembranen zu "reseal 'und ermöglicht Zellen zu ihrer ursprünglichen Membranwiderstand 9 erholen. Diese Hirnschnitt-Modell ist in der Lage, getreu nachahmen folgenden vermittelten Exzitotoxizität Hirnverletzungen 10 beobachteten Reaktionen und kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen in der Schlaganfall beteiligt zu untersuchen.

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Protocol

Alle Vorgänge werden mit Genehmigung durch die Universität von Newcastle Animal Care und Ethik-Kommission sowie in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften, einschließlich der NSW Tierforschungsgesetz, das NSW Tierforschung Verordnung und der australischen Verhaltenskodex für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken.

1. Dissection von Hirngewebe

  1. Sacrifice 12 Wochen alte männliche Ratten durch Enthauptung. Ratten können entweder durch atemberaubende und Enthauptung getötet werden, oder es kann zunächst mit Isofluran (5% Induktion, 1,5-2% Wartung) in 70% N 2 und 30% O 2 anästhesiert werden, und dann enthauptet.
  2. Entfernen das Gehirn aus dem Schädel so schnell wie möglich (im Idealfall sollte dies in weniger als 2 Minuten durchgeführt werden.)
  3. Entfernen Sie die Rinde von Freihand-Dissektion. Die Präparation ist in kürzester Zeit möglich durchgeführt werden, mit so wenig Schädigung des Gehirns wie möglich, um maintain die Unversehrtheit der Scheiben.
  4. Um jegliche Rest Haut zu entfernen, Fell, Blut, usw., tauchen das Gehirn in einer kleinen Menge (3-5 ml) von 37 ° C Krebs-Puffer (118 mM Natriumchlorid, 4,7 mM Kaliumchlorid, 1,3 mM Calciumchlorid, 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 1,2 mM Magnesiumsulfat, 25 mM Natriumhydrogencarbonat, 11,7 mM Glucose, 0,03 mM Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), mit 95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid (Carbogen), pH 7,4) äquilibriert.

2. Vorbereitung der Microslices

  1. Legen Sie das Gehirn auf der Bühne eines McIlwain Chopper auf der zwei Scheiben aus Filterpapier platziert wurden und in warmen Krebs-Puffer befeuchtet. Halten das Gehirn und das Filterpapier mit warmem Krebs-Puffer benetzt, aber nicht so feucht, dass freie Flüssigkeit auf der Oberfläche des Papiers, die dazu führen kann, um das Gehirn herum gleiten.
  2. Schneiden Sie das Gehirn in 250 um koronalen Abschnitte. Als Nährstoffe, Sauerstoff und Abfallstoffe thbei normalerweise mit der Blutversorgung mit einem Fluid, die das Gewebe in isolierten Nervengewebe umgibt ausgetauscht ausgetauscht, die Größe der Scheiben nicht mehr als 400 um dick sein, damit eine angemessene Sauerstoffversorgung und Stoffaustausch stattfindet.
  3. Drehen Sie den McIlwain Stufe 90 °.
  4. Gehirn in Scheiben schneiden 250 um sagittal. Hier sind diese Gehirnschnitte (250 &mgr; m × 250 &mgr; m Schnitte mit variabler Länge abhängig von der Dicke des Gewebes) werden als microslices bezeichnet.
  5. Platzieren Sie die microslices in einen Rundrohr mit 10-15 ml 37 ° C Krebs-Puffer (die Menge von Krebs-Puffer wird auf die Menge des Gewebes abhängen).

3. Equilibrierung Microslices

  1. Vorsichtig geschwenkt, bis einzelne microslices aufgehängt sind, und es ihnen ermöglichen, unter der Schwerkraft zu begleichen.
  2. Vorsichtig den Überstand zu entfernen, die trübe durch Zelltrümmer ausgesetzt sein wird, und 10 ml 37 ° C FrischKrebs-Puffer mit dem Rohr.
  3. Wiederholung dieser Waschprozedur viermal, was bei der Entfernung der meisten Schmutz führt.
  4. Danach ins Gleichgewicht microslices die bei 37 ° C unter leichtem Schütteln / Inversion, und ändern Sie das Krebs-Puffer alle 15 min für 1 Stunde in total.
  5. Zu dieser Zeit, 2 ml 37 ° C Frisch Krebs-Puffer, und übertragen 15-20 microslices (150 ul Microslice Suspension) zu flachen Boden 5 ml Polystyrolröhrchen mit einem extra breiten Bohrung Pipettenspitze mit geglätteten Kanten (die erstellt werden können Schneid ~ 2 mm von dem Ende einer P1000 Tipp). Spread die microslices gleichmäßig über den Boden des Rohres in einer einzelnen Schicht, so dass jedes Microslice nicht weiter als einige wenige Millimeter von der mit Sauerstoff angereicherten Atmosphäre.

4. Exzitotoxische Stimulation

  1. Die microslices Bei 37 ° C und ständig passieren über die Oberfläche des 150 ul Microslice Suspension CARBOGEN, mit einer Gasleitung, die Positioned gerade über die Oberfläche des Microslice-Suspension (in mechanische Störung zu vermeiden).
  2. Gönnen microslices entweder mit 150 ul 5 mM Glutamat + 100 uM Glycin in Krebs-Puffer (exzitotoxische Reiz: Endkonzentration 2,5 mM Glutamat + 50 uM Glycin) oder 150 ul Krebs allein Puffer (Kontrolle nicht stimulierten). Eine Vielzahl von Stimuli können in diesem Schritt verwendet werden (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, AMPA-, NMDA + Glycin, KCl-Depolarisation und Sauerstoff / Glucose-Entzug).
  3. Entfernen Sie die Inkubationslösung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation (0, 30, 60, 90, 120 und 300 Sekunden), und ersetzen Sie es mit 300 ul eiskaltem Homogenisierung Puffer (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM Ethylenglycol tetraessigsäure, 4 mM EDTA, 100 &mgr; M Ammoniummolybdat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 25 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride vollständige Proteaseinhibitor-Cocktail).
  4. Homogenisieren microslices auf Eis, mit einem Glas-Teflon-Homogenisator Dounce(20 Schläge, 700 rpm).
  5. Speicher Homogenate bei -80 ° C, und verschiedene Signalmoleküle, Tod Moleküle usw. können durch Western-Blot gemessen werden.

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Representative Results

Microslices erzeugt unter Verwendung dieses Verfahrens lebensfähig sind, und eine Vielzahl von Arten (z. B. Ratte, Maus und Huhn) auf microslices verwendet werden. Drei voneinander unabhängige Maßnahmen der Rentabilität verwendet worden: Atemfrequenz (Abbildung 1), Adenin-Nukleotid-Verhältnisse (Abbildung 2), und Gewebekaliumgehalt (Abbildung 3). Durch diese Maßnahmen hat es sich gezeigt, dass microslices lebensfähig bleiben für mindestens 2 h nach der Erzeugung.

Gehirn microslices kann verwendet werden, um verschiedene Signalmoleküle zu untersuchen, um eine Vielzahl von Stimuli (z. B. KCl-Depolarisation [4], AMPA-, NMDA-, Glutamat-Stimulation 10), und kann auch verwendet werden, um Antworten von Zellsignalmoleküle zwischen mehreren Hirnregionen verglichen werden (Abbildung 4). Zusätzlich kann die Wirkung verschiedener Inhibitoren / Arzneimittelbehandlungen auf dieser Moleküle untersucht werden (zB Kinase Inhibitoren 10, 11 Glutamat-Rezeptor-Agonisten, Quisqualsäure 12).

Figur 1
Fig. 1 ist. Atmungsraten von microslices aus Hühnerhirn Die Atmungsraten von Hirngewebe wurden wie folgt berechnet:. Die Menge des verbrauchten Sauerstoffs (Differenz zwischen der Sauerstoffelektrode Werte am Anfang und am Ende des Experiments), multipliziert mit der Mol Sauerstoff in der Lösung, aufgeteilt die Inkubationszeit (Stunden) und der Menge an Protein (mg). Typische Atmungsraten von isolierten Säugetier Hirnrinde sind zwischen 55-80 mmol O 2 / g Frisch Gew. / h unter normalen Bedingungen neun. n = 9.

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.. 2 Gegenwart von Adenin-Nukleotiden microslices aus Hühnerhirn Repräsentative HPLC-Spur Mess ATP: ADP-Verhältnissen, wie zuvor beschrieben 13. Hohe und niedrige ATP ADP Ebenen sind in der Regel in lebensfähigen Zellen gefunden, während verringerte Niveaus von ATP und erhöhte ADP sind charakteristisch für apoptotischen und nekrotischen Zellen 14. Typische ATP: ADP-Verhältnisse von microslices variiert 3.01 bis 6.01, und bei diesen Niveaus für mehr als 2 Stunden gehalten.

Fig. 3
3. Tissue K +-Gehalt des Gehirns microslices aus unreifen Hühnervorderhirn. Die Bestimmung der Gewebe Kalium ist ein unseful Maß für die Lebensfähigkeit, wie viele von den chemischen und physiologischen Aktivitäten eines Gewebes hängen von Membranpotential, die einen normalen intrazellulären Kaliumgehalt 9 benötigt. Wenn microslices wurden in K +-freien Puffer unmittelbar nach Zerkleinern gewaschen wurde Gewebe K + auf Werte, die knapp über Hintergrund (Zeitpunkt 0) waren erschöpft. Doch auf nachfolgende Inkubation mit Krebs-Puffer, die microslices schnell angesammelt K + aus dem umgebenden Medium, und innerhalb von 5 min sie einen stabilen Zustand Ebene ähnlich wie bei unbehandelten microslices (dh microslices gewaschen und in normalen Puffer) erreicht hatte. Die Zugabe von Ouabain (0,2 mM) und EGTA (2 mM) nach 20 min Inkubation verursachte Gewebe K +-Gehalt auf 0 in 8 min sinken. Dies zeigt, dass die microslices normalerweise pumpen aktiv K +, und dass die Gewebe-K +-Konzentrationen sind nicht auf K + in totem Gewebe oder Zwischenräumen gefangen. n = 4 ist.

Fig. 4
4. Zeitlicher Verlauf der Phosphorylierung GluN2B und GluA1 folgende Depolarisation mit KCl. Microslices wurden aus dem Striatum und sensorischen Kortex von männlichen Ratten erzeugte (n = 8), depolarisiert mit hohen K +-Krebs-Puffer aufgenommen, homogenisiert und untersucht, um (a) GluN2B Phosphorylierung (bei ​​Ser1303) und (B) GluA1 Phosphorylierung (at Ser845) durch Western-Blotting zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation (0-300 sec). Phosphorylierung normiert auf Gesamt GluN2B und GluA1 Ausdruck (dh Phosphorylierung / Gesamt Ausdruck). * Kennzeichnet eine statistische Signifikanz zwischen den Gehirnregionen (p <0,05). Depolarisation mit KCl ergab Phosphorylierung von GluN2B und GluA1 Rezeptoren an und S1303S845 verbunden. Die Rate der GluN2B Phosphorylierung an S1303 variiert zwischen Kortex und Striatum, während die Rate der GluA1 Phosphorylierung an S845 war das gleiche in Kortex und Striatum. In nachfolgenden Experimenten haben wir gezeigt, dass diese aufgrund der unterschiedlichen Regelung der multifunktionalen Kinase-, Calcium / Calmodulin-stimulierte Proteinkinase II (CaMKII), die GluN2B an S1303 phosphoryliert, aber nicht GluA1 bei S845 10. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Hierin wird ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung von microslices, die verwendet werden können, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität und Ischämie-vermittelten Zelltod in intakten reifen Hirngewebe beteiligt untersuchen beschrieben. Diese Technik produziert lebensfähiges Gewebe (Abb. 1-3), das ist metabolisch ähnlich größer organotypischen 15 Scheiben. Außerdem diese Microslice-Modell eng entspricht der folgenden vermittelten Exzitotoxizität Hirnverletzungen in vivo 10 beobachtet Antwort. 90 Sekunden in vitro Stimulus des Hirn microslices mit AMPA-, NMDA-oder Glutamat induziert die gleichen Reaktionen in einer Vielzahl von Molekülen (zB CaMKII, GluN2B und GluA1) als eine zweite Zeit Verschluß 90 in vivo 10. Dies ist eine weitere Bestätigung dafür, dass die hier beschriebene Microslice-Modell ist eine gültige Methode, die verwendet werden können, um die molekularen Mechanismen der Ischämie und exzitotoxische zu erforschenkeit vermittelten Zelltod.

Wie bei jedem experimentellen Technik kann dieses Verfahren variiert werden, und diese Variationen können oder können sich nicht auf experimentellen Ergebnissen. Basierend auf der Erfahrung, das Protokoll hier ausführlich darstellt, die optimalen Bedingungen für die Erzeugung der höchsten Gewebeausbeute und Microslice Lebensfähigkeit. Dieses Protokoll kann für die Verwendung in einer Vielzahl von Arten (microslices von Ratten, Mäusen und Hühnern zuvor erfolgreich erzeugt wird) angepaßt werden, und bei allen Gehirnregion (Fig. 1-3 zeigen microslices aus Gesamthirn abgeleitet ist, Fig. 4 zeigt microslices abgeleiteten von Kortex und Striatum). Zusätzlich kann der Microslice Dicke von 150 bis 350 &mgr; m verändert werden, ohne merklichen Verlust der Lebensfähigkeit der Scheiben. Die optimale Schichtdicke beträgt 250 &mgr; m, wie dies ergibt die höchste Ausbeute an Gewebe und reproduzierbarer Abtastung als bei größeren Scheiben. Die statistische Entnahme von Hirngewebe produziert vonDie Aliquots von microslices muss repräsentativ für die Gewebe, aus dem die Scheiben hergestellt werden. Um dies zu tun, müssen wir die kleinste Größe Scheiben pro Aliquot verwenden, um eine repräsentative Probenahme des Gewebes zu gewährleisten. Die optimalen Bedingungen für diese gefunden wurden zu 250 &mgr; m dick sein, und 1 mg des Gewebeprotein, das auf ~ 15-20 Scheiben / Aliquot entspricht. Die Temperatur, bei der microslices sollten zerkleinert und gewaschen werden, wurde durch Vergleich der Atmungsraten von microslices mit erzeugt und ohne Kühlung auf 4 ° C untersucht Obwohl die Auswirkungen der Azidose und Anoxie kann reduziert werden, wenn das Gewebe auf 4 ° C gebracht, Mikrotubuli-Zusammenbau kann geändert werden, wenn Gewebe gekühlt und dann wieder erwärmt 16. Diese Reorganisation des Zytoskeletts kann die funktionelle Aktivität der Zellen für einen gewissen Zeitraum nach dem Aufwärmen beeinflussen. Noncooled microslices haben eine höhere Rentabilität und Atemfrequenz im Vergleich zu Scheiben abgekühlt. Darüber hinaus sind drei Wäschen (Schritte 3.1-3.3) ausreichendzient die meisten der Ablagerungen zu entfernen. Die Äquilibrierungsperiode (Schritt 3.4) mit periodischen Änderungen im Puffer können die microslices zu "erholen" von Hacken, und verbessert die Reproduzierbarkeit in verschiedenen funktionellen Assays (wie Calcium Akkumulation).

Das Verfahren ist geeignet, um die Auswirkungen einer Vielzahl von Stimuli zu untersuchen und nach der Behandlung mit Medikamenten / Inhibitoren. Einem Arzneimittel / Inhibitor, durchlässige Membran ist das Potential hat, über diese Technik und jedes Molekül, das durch Western-Blot-(oder ähnliches) erfasst werden kann, kann untersucht werden, untersucht werden.

Zusammenfassend ist die Manipulation von Signalkaskaden in Exzitotoxizität und Ischämie-vermittelten Zelltod beteiligt bieten ein attraktives Konzept für die Entwicklung von Medikamenten, die den neuronalen Zelltod nach Schlaganfall begrenzen. Die beschriebene Microslice-Methode ist ein leicht anwendbares Modell, das die Untersuchung dieser Signalkaskaden in intakten reifen Gehirn erlaubtGewebe. Diese Technik kann verwendet werden, um helfen, neue Behandlungen, die neuronalen Zelltod nach Schlaganfall begrenzen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt in Bezug auf eine der Arbeiten innerhalb dieser Handschrift durchgeführt haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, der Hunter Medical Research Institute und der University of Newcastle unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guillotine Used to decapitate animal
Surgical equipment Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes Greiner
Water bath For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes Nunc
Dounce Homogenizer

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References

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