ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

Biology

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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

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Abstract

活性酸素種(ROS)高レベルの酸化ストレス状態に向かって細胞の酸化還元状態の変化を引き起こすことがある。この状況は、分子(脂質、DNA、蛋白質)の酸化を引き起こし、細胞死に至る。酸化ストレスにも影響、糖尿病、網膜症、神経変性、および癌などのいくつかの病理学的状態の進行。これにより、単一細胞のレベルではなく、生物全体との関連においてのみならず、酸化ストレス状態を調査するためのツールを定義することが重要である。ここでは、そのような研究を行い、in vivoでの酸化ストレスを測定するためのプロトコルを提供するように、インビボ系において有用であるとゼブラフィッシュ胚を考える。 "i)の酸化ストレスの定性的測定のための「全胚ROS検出法」およびii)A:蛍光ROSプローブ及びゼブラフィッシュトランスジェニック蛍光線を利用して、我々は、 生体内で酸化ストレスを測定するための2つの異なる方法を開発単一細胞ROS酸化ストレスの定量的測定のための検出方法 "。ここで、我々は、酸化剤および生理学的または遺伝的方法によって、組織における酸化ストレスを増加させることによって、これらの手順の有効性を実証する。このプロトコルは、フォワード遺伝子スクリーニングのために適している、それはそのような神経疾患や癌などの酸化ストレスに関連する病状の動物モデルにおけるROSのアドレス因果関係を支援します。

Introduction

酸化ストレスは、特にアンバランス細胞のレドックス状態から生じる状態と定義される。日常の内側の細胞を発生する複雑な酸化還元反応は、細胞の酸化還元状態を決定する。酸化還元反応は、分子の還元および酸化を生産する生物学的分子の原子間の電子の移動で構成され、全ての化学反応( すなわち酸化還元反応)で構成されています。これらの反応は極端な構造的な不安定性や近隣の生体分子と交換するアンバランスな電子の自然活性化を特徴としている電子的に活性種( すなわち酸化促進種)によって触媒される。これらの不規則な反応は、DNA損傷、タンパク質カルボキシル化、および脂質酸化にもたらし、最終的に細胞死をもたらす1。酸化ストレスのレベルの増加は、加齢と異なる病態2の進行と関連している。酸化ストレスはあります糖尿病や心血管疾患3,4の血管の変化の原因であることが報告されて。それはまた、アルツハイマー病における神経変性に重要な役割を果たしており、パーキンソン病5。さらに、酸化ストレスは、癌の進行および転移性事象6,7を支配する重要な要因として実証されている。加えて、炎症および免疫応答を惹起し、さらに酸化ストレス8をサポートすることができる。

または窒素(RNS、反応性窒素種)、生きた細胞において、酸化促進種は、酸素(活性酸素種ROS)に由来する。 (OH)(O 2 - )、過酸化水素(H 2 O 2)ROSは、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオンが挙げられる。主なRNSは亜酸化窒素(NO)である。二次反応種の一連のbetwee自発的相互作用によって生成することができるROS及びRNSまたはフリーの金属イオンが9 N。 H 2 O 2は、Fe 2 +、ヒドロキシルラジカルを生成すると反応しながら、 -例えば、スーパーオキシドアニオンはperoxynitrate(ONOO)を形成する亜酸化窒素と反応する。いくつかの生体分子と反応する能力のために、ROS及びRNSは、生理的な酸化還元状態10を維持するために危険な脅威と考えられている。酸化還元状態の細胞を維持するために抗酸化分子や酵素を解毒する一連のを完備しています。 11 -スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびペルオキシレドキシンは、本質的にH 2 O 2、OH及びOONO含む酸化促進種からの細胞の保護を提供する抗酸化酵素-武器を構成する。また、ビタミンCおよびE、ポリフェノールおよびコエンザイムQ10(コエンザイムQ10)のような抗酸化分子がROSとその危険な脱をクエンチする非常に重要である12,13 rivatives。しかし、ROS及びRNSの過剰産生、または抗酸化系における機能不全は、酸化ストレス14に向かって細胞の酸化還元状態に移行する。

彼らの否定的な意味合いのほかに、ROSは、異なる起源の細胞では、様々な生理的役割を再生することができます。細胞は通常、宿主防御および創傷修復の15〜17などの通常の生物学的事象を仲介するシグナル伝達分子として、ROSを生成する。反応種は、通常、シグナル伝達因子、成長因子、およびカルシウムレベル18,19の細胞内変動に応答してそのようなNOX(NADPHオキシダーゼ)およびXO(キサンチンオキシダーゼ)のような細胞内酵素により細胞内で産生される。これは、ROSを差動例えばATM-キナーゼなどのp53または細胞成分、DNA損傷に応答し20のマスター調節因子として重要な核因子の活性を調節し得ることが報告されている。同様にROSは強く目を媒介することによって細胞内シグナル伝達に影響を与える電子酸化及びシグナル伝達21の重要な調節因子として確立されているタンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)の不活性化。また、プロテオミクスベースの方法論は、RNSは、分子シグナリングの特定のタンパク質の修正および変更に責任があることを示している。 RNSは、S-nitrothiols(SNO)にそれらを変更し、このような炎症性疾患および自己免疫疾患などの病理学的状態22,23に付随する分子経路を誘発システインチオール基と反応する。

細胞培養実験は、部分的にのみインビボで作用する多数の因子を再現するので、動物モデル24,25レドックス研究を行うために非常に興味深い。これを達成するために、ゼブラフィッシュは、酸化ストレスのダイナミクス26を研究するために適切な脊椎動物動物モデルと考えられてきた。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のDEV間、細胞および遺伝的事象を研究するいくつかの利点を付与する新たなモデル系であるelopmentと病気。胚の大きなクラスターが生成され、実験的なニーズのために毎週利用可能することができる。また、ゼブラフィッシュ胚の異常な光学的透明性だけでなく、その小さなサイズは、全生物27の単一細胞イメージングと動的トラッキングを可能にします。過去10年間では、ゼブラフィッシュ変異体の相当数は、癌や遺伝病28〜31のようなヒトの病的状態をモデル化するために生成されました。最も重要なことには、多数のトランスジェニック系統は、遺伝的および生物学的操作32の大規模な機会を可能にするように製造されている。例えば、トランスジェニック組織特異的なゼブラフィッシュ系統を定期的にin vivo研究のために利用される。これらの線は、インビボで単一細胞を同定する能力、ならびにそれらが含む解剖学的構造を提供する、選択されたプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現する。

いくつかの毒物学的研究は、すでにTを使用していた彼は、創薬および酸化ストレス33-35のフィールドのための動物モデルとして、この脊椎動物の適合性を示唆し、酸化還元ホメオスタシスに対する化学物質のインビボ効果を評価するためにゼブラフィッシュ。いくつかの蛍光プローブは、ゼブラフィッシュの幼虫36,37における酸化ストレスを監視するために試験されているにもかかわらず、ゼブラフィッシュ組織および生体細胞内の酸化的ストレスのレベルを検出および測定するための確立されたアッセイは存在しない。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の生細胞における酸化ストレスのin vivo定量化のための手順を記述している。イメージングツール、FACSソーティング、蛍光プローブおよび酸化促進条件が全てゼブラフィッシュ胚および組織中の酸化種の検出および定量のための単純な検定を生成するために組み合わされる。

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Protocol

1。楽器の準備と作業溶液

  1. 魚の水溶液を調製する。蒸留水50ml中の海塩「インスタントオーシャン」の2グラムを溶解することにより保存溶液を作る。 (最終濃度60μg/ mlの海の塩)魚の水を使用する準備ができて準備する1リットルの蒸留水に株式魚の水の1.5ミリリットルを追加します。使用法の前に魚の水を使用する準備ができてオートクレーブ。この溶液を、ゼブラフィッシュ胚培地として使用される。
  2. 胚マウント用メチルセルロースを準備します。滅菌魚の水50ml中に1.5gのメチルセルロースを溶解する。撹拌プレート上の磁石を使用して、溶解を容易にする。粉末が完全に溶解し、数時間が必要な場合があります。小さなチューブに透明度と分量のためのソリューションをご確認ください。ヶ月間-20℃で保存し、使用時に一定分量を解凍する。使用する前に、5分間950×gでメチルセルロースを遠心分離する。一定分量の凍結融解は避けてください。
  3. トリカイン/エチル3 - アミノ安息香mを50mlの調製を水100mlにトリカイン200mgの溶解し、トリス-HCl、1M液(pH 9)を用いてpHを7.0に調整することによってエタンスルホン酸塩(原液)。以上30日間、4℃で、この株式を保管してください。注意:トリカインは有毒である。適切な取り扱いのガイドラインに従って使用してください。
  4. ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを誘導する
    1. 一般的な酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製する:H 2 O 2ストック溶液(過酸化水素;の100mM)を加えることにより、酸化剤溶液50mlを加え、魚の水。 2 mMおよび100μMの間の最終濃度のH 2 O 2を使用してください。直前の使用前に、この溶液を調製する。酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。このソリューションを保管しないでください。注意:H 2 O 2は危険であり、吸入したり、飲み込むと有害。可燃性物質と接触すると火災の原因になります。ヒュームフードの下で処理し、適切な私信を着用onal保護具。
    2. ミトコンドリア由来の酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製:ジメチルスルホキシド(DMSO)2mlにロテノン3.9mgの酸化剤を溶解することによってストック溶液(5ミリモル)を作る。暗所で室温でこの溶液を保管してください。
      1. 溶液を用いることができるようにするまでに、魚の水10ミリリットルにロテノン原液を溶解。 5〜50μMの濃度でロテノンを使用してください。 100μMのより高い濃度でロテノンを使用しないでください。適切な濃度で、この酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。注意:ロテノンは有毒、有害である。適切な注意書きに従って処理します。
    3. ノックダウン遺伝子によって酸化ストレスを誘発:ゼブラフィッシュ胚におけるノックダウンnrf2a遺伝子発現モルホリノマイクロインジェクションによって以前にTimme-Laragy A. によって報告され、2012年38。
    4. OXIDを誘導組織損傷後のストレスをative:以前ニートハンマー 、2009年39に記載されているように72 HPFのゼブラフィッシュ胚のテールフィンで巻きマージンを生成します。
  5. 単一セルのROS検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備します。
    1. 一般的なROS検出のためのソリューション:作業溶液(:2.5-10μM濃度範囲)を作製するために、HBSS(ハンクス平衡塩溶液)の汎用のROSに敏感な分子プローブを溶かす。このソリューションは、使用直前に準備する必要があります。
    2. ミトコンドリアによって誘導された特異的な検出のROSのためのソリューション:使用直前にDMSOを5 mMの原液を作ると、ミトコンドリアのROS感受性プローブ​​を溶かす。ワーキング溶液(:2.5-10μM濃度範囲)を調製するために、HBSS中のストック溶液に溶解する。
      注:ROS検出ワーキングソリューションとそれぞれのストック溶液の光と酸素曝露を避ける。使用して光からチューブを守るアルミホイル。格納またはHBSSに溶解し再利用プローブしないでください。月の-20℃で保存溶液を保管してください。
      注意:適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下で分子プローブ及びDMSOを処理します。
  6. ホールマウント、ROSの検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備作業溶液(:2.5-5μM濃度範囲)を作製するために、HBSS中(DMSOに安定化された)の一般的なROS感受性プローブ​​原液を溶解する。光や酸素暴露を避ける。光からチューブを保護します。使用前に、この溶液を調製する。このソリューションを保存したり、再使用しないでください。注意:適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下に分子プローブを処理します。
  7. PBS 1Xの15ミリリットルにウシ胎児血清10ミリリットルを追加することにより、停止溶液25ミリリットルを加えます。滅菌溶液を保管してください。 4℃で、このソリューションを保存するROS検出法 - このソリューションは、単一のセルに必要とされる。
  8. 28 AT&ゼブラフィッシュ空気インキュベーターを設定#176;で
  9. 単一セルのROS検出法、4℃で遠心分離器を設定します。

2。成人魚の交配やゼブラフィッシュ胚の選択

  1. セットアップ大人のゼブラフィッシュのペアは、標準的なプロトコル40によると交差する。具体的な実験のニーズに応じた適切なトランスジェニック系統を選択します。
  2. 卵を収集し、魚の水/胚培地で90-mmディッシュに入れます。胚が開発し、目的の発達段階に成長するまで、28℃で卵を保つ( 例えば 、48 HPF、72 HPF、HPF:時間後に受精)。
  3. 胚を開発するための画面が表示されます。すべての未受精卵または未発達の胚を除外します。
  4. 50ミリリットル魚の水にトリカインの1ミリリットル(ストック溶液)を添加することにより胚を麻酔。
  5. 実体顕微鏡下でのTg蛍光胚を選択します。

酸化剤エージェントと胚の3。治療

  1. 48時間の間に少なくとも30の胚を使うPFと異なる条件ごとに72 HPF。トリカインを除去するために、新鮮な魚の水で2回、胚を洗浄します。
  2. 3皿に蛍光胚を分割します。これ以上の30以上の胚/皿を置く。
  3. 洗浄溶液を除去し、対照溶液等の酸化剤溶液10ml又は魚10mlの水を加える。
  4. 28℃で1時間に10分間胚をインキュベートインキュベーション期間は、特定の組織において誘導される酸化的ストレスのレベルによって左右される。酸化ストレスの影響を受けた細胞が徐々に細胞死を受けるように短い期間は最高です。
  5. HBSSを含む新しい皿に胚を移し、回転させることによって胚を洗う。 28℃でのプレ暖かいHBSS

4。ホールマウントROS検出手法

  1. 酸化剤処理後の胚を収集し、小さな管には10以上の胚を置く。可能な限りHBSSで洗浄します。アルミ箔を使用した光からチューブを保護します。
  2. のため、ROS検出溶液の1ミリリットルを追加各チューブ。
  3. 光の露出を避けるために、28℃で15分間、暗所で胚を培養する。
  4. インキュベーション時間の間、全胚分析用のガラススライドを準備します。 「うつ病」スライドガラス上にメチルセルロースを300μlを入れ、ピペットチップでガラス面の上に敷い。メチルセルロースを放出しながら泡を避けてください。
  5. インキュベーション時間の終了時に、直ちにROS検出溶液を除去し、HBSS 2mlで二回洗浄する。チューブを数回転倒胚を洗浄します。ピペットまたはボルテックスしないでください。
  6. ガラスパスツールピペットに吸引胚まで。ピペットの開口部に近​​い、静かに位置胚をメチルセルロースにそれらを取り出す。細いナイロンラインと適切に胚を配向。
  7. 治療の胚と対照胚の蛍光を比較してください。すべての胚が同じものを使用して画像化されるように、別の方法として、蛍光実体顕微鏡や共焦点顕微鏡のパラメータを修正イメージングの設定。

5。単一細胞のROS-検出法

  1. 3.5:ステップから始める。各条件について、少なくとも35の胚を持っていることを確認します。
  2. 新しい皿に胚を移す。可能な限り魚の水を除去する。氷冷PBS 1Xの10ミリリットルを加え、プロテアーゼ阻害剤カクテル400μlの。手動鉗子で胚をdechorionate、細かい針で卵黄袋を取り外します。注意:卵黄袋を削除すると、次のFACS分析のためにクリーンなサンプルを保証します。このステップは、FACS装置によれば回避することができる。
  3. 転送デyolked 24穴マルチウェルプレートに胚(15胚/ウェル)は、すべての魚の水を除去する。
  4. 各ウェル中のHBSS300μL、30μlのコラゲナーゼP、50μlのトリプシン-EDTAを追加します。
  5. 優しく厳しいピペットチップ(1,000μL)を上下にピペッティングして胚を均質化する。
  6. 20分間28℃でインキュベートし、5分毎にピペッティングすることにより、サンプルを均質化する。
  7. 組織DISRを確認してください複合顕微鏡でのホモジネートのアリコートを観察することによってuption。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を容易にする。 30分以上のための胚をインキュベートしないでください。
  8. 停止溶液200μlを添加して反応を停止させます。静かにピペッティングして混合します。
  9. タイトなボトムであらかじめ冷却チューブに細胞懸濁液を転送します。チューブを氷上に維持し、光の露出を避けてください。
  10. 4℃で250×gで5分間遠心
  11. 優しくピペッティングして氷冷HBSSで上相と再懸濁細胞を除去。
  12. 細胞をカウントして、あなたのすべてのサンプル中の細胞の数が同じであることを確認してください。未満2×10 6個の細胞を使用しないでください。
  13. 4℃で250×gで5分間遠心細胞
  14. 上清を除去し、ROS感受性プローブ​​を含む氷で冷やしたHBSS 1mlでペレットを中断。
  15. 暗闇の中で3分間室温で静置する。酸化ストレスのレベルに応じて、インキュベーション時間を変化させ、tに彼プローブの感度は。
  16. FACSチューブに細胞を移す。氷上でチューブを保持し、FACS分析の前に光の露出を避けてください。
  17. 蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いて細胞をソートする。 Tgが組織蛍光( 例えば 、GFP)及びROSの検出( 例えば 、特定のミトコンドリアのROSに敏感なプローブ、一般的なROS敏感なプローブ)のために使用される分子プローブの励起/発光スペクトルに応じて設定波長。
  18. 各条件について、同じFACS設定を適用することによって、同じ実験セッション内のすべてのサンプルを測定します。異なる生物学的反復の平均値としての蛍光細胞の割合を計算します。各条件のための少なくとも2つの複製を分析する。

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Representative Results

ここに記載された方法を適用することによって、我々は簡単にゼブラフィッシュ胚組織における酸化ストレス(ROS及びレベル)を測定し、検出することができる。大人のゼブラフィッシュを横断した後、卵を回収し、72時間後に受精(HPF)に28℃で開発することが許可されています。強い酸化促進試薬との胚の1)の処置または2)組織損傷後のROS形成を促進する酸化的ストレスを誘導するために、我々は2つ​​の異なるアプローチを提案する。

過酸化水素(H 2 O 2)、一般的な細胞性ROS形成剤として、およびロテノン、特定のミトコンドリアのROSドライバとして得た:最初のアプローチでは、特定のニーズに応じて二つの異なる試薬を用いる。ロテノンは規制緩和が酸化ストレス41の原因であるETCの複合体Iの阻害剤である。

第二のアプローチにおいて、我々は、ゼブラフィッシュ胚のテールフィンで創傷を作成することにより、ROSの蓄積を誘導し39。また、酸化ストレス条件がモルホリノ注入と酸化ストレス38の細胞毒性効果に対する一次細胞の防御であるNrf2の抗酸化応答経路をノックダウンすることにより、ゼブラフィッシュの組織において促進することができる。

酸化ストレスは、ゼブラフィッシュ胚において誘導されると、活性酸素種(ROS)の蓄積は、蛍光活性化時( すなわち酸化)になるジェネリックまたはミトコンドリアROS特異的に敏感なプローブを用いて測定することができる。

処理された胚は、ホールマウントROS検出法を用いて、または図1にまとめたように単一細胞-ROS検出方法を適用することによって分析することができる。方法の間の選択は、酸化ストレスの定性的又は定量的測定を実行する必要性に依存している。両方の方法の代表的な結果を図2に表されている図3。

ホールマウント、ROSの検出方法

図2は、酸化ストレスのin vivoイメージングのためのホールマウントROS検出方法の適用を示す。特に、この方法は、外因性のプロオキシダントの処置ならびに創傷傷害または遺伝子欠失などのより生理的条件により生成された「低」酸化ストレスによって生成された「強い」酸化ストレスの両方に追従するために適用されている。

酸化種の生理的レベルは72 HPFでのライブゼブラフィッシュ胚のテールフィンのマイクロ傷害またはワイド傷を発生させることによって誘導される。これは、損傷後、H 2 O 2は創傷後の39創縁20分で蓄積することが実証されている。創縁における酸化ストレスの蓄積を可視化するために、胚は、汎用と共にインキュベートしたROS感受性プローブと39が負傷した後20分で画像化した。負傷した尾で無傷尾翼を比較することにより、創傷の縁( 図2A)で蛍光プローブの蓄 ​​積を区別することが可能である。非特異的な弱い蛍光信号が、すべての両方の条件でテールフィンの周囲の組織が検出される。

創傷マージンで、ROS感受性プローブの特異的蓄積を検証するために、傷のH 2 O 2濃度は、薬理学的なアプローチによって下げられている。それは創傷マージンH 2 O 2を蓄積DUOX -阻害剤VAS2870 39に非常に敏感であることが実証されているため、胚は創傷前に、この阻害剤で前処理した。 ROS感受性プローブの蛍光と比較し、VAS前処理された胚およびそれぞれの対照から、信号はROSの蓄積( すなわち、H 2 O 2に依存することを示す)( 図2B)。

加えて、我々はゼブラフィッシュ胚ロテノンで処理することにより、ゼブラフィッシュ組織における酸化種の高いレベルを生成した。ロテノンで処理した胚およびコントロールは特にROS種を検出する一般的なROS感受性プローブ​​と共にインキュベートした。その後、プローブを洗浄除去した胚は、蛍光実体顕微鏡下で画像化した。酸化ストレスは、胚( 図2C)の全身で検出された。高倍率画像は、プローブが正常に代謝される解剖学的領域( 図2D)を示す。蛍光画像(下のパネル)はROS陽性細胞を示し、一方、明視野像(上のパネル)は、解剖学的構造を区別する。蛍光画像により示されるような結果は、主に、処理された胚での制御とを比較することによって達成される酸化ストレスの検出、の定性的報告されている。

単細胞-ROS検出方法

単一細胞ROS検出方法を適用することにより、図3のレポートの代表的FACSプロットおよび酸化ストレスの定量化。この方法では、図の説明において、詳細なプロトコルの報告のように酸化促進条件に供されたゼブラフィッシュ細胞中の酸化ストレスレベルを測定するように適合されている。上述したように、酸化ストレスは、ROS敏感な分子プローブを有する単一の細胞に解離ゼブラフィッシュ組織をインキュベートすることによって測定された。解離手順およびFACS自体が細胞の損傷を引き起こす可能性があるので、試料の分析は、「生細胞」は、酸化ストレスの定量のために考慮されることを必要とする。したがって、解離した細胞を「生細胞」は、物理的パラメータ( 図3A)を示す細胞の画分を選択することにより、および( 図3B)死細胞を除外することによって分析される。従って、サンプルは定量するために酸化的ストレスレベルROS感受性プローブの蛍光に従って、そのようなGFP( 図3C)が陽性などの内因性蛍光を示す。 ROS感受性プローブの陰性対照試料は、取り扱いおよび技術手順によって誘発される酸化ストレスを評価するために含まれるべきである( 図3Cと 、パネル:コントロール- )。相対的なFACSプロットの定量化は、さまざまな生物学的複製( 図3D-E)の測定結果を示すヒストグラムで実証。

過酸化水素処理時の酸化ストレスレベルの定量化に加えて、この方法は、nrf2aのモルファントとそれぞれの対照( 図3F)中のボランティアは、生理学的条件内の酸化ストレスレベルを定量するために適用されている。

さらに、ミトコンドリアのような特定の問い合わせRO-ROS感受性プローブ​​を用いて単一細胞ROS検出方法を組み合わせることによりS-感受性プローブは、特定のミトコンドリア標的化酸化促進処理( 図3G)の文脈における酸化ストレスを測定することも可能である。

図1

図1。ゼブラフィッシュ胚におけるROSレベルを測定するための方法の概略図。ゼブラ大人は、適切な飼育槽に交差している。受精卵は、その後、胚が完全に開発できるように皿に採取し、28℃で保存する酸化ストレスの誘導は、薬学的処置により、または遺伝的または物理的な傷害のいずれかによって、異なる方法で達成することができる。あるいは、遺伝的変異体を解析する場合には、このインキュベーションをスキップして前進することができる。この時点で、2つの異なる方法に従って進めることができる。「全メートルによるount ROS検出」方法は、(左)、ゼブラフィッシュ胚を直ちに蛍光ROS感受性プローブ​​(1)、次いで、蛍光または共焦点顕微鏡(2)で分析と共にインキュベートする。 「単セルROS検出」法(右)において、ゼブラフィッシュ胚は、(1)、蛍光ROS感受性プローブ​​(2)と共にインキュベートし、蛍光検出および定量(3)のためにFACSによって分析し、単一細胞に解離される。 「ホールマウント-ROS検出」メソッドは、主に定性分析、定性および酸化的ストレスレベルの定量的測定の両方「単一セルベース」方式の助成金として生きている胚における酸化ストレスの検出を可能にする一方。

図2
72ゼブラで図2ホールマウント-ROS検出方法の代表的な結果。A)ゼブラフィッシュ胚を供した以前ニートハンマーに記載されているように負傷した。、200939代表の共焦点画像が負傷尾びれの傷の縁に酸化促進種(ROS)の蓄積(矢印)を示している。酸化種は、一般的なROSプローブで検出されている(CellROX; 2.5μM)を20分後に創傷がなされている。スケールバーは20μm。B)72 HPFでゼブラフィッシュ胚の創傷の縁を示す代表的な共焦点画像。創傷がなされた前胚を90分間VAS2870(20μM)またはDMSOで前処理した。傷後20分、ROSは、一般的なROS感受性プローブ​​(2.5μMCellROX)で検出されている。ゼブラフィッシュ胚でロテノン誘発される酸化ストレスを示すスケールバーは20μm。C)全身像。パネルDに示すように酸化ストレスが強く胚の尾部領域で検出される。ロテノンは、主にskelディレクトリに影響するミトコンドリアETCの強力な阻害剤であるゼブラフィッシュにおけるETAL筋細胞。スケールバー、180程度である。

図3
図3単一細胞ROS検出方法の代表的な結果。A)ゼブラフィッシュ胚の典型的なサンプルを示す代表的なFACSプロットは、単一細胞に解離。生細胞は、FSC-HおよびSSC-Hパラメータで応じ、R1領域でゲートされています。 SSC-H:539(電圧)、1.0(AMPGAIN)、モード:リニア; FSC-H:ゼブラフィッシュ胚の典型的なサンプルを示すE00(電圧)、2.1(AMPGAIN)B)の代表的なFACSプロットは、単一細胞に解離。 5分間、FACS分析の前に、サンプルは、ヨウ化プロピジウム(1μg/ mlのPI)と共にインキュベートされた。死んだ細胞は、PI蛍光(FL2-Hチャネル)と応じ、R2領域上にゲートされています。 FSC-H:E00(電圧)、2.1(AMPGAIN)、モード:リニア、SSC-H:539(電圧)、1.0(AMPGAIN)、モード:李近く。電圧チャネル:FL-2:613ログC)を示す代表的なFACSプロットは、酸化促進剤処理(H 2 O 2)にかけゼブラフィッシュ胚およびそれぞれのコントロールが解離し。内皮細胞は、GFPチャネルによって可視化される。 FACSプロットは、ULおよびURに酸化ストレス(ROS)によって影響を受けるすべてのセルを表します。陰性細胞が低い象限(LLおよびLR)上にプロットされる。 Tgは(Kdrl:GFP)48hpfにおけるS843ゼブラフィッシュ胚を、10分間の対照としてH 2 O 2(2 ​​mM)を又はH 2 Oと一緒にインキュベートした。プロトコールに記載のようにFACS分析の前に、胚は処理される。酸化ストレスによって影響を受けた細胞は、一般的なROS感受性蛍光プローブ(; 2.5μMCellROX)を用いて検出される。 ROS感受性プローブ​​とともにインキュベートしていない試料は、陰性対照として含まれている。それぞれのコントロールに酸化促進処理を行った試料を比較すると、上部の四分円(UL + UR)にプロット細胞の数が高くなる。 FACSのアキ次のようにitionの設定であった:電圧チャネル:FL-1:582ログイン; FL-4:H 2 O 2処理した胚および各制御における酸化ストレスの影響を受けて410細胞の割合を示すログD)ヒストグラム(UL + UR)。測定は、(c)に示すサンプルに関連しています。酸化ストレスによって影響を受けた細胞は、一般的なROS感受性蛍光プローブ(; 2.5μMCellROX)を用いて検出される。結果は、H 2 O 2処理した胚および各制御における酸化ストレス(ROS +)の影響を受けた内皮細胞のパーセンテージ(GFP +)を示すSD。E)ヒストグラム±n = 2の異なる生物学的複製の平均である。測定は、(c)に示すサンプルに関連しています。 nrf2aのモルファント(nrf2a MO)とそれぞれの対照の結果は、酸化ストレス(ROS +によって影響を受ける細胞の割合を示す値±SD、N = 2の異なる生物学的複製の平均である。 女)ヒストグラム)24 HPFで(CTRL MO)。 72 HPFでDMSO);10μM)と、それぞれのコントロール(Ctrlキー、結果は平均±SD、N = 2の異なる生物学的複製の平均治療胚におけるミトコンドリアの酸化ストレス(ロテノンの影響を受けた細胞の割合を示すG)のヒストグラムである。単一細胞に胚の解離した後、ミトコンドリアの酸化ストレス(ミトコンドリアROS +)は、ミトコンドリア特異的プローブ(;5μMのMitoSOX)を用いて測定した。結果は平均±SD、N = 3の異なる生物学的複製の平均である。

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Discussion

重要なステップ

本明細書に記載されるゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを検出するための手順は、2つの異なる方法を含む。単一細胞ROS検出方法( 図1)のより具体的な定量的測定を可能にしながら、ホールマウントROS検出方法は、主にROS検出のための定性的なアッセイである。どちらの方法も、ゼブラフィッシュ胚に、生体内のROS検出を評価するための迅速かつ簡単な方法を提供します。しかし、どちらも、いくつかの重要なステップを紹介します。

方法Iに関連する重要なステップ

ホールマウントROS検出するための第1の方法は容易に生きた胚( 図2)の全ての組織における酸化ストレスを検出するために大きな利点を有する。胚組織に対するプローブの1)の透過性、2)プローブ毒性および3)番目:しかし考慮されなければならないとアッセイの結果に影響を与える可能性があります3の重要な重要な側面があります低ROS濃度に電子プローブ感度。

第一の態様は、具体的に方法42 のin vivo応用に関連する。 ROS感受性プローブ​​の「細胞透過性」プロパティは、このアッセイの達成のために不可欠な機能です。理想的には、全ての水溶性の化学物質は、ライブゼブラフィッシュ胚での配信に最適な;しかしながら、酸化ストレスを検出するための試薬の多くは水に不溶である。したがって、通常は、DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解性であるプローブを使用することをお勧めします。

ROSのプローブの濃度にリンクされた胚に可能な毒性作用があります。副作用は、通常、組織の損傷( すなわち、壊死)またはプローブの加速された代謝によって表される。 5高用量の間ヒドロエチジンプローブ原因胚死ゼブラフィッシュ胚の長いインキュベーション期間(日) - (および-6) - カルボキシ-2 '、7'-nの中のジクロロフルオレセインジアセテート結果腸(未発表データ)における蛍光のオン特異的蓄積。この問題を克服するために、プローブとのインキュベーションの間、胚を監視することが重要である。同じプローブとのインキュベーションのいくつかの濃度と時間のテストでは、同様に有益であろう。最適なインキュベーション時間は、表面的な組織の損傷を与えることなく、分子プローブの配信と酸化を可能にする。化学プローブ(0.5〜10μM)を使用して、インキュベーション時間は、一般的に10から30分の範囲内に固定することができ、1時間を超えないようにしてください。この条件は、酸化種の量は生理的レベルに近い場合や、それが内部胚組織に限定されている場合は特に設定するのは非常に難しいことができます。生物全体をROS検出化学プローブとインキュベートされたときに、プローブが主に酸化され、蛍光性となる場合実際、最も表面組織( すなわち、皮膚、眼、および心臓)である。その後、プローブは徐々に、内臓に配信肝臓やVEのさssels。結果として、ROS検出プローブを用いたゼブラフィッシュ胚のインキュベーションのための適切な時間は、全ての組織において酸化ストレスを検出することが重要です。

この方法を使用するときに最後に、組織によって発現される酸化ストレスのレベルへのプローブの感度を考慮することが重要である。市販のプローブのほとんどが細かくそれらの感受性について特徴づけ、これは、特定の用途のための最適なプローブが経験的に決定しなければならないことを意味されない。すべてのROS敏感なプローブは、一般に、酸化ストレスの高いレベルを検出し、それらのほとんどは、酸化ストレスレベル43の最小限のシフトに敏感ではない。

この欠点を制限し、より詳細かつ正確な分析を可能にするためには、酸化ストレスの単一細胞検出に基づく第二の方法を適用することが提案されている。

方法IIに関連する重要なステップ

Sイングル細胞のROS検出方法は、いくつかの重要な手順を説明します。それらは、主に、1)胚細胞解離の効率および2によって)アッセイに関連するROS感受性プローブ​​のタイプを決定する。

単一細胞への胚の解離は、フローサイトメトリー44を介して、ゼブラフィッシュ細胞分析のために、以前のプロトコルから適合され、強く全体の手順の結果に影響を与えるつの重要な側面を提示してきた。第1は、分離した細胞の回復に関連している間に第一の態様は、胚を解離するために使用する方法を考えています。

単一細胞への胚の解離は、主に解離試薬の濃度( すなわち、コラゲナーゼP及びトリプシン)によって制御される。しかしながら、組織解離の効率は、胚培養し、それらの発達段階の数に依存することを考慮しなければならない。以前の発生段階のゼブラフィッシュ胚(24 HPF-48 HPF)が原因45成長プログレッシブ組織幼虫(96 HPF-120 HPF)よりも解離試薬により賢明である。 72 HPFとは異なる発生段階のゼブラフィッシュ胚で作業する場合このように、解離手順の調整が必要である。試薬の濃度が低減され、部分的にしか胚を解離しながら、過剰な試薬とのインキュベーションは、細胞死を引き起こす。それが正しく組織を分解することが重要であるとして、それは、単一の細胞を収集し、保存することも同様に重要である。考慮すべき重要なことは、細胞が組織分割後に回収される温度である。これは、組織または取り扱い手順の機械的破壊に対する二次酸化ストレスを制限するために、遠心分離の間、氷上で又は4℃で細胞を維持することが重要である。

関連付けられたプローブに関しては第二の重要なステップは、対象となる具体的な組織に分析にリンクされています。細胞populを検出するための最も簡単な方法ゼブラフィッシュにおけるATIONはここ数十年46,47年に設立されたトランスジェニック系統の広い配列によって提供されています。しかし、選択したトランスジェニックラインの蛍光は、ROS検出プローブと互換性がなければならない。これは、背景組織蛍光およびプローブによって放出され、低いが、特定の蛍光シグナル間のクロストークを回避することが重要である。

このプロトコルのアプリケーション

両方の方法は、インビボにおける酸化ストレスを測定するための簡単かつコスト効果的なアッセイを提供して考慮すると、いくつかの条件にこのプロトコルを適用することが可能である。

異なる遺伝子( 例えば 、病理学)の条件での酸化ストレスの測定

酸化剤および酸化防止剤の遺伝子は容易モルホリノ(機能喪失)またはmRNA(機能獲得型)を注入することにより、ゼブラフィッシュ胚で変調することができる。遺伝子ノックダウンとmicroinの最近報告された実験ゼブラフィッシュ胚におけるキャップmRNAのjectionは、開発中の酸化ストレスから細胞を保護する抗酸化Nrf2aとNrf2b遺伝子のための様々な役割を確立した。遺伝子発現調節のアプローチは、神経細胞38,48における低酸素応答と酸化ストレスに哺乳類とゼブラフィッシュの間に進化的に保存された軸を評価した。また、酸化ストレスを研究する絶好の機会は、いくつかのゼブラフィッシュ突然変異系統によって提供されています。例えば、ゼブラフィッシュducttrip(DTP)変異体は、病的状態に関連する酸化ストレスの特徴付けのための興味深い例を示している。 DTP変異体は、S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素(AHCY)遺伝子およびその特徴付けのための欠乏を運ぶAHCY活性の損失はROSレベル49に影響与えることによって、肝変性を引き起こすことを明らかにした。喪失のfunctioを運ぶ同等に、ゼブラフィッシュ変異体のNrf2 fh318、転写因子Nrf2の遺伝子のN変異は、下等脊椎動物50で、この抗酸化遺伝子の保護の役割を調査するためにかなりの関心と見なされてきた。

医薬化合物をきっかけに酸化還元状態の測定

小さな薬によるゼブラフィッシュ胚の治療は、酸化ストレスを阻害または活性化することができる。我々は最近、ゼブラフィッシュ胚のスタチン治療は、CoQ10の処理51によって回収することができる酸化ストレスを誘導したことを実証する。あるいは、ヒトRYR1関連性筋疾患のためのゼブラフィッシュ、動物モデルにおける酸化ストレスの分析は、筋肉疾患52のための潜在的な治療アプローチとしての抗酸化薬のNAC(N-アセチルシステイン)の役割を強調した。

低分子およびそれらの酸化的特性を特徴付けるへの薬物の大規模スクリーニング

ゼブラフィッシュは、十分に確立された動物MODである大きな化学スクリーニングのためのEL。ゼブラフィッシュで行われる小分子の最近の化学スクリーニングは厳しく、パーキンソン病53などの哺乳動物の神経変性疾患において影響されるドーパミン作動性ニューロンの生存のモジュレーターとしての抗酸化剤を同定した。この方法は、 インビボでの新規なプロまたは抗酸化分子をスクリーニングするために使用することができる。

意義と限界

「ホールマウント」および「単セル」ROS検出法の両方の隆起は、単純な実験技術と基本装置を用いて酸化ストレスのインビボ測定において実行する能力に依存する。 ROS-detecting probesとcombinationにおけるanimalのmodel as zebrafishのapplicationはmere oxidative stressのrevelation、but also single tissuesのlevel at living用organism及びquantificationのcontextにおけるits detection not onlyをallows。重要なことに、これらのアッセイは、することができます市販のツールを用いて行われ、実現されるように、特定の専門知識を必要としません。さらに、両方の方法は、時間のかかる手順ではなく、サンプルの大規模なセットに適切な時間で適用することができる。すべて一緒にこれらの実用的な利点は、生体内で酸化ストレス解析を改善するために特に重要な、これらのメソッドを作成します。

しかし、これらのアッセイはまた、いくつかの制限を示しています。一般的に、現在市販ROS最も敏感なプローブは、生細胞中の酸化ストレスレベルの微細な定性的および定量的分析のために評価されていない。一般的に使用されるヒドロエチジンとMitoSOXプローブは、スーパーオキシド(O 2 - )の検出のために設計されましたが、蛍光ベースのアッセイ54を使用するときに、最近、その特異性についての懸念は、特に、提起されている。同様にいくつかの報告は、排他的なH 2のためのジクロロジアセテート(DCFH-DA)に疑問を高度な2 55,56を検出。さらに、これらの酸化還元活性の蛍光プローブは、部分的な非特異的な活性化( すなわち 、組織の自家蛍光)を特徴とし、酸化後の可逆的ではない。蛍光プローブは、ROSにより酸化されると、それが戻って、その非蛍光還元状態に来ることができない。これにより時間分解能を有するROS変動の検出は、化学プローブ43を適用することによって制限される。

このフィールドのかなりの制限は、排他的なRNSの検出のためのプローブの欠如によって表される。近年、プロテオミクスベースの方法論がRNSのニトロソ活性ストレスのバイオマーカーとみなされ、タンパク質の酸化/ニトロ化に特異的な抗体を用いて免疫ブロットアッセイを介して評価することができるタンパク質修飾を誘導することを示した( 例えば 、抗SNO-システイン、抗-3 -ニトロチロシン)22,23。ただし、すべてのこれらのアッセイは、酸化STREの唯一の間接的測定値であるSSはRNSによってトリガされ、ほとんどの場合、彼らは生きた細胞やゼブラフィッシュ胚生活には適用されません。つまり、細胞抽出物を必要とする。

従来のプローブへの有効な代替案は、遺伝的にコードされたレドックス感受性蛍光タンパク質によって表されます。このグループの主な構成要素は以下のとおりです。緑色蛍光タンパク質、rxYFPとcpYFP、黄色蛍光タンパク質およびHyperプローブ、特定のH 2 O 2感受性蛍光プローブ57から派生両方から派生roGFP、。蛍光タンパク質によって作成されたこれらの設計の酸化還元プローブのすべては、蛍光ベースのレシオメトリック定量化を可能にし、化学プローブより(秒から数分まで)、より高い時間分解能を可能にする58。 インビボ HYPERを表現するゼブラフィッシュトランスジェニック系統によって示されるように、これらのバイオセンサーの適用も可能である内因性H 2 O 2レベル39,59のリアルタイム検出のため。私遺伝的にコードされたセンサーとゼブラフィッシュをmplementingは、酸化ストレスを調査する最適なシステムを提供していますが、トランスジェニック動物ラインと、適切なイメージングツールをセットアップする必要があります。ここで紹介するゼブラフィッシュにおける酸化ストレスを検出するための手順は、遺伝的な方法よりも正確ですが、速く、酸化促進種の高レベルのin vivoでの検出のための一次アッセイを提供する。個々の反応性酸素および/または窒素種の正確な測定は、現在、この研究分野の限界である。将来的には、今後のナノスケールの酸化還元センサーは、この問題を解決するために役立つ可能性があります。ナノ粒子とナノチューブベースのレドックスセンサーの成功したアプリケーションは、いくつかのin vitro試験において試験されたが、現在60時までのin vivoアッセイとして使用することはできませんされています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)
P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)
A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'
Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

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1 Comment

  1. Really it's interesting paper,
    But please Can we Know the ROS-sensitive prob that used in this paper in case of generic and mitochondrial oxidative stress?
    Thanks so much

    Reply
    Posted by: bedo v.
    January 23, 2017 - 8:18 AM

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