Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीवित कोशिकाओं में endocytic और साइटोसोलिक डिब्बों में एक साथ पीएच मापन

Biology

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Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

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Abstract

Protocol

सेलुलर पीएच अंशांकन के समाधान के लिए 1. तैयारी

  1. जांच के लिए प्रयोग की जाने वाली 5 समाधान तैयार करने के लिए पांच अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए निम्न यौगिकों करें:
    • NaCl (1 एम NaCl के 1 मिलीलीटर) (1 एम NaCl 10 एमएल एच 2 0 में = 0.58 G)
    • KCl (6.75 1 एम KCl की एमएल) (1 एम KCl 10 मिलीलीटर एच 2 0 में 0.75 जी =)
    • ग्लूकोज (1 एम डी ग्लुकोज के 1 मिलीलीटर) (1 एम डी ग्लुकोज = 10 एमएल एच में 1.80 जी 2 0)
    • MgS0 4 (0.05 1 एम MgSO 4 मिलीलीटर) (1 एम MgSO 10 मिलीलीटर एच 2 0 में 4 = 1.20 G)
    • 20 मिमी HEPES (1M HEPES के 1 मिलीलीटर) (10 मिलीलीटर एच 2 0 में 1 एम HEPES = 2.38 G)
    • 2 CaCl (1M 2 CaCl की 0.05 मिलीग्राम) (10 मिलीलीटर एच में एम 1 2 CaCl = 1.47 जी 2 0)
      दोहरा आसुत एच 2 ओ (DDH 2 हे) के सभी समाधान तैयार करें.
  2. DDH 2 हे की 35 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक समाधान पूरा और इसलिए जब तक एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ मिश्रणlution हासिल की है.
  3. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 और 7.5 के पीएच मान प्राप्त करने के लिए 1 एन KOH या 1 एन एचसीएल के साथ प्रत्येक समाधान के पीएच को समायोजित करें. फिर, 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ मात्रा समायोजित करें.
  4. उपाय 5 nigericin के मिलीग्राम और शेयर समाधान nigericin एक 10 मिमी तैयार करने के लिए पूर्ण EtOH के 670 μl जोड़ें.
    सावधानी: nigericin बेहद जहरीला है और महान देखभाल (दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और मुखौटा) के साथ संभाला जाना चाहिए. Nigericin पूरी तरह भंग है जब तक उलटा द्वारा समाधान मिश्रण.
  5. प्रत्येक अंशांकन समाधान करने के लिए 10 मिमी nigericin (अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोन) के 0.05 मिलीलीटर जोड़ें. Nigericin कोशिका झिल्ली पारगम्यता बढ़ जाती है और कोशिकी + K के एक depolarizing एकाग्रता की उपस्थिति में intracellular और बाह्य पीएच संतुलन का कारण बनता है कि एक ionophore है.
  6. अंशांकन समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता

2. सेल तैयार

  1. एक जैविक safet के तहत35 एमएम Y हुड, बीज कोशिकाओं x 10 मिमी संस्कृति व्यंजन 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर में. 24 घंटे के बाद लगभग 50% संगम सुनिश्चित करने की जरूरत कोशिकाओं की मात्रा का प्रयोग करें.
    नोट: हमारी प्रयोगों में, हम हिंदुस्तान टाइम्स-1080 सेल लाइन और थाली संस्कृति पकवान प्रति 1 x 10 5 कोशिकाओं का उपयोग करें.
  2. जांच के लिए प्रयोग की जाने वाली प्रयोग और प्लेट 5 अतिरिक्त संस्कृति व्यंजन के लिए आवश्यक संस्कृति व्यंजन की संख्या निर्धारित करते हैं.
  3. कम से कम 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह संस्कृति व्यंजन.

पीएच संवेदन जांच की 3. तैयारी

  1. DDH 2 0 में फ्लोरोसेंट पीएच जांच 8 hydroxypyrene-1, 3,6 trisulfonic एसिड, trisodium नमक (एचपीटी / pyranine) की एक 1M शेयर समाधान तैयार करें. यह समाधान आरटी पर संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए.
  2. Thereâ कहा जाता है, (और -6) carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethyl एस्टर एसीटेट (सी snarf -1 पूर्वाह्न - 1 से 5 मिमी की एक शेयर समाधान तैयारfter snarf -1) DMSO के 1.76 मिलीलीटर में snarf-1 के 1 मिलीग्राम भंग करके. अच्छी तरह से दोहराया pipetting द्वारा मिश्रण. Snarf -1 समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए.

4. सेल लेबलिंग

  1. सोलह घंटे रहने कक्ष इमेजिंग से पहले, पूर्ण मध्यम 2 मिलीलीटर युक्त प्रत्येक संस्कृति डिश के लिए 1M एचपीटी स्टॉक समाधान के 2 μl (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी) जोड़ें.
  2. इनक्यूबेटर संस्कृति व्यंजन लौटें. एचपीटी जांच इसलिए लेबल को जांच pinocytosis से ऊपर रखा जाना चाहिए organelles, सेल impermeant है. इस हालत एचपीटी साथ सेल incubations सीरम पूरक संस्कृति के माध्यम में प्रदर्शन कर रहे हैं कि आवश्यकता है.
  3. एचपीटी साथ ऊष्मायन के बाद, बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें और कम से कम 2 घंटे के लिए सीरम मुक्त मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें. Snarf-1 के साथ ऊष्मायन सीरम जांच के तेज रोक सकता है क्योंकि सीरम मुक्त माध्यम में प्रदर्शन करने की आवश्यकता है.
  4. वायुसेना प्राप्त करने के लिए एक 1 मिमी snarf -1 स्टॉक समाधान के 10 μl जोड़ेंinal 5 माइक्रोन की एकाग्रता और कोशिकाओं मंद रोशनी के नीचे, 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते दें. सी snarf -1 एकाग्रता और ऊष्मायन के समय सेल के प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
  5. ऊष्मायन के अंत में, बाँझ पीबीएस में दो बार धोने कोशिकाओं और सीरम मुक्त मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें.

पीएच modulators के 5. इसके अलावा

  1. विधि कोशिकाओं में पीएच परिवर्तन का पता लगा सकते आकलन है कि, intracellular पीएच मिलाना कि विभिन्न अभिकर्मकों इस्तेमाल किया जा सकता है:
    • Bafilomycin A1, वि ATPase 5 की एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला
    • ना + / एच + एक्सचेंजर isoform 1 (NHE -1) 6
    • एनएच 4 सीएल, intracellular पीएच 7 बढ़ जाती है कि एक कमजोर आधार
    1. ऊपर उल्लेख किया अभिकर्मकों के शेयर समाधान तैयार:
      • Bafilomycin A1: 100 माइक्रोन के एक शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए DMSO के 160 μl को bafilomycin A1 की 10 ग्राम जोड़
      • EIPA: obtai को मेथनॉल के 1.67 मिलीलीटर EIPA के 25 मिलीग्राम जोड़ें50 मिमी की ना अंतिम एकाग्रता
      • एनएच 4 सीएल: 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए DDH 2 हे के 10 एमएल में अमोनियम क्लोराइड की 0.53 ग्राम भंग.

      नोट: सभी शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए जो bafilomycin A1 के लिए छोड़कर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए.
    2. अलग संस्कृति बर्तन में, जैसा कि नीचे वर्णित अभिकर्मकों में से एक जोड़ें:
      • 100 माइक्रोन bafilomycin A1 के 2 μl (अंतिम एकाग्रता 100 एनएम)
      • 50 मिमी EIPA के 1 μl (अंतिम एकाग्रता 25 माइक्रोन)
      • 1M एनएच 4 सीएल (अंतिम एकाग्रता 20 मिमी) का 40 μl
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते
  2. छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें.

6. लाइव सेल इमेजिंग खुर्दबीन के विनिर्देशों और अधिग्रहण सेटिंग्स

  1. का उपयोग कर जीना सेल इमेजिंग प्रदर्शन एक 40x उद्देश्य एक वर्णक्रमीय उल्टे स्कैनिंग confocal microsco पर घुड़सवारपे एक मोटर चालित XY मंच, एक पर्यावरण नियंत्रित (तापमान, आर्द्रता, सीओ 2) चरण इनक्यूबेटर में गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन accommodates कि एक कक्ष के साथ सुसज्जित है.
  2. यहां इस्तेमाल confocal साधन (ओलिंप FV1000) के साथ सुसज्जित है:
    • एक डायोड लेजर 405 एनएम
    • एक 40 मेगावाट आर्गन लेजर (458 एनएम, 488 एनएम, 515 एनएम)
    • एक हीलियम नीयन लेजर (543 एनएम)
    • फ्लोराइट 10X उद्देश्य, NA0.4
    • एक LUCPLFLN 40X उद्देश्य, NA0.60
    • एक PLAPONSC योजना ए पी ओ 60X तेल उद्देश्य, NA1.4
    • एक dichroic दर्पण डीएम 405/458/488/543
    • एक एसडीएम 560 और एक एसडीएम 640 dichroic फिल्टर
    • एक BA655-755 फिल्टर बाधा
    • एक बीम फाड़नेवाला BS20/80
    • छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर,
  3. चरण इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म है और माइक्रोस्कोप एक बार स्थापित है, पहले से confocal चरण इमेजिंग कक्ष में एचपीटी और snarf-1 के साथ incubated एक संस्कृति पकवान.
  4. एकब्याज की एक क्षेत्र का पता लगाने fter, सॉफ्टवेयर अधिग्रहण सेटिंग 1 चित्रा समायोजित करें.
    • दो आभासी चैनल सेट सेट करें.
    • 525 एनएम और 570 पर 543 एनएम और उत्सर्जन संग्रह में snarf -1 उत्तेजना - - 600 एनएम 505 पर 405 एनएम और उत्सर्जन संग्रह में एचपीटी उत्तेजना से मेल खाती है कि पहले चरण आरंभ.
    • 525 एनएम और 640 पर 543 एनएम और उत्सर्जन संग्रह में snarf -1 उत्तेजना - - 650 एनएम 505 पर 458 एनएम और उत्सर्जन संग्रह में एचपीटी उत्तेजना से मेल खाती है कि दूसरा चरण आरंभ.
    • confocal एपर्चर डिफ़ॉल्ट रूप से 175 माइक्रोन के लिए सेट और इष्टतम एपर्चर मैन्युअल रूप से 300 माइक्रोन पर निर्धारित करने की आवश्यकता है.
    • 0.4 माइक्रोन मोटाई के धारावाहिक क्षैतिज ऑप्टिकल वर्गों (800 x 800 पिक्सल) stacking द्वारा छवि ले.

ध्यान दें: एक 40x उद्देश्य एक साथ कई कक्षों का निरीक्षण करने के लिए उपयोगी है और organelle देखने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. हालांकि, स्थानिक संकल्प और संकेत तीव्रता Bette हैंआर एक 60X तेल उद्देश्य प्रयोग कर प्राप्त किया. इसके अलावा, दो रंगों के बीच कोई उत्तेजना या उत्सर्जन पार बात नहीं है.

पीएच संवेदन जांच की 7. कैलिब्रेशन

  1. अंशांकन से पहले, पहले से एचपीटी और snarf-1 के साथ incubated संस्कृति पकवान से मध्यम हटाने बाँझ पीबीएस के साथ दो बार धोने और फिर पांच अंशांकन समाधानों में से एक के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. Confocal मंच चेंबर में संस्कृति पकवान.
  3. निम्नलिखित सेटिंग्स के अनुसार समय चूक छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें:
    1. प्रयोग के लिए छवियों और इंटरवल अवधि समय की संख्या निर्धारित करें.
      नोट: हम आम तौर पर करने के लिए 30 मिनट के लिए छवियों के बीच एक 1 मिनट के अंतराल का उपयोग करें.
    2. प्रत्येक छवि के अधिग्रहण के बीच बंद करने के लिए शटर कार्यक्रम.
  4. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में प्रति मिनट प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और प्रतिदीप्ति तीव्रता स्थिर है जब समय निर्धारित करते हैं. 20 मिनट - intracellular पीएच 15 के बाद आम तौर पर स्थिर है.
  5. आरEPEAT प्रत्येक शेष अंशांकन समाधान के लिए एक नई संस्कृति पकवान का उपयोग 7.1-7.4 कदम.

8. डाटा अधिग्रहण

  1. अंशांकन किया गया है, क्षेत्र 15-20 प्रतिशत की कोशिकाओं से युक्त 4-5 बेतरतीब ढंग से चुने हुए क्षेत्रों से नमूना डेटा प्राप्त. दो छवियों प्रत्येक क्षेत्र के लिए प्राप्त कर रहे हैं: एचपीटी लेबलिंग (vesicles) और snarf -1 लेबलिंग (cytosol) के लिए दूसरे के लिए एक.
  2. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (बाह्य क्षेत्र) डिजिटल रूप से दोनों जांच के फ्लोरोसेंट छवियों से घटाया जाता है. उनके संबंधित संग्रहीत छवियों से लेबल vesicles और cytosol एक द्विआधारी मुखौटा का उपयोग कर चयन कर रहे हैं. प्रत्येक पीएच संवेदन जांच के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता एक संख्यात्मक पैमाने (0-4,095 ग्रे स्तर पैमाने पर) पर मापा जाता है. Organelle या कोशिका द्रव्य में सभी पिक्सल के लिए एक मतलब तीव्रता की गणना है और मूल्यों प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है.

9. डेटा विश्लेषण

  1. विभिन्न सॉफ्टवेयर संकुल डेटा विश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. यानीFluoView सॉफ्टवेयर.
  2. के रूप में निम्नानुसार एक स्प्रेडशीट, रिकॉर्ड मूल्यों में और प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना: एचपीटी के मामले में, आर = (एफ 458 एनएम / एफ 405 एनएम) और, snarf -1, आर = (एफ 644 एनएम / एफ 584 एनएम के मामले में ).
  3. ऐसे GraphPad चश्मे के रूप में वैज्ञानिक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा प्लॉट. साजिश पीएच (एक्स अक्ष) के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति अनुपात (शाफ़्ट) पेश करना चाहिए. वक्र ढाले गैर रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर हासिल की है.
  4. कदम 8.2 में वर्णित के रूप में नमूने के प्रतिदीप्ति तीव्रता लीजिए और प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना. पीएच मान में अनुपात को बदलने के लिए अंशांकन घटता का प्रयोग करें.

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Representative Results

Intracellular और endosomal / lysosomal सेल के डिब्बों दोनों में पीएच की एक साथ माप के लिए, ratiometric फ्लोरोसेंट पीएच संवेदन snarf -1 जांच और एचपीटी इस्तेमाल किया गया. एचपीटी endosomal / lysosomal डिब्बे के ratiometric पीएच माप की अनुमति देता है, जबकि snarf -1 साइटोसोलिक डिब्बे तक ही सीमित है. 16 घंटे के लिए एचपीटी साथ सेल लोड हो रहा है endosomes / लाइसोसोम 4 में अपनी चयनात्मक स्थानीयकरण की अनुमति देता है. पीएच संवेदन जांच के साथ भरी हुई एचटी-1080 कोशिकाओं से दर्ज प्रतिदीप्ति का एक विशिष्ट उदाहरण चित्रा 2A में दिखाया गया है. एचपीटी endosomal और lysosomal दोनों डिब्बों लेबल सबूत है कि एलेक्सा 546 संयुग्मित transferrin (endosomes) या एक फ्लोरोसेंट lysotrophic जांच (Lysotracker दीप Reddye) के साथ सह धुंधला द्वारा प्राप्त किया गया था. आंकड़े स्पष्ट रूप से एचपीटी दोनों डिब्बों 2A चित्रा दाग दिखाया.

ऊपर वर्णित पद्धति का प्रयोग, जीवित कोशिकाओं में intracellular पीएच मान का उपयोग कर निर्धारित किया गया हैप्रत्येक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई के ratiometric गुणों के आधार पर प्रत्येक जांच आंकड़े 2 बी और -2 सी के लिए एक अंशांकन वक्र,. पांच अंशांकन समाधान पीएच इकाइयों को प्रतिदीप्ति तीव्रता कन्वर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया. तीन स्वतंत्र calibrations से डेटा प्रत्येक पीएच संवेदन जांच चित्रा -2 के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं. प्रत्येक डेटा बिंदु एचपीटी या एक दिया पीएच में snarf -1 के लिए 644/584 एनएम का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए 458/405 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है. दोनों जांच के लिए अंशांकन घटता सबसे अच्छा एक घातीय समीकरण चित्रा -2 के साथ लगाया गया था कि एक गैर रेखीय रिश्ता दिखाया. सेलुलर डिब्बे जुड़े पीएच परिवर्तन का पता लगाने के लिए विधि की दक्षता एनएच 4 सीएल, intracellular पीएच बढ़ जाती है कि एक कमजोर आधार, bafilomycin A1, वि ATPases और EIPA की एक औषधीय अवरोध करनेवाला, एक NHE का उपयोग कर Live हिंदुस्तान टाइम्स-1080 कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया था 1 अवरोध करनेवाला. एनएच 4 सीएल ट्रिगर intravesicular और cyto6.35-7.10 और 7.00-7.40 solic पीएच बढ़ जाती है, क्रमशः 3 ए और 3 बी रु. Bafilomycin A1 साइटोसोलिक पीएच बदलने के बिना endosomal और lysosomal डिब्बों की alkalinization प्रेरित किया. इसके विपरीत, EIPA अनुपचारित कोशिकाओं आंकड़े 3 ए और 3 बी में 7.00 की तुलना में 6.62 की एक पीएच मूल्य तक पहुँचने cytosol का अम्लीकरण प्रेरित किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के लिए अधिग्रहण सेटिंग के चित्र. (ए) के पहले चरण में एक dichroic (DM405/488/543/633) दर्पण के माध्यम से एक साथ 543 पर 405 एनएम और snarf -1 में एचपीटी उत्तेजित एनएम निर्धारित है. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पहले एक dichroic दर्पण (SDM560) का उपयोग 505-525 एनएम पर एचपीटी के लिए दर्ज की गई है. Snarf -1 की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तो एक bandpa के माध्यम से नजर रखी है570-600 एनएम की सीमा में एसएस हस्तक्षेप फिल्टर. (बी) के दूसरे चरण में एक साथ एचपीटी की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (exc, 458 एनएम) और snarf -1 (exc, 543 एनएम) इकट्ठा करने के लिए निर्धारित है. हर जांच के पहले चरण में इस्तेमाल किया dichroic दर्पण के माध्यम से इकट्ठा किया जाता है के लिए लेजर बीम से उत्पन्न जांच उत्तेजना एक बीम फाड़नेवाला (BS20/80) और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन से होकर गुजरता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. पीएच संवेदन जांच की सीटू अंशांकन में. (ए) एचपीटी और हिंदुस्तान टाइम्स-1080 तंतु - सार्कोमा कोशिकाओं में snarf -1 उप सेलुलर स्थानीयकरण के प्रतिनिधि छवियाँ. अपर छवियों snarf -1 जबकि कोशिका द्रव्य लेबल बताते हैं कि एचपीटीएस जुड़े प्रतिदीप्ति intravesicular स्थानीयकरण से पता चलता है. हिंदुस्तान टाइम्स-1080 कोशिकाओं एलेक्सा 546 संयुग्मित transferrin (5 ग्राम / एमएल) या एक lysotrophic डाई क्रमशः (Lysotracker दीप Reddye) (100 एनएम) के साथ 30 मिनट के लिए incubated रहे थे. लोअर छवियों एचपीटी transferrin और lysotrophic डाई (60X) के साथ colocalizes बताते हैं कि. प्रतिदीप्ति तीव्रता का (बी) के पीएच 6.0 और 7.5 पीएच पर अंशांकन समाधान के साथ 15 मिनट के लिए incubated कोशिकाओं में दोनों पीएच संवेदन जांच के प्रतिनिधि छवियाँ. (सी) रिश्ता एचपीटी और snarf-1 के लिए अनुपात पीएच के एक समारोह के रूप में अंशांकन समाधान का उपयोग निर्धारित की. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
मैं NT के चित्रा 3. मॉड्यूलेशनbafilomycin A1, EIPA और एनएच 4 सीएल द्वारा racellular पीएच. औषधीय inhibitors (bafilomycin A1, EIPA) और intracellular पीएच न्यूनाधिक एनएच 4 सीएल पद्धति को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया. रेखांकन endosomal / lysosomal कम्पार्टमेंट (ए) या ​​एचपीटी और snarf-1 के साथ भरी हुई है और एनएच 4 सीएल की उपस्थिति या अनुपस्थिति (नियंत्रण) में 30 मिनट के लिए incubated हिंदुस्तान टाइम्स-1080 कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य (बी) (में दर्ज पीएच मान दिखाने 20 मिमी), EIPA (25 माइक्रोन) या bafilomycin A1 (100 एनएम). डाटा मतलब + SEM (पी ** 0.005, *** पी 0.0001) के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.

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Discussion

विभिन्न सेलुलर डिब्बों का जीना सेल इमेजिंग में मात्रात्मक पीएच माप सही बाहरी चुनौतियों के लिए सेल प्रतिक्रिया में पीएच विविधताओं को मापने की जरूरत है. हालांकि, रहता है कि प्रमुख बाधाओं में से एक को आसानी से और विशेष रूप से सेलुलर डिब्बों को लक्षित करने की है. इस संबंध में, कुछ अध्ययनों electroporation या microinjection 8-10 से कोशिकाओं में शुरू की एक intracellular पीएच सूचक के रूप में एचपीटी के उपयोग पर प्रकाश डाला है. इन तकनीकों में अर्थात् electroporation कोशिकाओं को व्यापक नुकसान का कारण बनता है, और microinjection विशेष उपकरण और तकनीकी कौशल की आवश्यकता है, गंभीर खामियों से ग्रस्त हैं. ब्याज की, हिंटन एट अल., पहले से एचपीटी pinocytosis की एक प्रक्रिया से कोशिकाओं द्वारा उठाया और snarf -1 और एचपीटी के संयोजन / lysosomal डिब्बों 3 cytosol और endosomal के पीएच की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि हो सकता है कि सूचित किया है . हम lysosomal / endosomal compartm में पीएच विविधताओं रिकॉर्ड करने के लिए इस संपत्ति का इस्तेमाल किया हैलाइव हिंदुस्तान टाइम्स-1080 कोशिकाओं के ईएनटी. एचपीटी इस डिब्बे में स्थित था और, इसलिए, एक विश्वसनीय पीएच सूचक के रूप में सेवा कर सकता है कि साक्ष्य fluorophore संयुग्मित transferrin साथ सह धुंधला द्वारा प्राप्त किया गया था, lysosomal / endosomal डिब्बे के एक मार्कर, या एक acidophilic डाई के साथ ज्यादातर लाइसोसोम चित्रा लेबल कि 2. इसके अलावा, अलग सेलुलर डिब्बों को लक्षित विभिन्न intracellular पीएच modulators का उपयोग bafilomycin A1 विशेष रूप से cytoplasmic पीएच बदलने के बिना intravesicular पीएच है कि वृद्धि का संकेत दिया. इसके विपरीत, EIPA मुख्य रूप से साइटोसोलिक पीएच बदल लेकिन अमोनियम क्लोराइड दोनों डिब्बों के पीएच प्रभावित जबकि endosomal और lysosomal पीएच पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ा. इन परिणामों snarf -1 और एचपीटी एक साथ इन दो अलग सेलुलर डिब्बों में पीएच परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सबूत मुहैया कराए.

यहाँ वर्णित विधि की एक महत्वपूर्ण विशेषता लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का इस्तेमाल होता है. सबसे अध्ययन रेपोintracellular पीएच माप पर साहित्य में rted spectrofluorometry द्वारा किया गया है. आसान उपयोग और तेजी से डाटा अधिग्रहण प्रदान करने के लिए हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रयोग के दौरान कोशिकाओं का अवलोकन की अनुमति नहीं है. यह अंशांकन कदम के दौरान, अम्लीय तहत विस्तारित ऊष्मायन (5.5 पीएच) या क्षारीय (8.0 पीएच) स्थितियां प्रतिकूल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को प्रभावित करने और apoptosis ट्रिगर हो सकता है कि हमारे अनुभव रहा है के बाद से इस खामी महत्व का हो सकता है. हिंदुस्तान टाइम्स-1080 कोशिकाओं के मामले में, apoptosis इस प्रकार snarf -1 (नहीं दिखाया डेटा) का पीएच पर निर्भर प्रतिदीप्ति के साथ दखल दे, लाल autofluorescence की ओर जाता है. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम apoptosis या अन्य सेल परिवर्तन के संकेत मनाया गया जहां एक हर जांच के लिए अलग संस्कृति पकवान और त्याग प्रयोगों का इस्तेमाल किया है. पीएच माप के लिए confocal खुर्दबीन का उपयोग भी आसान डेटा का विश्लेषण करता है. उदाहरण के लिए, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का विश्लेषण apoptoti, कलाकृतियों त्यागने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसी कोशिकाओं और पृष्ठभूमि शोर, गणना आसान और अधिक सटीक बना रही है.

विधि यहाँ वर्णित अन्य तरीकों पर कई फायदे प्रदान करता है, यह कुछ सीमाएँ हैं. इनमें से एक हर जांच के लिए आवश्यक विभिन्न लोडिंग की स्थिति से संबंधित है. एचपीटी के लिए सम्मान के साथ, डाई pinocytosis द्वारा लिया जाना है. यह प्रतिबंध कोशिकाओं pinocytosis और endocytic डिब्बे की जिससे लेबलिंग को बढ़ावा देने के लिए एक सीरम पूरक मध्यम में समय की एक विस्तारित अवधि (जैसे 12 घंटा) के लिए बनाए रखा जाना चाहिए कि आवश्यकता है. इसके विपरीत, सेल permeant snarf -1 सीरम युक्त गैर विशिष्ट esterases द्वारा acetoxymethyl एस्टर (AM) hydrolysis की संभावना को रोकने के लिए एक सीरम मुक्त माध्यम में incubated की जरूरत है. ये प्रतिबंध लोड हो रहा है असंगत सेल संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता है कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल से अलग रहेगा. इसके अलावा, अम्लीय माध्यम को एचपीटी की संवेदनशीलता एक महत्वपूर्ण सीमा है. चित्रा 2, च में दिखाया गया है458 एनएम पर उत्साहित एचपीटी की luorescence तीव्रता पृष्ठभूमि मूल्यों के करीब अनुपात के साथ 6.0 पीएच या कम से कम न्यूनतम भिन्नता, दिखाते हैं. एचपीटी के इस आंतरिक संपत्ति ऐसी 4.0-5.0 जितनी कम पीएच मान है कि लाइसोसोम के रूप में बहुत अम्लीय सेलुलर डिब्बों की पढ़ाई के मामले में ध्यान में रखा जाना चाहिए. हालांकि, हमारे ज्ञान करने के लिए, एचपीटी intraendosomal पीएच मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि केवल उपलब्ध ratiometric डाई है. उदाहरण के लिए, आमतौर पर इस्तेमाल किया lysosensor डाई अधिक अम्लीय lysosomal डिब्बे के भीतर ज्यादातर विभाजन होगा. endosomal डिब्बे के भीतर इस डाई के विभाजन की हद endosomal पीएच होमियोस्टेसिस बदल दिया है, जहां कोशिकाओं में intravesicular पीएच मापने जब एक बड़ी खामी है, जो इन vesicles भीतर पीएच मान पर निर्भर करेगा.

अंत में, हम एक साथ एकल कक्षों में साइटोसोलिक और endosomal पीएच मान को मापने के लिए इस के साथ साथ एक दृष्टिकोण का वर्णन. यह कोशिकाओं में पीएच homeostasis के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है wherई म्यूटेशन या दवाओं endosomes में तपका और प्रोटॉनों की आमद को प्रभावित कर सकते हैं.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

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References

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