La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Biology

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Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

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Abstract

Protocol

1. Preparazione di soluzioni per cellulare pH Calibrazione

  1. Aggiungere i seguenti composti da cinque tubi 50 ml coniche separati per preparare 5 soluzioni da utilizzare per la calibrazione:
    • NaCl (1 ml di 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml di H 2 0)
    • KCl (6,75 ml di 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml di H 2 0)
    • Glucosio (1 ml di 1 M D-glucosio) (1M D-Glucosio = 1,80 g in 10 ml di H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml di 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g in 10 ml di H 2 0)
    • HEPES 20 mM (1 ml di 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml di H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 ml di 1M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g in 10 ml di H 2 0)
      Preparare tutte le soluzioni a doppia distillata H 2 O (DDH 2 O).
  2. Completare ogni soluzione con 35 ml di DDH 2 O e mescolare con un agitatore magnetico fino a tantoluzione è raggiunto.
  3. Regolare il pH di ciascuna soluzione con 1 N KOH o 1 N HCl per ottenere valori di pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 e 7.5. Poi, regolare il volume con acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml.
  4. Misura 5 mg di nigericin e aggiungerlo a 670 ml di EtOH assoluto per preparare un 10 mM nigericin soluzione stock.
    Attenzione: nigericin è altamente tossico e deve essere maneggiata con molta cura (guanti, occhiali di protezione e maschera). Miscelare la soluzione per inversione fino a quando il nigericin è completamente sciolto.
  5. Aggiungere 0,05 ml di nigericin 10 mm (concentrazione finale 10 mM) ad ogni soluzione di taratura. Nigericina è uno ionoforo che aumenta la permeabilità della membrana cellulare e provoca equilibrazione di pH intracellulare ed extracellulare in presenza di una concentrazione depolarizzante di K + extracellulare.
  6. Soluzioni di taratura possono essere memorizzati fino a 1 mese a 4 ° C

2. Preparazione cellulare

  1. Sotto un safet biologicoCappa y, cellule seme in 35 millimetri x 10 millimetri piatti di coltura in 2 ml di terreno di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici. Usare la quantità di cellule necessarie per garantire circa il 50% di confluenza dopo 24 ore.
    NOTA: Nei nostri esperimenti, usiamo la linea cellulare HT-1080 e la piastra 1 x 10 5 cellule per capsula di Petri.
  2. Determinare il numero di piatti di coltura necessari per l'esperimento e piastra 5 ulteriori piastre di coltura da utilizzare per la calibrazione.
  3. Piatti di porre la cultura in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno 24 ore.

3. Preparazione di sonde pH-sensing

  1. Preparare una soluzione madre 1M della sonda pH fluorescente 8-idrossipirene-1, 3,6 acido trisolfonico, sale trisodico (HPTS / pyranine) in DDH 2 0. Questa soluzione deve essere conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
  2. Preparare una soluzione stock di 1 mM 5 - (e-6)-carbossilico seminaphthorhodafluor acetossimetilico estere acetato (C-SNARF-01:00; chiamato thereaopo SNARF-1) sciogliendo 1 mg di SNARF-1 in 1,76 ml di DMSO. Mescolare accuratamente pipettando ripetuta. SNARF-1 soluzione deve essere conservata a -20 ° C e al riparo dalla luce.

4. Etichettatura cellulare

  1. Sedici ore prima del live-cell imaging, aggiungere 2 ml di soluzione stock 1M HPTS (concentrazione finale 1 mm) per ogni piatto di coltura contenente 2 ml di terreno completo.
  2. Riportare i piatti della cultura per l'incubatore. La sonda HPTS è cell-impermeant, quindi etichetta organelli la sonda deve essere occupato da pinocitosi. Questa condizione richiede che incubazione delle cellule con HPTS vengono eseguite in medium siero supplementato cultura.
  3. Dopo l'incubazione con HPTS, lavare le cellule due volte con PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero per almeno 2 ore. Incubazione con SNARF-1 deve essere eseguita in terreno privo di siero perché siero può impedire l'assorbimento della sonda.
  4. Aggiungere 10 ml di un SNARF-1 soluzione stock 1 mm per ottenere afconcentrazione inale su 5 micron e consentono alle cellule di incubare per 20 min a 37 ° C, sotto la luce fioca. C-1-SNARF concentrazione e tempo di incubazione può variare a seconda del tipo cellulare.
  5. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in PBS sterile e aggiungere 2 ml di mezzo privo di siero.

5. Aggiunta di pH modulatori

  1. Per valutare se il metodo può rilevare variazioni di pH nelle cellule, diversi reagenti che modulano pH intracellulare possono essere utilizzati:
    • Bafilomycin A1, un inibitore specifico della V-ATPasi 5
    • Na + / H + scambiatore isoforma 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, una base debole che aumenta intracellulare pH 7
    1. Preparare soluzioni madre dei reattivi di cui sopra:
      • Bafilomycin A1: aggiungere 10 mg di bafilomycin A1 a 160 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock di 100 micron
      • EIPA: aggiungere 25 mg di EIPA a 1.67 ml di metanolo per ottenuna concentrazione finale di 50 mM
      • NH 4 Cl: sciogliere 0,53 g di cloruro di ammonio in 10 ml di DDH 2 O per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.

      Nota: Tutte le soluzioni di archivi devono essere conservati a 4 ° C ad eccezione di bafilomycin A1, che deve essere conservato a -20 ° C e al riparo dalla luce.
    2. In piatti della cultura separati, aggiungere uno dei reagenti come descritto di seguito:
      • 2 ml di 100 mM bafilomycin A1 (concentrazione finale 100 nm)
      • 1 ml di 50 mM EIPA (concentrazione finale 25 pm)
      • 40 ml di 1M NH 4 Cl (concentrazione finale 20 mM)
    3. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.
  2. Procedere alla acquisizione delle immagini.

6. Specifiche tecniche di imaging microscopio live-cell e impostazioni di acquisizione

  1. Eseguire live-cell imaging usando un obiettivo 40X montato su una spettrale invertito confocale a scansione microscope dotato di un palco XY motorizzato, una camera che ospita fondo di vetro piatti della cultura in un (temperatura, umidità, CO 2) fase di incubatore ambiente controllato.
  2. Lo strumento confocale (Olympus FV1000) qui usato è dotato di:
    • Un diodo laser 405 nm
    • Un laser ad argon 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Un laser elio neon (543 nm)
    • Obiettivo Fluorite 10X, NA0.4
    • Un obiettivo LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • Un obiettivo olio PLAPONSC PIANO APO 60X, NA1.4
    • Uno specchio dicroico DM 405/458/488/543
    • Un SDM 560 e un SDM 640 filtri dicroici
    • Un filtro barriera BA655-755
    • Un BS20/80 divisore di fascio
    • Software di analisi dei dati per acquisizione ed elaborazione,
  3. Una volta che l'incubatore fase si è riscaldata fino a 37 ° C e il microscopio è istituito, mettere un piatto di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1 nella camera di imaging fase confocale.
  4. Laopo l'individuazione di una zona di interesse, regolare le impostazioni di acquisizione del software Figura 1.
    • Impostare due set di canali virtuali.
    • Avviare la prima fase che corrisponde al HPTS eccitazione a 405 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 570-600 nm.
    • Avviare la seconda fase che corrisponde alla HPTS eccitazione a 458 nm e la raccolta emissione a 505-525 nm e SNARF-1 eccitazione a 543 nm e la raccolta emissione a 640-650 nm.
    • L'apertura confocale è impostato a 175 micron per default e apertura ottimale deve essere impostata manualmente a 300 micron.
    • Prendere Immagine impilando seriali sezioni ottiche orizzontali (800 x 800 pixel) da 0,4 micron di spessore.

NOTA: Un obiettivo 40X è utile osservare più celle contemporaneamente e funziona bene per la visualizzazione organello. Tuttavia, la risoluzione spaziale e l'intensità del segnale sono better ottenuto utilizzando un obiettivo 60X olio. Inoltre, non c'è eccitazione o di emissione di diafonia tra i due coloranti.

7. Taratura delle sonde di pH-sensing

  1. Prima della taratura, rimuovere terreno dalla piastra di coltura precedentemente incubate con HPTS e SNARF-1, lavare due volte con PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di una delle cinque soluzioni di taratura.
  2. Posizionare il piatto cultura nella camera di fase confocale.
  3. Procedere al time-lapse acquisizione delle immagini secondo le seguenti impostazioni:
    1. Impostare il numero di immagini e tempi di durata degli intervalli per l'esperimento.
      NOTA: Usiamo tipicamente un intervallo di 1 minuto tra le immagini fino a 30 min.
    2. Programmare l'otturatore per chiudere tra l'acquisizione di ogni immagine.
  4. Registrare l'intensità di fluorescenza per min in un foglio elettronico e determinare il momento in cui l'intensità di fluorescenza è costante. PH intracellulare è generalmente stabile dopo 15 - 20 min.
  5. Ripetere passaggi 7,1-7,4 utilizzando un nuovo piatto di coltura per ogni soluzione di calibrazione rimanente.

8. Acquisizione dati

  1. Una volta che la calibrazione è stato fatto, acquisire dati di esempio 4-5 campi scelti a caso contengono 15-20 cellule per campo. Due immagini sono ottenute per ciascun campo: uno per l'etichettatura HPTS (vescicole) e il secondo per SNARF-1 etichettatura (citosol).
  2. Fluorescenza di fondo (zona extracellulare) viene digitalmente sottratto dalle immagini fluorescenti di entrambe le sonde. Vescicole etichettati e citoplasma dei rispettivi immagini memorizzate sono state selezionate usando una maschera binaria. Per ogni sonda pH-sensing, intensità di fluorescenza sono misurati su una scala numerica (0-4,095 scala di livelli di grigio). Una intensità medio per tutti i pixel del organello o citoplasma è calcolato ei valori vengono utilizzati per calcolare i rapporti di fluorescenza.

9. Analisi dei dati

  1. I vari pacchetti software sono disponibili in commercio per l'analisi dei dati. EsempioFluoView Software.
  2. In un foglio di calcolo, i valori dei record e calcolare rapporti di fluorescenza come segue: Nel caso di HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, nel caso di SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Tracciare i dati utilizzando software grafici scientifici come GraphPad Prism. La trama dovrebbe ritrarre rapporti di fluorescenza (asse y) in funzione del pH (asse X). Curva di raccordo è realizzato utilizzando la regressione non lineare.
  4. Raccogliere intensità di fluorescenza dei campioni come descritto al punto 8.2 e calcolare rapporti di fluorescenza. Usare curve di calibrazione per trasformare i rapporti in valori di pH.

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Representative Results

Per la misura simultanea di pH sia intracellulare e compartimenti cellulari endosomal / lisosomiali, sono stati usati i fluorescenti sonde pH-sensing raziometrici Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 è limitata al compartimento citosolico che HPTS permette di misurare raziometrica pH del vano endosomale / lisosomiale. Carico delle cellule con HPTS per 16 ore permette la sua localizzazione selettiva negli endosomi / lisosomi 4. Un tipico esempio di fluorescenza registrata da cellule HT-1080 caricato con le sonde pH-sensibile è mostrato in Figura 2A. La prova che HPTS etichette sia endosomali e lisosomiali compartimenti è stato ottenuto da co-colorazione con Alexa transferrina 546-coniugato (endosomi) o una sonda fluorescente lysotrophic (Lysotracker profonda Reddye). I dati chiaramente dimostrato che HPTS macchiato entrambi i comparti Figura 2A.

Secondo il metodo sopra descritto, i valori di pH intracellulare in cellule viventi sono stati determinati usandouna curva di calibrazione per ogni sonda Figure 2B e 2C, in base alle proprietà raziometrici di ciascun colorante sensibile al pH. I cinque soluzioni di taratura sono stati usati per convertire intensità di fluorescenza per unità di pH. I dati provenienti da tre calibrazioni indipendenti sono riportati per ciascun pH-sensing sonda Figura 2C. Ciascun punto di dati rappresenta un rapporto di intensità di fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione di 458/405 nm per HPTS o lunghezze d'onda di emissione di 644/584 nm per SNARF-1 in un determinato pH. Le curve di calibrazione per entrambe le sonde hanno mostrato una relazione non lineare che è stato meglio munito di una equazione esponenziale Figura 2C. L'efficienza del metodo per la rilevazione cellulari variazioni di pH vano-associata è stata valutata in cellule HT-1080 vivi utilizzando NH 4 Cl, una base debole che aumenta il pH intracellulare, bafilomycin A1, un inibitore farmacologico di V-ATPasi e EIPA, un NHE- 1 inibitore. NH 4 Cl attivato intravesicular e citopH aumenta Solic 6,35-7,10 e 7,00-7,40, Figure rispettivamente, 3A e 3B. Bafilomycin A1 indotto alcalinizzazione delle endosomal e lisosomiali scompartimenti senza alterare il pH citosolico. Al contrario, EIPA indotto acidificazione del citosol raggiungendo un valore pH di 6,62 rispetto a 7,00 in cellule non trattate Figure 3A e 3B.

Figura 1
Figura 1. Diagrammi di impostazioni di acquisizione per il microscopio confocale a scansione laser. (A) La prima fase è impostato per eccitare HPTS a 405 nm e SNARF-1 a 543 nm, simultaneamente attraverso un dicroico (DM405/488/543/633) specchio. Emissione di fluorescenza viene prima registrata per HPTS a 505-525 nm usando uno specchio dicroico (SDM560). Emissione di fluorescenza di SNARF-1 viene monitorata attraverso un bandpass filtro di interferenza nel range di 570-600 nm. (B) La seconda fase è impostato per raccogliere contemporaneamente emissione di fluorescenza di HPTS (esc, 458 nm) e SNARF-1 (EXC, 543 nm). Eccitazione Probe generato dal raggio laser passa attraverso un divisore di fascio (BS20/80) ed emissione di fluorescenza per ogni sonda viene raccolto attraverso gli specchi dicroici utilizzati nella prima fase. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Nella calibrazione in situ di sonde pH-sensibili. (A) Immagini rappresentative della HPTS e SNARF-1 sub-cellulare localizzazione in HT-1080 cellule di fibrosarcoma. Immagini superiori mostrano che SNARF-1 etichette citoplasma, mentre HPTFluorescenza S-associata mostra la localizzazione intravesicular. Cellule HT-1080 sono state incubate per 30 minuti con Alexa transferrina 546-coniugato (5 pg / ml) o un colorante lysotrophic (Lysotracker profonda Reddye) (100 nM), rispettivamente. Immagini inferiori mostrano che HPTS colocalizza con transferrina e il colorante lysotrophic (60X). (B) Immagini rappresentative di entrambe le sonde pH-sensing in cellule incubate per 15 min con soluzioni di calibrazione a pH 6.0 e pH 7.5. (C) Relazione tra intensità di fluorescenza rapporti di HPTS e SNARF-1 determinati utilizzando le soluzioni di taratura in funzione del pH. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Modulazione di intracellular pH bafilomycin A1, EIPA e NH 4 Cl. inibitori farmacologici (bafilomycin A1, EIPA) e il pH intracellulare modulatore NH 4 Cl sono stati usati per convalidare la metodologia. Grafici mostrano valori di pH registrati nel vano endosomal / lisosomiale (A) o il citoplasma (B) di cellule HT-1080 caricato con HPTS e SNARF-1 e incubate per 30 minuti in presenza o in assenza (controllo) di NH 4 Cl ( 20 mm), EIPA (25 micron) o bafilomycin A1 (100 nm). I dati sono rappresentati come media + SEM (** p 0,005, *** p 0.0001).

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Discussion

Misura di pH quantitativa in live-cell imaging di diversi compartimenti cellulari è necessaria per misurare con precisione le variazioni di pH nelle risposte cellulari alle sfide esterne. Tuttavia, uno dei principali ostacoli che rimane è facile e specificamente i compartimenti cellulari. A questo proposito, alcuni studi hanno evidenziato l'uso di HPTS come indicatore di pH intracellulare introdotto in cellule mediante elettroporazione o microiniezione 8-10. Queste tecniche soffrono di gravi inconvenienti, vale a dire l'elettroporazione provoca ingenti danni alle cellule, e microiniezione richiede attrezzature speciali e competenze tecniche. Di interesse, Hinton et al., Precedentemente riportato che HPTS può essere assorbito dalle cellule mediante un processo di pinocitosi e che la combinazione di SNARF-1 e HPTS può essere utilizzato per monitorare il pH del citosol e endosomal / compartimenti lisosomiali 3 . Abbiamo utilizzato questa struttura per registrare le variazioni di pH nel compartm lisosomiale / endosomalento di cellule HT-1080 live. La prova che HPTS trovava in questo compartimento e, quindi, potrebbe servire come indicatore di pH affidabile è stato ottenuto mediante co-colorazione con fluorocromo coniugato transferrina, un marcatore del compartimento lisosomiale / endosomal, o con un colorante acidofile che etichetta lo più lisosomi Figura 2. Inoltre, l'uso di differenti modulatori pH intracellulare destinati compartimenti cellulari distinti indicato che bafilomycin A1 specificamente aumentata pH intravesicular senza alterare pH citoplasmatico. Al contrario, EIPA principalmente alterato pH citosolico ma aveva poco o nessun effetto sulla endosomi e lisosomi pH mentre il cloruro di ammonio influenzato pH di entrambi i vani. Questi risultati hanno fornito la prova che SNARF-1 e HPTS potrebbero essere utilizzati per monitorare simultaneamente variazioni di pH in queste due differenti compartimenti cellulari.

Una caratteristica importante del metodo qui descritto è l'uso del microscopio confocale a scansione laser. La maggior parte studi repotati nella letteratura sulla misurazione del pH intracellulari sono state fatte da spettrofluorimetria. Sebbene facile da usare e fornire una rapida acquisizione dati, questo approccio non permette l'osservazione di cellule durante l'esperimento. Questo inconveniente può diventare di importanza dal momento che è stata la nostra esperienza che, durante la fase di calibrazione, di incubazione prolungato sotto acido (pH 5,5) o alcalini (pH 8,0) condizioni possono influenzare negativamente vari tipi di cellule e innescare l'apoptosi. Nel caso di cellule HT-1080, apoptosi porta ad autofluorescenza rosso, interferendo così con la fluorescenza pH-dipendente di SNARF-1 (dati non mostrati). Per aggirare questo problema, abbiamo usato un piatto di coltura separato per ogni taratura ed esperimenti scartati in cui sono stati osservati segni di apoptosi o di altre alterazioni cellulari. L'uso del microscopio confocale per misure di pH rende anche l'analisi dei dati più facile. Per esempio, analisi di microscopia confocale a fluorescenza può essere utilizzata per eliminare artefatti, apoptotic cellule e rumori di fondo, rendendo i calcoli più facile e più accurata.

Sebbene il metodo qui descritto offre molti vantaggi rispetto ad altri approcci, ha alcune limitazioni. Uno di questi è relativo alle diverse condizioni di carico richieste per ciascuna sonda. Per quanto riguarda HPTS, il colorante deve essere preso per pinocitosi. Questa restrizione richiede che le cellule devono essere mantenute per un periodo prolungato di tempo (ad esempio 12 ore) in un mezzo siero-integrato per promuovere pinocitosi e quindi etichettatura del vano endocitosi. Al contrario, cellule permeanti SNARF-1 deve essere incubate in un mezzo privo di siero per evitare la possibilità di acetossimetilico estere (AM) idrolisi da parte delle esterasi non specifiche contenente siero. Queste restrizioni si esclude protocolli sperimentali che richiedono condizioni di coltura cellulare di carico-compatibile. Inoltre, la sensibilità di HPTS per mezzo acido è una limitazione importante. Come mostrato in Figura 2, fintensità luorescence di HPTS eccitati a 458 nM mostrano variazioni minime a pH 6.0 o inferiore, con rapporti stretti ai valori di fondo. Questa proprietà intrinseca di HPTS devono essere presi in considerazione nel caso di studi di compartimenti cellulari molto acidi come lisosomi che hanno valori di pH a partire da 4,0 di 5,0. Tuttavia, a nostra conoscenza, HPTS è l'unico colorante raziometrica disponibile che può essere utilizzato per misurare intraendosomal pH. Ad esempio, il lysosensor colorante comunemente usato saranno principalmente partizione all'interno del compartimento lisosomiale più acida. Il grado di partizione del colorante all'interno del vano endosomal dipenderà valori di pH entro queste vescicole, che è un grave inconveniente quando si misura il pH intravesicular in cellule in cui endosomal pH omeostasi è alterata.

In conclusione, si descrive qui un approccio per misurare simultaneamente pH citosolico e endosomali in cellule singole. Questo è particolarmente importante per lo studio di pH omeostasi nelle cellule where mutazioni o farmaci possono influenzare efflusso ed afflusso di protoni in endosomi.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

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References

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