Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Biology

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Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

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Abstract

Protocol

1. Preparação das soluções de calibração para pH celular

  1. Adicionar os seguintes compostos de cinco tubos cónicos de 50 ml separados para preparar soluções a 5 para ser utilizados para a calibração:
    • De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (NaCl 1 M = 0,58 g em 10 ml de H 2 0)
    • KCl (6,75 ml de 1 M de KCl) (1 M KCl = 0,75 g em 10 ml de H 2 0)
    • Glucose (1 ml de 1 M de D-glicose) (1M de D-Glucose = 1,80 g em 10 ml de H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g em 10 ml de H 2 0)
    • HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1M) (HEPES 1 M = 2,38 g em 10 ml de H 2 0)
    • CaCl2 (0,05 ml de 1M de CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g em 10 ml de H 2 0)
      Prepare todas as soluções em duas vezes destilada H 2 O (DDH 2 O).
  2. Complete cada solução com 35 ml de ddH2O e misturar com um agitador magnético até entãolução é alcançado.
  3. Ajustar o pH de cada solução com 1 N de KOH ou HCl 1 N para se obter os valores de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 e 7,5 de pH. Em seguida, ajustar o volume com água desionizada até um volume final de 50 ml.
  4. Medida 5 mg de nigericina e adicioná-lo ao 670 ul de EtOH absoluto para se preparar uma solução de 10 mM de nigericina estoque.
    Atenção: nigericina é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado (luvas, óculos de segurança e máscara). Misture a solução por inversão até a nigericina esteja completamente dissolvido.
  5. Adicionar 0,05 ml de nigericina 10 mM (concentração final 10 uM) a cada solução de calibração. Nigericina é um ionóforo que aumenta a permeabilidade da membrana da célula e causa de equilíbrio do pH intracelular e extracelular, na presença de uma concentração de despolarização de K + extracelular.
  6. Soluções de calibração podem ser armazenados até 1 mês a 4 ° C

2. Preparação celular

  1. Sob um Safet biológicay capuz, as células de semente de 35 milímetros x 10 milímetros em pratos de cultura de 2 ml de meio de crescimento suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos. Utilizar a quantidade de células necessárias para assegurar cerca de 50% de confluência após 24 hr.
    NOTA: Em nossos experimentos, usamos a linha de células HT-1080 e placa 1 x 10 5 células por placa de cultura.
  2. Determinar o número de pratos de cultura necessárias para a 5 pratos de cultura adicionais experimento e placa a ser usada para a calibração.
  3. Pratos de cultura em lugar de um de 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 24 horas.

3. Preparação de Sondas de pH sensores

  1. Prepare uma solução estoque 1M da sonda fluorescente pH 8 hidroxipireno-1, 3,6 trissulfónico, sal trissódico (HPTS / piranina) em DDH 2 a 0. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e protegida da luz.
  2. Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de 5 - (e-6)-carboxil seminaphthorhodafluor acetoximetil éster de etilo (C-SNARF-01:00; chamado Thereaepois SNARF-1) através da dissolução de 1 mg de SNARF-1 em 1,76 ml de DMSO. Misture bem por pipetagem repetida. SNARF-1 solução deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz.

4. Labeling celular

  1. Dezasseis horas antes de imagem ao vivo de células, adicionar 2 ml de solução de estoque 1M HPTS (concentração final 1 mM) para cada placa de cultura contendo 2 ml de meio completo.
  2. Retorne os pratos de cultura para a incubadora. A sonda HPTS é célula-impermeant, portanto, a etiqueta organelas a sonda deve ser tomada por pinocitose. Esta condição implica que as incubações das células com HPTS são realizadas em meio de cultura suplementado com soro.
  3. Após a incubação com HPTS, lavar as células duas vezes com PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro, durante pelo menos 2 horas. A incubação com SNARF-1 tem de ser realizada em meio isento de soro, porque o soro pode impedir a absorção da sonda.
  4. Adicionam-se 10 ul de uma SNARF-1 de solução stock a 1 mM para se obter afinal concentração de 5 uM e permitir que as células a incubar durante 20 minutos a 37 ° C, sob luz fraca. C-1-SNARF concentração e tempo de incubação pode variar de acordo com o tipo de célula.
  5. No final da incubação, lavar as células duas vezes em PBS estéril e adicionar 2 ml de meio isento de soro.

5. Adição de pH moduladores

  1. Para avaliar se o método pode detectar alterações de pH nas células, diferentes reagentes que modulam o pH intracelular pode ser usado:
    • Bafilomicina A1, um inibidor específico da V-ATPase 5
    • Isoforma permutador Na + / H + 1 (NHE-1) 6
    • NH4Cl, uma base fraca que aumenta o pH intracelular 7
    1. Preparar soluções estoque de reagentes mencionados acima:
      • Bafilomicina A1: acrescentar 10 ug de bafilomicina A1 a 160 ul de DMSO para se obter uma solução stock de 100 uM
      • EIPA: adicionar 25 mg de EIPA para 1,67 ml de metanol a obtina concentração final de 50 mM
      • NH4Cl: dissolver 0,53 g de cloreto de amónio em 10 ml de ddH2O para obter uma concentração final de 1 mM.

      Nota: Todas as soluções de reserva deve ser mantida a 4 ° C, excepto para bafilomicina A1, que deve ser armazenada a -20 ° C e protegida da luz.
    2. Em pratos de cultura separados, adicionar um dos reagentes, tal como descrito abaixo:
      • 2 ul de 100 uM bafilomicina A1 (concentração final 100 nM)
      • 1 ul de EIPA 50 mM (concentração final 25 uM)
      • 40 ul de 1M de NH 4 Cl (concentração final 20 mM)
    3. Incubar as células durante 30 min a 37 ° C.
  2. Vá para a aquisição de imagem.

6. Especificações do Microscópio de imagem de células vivas e configurações de aquisição

  1. Realize imagens ao vivo de células usando uma objetiva de 40X montado em um invertido digitalização microscopia confocal espectralpe equipado com um estágio XY motorizada, uma câmara de vidro que acomoda placas de cultura de fundo em um ambiente controlado (temperatura, umidade, CO 2) fase incubadora.
  2. O instrumento confocal (Olympus FV1000) usada aqui está equipado com:
    • Um laser de diodo 405 nm
    • Um laser de argônio de 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Um laser neon hélio (543 nm)
    • Objetivo de fluorita de 10x, NA0.4
    • Um objectivo LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • Um objectivo óleo PLAPONSC PLANO APO 60X, NA1.4
    • Um espelho dicróico 405/458/488/543 DM
    • A SDM 560 e um SDM 640 filtros dicróicas
    • Um filtro de barreira BA655-755
    • A BS20/80 divisor de feixe
    • O software de análise de dados para a aquisição e análise de imagem,
  3. Uma vez que a incubadora estágio tem aquecido até 37 ° C e o microscópio está configurado, coloque um prato de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1 para a câmara de estágio imagem confocal.
  4. Aepois de localizar uma área de interesse, ajuste as configurações de aquisição de software Figura 1.
    • Configure dois conjuntos de canais virtuais.
    • Iniciar a primeira fase que corresponde ao HPTS excitação a 405 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 570-600 nm.
    • Inicie a segunda fase que corresponde ao HPTS excitação em 458 nm e coleta de emissão em 505-525 nm e SNARF-1 de excitação em 543 nm e coleta de emissão em 640 - 650 nm.
    • A abertura confocal está definido para 175 um por padrão e abertura ideal precisa ser configurado manualmente em 300 mm.
    • Tome Imagem por empilhamento de série secções ópticas horizontais (800 x 800 pixels) de 0,4 m de espessura.

NOTA: uma objetiva de 40X é útil para observar várias células simultaneamente e funciona bem para a visão organela. No entanto, a resolução espacial e intensidade do sinal são better conseguido usando uma objetiva de óleo 60X. Além disso, não há excitação ou de emissão de conversa cruzada entre os dois corantes.

7. Calibração de Sondas de pH de sensoriamento

  1. Antes da calibração, remover o meio da placa de cultura previamente incubadas com HPTS e SNARF-1, lavar duas vezes com PBS estéril e, em seguida, adicionar 2 ml de uma das cinco soluções de calibração.
  2. Coloque o prato de cultura na câmara de estágio confocal.
  3. Vá para a aquisição de imagens de lapso de tempo de acordo com as seguintes definições:
    1. Defina o número de imagens e tempo de duração do intervalo para o experimento.
      NOTA: Normalmente usamos um intervalo de 1 min entre as imagens por até 30 min.
    2. Programe o obturador para fechar entre a aquisição de cada imagem.
  4. Gravar a intensidade de fluorescência por minuto em um software de folha de cálculo e de determinar o momento em que a intensidade de fluorescência é constante. PH intracelular é geralmente estável depois de 15 - 20 min.
  5. REPEAT os passos 7.1 a 7.4 usando um novo prato de cultura para cada solução de calibração restante.

8. Aquisição de Dados

  1. Uma vez que a calibração foi feito, adquirir dados de amostra 4-5 campos escolhidos aleatoriamente contendo 15-20 células por campo. Duas imagens são obtidas para cada campo: um para rotulagem HPTS (vesículas) e o segundo para SNARF-1 rotulagem (citosol).
  2. A fluorescência de fundo (zona extracelular) é subtraído digitalmente imagens fluorescentes de ambas as sondas. Vesículas rotulados e citosol de suas respectivas imagens armazenadas são selecionados usando uma máscara binária. Para cada sonda de pH-sensing, intensidades de fluorescência são medidos em uma escala numérica (0-4,095 escala de nível de cinza). A intensidade média de todos os pixels na organelo ou citoplasma é calculada e os valores são utilizados para calcular os rácios de fluorescência.

9. Data Analysis

  1. Vários pacotes de software estão comercialmente disponíveis para a análise de dados. IstoSoftware FluoView.
  2. Em uma planilha, valores de registro e calcular índices de fluorescência da seguinte forma: No caso de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) e, no caso de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Plotar os dados usando o software de gráficos científica como GraphPad Prism. A trama deve representar proporções de fluorescência (eixo Y) como uma função do pH (eixo X). Ajuste de curva é obtida por meio de regressão não-linear.
  4. Recolhe intensidades de fluorescência das amostras, conforme descrito no passo 8.2 e calcular rácios de fluorescência. Use as curvas de calibração para transformar proporções em valores de pH.

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Representative Results

Para a medição simultânea de pH em ambos os compartimentos da célula intracelular e endossomal / lisossomal, foram usadas as sondas de pH de detecção fluorescente raciométrica Snarf-1 e HPTS. SNARF-1 é restrita ao compartimento citosólico enquanto HPTS permite a medição de o compartimento endossomal / lisossomal raciométrica pH. Carregamento celular com HPTS para 16 horas permite a sua localização seletiva em endossomas / 4 lisossomos. Um exemplo típico de fluorescência registada a partir de células HT-1080 carregados com as sondas de pH de detecção é mostrado na Figura 2A. A evidência de que tanto HPTS etiquetas endossomais e lisossomais compartimentos foi obtido por co-coloração com Alexa 546 transferrina conjugada (endossomas) ou uma sonda fluorescente lysotrophic (Lyso Tracker profundo Reddye). Os dados demonstram claramente que ambos os compartimentos HPTS coradas Figura 2A.

Utilizando a metodologia descrita acima, os valores de pH intracelular em células vivas foram determinadas usandouma curva de calibração para cada sonda Figuras 2B e 2C, com base nas propriedades de medida proporcional de cada corante sensível ao pH. As cinco soluções de calibração foram utilizados para converter intensidades de fluorescência em unidades de pH. Dados de três calibrações independentes são relatados para cada pH de detecção Figura sonda 2C. Cada ponto de dados representa uma proporção de intensidade de fluorescência a comprimentos de onda de excitação de 458/405 nm para HPTS ou comprimentos de onda de emissão de 644/584 nm para SNARF-1 a um dado pH. As curvas de calibração para ambas as sondas mostraram uma relação não-linear, que foi melhor equipado com uma equação exponencial Figura 2C. A eficiência do método para a detecção de alterações de pH associadas ao compartimento celular foi avaliada nas células HT-1080 vivo usando NH 4 Cl, uma base fraca que aumenta o pH intracelular, bafilomicina A1, um inibidor farmacológico da V-ATPase e EIPA, um NHE um inibidor. NH 4 Cl desencadeada intravesicular e citopH aumenta Solic 6,35-7,10 e 7,00-7,40, respectivamente Figuras 3A e 3B. Bafilomicina A1 induzido alcalinização dos endossomais e lisossomais compartimentos sem alterar o pH citosólico. Em contraste, EIPA induzida acidificação do citosol para atingir o valor de 6,62, em comparação com pH 7,00 em células não tratadas Figuras 3A e 3B.

Figura 1
Figura 1. Diagramas de configurações de aquisição para o microscópio confocal de varredura a laser. (A) A primeira fase é definida para excitar HPTS a 405 nm e SNARF-1 a 543 nm, simultaneamente, através de um espelho dicróico (DM405/488/543/633). Emissão de fluorescência é registrado pela primeira vez para HPTS em 505-525 nm, utilizando um espelho dicróico (SDM560). Emissão de fluorescência de SNARF-1 é, em seguida, monitorizada por meio de um bandpass filtro de interferência na faixa de 570-600 nm. (B) A segunda fase é configurada para recolher simultaneamente a fluorescência de emissão de HPTS (exc, 458 nm) e SNARF-1 (iva, 543 nm). Sonda excitação gerada pelo feixe de laser passa através de um divisor de feixe (BS20/80) e emissão de fluorescência para cada sonda é coletado através dos espelhos dicróicas utilizadas na primeira fase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Em calibração in situ de sondas de detecção de pH. (A) Imagens representativas de HPTS e SNARF-1 sub-celular localização no HT-1080 células de fibrossarcoma. Imagens superiores mostram que SNARF-1 rotula o citoplasma enquanto HPTFluorescência S-associado é mostrada a localização intravesicular. As células HT-1080 foram incubadas durante 30 min com Alexa 546-conjugado de transferrina (5 ug / ml) ou um corante lysotrophic (Lyso Tracker profundo Reddye) (100 nM), respectivamente. Imagens inferiores mostram que HPTS colocalizes com transferrina e o corante lysotrophic (60X). (B) Imagens representativas de ambas as sondas de pH de detecção em células incubadas durante 15 minutos com as soluções de calibração, a pH 6,0 e pH 7,5. (C) Relação da intensidade de fluorescência relações para HPTS e SNARF-1 determinados utilizando as soluções de calibração em função do pH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Modulação de i ntracellular pH por bafilomicina A1, EIPA e NH 4 Cl. inibidores farmacológicos (bafilomicina A1, EIPA) e modulador pH intracelular NH4Cl foram utilizados para validar a metodologia. Os gráficos mostram os valores de pH registados no compartimento endossomal / lisossomal (A) ou o citoplasma (B) de células HT-1080 carregados com HPTS e SNARF-1 e incubadas durante 30 min na presença ou ausência (controlo) de NH 4 Cl ( 20 mM), EIPA (25 uM) ou bafilomicina A1 (100 nM). Os dados estão representados como a média ± SEM (** p 0,005, *** p = 0,0001).

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Discussion

Medição de pH quantitativa em imagens ao vivo de células de diferentes compartimentos celulares é necessário para medir com precisão as variações de pH em respostas das células aos desafios externos. No entanto, um dos principais obstáculos que resta é fácil e visam especificamente compartimentos celulares. A este respeito, alguns estudos puseram em evidência o uso de HPTS como um indicador de pH intracelular introduzido nas células por electroporação ou microinjecção 8-10. Estas técnicas sofrem de graves inconvenientes, nomeadamente eletroporação causa danos extensos para as células, e microinjeção requer equipamento especial e habilidades técnicas. De interesse, Hinton et al., Relataram anteriormente que HPTS pode ser absorvida pelas células através de um processo de pinocitose, e que a combinação de SNARF-1 e HPTS pode ser utilizado para monitorar o pH do citosol e endossomal / compartimentos lisossomais 3 . Nós usamos essa propriedade para registrar as variações de pH na compartm lisossômico / endosomalent de células HT-1080 ao vivo. A prova de que HPTS foi localizado nesse compartimento e, portanto, pode servir como um indicador de pH fiável foi obtida por co-coloração com transferrina conjugada com fluoróforo, um marcador de o compartimento lisossomal / endossomal, ou com um corante acidófilas que rotula principalmente lisosomas figura 2. Além disso, o uso de diferentes moduladores de pH intracelulares segmentação compartimentos celulares diferentes indicaram que a bafilomicina A1 aumentou especificamente pH intravesicular, sem alteração do pH citoplasmático. Em contraste, EIPA alterada principalmente citosólica de pH, mas teve pouco ou nenhum efeito sobre o pH lisossomal endossomal e cloreto de amónio enquanto afectada pH de ambos os compartimentos. Estes resultados forneceram a evidência que SNARF-1 e HPTS poderia ser utilizado para monitorar as alterações de pH ao mesmo tempo nestes dois compartimentos celulares diferentes.

Uma característica importante do método descrito aqui é o uso de microscopia confocal de varrimento laser. Mais estudos reported na literatura sobre medições de pH intracelulares ter sido feito por espectrofluorometria. Embora seja fácil de usar e proporcionando a aquisição de dados rápida, esta abordagem não permite a observação de células durante a experiência. Este inconveniente pode tornar-se de importância, uma vez que tem sido a nossa experiência, que durante a fase de calibração, incubação prorrogado nos termos do ácido (pH 5,5) ou alcalino (pH 8,0) condições podem afetar negativamente vários tipos de células e desencadear a apoptose. No caso das células HT-1080, a apoptose conduz a autofluorescência vermelho, interferindo assim com a fluorescência do SNARF-1 (dados não mostrados) dependente do pH. Para contornar esse problema, nós usamos uma placa de cultura separada para cada calibração e experimentos descartados onde foram observados sinais de apoptose ou outras alterações celulares. O uso de um microscópio confocal para medições de pH, também torna mais fácil a análise de dados. Por exemplo, a análise de imagens de microscopia confocal de fluorescência pode ser utilizado para descartar artefactos, apoptotic células e ruído de fundo, fazer cálculos mais fácil e mais preciso.

Embora o método descrito aqui oferece muitas vantagens sobre outros métodos, tem algumas limitações. Um deles está relacionado com as diferentes condições de carga requeridos para cada sonda. No que diz respeito ao HPTS, o corante tem de ser feita até por pinocitose. Esta restrição requer que as células devem ser mantidas durante um período de tempo prolongado (por exemplo, 12 horas) em meio suplementado com soro para promover a pinocitose e, assim, a rotulagem do compartimento endocítica. Em contraste, a célula-permeante SNARF-1 tem de ser incubadas num meio livre de soro, para evitar a possibilidade de éster acetoximetílico (PM) de hidrólise por esterases não específicas com soro. Estas restrições excluirá protocolos experimentais que requerem condições de cultura de células de carga-incompatíveis. Além disso, a sensibilidade de HPTS para meio ácido é uma limitação importante. Como mostrado na Figura 2, fintensidades luorescence de HPTS animado com 458 nM mostram uma variação mínima em pH 6,0 ou inferior, com relações estreitas com os valores de fundo. Esta propriedade intrínseca de HPTS deve ser tida em conta no caso de estudos de compartimentos celulares muito ácidas, tais como lisossomas, que têm valores de pH tão baixos como 4,0 a 5,0. No entanto, para o nosso conhecimento, HPTS é o único corante raciométrica disponível que pode ser usada para medir intraendosomal pH. Por exemplo, o corante lysosensor utilizada será principalmente divisória no interior do compartimento lisossomal mais ácida. A extensão de partição deste corante no interior do compartimento endossomal dependerá valores de pH dentro destas vesículas, que é uma grande desvantagem quando se mede o pH intravesicular em células onde a homeostase endossomal pH é alterado.

Em conclusão, nós descrevemos aqui uma abordagem para medir simultaneamente os valores de pH e citosólicas endossomais em células individuais. Isto é especialmente importante para o estudo da homeostase do pH em células where mutações ou drogas podem afetar o efluxo e influxo de prótons em endosomes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

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References

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