Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Biology

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Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

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Abstract

Protocol

1. Préparation des solutions pour cellulaire pH Calibration

  1. Ajouter les composés suivants à cinq tubes de 50 ml coniques distincts 5 pour préparer des solutions à utiliser pour l'étalonnage:
    • De NaCl (1 ml de NaCl 1 M) (1 M NaCl = 0,58 g dans 10 ml H 2 0)
    • KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g dans 10 ml H 2 0)
    • Glucose (1 ml de 1 M de D-glucose) (1M D-Glucose = 1,80 g dans 10 ml H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g dans 10 ml H 2 0)
    • HEPES 20 mM (1 ml d'HEPES 1M) (1 M HEPES = 2,38 g dans 10 ml H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 ml de CaCl2 1 M) (1 M CaCl2 = 1,47 g dans 10 ml H 2 0)
      Préparer toutes les solutions double distillée H 2 O (le trou DDH 2 O).
  2. Remplissez chaque solution avec 35 ml de ddH 2 O et mélanger avec un agitateur magnétique jusqu'à sortelution est atteint.
  3. Ajuster le pH de chaque solution de KOH 1 N ou HCl 1 N pour obtenir des valeurs de pH de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 et 7,5. Ensuite, régler le volume avec de l'eau déminéralisée à un volume final de 50 ml.
  4. Mesure 5 mg de nigéricine et l'ajouter à 670 pi d'EtOH absolu pour préparer un 10 mM nigéricine solution stock.
    Attention: nigéricine est très toxique et doit être manipulé avec grand soin (gants, lunettes de protection et masque). Mélanger la solution par inversion jusqu'à la nigéricine est complètement dissous.
  5. Ajouter 0,05 ml de 10 mM de nigéricine (concentration finale de 10 pM) à chaque solution d'étalonnage. Nigéricine est un ionophore qui augmente la perméabilité de la membrane cellulaire et provoque l'équilibration du pH intracellulaire et extracellulaire en présence d'une concentration de dépolarisation de K + extracellulaire.
  6. Les solutions d'étalonnage peuvent être stockés jusqu'à 1 mois à 4 ° C

2. Préparation des cellules

  1. En vertu d'un Safet biologiquey capot, des cellules de semences en 35 mm x boîtes de culture de 10 mm dans 2 ml de milieu de croissance supplémenté par 10% de sérum et d'antibiotiques de veau fœtal. Utiliser la quantité de cellules nécessaire pour assurer environ 50% de confluence après 24 h.
    NOTE: Dans nos expériences, nous utilisons la lignée cellulaire HT-1080 et la plaque 1 x 10 5 cellules par boîte de culture.
  2. Déterminer le nombre de boîtes de culture nécessaires pour l'expérience et la plaque 5 boîtes de culture supplémentaires qui seront utilisés pour l'étalonnage.
  3. Plats place de la culture dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 24 heures.

3. Préparation des sondes de détection de pH

  1. Préparer une solution stock de 1M de la sonde de pH fluorescent 8 hydroxypyrène-1, 3,6 trisulfonique, sel trisodique (HHP / pyranine) dans le trou DDH 2 0. Cette solution doit être conservé à température ambiante et protégé de la lumière.
  2. Préparer une solution stock de 1 mM 5 - (et 6)-carboxy seminaphthorhodafluor acétoxyméthylique ester acétate (C-SNARF-une heures; appelé Thereafter SNARF-1) en dissolvant 1 mg de SNARF-1 dans 1,76 ml de DMSO. Bien mélanger par pipetage répété. SNARF-1 solution doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière.

4. Portable étiquetage

  1. Seize heures avant imagerie des cellules vivantes, ajouter 2 pi de 1M HPTS solution stock (concentration finale 1 mM) à chaque boîte de culture contenant 2 ml de milieu complet.
  2. Retour des boîtes de culture à l'incubateur. La sonde est HPTS cellulaire imperméant, donc étiquette organites la sonde doit être prise par pinocytose. Cette condition exige que les incubations de cellules avec HPTS sont effectuées dans un milieu de culture additionné de sérum.
  3. Après incubation avec HPTS, laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu exempt de sérum pendant au moins 2 heures. L'incubation avec SNARF-1 doit être effectuée dans un milieu sans sérum, car le sérum peut empêcher l'absorption de la sonde.
  4. Ajouter 10 ul d'une SNARF-1 solution 1 mM pour obtenir afconcentration inal de 5 uM et permettent aux cellules incuber pendant 20 min à 37 ° C, sous une lumière faible. C-SNARF-1 et de concentration temps d'incubation peuvent varier en fonction du type de cellule.
  5. A la fin de l'incubation, laver les cellules deux fois dans du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu sans sérum.

5. Ajout de pH modulateurs

  1. Pour évaluer si la méthode peut détecter des changements de pH dans les cellules, les différents réactifs qui modulent le pH intracellulaire peuvent être utilisés:
    • Bafilomycine A1, un inhibiteur spécifique de la V-ATPase 5
    • Na + / H + échangeur isoforme 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, une base faible qui augmente le pH intracellulaire 7
    1. Préparer des solutions de des réactifs mentionnés ci-dessus:
      • Bafilomycine A1: ajouter 10 pg de bafilomycine A1 160 ul de DMSO pour obtenir une solution stock de 100 um
      • IEAP: ajouter 25 mg de l'IEAP à 1,67 ml de méthanol à obtena concentration finale de 50 mM
      • NH 4 Cl: dissoudre 0,53 g de chlorure d'ammonium dans 10 ml de trou DDH 2 O pour obtenir une concentration finale de 1 mM.

      Remarque: Toutes les solutions mères doivent être conservés à 4 ° C sauf pour bafilomycine A1 qui doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière.
    2. Dans des cultures distinctes, ajouter l'un des réactifs tels que décrits ci-dessous:
      • 2 pl de 100 uM bafilomycine A1 (concentration finale de 100 nM)
      • 1 pl de l'IEAP 50 mM (concentration finale de 25 uM)
      • 40 pl de 1 M de NH 4 Cl (concentration finale 20 mM)
    3. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
  2. Procéder à l'acquisition de l'image.

6. Spécifications du microscope d'imagerie des cellules vivantes et des paramètres d'acquisition

  1. Effectuer imagerie des cellules vivantes en utilisant un objectif 40x monté sur un balayage inversé microsco confocale spectralepe équipé d'une platine XY motorisée, une chambre pouvant accueillir des plats de verre de la culture de fond dans un (température, humidité, CO 2) incubateur à environnement contrôlé de phase.
  2. L'instrument confocal (Olympus FV1000) utilisé ici est équipé de:
    • Un laser à diode de 405 nm
    • A 40 mW laser argon (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Un laser hélium néon (543 nm)
    • Objectif fluorite 10X, NA0.4
    • Un objectif LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • Un objectif de l'huile PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4
    • Un miroir dichroïque DM 405/458/488/543
    • Un SDM 560 et un SDM 640 filtres dichroïques
    • Un filtre de barrière BA655-755
    • Un BS20/80 de diviseur de faisceau
    • logiciel d'analyse de données pour l'acquisition et l'analyse d'images,
  3. Une fois l'incubateur d'étape a réchauffé à 37 ° C et le microscope est mis en place, placer une boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1 dans la chambre d'imagerie confocale stade.
  4. Après avoir localiser une zone d'intérêt, régler les paramètres d'acquisition de logiciels Figure 1.
    • Mettre en place deux ensembles de canaux virtuels.
    • Initier la première phase qui correspond à HPTS excitation à 405 nm et la collecte d'émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d'émission à 570-600 nm.
    • Lancer la deuxième phase qui correspond à HPTS excitation à 458 nm et la collecte d'émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d'émission à 640-650 nm.
    • L'ouverture confocale est fixé à 175 um par défaut et l'ouverture optimale doit être réglé manuellement à 300 um.
    • Prenez l'image par l'empilement des sections optiques horizontales série (800 x 800 pixels) de 0,4 um d'épaisseur.

NOTE: Un objectif 40X est utile d'observer plusieurs cellules simultanément et fonctionne bien pour organite visualisation. Cependant, la résolution spatiale et de l'intensité du signal sont better obtenue en utilisant un objectif 60x huile. En outre, il n'y a pas d'excitation ou d'émission de la diaphonie entre les deux colorants.

7. Étalonnage de sondes pH-détection

  1. Avant l'étalonnage, éliminer le milieu de la boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1, laver deux fois avec du PBS stérile, puis ajouter 2 ml d'une des solutions d'étalonnage cinq.
  2. Placez la boîte de culture dans la chambre de stade confocale.
  3. Procéder à une acquisition d'image temps-lapse selon les paramètres suivants:
    1. Définissez le nombre d'images et de durées d'intervalle pour l'expérience.
      NOTE: Nous utilisons généralement un intervalle de 1 min entre les images pour un maximum de 30 minutes.
    2. Programmer le déclencheur pour fermer entre l'acquisition de chaque image.
  4. Enregistrer l'intensité de fluorescence par minute dans un logiciel de feuille de calcul et de déterminer le moment où l'intensité de fluorescence est stable. PH intracellulaire est généralement stable après le 15 - 20 min.
  5. REPEAT les étapes 7.1 à 7.4 en utilisant une nouvelle boîte de culture pour chaque solution d'étalonnage restant.

8. D'acquisition de données

  1. Une fois le calibrage a été fait, l'acquisition de données de l'échantillon 4-5 champs choisis au hasard contenant 15-20 cellules par champ. Deux images sont obtenues pour chaque domaine: l'un pour l'étiquetage HPTS (vésicules) et le second pour SNARF-1 étiquetage (cytosol).
  2. Fluorescence de fond (zone extracellulaire) est numériquement soustrait des images fluorescentes de deux sondes. Vésicules marquées et cytosol de leurs images stockées respectives sont sélectionnés à l'aide d'un masque binaire. Pour chaque sonde pH-détection, les intensités de fluorescence sont mesurées sur une échelle numérique (0-4,095 échelle de niveaux de gris). Une intensité moyenne de tous les pixels dans le cytoplasme ou organelle est calculée et les valeurs sont utilisées pour calculer les rapports de fluorescence.

9. Analyse des données

  1. Divers logiciels sont disponibles dans le commerce pour l'analyse des données. DireFluoview logiciel.
  2. Dans une feuille de calcul, valeurs de l'enregistrement et le calcul des ratios de fluorescence comme suit: Dans le cas de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) et, dans le cas de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Tracer les données en utilisant un logiciel graphique scientifique comme GraphPad Prism. La parcelle doit présenter des ratios de fluorescence (axe Y) en fonction du pH (axe X). d'ajustement de courbe est réalisé en utilisant une régression non linéaire.
  4. Recueillir les intensités de fluorescence des échantillons de la manière décrite dans l'étape 8.2 et de calculer les rapports de fluorescence. Utilisation des courbes d'étalonnage pour transformer en ratios des valeurs de pH.

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Representative Results

Pour la mesure simultanée du pH intracellulaire dans les deux compartiments de la cellule et endosomal / lysosomal, les sondes fluorescentes pH détection ratiométrique SNARF-1 et HPTS ont été utilisés. SNARF-1 est limitée au compartiment cytosolique tandis HPTS permet la mesure ratiométrique de pH du compartiment endosomal / lysosomal. Cellule de chargement avec HPTS pour 16 heures permet sa localisation sélective dans les endosomes / lysosomes 4. Un exemple typique de fluorescence enregistrée à partir de cellules HT-1080 chargées avec les sondes de détection de pH est représentée sur la figure 2A. Preuve que HPTS étiquettes fois endosomes et lysosomes compartiments a été obtenue par co-coloration avec Alexa transferrine 546 conjugué (endosomes) ou une sonde fluorescente lysotrophic (Lysotracker profonde Reddye). Les données ont montré clairement que HPTS taché deux compartiments Figure 2A.

En utilisant la méthodologie décrite ci-dessus, les valeurs de pH intracellulaire dans les cellules vivantes ont été déterminés parune courbe d'étalonnage pour chacune des sondes Figures 2B et 2C, en fonction des propriétés de chaque ratiométriques colorant sensible au pH. Les cinq solutions d'étalonnage ont été utilisés pour convertir les intensités de fluorescence en unités de pH. Les données de trois étalonnages indépendants sont présentés pour chaque pH-sonde de détection figure 2C. Chaque point de données représente un rapport d'intensité de fluorescence à des longueurs d'onde d'excitation de 458/405 nm pour HPTS ou des longueurs d'onde d'émission de 644/584 nm pour le SNARF-1 à un pH donné. Les courbes d'étalonnage pour les deux sondes ont montré une relation non linéaire qui a été le mieux équipé d'une équation exponentielle Figure 2C. L'efficacité de la méthode pour détecter les changements de pH du compartiment associée cellulaires a été évaluée dans des cellules HT-1080 en direct à l'aide de NH 4 Cl, une base faible qui augmente le pH intracellulaire, la bafilomycine A1, un inhibiteur pharmacologique de la V-ATPase et IEAP, un NHE- 1 inhibiteur. NH 4 Cl déclenché intravésiculaire et cytopH Šolić augmente de 6,35 à 7,10 et de 7,00 à 7,40, respectivement figures 3A et 3B. Bafilomycine A1 induit une alcalinisation des endosomes et lysosomes compartiments sans altérer cytosolique pH. En revanche, l'IEAP induite acidification du cytosol pour atteindre une valeur de pH de 6,62 à 7,00 par rapport à des cellules non traitées figures 3A et 3B.

Figure 1
Figure 1. Diagrammes de paramètres d'acquisition pour le confocal à balayage laser microscope. (A) La première phase est réglé pour exciter HPTS à 405 nm et SNARF-1 à 543 nm simultanément à travers une dichroïque (DM405/488/543/633) miroir. L'émission de fluorescence est d'abord enregistré pour HPTS à 505-525 nm en utilisant un miroir dichroïque (SDM560). L'émission de fluorescence de SNARF-1 est ensuite contrôlée par un bandpass filtre d'interférence dans la gamme de 570-600 nm. (B) La deuxième phase est de recueillir simultanément l'émission de fluorescence de HHP (HT, 458 nm) et SNARF-1 (HT, 543 nm). excitation de la sonde générée par le faisceau laser passe à travers un diviseur de faisceau (BS20/80) et l'émission de fluorescence pour chaque sonde sont collectées par les miroirs dichroïques utilisés dans la première phase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Lors de la calibration in situ de sondes de détection du pH. (A) Des images représentatives de HPTS et SNARF-1 localisation sous-cellulaire dans des cellules HT-1080 de fibrosarcome. Images supérieures montrent que SNARF-1 étiquette le cytoplasme alors que HPTS-fluorescence associée montre la localisation intravésiculaire. cellules HT-1080 ont été incubées pendant 30 min avec Alexa 546-conjugué transferrine (5 ug / ml) ou un colorant lysotrophic (Lysotracker profonde Reddye) (100 nM), respectivement. Images du bas montrent que HHP colocalise avec la transferrine et le colorant lysotrophic (60X). (B) images représentatives des deux sondes pH-sensibles dans des cellules incubées pendant 15 minutes avec des solutions d'étalonnage à pH 6,0 et pH 7,5. (C) Relations de l'intensité de fluorescence rapports pour HPTS et SNARF-1 déterminées en utilisant des solutions d'étalonnage en fonction du pH. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Modulation de i ntracellular pH par bafilomycine A1, l'IEAP et NH 4 Cl. inhibiteurs pharmacologiques (bafilomycine A1, l'IEAP) et le pH intracellulaire modulateur NH 4 Cl ont été utilisés pour valider la méthodologie. Les graphiques montrent les valeurs de pH enregistrées dans le compartiment endosomal / lysosomal (A) ou le cytoplasme (B) des cellules HT-1080 chargés de HPTS et SNARF-1 et incubées pendant 30 min en présence ou en l'absence (témoin) de NH 4 Cl ( 20 mM), l'IEAP (25 M) ou bafilomycine A1 (100 nM). Les données sont représentées sous forme de moyenne + SEM (** p 0,005, p *** 0,0001).

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Discussion

Mesure du pH quantitative en imagerie des cellules vivantes de différents compartiments cellulaires est nécessaire de mesurer avec précision les variations de pH dans les réponses cellulaires aux défis extérieurs. Cependant, l'un des principaux obstacles qui reste est de cibler facilement et précisément compartiments cellulaires. A cet égard, un certain nombre d'études ont mis en évidence l'utilisation de HPTS comme indicateur de pH intracellulaire introduit dans les cellules par électroporation ou micro-injection 8-10. Ces techniques présentent des inconvénients graves, à savoir l'électroporation provoque des dommages importants aux cellules, et la micro-injection nécessite un équipement spécial et des compétences techniques. D'un intérêt, Hinton et al. Ont précédemment rapporté que HPTS peut être absorbé par les cellules par un processus de pinocytose et que la combinaison du SNARF-1 et HPTS peut être utilisé pour contrôler le pH du cytosol et endosomal / lysosomal trois compartiments . Nous avons utilisé cette propriété pour enregistrer les variations de pH dans le compartm lysosomale / endosomalent de cellules vivantes HT-1080. La preuve que HPTS était située dans ce compartiment et, par conséquent, pourrait servir d'indicateur de pH est fiable a été obtenue par co-coloration avec un fluorophore conjugué transferrine, un marqueur du compartiment lysosomal / endosomal, ou avec un colorant acidophile que les étiquettes surtout lysosomes Figure 2. En outre, l'utilisation des différents modulateurs de pH intracellulaires ciblant compartiments cellulaires distincts indique que la bafilomycine A1 spécifiquement augmentée sans modifier le pH intravésiculaire pH cytoplasmique. En revanche, l'IEAP principalement modifié cytosolique pH mais a eu peu ou pas d'effet sur endosomes et lysosomes pH tandis que le chlorure d'ammonium pH des deux compartiments touchés. Ces résultats ont fourni des preuves que SNARF-1 et HPTS pourraient être utilisés pour contrôler simultanément les changements de pH dans ces deux compartiments cellulaires différents.

Une caractéristique importante de la méthode décrite ici est l'utilisation de la microscopie confocale à balayage laser. La plupart des études reported dans la littérature sur les mesures de pH intracellulaire ont été fait par spectrofluorimétrie. Bien que facile à utiliser et offrant acquisition rapide de données, cette approche ne permet pas l'observation des cellules au cours de l'expérience. Cet inconvénient peut devenir d'importance car il a été notre expérience que lors de l'étape de calibration, l'incubation prolongée dans des conditions acides (pH 5,5) ou alcalin (pH 8,0) conditions peut affecter divers types de cellules et déclencher l'apoptose. Dans le cas des cellules HT-1080, conduit à l'apoptose autofluorescence rouge, interférant ainsi avec la fluorescence dépendant du pH du SNARF-1 (données non présentées). Pour contourner ce problème, nous avons utilisé une boîte de culture distincte pour chaque étalonnage et expériences rebut où ont été observés des signes d'apoptose ou autres altérations cellulaires. L'utilisation du microscope confocal pour des mesures de pH rend également plus facile l'analyse des données. Par exemple, l'analyse des images confocales de microscopie par fluorescence peut être utilisé pour écarter les artefacts, apoptotic cellules et le bruit de fond, faire des calculs plus facile et plus précis.

Bien que le procédé décrit ici offre de nombreux avantages par rapport à d'autres approches, il a quelques limitations. L'un d'eux est lié aux différentes conditions de chargement pour chaque sonde. En ce qui concerne HPTS, le colorant doit être repris par pinocytose. Cette restriction exige que les cellules doivent être maintenues pendant une longue période de temps (par exemple 12 h) dans un milieu additionné de sérum pour favoriser de ce fait la pinocytose et l'étiquetage du compartiment endocytique. En revanche, les cellules infiltrant les SNARF-1 doit être incubés dans un milieu exempt de sérum pour éviter la possibilité d'acétoxyméthyl ester (AM) l'hydrolyse par des estérases non spécifiques contenant du sérum. Ces restrictions excluent protocoles expérimentaux qui requièrent des conditions de culture de cellules de chargement-incompatible. En outre, la sensibilité de HPTS à milieu acide est une limitation importante. Comme le montre la figure 2, fintensités de luorescence de HPTS excités à 458 nM montrent une variation minimale à pH 6,0 ou inférieure, avec des ratios proches des valeurs de fond. Cette propriété intrinsèque de HPTS doivent être prises en compte dans le cas d'études de compartiments cellulaires très acides tels que les lysosomes qui ont des valeurs aussi faibles que 4,0 à 5,0 de pH. Cependant, à notre connaissance, HPTS est le seul colorant ratiométrique disponible qui peut être utilisé pour mesurer intraendosomales pH. Par exemple, le colorant lysosensor couramment utilisée sera la plupart du temps la partition dans le compartiment lysosomal plus acide. L'étendue de la partition de ce colorant dans le compartiment endosomal dépendra des valeurs de pH à l'intérieur de ces vésicules, ce qui est un inconvénient majeur lorsque l'on mesure le pH intravésiculaire dans les cellules où le pH endosomal homéostasie est altéré.

En conclusion, nous décrivons ici une approche pour mesurer simultanément cytosoliques et endosomes valeurs de pH dans des cellules individuelles. Ceci est particulièrement important pour l'étude du pH dans l'homéostasie des cellules whermutations e ou médicaments peuvent affecter l'efflux et l'afflux de protons dans les endosomes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

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References

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