Samtidig måling av pH i endocytic og cytosoliske avdelinger i levende celler ved hjelp konfokalmikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

En. Utarbeidelse av løsninger for Cellular pH Calibration

  1. Legg de følgende forbindelser i fem separate 50 ml koniske rør for å forberede 5 løsninger som skal brukes for kalibrering:
    • NaCl (1 ml av 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g i 10 ml H 2 0)
    • KCl (6,75 ml av 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g i 10 ml H 2 0)
    • Glukose (1 ml av 1 M D-glukose) (1 M D-glukose = 1,80 g i 10 ml H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml av 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g i 10 ml H 2 0)
    • 20 mM HEPES (1 ml av 1M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g i 10 ml H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 ml av 1M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g i 10 ml H 2 0)
      Forbered alle løsninger i dobbelt destillert H 2 O (DDH 2 O).
  2. Komplett hvert løsning med 35 ml av DDH 2 O og bland med en magnetrører til sårensning er oppnådd.
  3. Juster pH i hver løsning med 1 N KOH og HC1 for å oppnå pH-verdier på 5,5, 6,0, 6.5, 7.0 og 7.5. Deretter justere volumet med avionisert vann til et sluttvolum på 50 ml.
  4. Mål 5 mg nigericin og legge den til 670 mL av absolutt EtOH å forberede en 10 mM nigericin stamløsning.
    Forsiktig: nigericin er svært giftig og må håndteres med stor forsiktighet (hansker, vernebriller og maske). Bland løsningen ved inversjon inntil nigericin er fullstendig oppløst.
  5. Til 0,05 ml 10 mM nigericin (endelig konsentrasjon 10 uM) til hver kalibreringsløsning. Nigericin er en ionofor som øker cellemembran permeabilitet og forårsaker ekvilibrering av intracellulær og ekstracellulær pH i nærvær av et polariserende konsentrasjon av ekstracellulær K +.
  6. Kalibreringsløsninger kan lagres opp til en måned ved 4 ° C

2. Cell Forberedelse

  1. Under en biologisk safety hette, frø-celler i 35 mm x 10 mm dyrkingsskåler i 2 ml vekstmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Bruk mengden av celler som trengs for å sikre at omtrent 50% sammenløpet etter 24 timer.
    MERK: I våre forsøk, bruker vi HT-1080 cellelinje og plate 1 x 10 5 celler per kultur parabolen.
  2. Bestem antall kultur retter som er nødvendig for forsøket og plate 5 ytterligere kultur retter som skal brukes for kalibrering.
  3. Place kultur retter i en 37 ° C / 5% CO 2 inkubator i minst 24 timer.

Tre. Utarbeidelse av pH-sensing prober

  1. Forbered en 1M stamløsning av fluorescerende pH probe 8-hydroxypyrene-1, 3,6 trisulfonic syre, trinatriumsalt (HPTS / pyranine) i DDH 2 0. Denne løsningen må lagres ved romtemperatur og beskyttet mot lys.
  2. Forbered en stamløsning av en mM 5 - (og-6)-karboksyl seminaphthorhodafluor acetoksymetyl ester acetate (C-Snarf-en AM; kalt thereafter snarf-1) ved å oppløse 1 mg av snarf-1 i 1,76 ml DMSO. Bland ved gjentatt pipettering. Snarf-1 løsning må lagres ved -20 ° C og beskyttet mot lys.

4. Cell Merking

  1. Seksten timer før live-cell imaging, tilsett 2 mL av 1M HPTS stamløsning (endelig konsentrasjon på 1 mm) til hver kultur tallerken som inneholder 2 ml komplett medium.
  2. Returner kultur retter til inkubatoren. Den HPTS probe er celle-impermeant derfor til etiketten organ sonden må tas opp ved pinocytose. Denne betingelse krever at celle inkubasjoner med HPTS utføres i serum-supplert kulturmedium.
  3. Etter inkubasjon med HPTS, vaskes cellene to ganger med sterilt PBS og tilsett 2 ml serumfritt medium i minst 2 timer. Inkubering med snarf-en trenger for å bli utført i serumfritt medium, fordi serum kan hindre binding av proben.
  4. Tilsett 10 pl av en 1 mM snarf-1 stamløsning for å oppnå afinal konsentrasjon på 5 uM og tillater celler å inkubere i 20 min ved 37 ° C under svakt lys. C-snarf-1-konsentrasjon og tid for inkuberingen kan variere avhengig av celletype.
  5. Ved slutten av inkubasjonen vaskes cellene to ganger i steril PBS og tilsett 2 ml serumfritt medium.

5. Tilsetting av pH Modulatorer

  1. For å vurdere om metoden kan påvise pH-forandringer i celler, kan forskjellige reagenser som modulerer intracellulær pH ​​bli brukt:
    • Bafilomycin A1, en ​​spesifikk inhibitor av V-ATPase 5
    • Na + / H +-veksleren isoform 1 (NHE-1) 6
    • NH4Cl, en svak base som øker intracellulære pH 7
    1. Forbered stamløsninger av reagensene som er nevnt ovenfor:
      • Bafilomycin A1: tilsett 10 mikrogram av bafilomycin A1 til 160 ul DMSO for å oppnå en stamløsning av 100 uM
      • EIPA: legg 25 mg av EIPA til 1,67 ml metanol til obtaina endelig konsentrasjon på 50 mM
      • NH4Cl: Løs 0,53 g ammoniumklorid i 10 ml DDH 2 O for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1 mM.

      Merk: Alle stamløsninger må holdes ved 4 ° C med unntak av bafilomycin A1 som må lagres ved -20 ° C og beskyttet mot lys.
    2. I separate kultur retter, legger en av de reagenser som er beskrevet nedenfor:
      • 2 mL av 100 mikrometer bafilomycin A1 (endelig konsentrasjon 100 Nm)
      • 1 pl av 50 mM EIPA (sluttkonsentrasjon 25 pM)
      • 40 pl av 1 M NH4Cl (sluttkonsentrasjon 20 mM)
    3. Inkuber cellene i 30 minutter ved 37 ° C.
  2. Fortsett til bildet oppkjøpet.

6. Spesifikasjoner av Live-celle Imaging mikroskop og kjøp innstillinger

  1. Opptre live-cell imaging ved hjelp av en 40X objektiv montert på en spektral invertert skanning konfokalmikroskoper mikroskoppe utstyrt med en motorisert XY scenen, et kammer som rommer glassbunn kultur retter på en miljømessig kontrollert (temperatur, fuktighet, CO 2) stadium inkubator.
  2. Confocal instrument (Olympus FV1000) som brukes her er utstyrt med:
    • En diode laser 405 nm
    • En 40 mW argon laser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • En helium neon laser (543 nm)
    • Fluoritt 10X objektiv, NA0.4
    • En LUCPLFLN 40X objektiv, NA0.60
    • En PLAPONSC PLAN APO 60X olje objektiv, NA1.4
    • En dichroic speil DM 405/458/488/543
    • En SDM 560 og en SDM 640 dichroic filtre
    • En BA655-755 barrierefilter
    • En bjelke splitter BS20/80
    • Dataanalyse programvare for bildeopptak og analyse,
  3. Når scenen inkubatoren har varmet opp til 37 ° C og mikroskop er satt opp, plasserer en kultur fatet tidligere inkuberes med HPTS og Snarf-en inn i confocal scenen bildebehandling kammer.
  4. After finne et område av interesse, justere programvaren kjøp innstillinger Figur 1.
    • Sett opp to virtuelle kanalsett.
    • Initiere første fase som tilsvarer HPTS eksitasjon ved 405 nm og emisjon samlingen ved 505-525 nm og snarf-en eksitasjon på 543 nm og emisjon samlingen på 570-600 nm.
    • Initiere den andre fasen som tilsvarer HPTS eksitasjon ved 458 nm og utslipp samling på 505-525 nm og Snarf-en eksitasjon ved 543 nm og utslipp samling på 640 - 650 nm.
    • Confocal blenderåpning er satt til 175 mikrometer som standard og optimal blenderåpning må stilles inn manuelt på 300 mikrometer.
    • Ta bilde ved å stable serie horisontale optiske deler (800 x 800 piksler) med 0,4 mikrometer tykkelse.

MERK: En 40X objektiv er nyttig å observere flere celler samtidig og fungerer godt for organelle visning. Men romlig oppløsning og signalintensitet er better oppnås ved hjelp av en 60X olje målet. I tillegg er det ingen magnetisering eller utslipp krysstale mellom de to fargestoffer.

7. Kalibrering av pH-sensing prober

  1. Før kalibrering, fjerne mediet fra kultur fatet tidligere inkuberes med HPTS og Snarf-en, vask to ganger med sterile PBS og deretter legge 2 ml av en av de fem kalibreringsløsninger.
  2. Plasser kultur fatet inn i confocal scenen kammeret.
  3. Fortsett til time-lapse bilde oppkjøp i henhold til følgende innstillinger:
    1. Angi antall bilder og intervallvarighetstidene for eksperimentet.
      MERK: Vi bruker vanligvis en 1 min intervall mellom bildene i opptil 30 min.
    2. Programmere lukker å lukke mellom oppkjøpet av hvert bilde.
  4. Spill fluorescens intensitet per min i et regneark programvare og bestemme når fluorescens intensiteten er jevn. Intracellulær pH ​​vanligvis er stabil etter 15 - 20 min.
  5. REPEAT trinn 7.1 til 7.4 ved hjelp av en ny kultur parabolen for hver gjenværende kalibreringsløsning.

8. Data Acquisition

  1. Når kalibreringen er ferdig, erverve eksempeldata 4-5 tilfeldig utvalgte felt som inneholder 15-20 celler per felt. To bilder er innhentet for hvert felt: en for HPTS merking (vesikler) og andre for Snarf-en merking (cytosol).
  2. Bakgrunn fluorescens (ekstracellulært område) er digitalt subtrahert fra fluorescerende bilder av begge prober. Merkede vesikler og cytosol fra sine respektive lagrede bilder er valgt ved hjelp av en binær maske. For hver pH-sonde, er fluorescensintensiteter målt på en numerisk skala (0-4,095 grå nivå skala). En gjennomsnittlig intensitet for alle piksler i organeller eller cytoplasma beregnes og verdier blir brukt til å beregne fluorescens forholdstall.

9. Data Analysis

  1. Ulike programvarepakker er kommersielt tilgjengelig for dataanalyse. Dvs.Fluoview Software.
  2. I et regneark, registrere verdier og beregne fluorescens forhold på følgende måte: I tilfelle av HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm), og, i tilfelle av snarf-1-, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Plott dataene ved hjelp av vitenskapelige grafer programvare som GraphPad Prism. Plottet bør rettere fluorescens forhold (Y-aksen) som en funksjon av pH-verdien (X-aksen). Kurvetilpasning er oppnådd ved hjelp av ikke-lineær regresjon.
  4. Samle fluorescensintensiteter av prøvene som beskrevet i trinn 8.2 og beregne fluorescens-forhold. Bruk kalibreringskurver for å forvandle forholdstall i pH-verdier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For samtidig måling av pH i både intracellulært og endosomal / lysosomale cellekamre, ble de ratiometric fluorescerende pH-sensing prober Snarf-en og HPTS brukt. Snarf-1 er begrenset til den cytosoliske rommet mens HPTS tillater ratiometrisk pH-måling av den endosomale / lysosomale rommet. Cell lasting med HPTS for 16 hr lar sine selektiv lokalisering i endosomes / lysosomer fire. Et typisk eksempel på fluorescens registrert fra HT-1080-celler lastet med de pH-føler sondene er vist i figur 2A. Bevis for at HPTS etiketter både endosomal og lysosomale avdelinger ble innhentet av co-farging med Alexa 546-konjugert transferrin (endosomes) eller et fluorescerende lysotrophic probe (Lysotracker Deep Reddye). Data viste tydelig at HPTS beiset begge avdelinger Figur 2A.

Ved hjelp av den metoden som er beskrevet ovenfor, ble det intracellulære pH-verdier i levende celler bestemt ved å brukeen kalibreringskurve for hver probe figurene 2B og 2C, basert på den ratiometrisk egenskapene til hver pH-følsomt fargestoff. De fem kalibreringsløsningene ble brukt til å konvertere fluorescensintensiteter til pH-enheter. Data fra tre uavhengige kalibreringer rapporteres for hver pH-sonde Figur 2C. Hvert datapunkt representerer et forhold mellom fluorescensintensiteten ved eksitasjons-bølgelengder på 458/405 nm for HPTS eller emisjonsbølgelengder på 644/584 nm for snarf-1 ved en gitt pH. De kalibreringskurvene for begge probene viste en ikke-lineær sammenheng som var best utstyrt med en eksponensiell ligning Figur 2C. Effektiviteten av fremgangsmåten for påvisning av cellulære kupé-assosiert pH-endringer ble evaluert i live-HT-1080-celler ved hjelp av NH4Cl, en svak base som øker intracellulære pH, bafilomycin A1, et farmakologisk inhibitor av V-ATPaser og EIPA, en NHE- en inhibitor. NH 4 Cl utløst intravesicular og cytoSolic pH øker 6,35 til 7,10 og 7,00 til 7,40, Figurene henholdsvis 3A og 3B. Bafilomycin A1 indusert alkalisering av endosomal og lysosomale avdelinger uten å endre cytosolic pH. I motsetning til dette induserte EIPA surgjøring av cytosol å nå en pH-verdi på 6,62 mot 7,00 i ubehandlede celler figurene 3A og 3B.

Figur 1
Figur 1. Diagrams av oppkjøps innstillinger for konfokal laser scanning mikroskop. (B) Den første fasen er satt til å eksitere HPTS ved 405 nm og snarf-1 ved 543 nm samtidig gjennom et dikroisk (DM405/488/543/633) speil. Fluorescensemisjon er først registrert for HPTS på 505-525 nm ved hjelp av en dichroic speil (SDM560). Fluorescens utslipp av Snarf-en blir deretter overvåket gjennom en bandpass interferensfilter i området fra 570 til 600 nm. (B) Den andre fasen er satt til samtidig samle fluorescensemisjonen av HPTS (eks, 458 nm) og snarf-1 (eks, 543 nm). Probe eksitasjon generert av laserstrålen passerer gjennom en strålesplitter (BS20/80) og fluorescens utslipp for hver sonde er samlet inn gjennom de dichroic speil som brukes i den første fasen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. In situ kalibrering av pH-sensing prober. (A) Representative bilder av HPTS og Snarf-1 sub-cellulær lokalisering i HT-1080 fibrosarcoma celler. Øvre bildene viser at Snarf-1 etiketter cytoplasma mens HPTS-forbundet fluorescens viser intravesicular lokalisering. HT-1080-celler ble inkubert i 30 min med Alexa 546-konjugert transferrin (5 ug / ml) eller en lysotrophic fargestoff (Lysotracker Deep Reddye) (100 nM), henholdsvis. Lavere bildene viser at HPTS colocalizes med transferrin og lysotrophic fargestoff (60X). (B) Representative bilder av både pH-sensing prober i cellene ruges i 15 min med kalibreringsløsninger ved pH 6,0 og pH 7,5. (C) Forholdet mellom fluorescens intensitet forholdstall for HPTS og Snarf-en bestemmes ved hjelp av kalibreringsløsninger som en funksjon av pH. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3.. Modulation av i ntracellular pH ved bafilomycin A1, EIPA og NH 4 Cl. farmakologiske hemmere (bafilomycin A1, EIPA) og den intracellulære pH modulator NH 4 Cl ble brukt til å validere metodikken. Diagrammene viser pH-verdiene registrert i endosomale / lysosomale rom (A) eller i cytoplasma (B) av HT-1080-celler lastet med HPTS og snarf-1 og inkubert i 30 min i nærvær eller fravær (kontroll) av NH4Cl ( 20 mM), EIPA (25 uM) eller bafilomycin A1 (100 nM). Dataene er presentert som gjennomsnittet + SEM (** p 0,005, *** p 0,0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitativ måling av pH i live-cell avbildning av ulike cellene er nødvendig for å måle pH-variasjoner i celle responser til eksterne utfordringer. Men, er en av de største hindringene som fortsatt er for enkelt og spesifikt mot cellene. I denne forbindelse er det få studier markert ved bruk av HPTS som en intracellulær pH-indikator innføres i celler ved elektroporering eller mikroinjeksjon 8-10. Disse teknikkene lider av alvorlige ulemper, nemlig elektroporering forårsaker omfattende skader på celler og mikroinjeksjon krever spesialutstyr og tekniske ferdigheter. Av interesse, Hinton et al. Har tidligere rapportert at HPTS kan bli tatt opp av cellene ved en prosess med pinocytose, og at kombinasjonen av snarf-1 og HPTS kan brukes til å overvåke pH-verdien i cytosol og endosomale / lysosomale rom 3 . Vi har brukt denne egenskapen til å ta opp pH-variasjoner i lysosomal / endosomal compartment av levende HT-1080 celler. Bevis for at HPTS ble plassert i dette kammeret, og derfor kan tjene som en pålitelig pH-indikator ble oppnådd ved co-farging med fluorofor-konjugert transferrin, en markør for det lysosomale / endosomal rommet, eller med en acidophilic fargestoff som etiketter hovedsakelig lysosomer figur 2.. Videre, bruk av forskjellige intracellulære pH-modulatorer rettet mot forskjellige cellene indikerte at bafilomycin A1 spesielt økt intravesicular pH uten å endre cytoplasmisk pH. I motsetning til dette EIPA hovedsakelig endret cytosolisk pH, men hadde liten eller ingen effekt på endosomal og lysosomal pH mens ammoniumklorid påvirkes pH på begge seksjonene. Disse resultatene gitt bevis for at snarf-1 og HPTS kunne brukes for samtidig å overvåke pH-endringer i disse to forskjellige cellene.

Et viktig trekk ved fremgangsmåten som beskrives her er bruk av konfokal laser-skanning mikroskopi. De fleste studier reported i litteraturen på intracellulære pH-målinger er gjort ved spectrofluorometry. Selv om enkle å bruke, og som gir hurtig datainnsamling, ikke denne tilnærming ikke tillater observasjon av celler i løpet av eksperimentet. Denne ulempen kan bli av betydning, siden det har vært vår erfaring at i løpet av kalibreringen, kan forlenget inkubasjon under sure (pH 5.5) eller alkalisk (pH 8,0) betingelser påvirke forskjellige celletyper og utløse apoptose. I tilfelle av HT-1080-celler, fører til apoptose red autofluorescens, og dermed forstyrrer den pH-avhengige fluorescensen av snarf-1 (data ikke vist). For å omgå dette problemet, har vi brukt en egen kultur parabolen for hver kalibrering og kasserte eksperimenter der tegn til apoptose eller andre celle endringer ble observert. Bruken av konfokal mikroskop for pH-målinger gjør det også analyse av data enklere. For eksempel, kan analyse av confocal fluorescens mikroskopi bilder brukes til å kaste gjenstander, apoptotic celler og bakgrunnsstøy, noe som gjør beregningene enklere og mer nøyaktig.

Selv om fremgangsmåten som er beskrevet her har mange fordeler fremfor andre metoder, har det noen begrensninger. En av disse er knyttet til de forskjellige belastningsforhold som kreves for hver probe. Med hensyn til HPTS, har fargestoffet tas opp av pinocytosis. Denne begrensning krever at cellene må opprettholdes i en lengre tidsperiode (for eksempel 12 timer) i en serum-supplert medium for å fremme pinocytose og derved merking av den endocytiske rommet. I motsetning til dette celle-permeant snarf-en trenger å bli inkubert i et serumfritt medium for å hindre muligheten av acetoksymetyl-ester (AM) hydrolyse av serum-inneholdende ikke-spesifikke esteraser. Disse restriksjonene vil utelukke eksperimentelle protokoller som krever lasting-uforenlig cellekulturforhold. Videre er følsomheten av HPTS til surt medium en viktig begrensning. Som vist i figur 2, fluorescence intensiteter av HPTS spent på 458 nM viser minimal variasjon ved pH 6,0 eller lavere, med forholdstall nær bakgrunnsverdiene. Denne iboende egenskap ved HPTS bør tas i betraktning når det gjelder undersøkelser av svært sure cellene som lysosomer som har pH-verdier så lave som 4,0 til 5,0. Men til vår kunnskap, er HPTS den eneste tilgjengelige ratiometric fargestoff som kan brukes til å måle intraendosomal pH. For eksempel er vanlig brukt lysosensor fargestoff vil det meste partisjon på surere lysosomal rommet. Graden av oppdeling av dette fargestoff i endosomal rommet vil avhenge av pH-verdier innenfor disse vesikler, som er en stor ulempe ved måling intravesicular pH i celler hvor endosomal pH homeostase er endret.

Som konklusjon, beskriver vi heri en metode for samtidig å måle cytosoliske og endosomal pH-verdier i enkeltceller. Dette er spesielt viktig for studiet av pH homeostase i cellene der hvore mutasjoner eller legemidler kan påvirke effluks og tilstrømningen av protoner i endosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics