Samtidig pH-måling i Endocytic og Cytosoliske Rum i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1.. Forberedelse af løsninger til Cellular pH kalibrering

  1. Tilføj de følgende forbindelser til fem separate 50 ml koniske rør til at forberede 5 løsninger, der skal anvendes til kalibrering:
    • NaCl (1 ml 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g i 10 ml H 2 0)
    • KCl (6,75 ml 1 M KCI) (1 M KCI = 0,75 g i 10 ml H 2 0)
    • Glucose (1 ml af 1 M D-glucose) (1M D-glucose = 1,80 g i 10 ml H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml 1 M MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g i 10 ml H 2 0)
    • 20 mM HEPES (1 ml 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g i 10 ml H 2 0)
    • CaCl2 (0,05 ml 1 M CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g i 10 ml H 2 0)
      Forbered alle løsninger i dobbelt destilleret H 2 O (Hedeselskabet 2 O).
  2. Komplet hvert løsning med 35 ml ddH2O og blandes med en magnetisk omrører, indtil såning er opnået.
  3. Juster pH-værdien af ​​hver opløsning med 1 N KOH eller 1 N HCI til opnåelse af pH-værdier på 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 og 7,5. Derefter justere lydstyrken med deioniseret vand til et samlet volumen på 50 ml.
  4. Foranstaltning 5 mg nigericin og føje den til 670 ul absolut EtOH til at forberede en 10 mM nigericin stamopløsning.
    Forsigtig: nigericin er meget giftigt og skal håndteres med stor forsigtighed (handsker, sikkerhedsbriller og maske). Bland opløsningen ved inversion, indtil nigericin er helt opløst.
  5. Tilføj 0,05 ml 10 mM nigericin (slutkoncentration 10 uM) til hver kalibreringsopløsning. Nigericinet er en ionophor, der øger cellemembranpermeabilitet og forårsager ækvilibrering af intracellulære og ekstracellulære pH-værdi i nærvær af en depolariserende koncentration af ekstracellulært K +.
  6. Kalibreringsopløsninger kan opbevares i op til 1 måned ved 4 ° C

2. Cell. Fremstilling

  1. Under en biologisk safety hætte, frø celler i 35 mm x 10 mm dyrkningsskåle i 2 ml vækstmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Brug mængde celler nødvendige for at sikre omkring 50% sammenløb efter 24 timer.
    BEMÆRK: I vores eksperimenter, vi bruger HT 1080 cellelinje og plade 1 x 10 5 celler pr kultur fad.
  2. Bestem antallet af dyrkningsskåle, der er nødvendige for eksperimentet og pladen 5 yderligere dyrkningsskåle, der anvendes til kalibrering.
  3. Place dyrkningsskåle i et 37 ° C / 5% CO2 inkubator i mindst 24 timer.

3.. Fremstilling af pH-sensing Probes

  1. Forbered en 1M stamopløsning af fluorescerende pH-sonden 8-hydroxypyren-1, 3,6 trisulfonsyre, trinatriumsalt (HPTS / pyranin) i ddH 2 0. Denne opløsning skal opbevares ved stuetemperatur og beskyttet mod lys.
  2. Der fremstilles en stamopløsning af 1 mM 5 - (and-6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethylester acetat (C-Snarf-1:00; kaldet thereâfter Snarf-1) ved at opløse 1 mg Snarf-1 i 1,76 ml DMSO. Bland omhyggeligt ved gentagen pipettering. Snarf-1 opløsning skal opbevares ved -20 ° C og beskyttet mod lys.

4. Cell. Mærkning

  1. Seksten timer før live-cell imaging, tilsættes 2 pi 1M HPTS stamopløsning (slutkoncentration 1 mM) til hver dyrkningsskål indeholdende 2 ml komplet medium.
  2. Retur dyrkningsskålene til inkubatoren. Den HPTS sonden er celle-impermeabel, derfor etiket organeller sonden skal tages op af pinocytose. Denne tilstand kræver, at celle inkubationer med HPTS udføres i serum-suppleret dyrkningsmedium.
  3. Efter inkubation med HPTS vaskes cellerne to gange med sterilt PBS, og der tilsættes 2 ml serumfrit medium i mindst 2 timer. Inkubation med Snarf-1 skal udføres i serum-frit medium, idet serum kan forhindre optagelsen af ​​sonden.
  4. Tilsæt 10 ul af en 1 mM Snarf-1 stamopløsning at opnå AFnelle koncentration på 5 uM og tillade cellerne at inkubere i 20 minutter ved 37 ° C under svagt lys. C-Snarf-1-koncentration og inkubationstid kan variere efter celletype.
  5. Ved slutningen af ​​inkubation vaskes cellerne to gange i sterilt PBS og tilsæt 2 ml serum-frit medium.

5.. Tilsætning af pH-modulatorer

  1. For at vurdere, om metoden kan detektere ændringer i pH i celler, kan forskellige reagenser, som modulerer intracellulær pH ​​anvendes:
    • Bafilomycin A1, en ​​specifik inhibitor af V-ATPase 5
    • Na + / H + exchanger isoform 1 (NHE-1) 6
    • NH4Cl, en svag base, der øger intracellulært pH 7
    1. Forbered stamopløsninger af de nævnte reagenser:
      • Bafilomycin A1: Tilsæt 10 ug bafilomycin A1 til 160 pi DMSO til opnåelse af en stamopløsning af 100 uM
      • EIPA: tilsættes 25 mg EIPA til 1,67 ml methanol til obtaina endelig koncentration på 50 mM
      • NH4Cl: Opløs 0,53 g ammoniumchlorid i 10 ml ddH2O at opnå en endelig koncentration på 1 mM.

      Bemærk: Alle stamopløsninger skal opbevares ved 4 ° C, bortset fra bafilomycin A1, som skal opbevares ved -20 ° C og beskyttet mod lys.
    2. Ved separate dyrkningsskåle, tilsættes et af reagenserne som beskrevet nedenfor:
      • 2 pi 100 uM bafilomycin A1 (slutkoncentration 100 NM),
      • 1 ml af 50 mM EIPA (slutkoncentration 25 uM)
      • 40 ul 1 M NH4Cl (slutkoncentration 20 mM)
    3. Inkubér cellerne i 30 minutter ved 37 ° C.
  2. Fortsæt til billede erhvervelse.

6.. Specifikationer for live-cell imaging mikroskop og Acquisition Indstillinger

  1. Udfør live-cell imaging ved hjælp af en 40X objektiv monteret på en spektral omvendt konfokal microscope udstyret med en motoriseret XY-scene, et kammer, der kan rumme glasbund kultur retter på en miljømæssigt kontrolleret (temperatur, luftfugtighed, CO 2) fase inkubator.
  2. Den konfokal instrument (Olympus FV1000), der anvendes her er udstyret med:
    • En diodelaser 405 nm
    • En 40 mW argon laser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • En helium neon laser (543 nm)
    • Fluorit 10X objektiv, NA0.4
    • En LUCPLFLN 40X objektiv, NA0.60
    • En PLAPONSC PLAN APO 60X olie mål, NA1.4
    • En dichroic spejl 405/458/488/543 DM
    • En SDM 560 og en SDM 640 dichroic filtre
    • En BA655 755 barriere filter
    • En stråledeler BS20/80
    • Dataanalyse software til indsamling og analyse billede,
  3. Når scenen inkubator er varmet op til 37 ° C og mikroskopet er sat op, placere en kultur fad tidligere inkuberet med HPTS og Snarf-1 ind i konfokal fase imaging kammer.
  4. After lokalisere et område af interesse, justere software indstillinger erhvervelse Figur 1..
    • Oprette to virtuelle kanalsæt.
    • Starte den første fase, der svarer til HPTS excitation ved 405 nm og indsamling emission ved 505-525 nm og Snarf-1 excitation ved 543 nm og indsamling emission ved 570-600 nm.
    • Indlede anden fase, der svarer til HPTS excitation ved 458 nm og indsamling emission ved 505-525 nm og Snarf-1 excitation ved 543 nm og indsamling emission ved 640-650 nm.
    • Konfokal blænden er indstillet til 175 um som standard og optimal blænde skal indstilles manuelt ved 300 um.
    • Tag Billede ved at stable serielle vandrette optiske sektioner (800 x 800 pixels) på 0,4 um tykkelse.

BEMÆRK: En 40X målsætning er nyttigt at observere flere celler samtidigt og fungerer godt for organel visning. Men rumlig opløsning og signalintensiteten er Better opnås ved anvendelse af et 60X objektiv olie. Desuden er der ingen excitation eller emission krydstale mellem de to farvestoffer.

7.. Kalibrering af pH-sensing Sonder

  1. Før kalibrering, fjerne mediet fra dyrkningsskålen tidligere inkuberet med HPTS og Snarf-1, vaskes to gange med steril PBS og derefter tilsættes 2 ml af et af de fem standardopløsninger.
  2. Placer dyrkningsskålen i konfokal scene kammeret.
  3. Fortsæt til time-lapse billede erhvervelse i henhold til følgende indstillinger:
    1. Indstil antallet af billeder og interval varighed tider for eksperimentet.
      BEMÆRK: Vi bruger typisk en 1 min interval mellem billeder i op til 30 minutter.
    2. Programmér lukkeren at lukke mellem erhvervelsen af ​​hvert billede.
  4. Optag fluorescensintensiteten pr minutter i et regneark og bestemme det tidspunkt, hvor fluorescensintensitet er stabil. Intracellulær pH ​​er normalt stabilt efter 15 - 20 min.
  5. REPEAT trin 7,1-7,4 ved hjælp af en ny kultur fad for hvert resterende kalibreringsopløsning.

8.. Dataopsamling

  1. Når kalibreringen er færdig, erhverve eksempeldata 4-5 tilfældigt udvalgte felter, der indeholder 15-20 celler pr. To billeder opnås for hvert felt: en for HPTS mærkning (vesikler) og den anden for Snarf-1 etikettering (cytosol).
  2. Baggrund fluorescens (ekstracellulær område) er digitalt fratrækkes fluorescerende billeder af begge sonder. Mærkede vesikler og cytosol fra deres respektive gemte billeder er valgt ved hjælp af en binær maske. For hver pH-sensing sonde, er fluorescensintensiteter målt på en numerisk skala (0-4,095 grå niveau skalaen). For alle pixels i organel eller cytoplasmaet En gennemsnitlig intensitet beregnes og værdierne anvendes til at beregne fluorescens forhold.

9.. Dataanalyse

  1. Forskellige software pakker er kommercielt tilgængelige til dataanalyse. DvsFluoView Software.
  2. I et regneark, optage værdier og beregne fluorescens nøgletal som følger: I tilfælde af HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm), og i tilfælde af Snarf-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Plot data ved hjælp af videnskabelige graftegning software som GraphPad Prism. Handlingen skal skildre fluorescens nøgletal (Y-akse) som funktion af pH (X-aksen). Kurvetilpasning opnås ved anvendelse af ikke-lineær regression.
  4. Saml fluorescensintensiteterne af prøverne som beskrevet i trin 8.2 og beregne fluorescens forhold. Brug kalibreringskurver at omdanne nøgletal i pH-værdier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til samtidig måling af pH i både intracellulære og endosomale / lysosomale cellekamre blev de ratiometriske fluorescerende pH-sensing sonder Snarf-1 og HPTS anvendes. Snarf-1 er begrænset til den cytosoliske rum mens HPTS tillader ratiometrisk pH-måling af endosomale / lysosomale rum. Cell belastning med HPTS til 16 timer giver sin selektive lokalisering i endosomes / lysosomer 4. Et typisk eksempel på fluorescens registreres fra HT-1080-celler fyldt med de pH-sensing prober er vist i figur 2A. Bevis for, at HPTS etiketter både endosomale og lysosomale rum blev opnået ved co-farvning med Alexa 546-konjugeret transferrin (endosomes) eller en fluorescerende lysotrophic sonde (lysoTracker Deep Reddye). Viste data viser klart, at HPTS farves begge rum figur 2A.

Brug den metode, der er beskrevet ovenfor, blev intracellulære pH-værdier i levende celler bestemmes ved hjælp afen kalibreringskurve for hver probe 2B og 2C, er baseret på ratiometrisk egenskaberne for hver pH-følsomt farvestof. De fem standardopløsninger blev anvendt til at konvertere fluorescensintensiteter til pH-enheder. Data fra tre uafhængige kalibreringer rapporteres for hver pH-sensing sonde Figur 2C. Hvert datapunkt repræsenterer et forhold mellem fluorescensintensiteten ved excitationsbølgelængder på 458/405 nm for HPTS eller emissions-bølgelængder på 644/584 nm for Snarf-1 ved en given pH. De kalibreringskurver for begge prober viste et ikke-lineært forhold, der var bedst udstyret med en eksponentiel ligning Figur 2C. Effektiviteten af fremgangsmåden til påvisning af cellulære rum-associeret pH-ændringer blev evalueret i levende HT-1080 celler under anvendelse af NH4Cl, en svag base, der øger intracellulær pH, bafilomycin A1, en ​​farmakologisk inhibitor af V-ATPaser og EIPA, en NHE- 1-inhibitor. NH4Cl udløst intravesikulær og cytosolic pH stiger fra 6,35 til 7,10 og 7,00 til 7,40, henholdsvis figur 3A og 3B. Bafilomycin A1 induceret alkalinisering af endosomale og lysosomale rum uden at ændre cytosolisk pH. I modsætning hertil EIPA induceret forsuring af cytosolen nå en pH-værdi på 6,62 i forhold til 7,00 i ubehandlede celler figur 3A og 3B.

Figur 1
Figur 1.. Diagrammer indstillinger erhvervelse for konfokal laser scanning mikroskop. (A) Den første fase er indstillet til at ophidse HPTS ved 405 nm og Snarf-1 ved 543 nm samtidigt gennem en dichroic (DM405/488/543/633) spejl. Fluorescensemission først registreret for HPTS ved 505-525 nm ved hjælp af en dichroic spejl (SDM560). Fluorescensemissionen Snarf-1 overvåges derefter gennem en bandpass filter indblanding i intervallet 570-600 nm. (B) Den anden fase er sat til samtidigt samle fluorescensemission af HPTS (exc, 458 nm) og Snarf-1 (exc, 543 nm). Probe excitation genereres af laserstrålen passerer gennem en stråledeler (BS20/80) og fluorescens-emissionen for hvert probe indsamles via de dikroiske spejle, der anvendes i den første fase. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. In situ kalibrering af pH-sensing prober. (A) Repræsentative billeder af HPTS og Snarf-1 sub-cellulære lokalisering i HT-1080 fibrosarcomaceller. Øvre billeder viser, at Snarf-1 etiketter cytoplasmaet mens HPTS-associeret fluorescens viser intravesikulær lokalisering. HT-1080-celler blev inkuberet i 30 min med Alexa 546-konjugeret transferrin (5 ug / ml) eller en lysotrophic farvestof (lysoTracker Deep Reddye) (100 nM), hhv. Lavere billeder viser, at HPTS colocalizes med transferrin og lysotrophic farvestof (60X). (B) Repræsentative billeder af både pH-sensing sonder i celler inkuberet i 15 min med kalibreringsopløsninger ved pH 6,0 og pH 7,5. (C) Forholdet af fluorescens intensitet nøgletal for HPTS og Snarf-1 bestemmes ved hjælp af kalibreringsopløsningerne som funktion af pH. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3.. Modulation af i ntracellular pH ved bafilomycin A1, EIPA og NH4Cl. farmakologiske hæmmere (bafilomycin A1, EIPA) og den intracellulære pH-modulator NH4Cl blev brugt til at validere metoden. Grafer viser pH-værdier registreret i den endosomale / lysosomale rum (A) eller cytoplasmaet (B) i HT-1080 celler belastet med HPTS og Snarf-1 og inkuberet i 30 minutter i nærvær eller fravær (kontrol) af NH4Cl ( 20 mM), EIPA (25 uM) eller bafilomycin A1 (100 nM). Data er vist som middelværdi + SEM (** p 0,005, *** p 0,0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er behov for Quantitative pH-måling i live-cell imaging af forskellige cellulære rum til nøjagtigt at måle pH-variationer i celle reaktioner på eksterne udfordringer. Men en af ​​de store hurdler, der er tilbage, er at nemt og specifikt at målrette cellulære rum. I denne forbindelse har nogle undersøgelser fremhævet brugen af HPTS som en intracellulær pH-indikator indført i celler ved elektroporation eller mikroinjektion 8-10. Disse teknikker lider alvorlige ulemper, nemlig elektroporation forårsager omfattende skader på celler og mikroinjektion kræver særligt udstyr og tekniske færdigheder. Af interesse, Hinton et al. Har tidligere rapporteret, at HPTS kan tages op af celler ved en proces med pinocytose, og at kombinationen af Snarf-1 og HPTS kan anvendes til at overvåge pH af cytosolen og endosomale / lysosomale rum 3 . Vi har brugt denne egenskab til at optage pH variationer i lysosomale / endosomale compartment af levende HT-1080 celler. Bevis for, at HPTS blev placeret i dette rum, og derfor kunne tjene som en pålidelig pH-indikator blev opnået ved co-farvning med fluoroforen-konjugeret transferrin, en markør for det lysosomale / endosomale rum, eller med en acidophilic farvestof, der oftest etiketter lysosomer figur 2. Desuden anvendelse af forskellige intracellulære pH-modulatorer målrettet forskellige cellulære rum indikerede, at bafilomycin A1 specifikt øget intravesikulær pH uden at ændre cytoplasmatisk pH. I modsætning hertil EIPA primært sker cytosolisk pH, men havde ringe eller ingen virkning på endosomal og lysosomal pH, mens ammoniumchlorid påvirket pH begge rum. Disse resultater fremlagt dokumentation for, Snarf-1 og HPTS kunne bruges til samtidigt at overvåge pH-ændringer i disse to forskellige cellulære rum.

Et vigtigt element i den her beskrevne fremgangsmåde er brugen af ​​konfokal laser scanning mikroskopi. De fleste undersøgelser reported i litteraturen om intracellulære pH-målinger er blevet udført af spektrofluorometri. Selv nem at bruge og give erhvervelse hurtig data, er denne fremgangsmåde ikke tillade observation af celler under eksperimentet. Denne ulempe kan blive af betydning, da det har været vores erfaring, at under trinnet kalibrering, kan forlænget inkubation under sure (pH 5,5) eller alkaliske (pH 8,0) betingelser påvirke forskellige celletyper og udløse apoptose. I tilfælde af HT-1080 celler, apoptose fører til rød autofluorescens, hvilket interfererer med pH-afhængig fluorescens Snarf-1 (data ikke vist). For at omgå dette problem, har vi brugt en særskilt kultur fad for hver kalibrering og kasserede forsøg, hvor tegn på apoptose eller andre celle forandringer blev observeret. Anvendelsen af ​​konfokalt mikroskop for pH-målinger gør også analyse af data lettere. For eksempel kan der anvendes analyse af konfokal fluorescens mikroskopi billeder til at skille artefakter apoptotic celler og baggrundsstøj, gør beregninger lettere og mere præcist.

Selv om den her beskrevne fremgangsmåde giver mange fordele i forhold til andre metoder, har det nogle begrænsninger. En af disse er relateret til de forskellige belastningstilstande, der kræves for hver probe. Med hensyn til HPTS farvestoffet skal tages op af pinocytose. Denne begrænsning kræver, at cellerne skal opretholdes i en længere periode (fx 12 timer) i en serum-suppleret medie til at fremme pinocytose og dermed mærkning af det endocytiske rum. I modsætning hertil har brug celle-gennemtrængende Snarf-1 inkuberes i et serum-frit medium for at forhindre muligheden af ​​acetoxymethylester (AM) hydrolyse af serum-holdige ikke-specifikke esteraser. Disse begrænsninger vil udelukke forsøgsprotokoller, der kræver loading-uforenelig cellekultur forhold. Hertil kommer, at følsomheden af ​​HPTS i surt medium er en vigtig begrænsning. Som vist i figur 2, fluorescence intensiteter af HPTS ophidset ved 458 nM viser minimal variation ved pH 6,0 eller lavere, med nøgletal tæt på baggrundsværdier. Denne iboende egenskab af HPTS bør tages i betragtning i tilfælde af undersøgelser af meget sure cellulære rum såsom lysosomer, der har pH-værdier så lave som 4,0 til 5,0. Men til vores viden, HPTS er den eneste tilgængelige ratiometrisk farvestof, der kan anvendes til at måle intraendosomal pH. For eksempel, de almindeligt anvendte lysosensor farvestof vil mest partition af mere sure lysosomal. Omfanget af opdeling af dette farvestof i endosomale rum vil afhænge af pH-værdier inden for disse vesikler, hvilket er en væsentlig ulempe ved måling intravesikulær pH-værdi i cellerne, hvor endosomale pH homeostase ændres.

Afslutningsvis beskrives heri en metode til samtidig cytosoliske og endosomale pH-værdier i enkeltceller. Dette er især vigtigt for studiet af pH homeostase i celler uafhængig af hvor retholtene mutationer eller lægemidler kan påvirke udstrømning og tilstrømning af protoner i endosomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics