단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

Biology

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Summary

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

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Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

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Abstract

Introduction

단일 분자 (SM) 기술은 크게 전통적인 벌크 용액 측정 1-3의 한계 중 일부를 극복하는 요구에 응답하기 위해 지난 30 년에 걸쳐 개발했다. 단일 생체 분자의 조작은 생체 고분자 (4)의 기계적 특성을 측정하고 단백질 - 단백질 5 및 단백질-DNA 상호 작용의 6,7 기계적 매개 변수를 제어 할 수있는 기회를 만들었다. SM 형광 검출은, 반면에, 로컬 화 및 나노 미터 정밀도로 단일 분자의 추적 가능성 선도, 시험 관내 및 생체 내에서의 단백질의 활성을 연구하는데 대단히 다용도 공구를 나타낸다. SM 이미지에 악기 점 - 확산 함수의 피팅을 통하여, 실제로, 한 정밀도가 신호 대 잡음비 (SNR)에 주로 의존 약 1 나노 미터 8,9의 한계에 도달하여 지역화를 달성 할 수있다. 이 방법은 강력한 찾기모터 단백질의 역학 연구에서 애플리케이션과의 DNA-결합 단백질의 검색 대상을 기초 확산 과정. 대상의 DNA 서열의 기능, 체류 시간으로 확산 상수를 결정하고 정확하게 일차원 확산 이벤트 동안 탐구 DNA 길이를 측정하는 기능, 단백질-DNA 상호 작용의 역학 연구 및 조사를위한 강력한 도구를 대표 특정 대상 검색의 메커니즘.

최근, 이들 두 기술의 조합은 예를 들어 (예를 들어 액틴 필라멘트 또는 DNA 분자) 상호 작용 파트너 효소 및 검출 / 지역화 생물학적 기판의 동시 조작을 가능하게 실험 셋업 10-14의 새로운 세대 (만들어 내고 미오신 또는 DNA-결합 단백질). 이러한 기술의 이점은 주로 ENA 따라서, 포획 된 중합체 위에 기계적 제어를 발휘할 수있는 가능성에 휴식힘 또는 토크 대 상호 작용의 역학 연구를 블링. 또, 방법론은 고전 SM 방법, 즉, 표면에 연구중인 분자의 고정화를위한 필요성 (유리 슬라이드 또는 마이크로 스피어)의 주요 제한을 피하면서 표면으로부터 멀리 생화학 반응을 측정 할 수있다.

두 개의 단일 분자 기술의 조합은 주로 기계적 안정성 및 15 (특히 나노 미터 정밀도로 현지화를 요구하는) 적절한 SNR의 요구 사항에서 발생하는 여러 가지 기술적 인 어려움을 극복해야합니다. 광 핀셋, 노이즈 감소 SM 형광 검출을 결합하고 포착 적외선 레이저 (16) 및 생물학적 착체의 조립 및 실험적 측정 (11)의 성능에 대한 생화학 버퍼로부터 photobleaching에 제어 할 때 특히, 매우 중요하다. 여기서는 성공한 행하는 방법을 설명이중 트래핑 / SM 형광 지역화 설정에서 측정. 방법론은 특정의 lacI 결합 서열 (즉, 오퍼레이터)을 함유 유당 리프레 서 단백질 (의 lacI) 형광 (Atto532로) 분류하고 (2 개의 광 핀셋 사이에 갇혀) DNA 분자에 결합으로서 검출의 예와 함께 도시되어있다. 우리는 목표 탐색 과정에서의 형상을 따라 DNA 및 확산의 lacI의 결합 검출에있어서의 효과를 보여준다. 상기 방법은 DNA 서열 및 DNA-결합 단백질의 임의의 조합뿐만 아니라 다른 시스템 (미세 소관 또는 액틴 필라멘트 및 그들과 상호 작용하는 단백질 모터)에 적용 가능하다.

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Protocol

나노 안정성과 1 광학 족집게 설정

실험 장치는 1 % 아래 트래핑 레이저의 나노 미터 수준과 강도 변화에 안정성을 가리키는 2 개의 광 핀셋을 제공해야합니다. 이들 조건의 조합이 전형적인 장력 아령 나노 안정성을 보장한다 (일 PN - 몇 PN 수만), 트랩 강성 (0.1 PN / 나노 미터)와 측정 대역폭 (이미지 수집 속도 20 초 -1). 실험 장치의 구조는 그림 1에 묘사되어있다.

  1. 광 핀셋 설계 및 시공 15,17 :
    1. 기계적 진동을 줄이기 위해 활성 절연체와 광학 테이블에 실험 장치를 탑재합니다. 소음 및 현미경 구조의 기계식 공진을 흡수하는 탄성 절연체에 현미경 구조를 탑재.
    2. R로, 레이저 소스에 가까운 트래핑 레이저의 경로 내에 광학 아이솔레이터를 삽입광학 피드백으로 인해 랜덤 진폭 변동을 끌어 내고.
    3. 가급적 트래핑 레이저의 경로 길이를 줄이고 공기 흐름과 난류에 의한 레이저 포인팅 변동을 줄이기 위해 밀폐 상자에 전체 경로를 묶.
    4. 직교 편파 두 개의 빔으로 (YAG 레이저, 1,064 nm 파장의 Nd) 하나의 근적외선 레이저 소스를 분할하여 두 번 광 핀셋을 만듭니다. 그들은 긴장 12에서 아령의 진동의 원인이 있기 때문에 시간 공유 트랩을 사용하지 마십시오.
    5. (적어도) 한 트랩 및 DNA 장력을 정밀하게 조절의 미세한 움직임을 할 수 있도록 직접 디지털 합성기 (DDSS)에 의해 구동 음향 광학 편 향기 (AODs)를 사용합니다. DDSS는 전압 제어 발진기 (VCO)보다 더 나은 트랩 안정성을 할 수 있습니다.
    6. 서브 - 나노 미터 정밀도로 포획 구슬의 위치를​​ 감지하는 응축기의 후면 초점면에서 두 개의 사분면 검출기 포토 다이오드 (QDPs)를 삽입한다.
  2. 그 강도 F 확인현미경 입구 트래핑 레이저 luctuations는 화상 취득의 레이트보다 더 큰 대역폭을 가진 포토 다이오드를 사용하여 1 % 이하이다.
  3. 이 트래핑 레이저 포인팅 안정성 확인
    1. 인산염 완충액에 실리카 비드를 준비 : 실리카 비드의 20 μl를 희석 (1.54 μm의 10 % 고체)을 아세톤 1 ㎖에 짧게 30 초, 소용돌이 초음파 처리하고 원심 분리기 2 분에서 19,000 × g으로. 1 ml의 아세톤 및 반복 세척에 재현 탁. 50 mM의 인산염 완충액 1 ㎖에 재현 탁은 두 번 세척하고, 마지막으로 50 mM의 인산염 완충액 100 ㎕에 재현 탁.
    2. 실리카 비드와 광 핀셋 교정 : (약 60 μm의 두께)을 두 번 끈끈이 테이프를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 부착하여 흐름 세포를 준비합니다. 1 ㎎ / ㎖의 BSA 흐름과 3 분을 기다립니다. 실리카 비드가 인산염 완충액에 1 / 1000로 희석 흐름 및 실리콘 그리스 유량 용기를 밀봉. 트랩 한 각 트랩의 비드 및 전력 스펙트럼을 사용하는 방법 (18)을 보정 트랩. 펜틸 아세테이트 및 니트로 셀룰로오스의 실리카 비드를 제조 : 실리카 비드 20 ㎕의 희석 (1.54 μM, 10 % 고형분) 아세톤 1 ㎖ 중에, 짧게 30 초, 와류를 초음파 처리하고, 원심 분리로 2 분에서 19000 × g으로. 1 ml의 아세톤 및 반복 세척에 재현 탁. 및 펜틸 아세테이트 1 ㎖에 재현 탁은 2 회 반복한다. 마지막 펜틸 아세테이트에 용해 0.1 % 니트로 셀룰로스로 펜틸 아세테이트에이를 재현 탁.
    3. 제 커버 슬립 (24 X 60mm)를 사용하여 커버 슬립 (24 X 24mm)의 표면 상 펜틸 아세테이트 + 0.1 % 니트로 셀룰로스에 용해하고 1.54 μm의 직경의 실리카 비드의 2 μl를 확산. 플로우 셀을 만들기 위해 양면 테이프의 두 가지를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 부착. 50 mM의 인산 버퍼 플로우 셀을 채우고 실리콘 그리스를 밀봉하십시오.
    4. 2,000X 배율의 시야 현미경의 이미지 한 실리카 비드. 비드 (190)는 화상 (P)의 직경을 갖도록 시야는 768 X 576 픽셀에서 취득한 7 × 5 μM이어야ixels. REF. 17에있어서, 회절 고리로부터의 화상 및 z 중심으로부터의 XY 위치를 산출하고 nm의 정확도 또는 그 이상을 가진 피에조 스테이지를 이동 감도를 수정, 피드백 소프트웨어 열적 드리프트를 보상.
    5. 비드 중앙과 좌측 트랩의 중심과 중첩 (QDP부터 XY 신호 레벨은 교정시 측정 같아야) 및 위치 노이즈 QDP로부터 표준 편차를 측정한다. 오른쪽 트랩에 대한 측정을 반복합니다.

나노 미터의 정확도와 2 단일 분자 현지화

  1. 형광 현미경 설계 및 건설 15,19
    1. 나노 파악 정확성을 위해 필요한 높은 신호대 잡음비를 달성하도록 높은 양자 효율과 전자 승산 CCD를 사용한다.
    2. 화상 픽셀 크기 ~ 80nm의 것을 알고 광학를 선택 (예를 들면, 16 μM의 카메라 픽셀 크기의 이미지 배율 ~ 200X). 이 suffi입니다픽셀 화 8로 인해 현지화 오류를 무시하는 ciently 작지만 충분히 큰 픽셀 당 광자의 상당한 수를 수집합니다.
    3. 여기 원으로서, 방향에 관계없이, 하나의 발색단의 여진을 최대화하기 위해, 레이저 (비 편파 유지 광파이버를 통과하여) 비 편광 인 광 또는 원 (λ / 4 파장 판을 통과하여) 편광을 사용한다.
    4. 효율적으로 차단 모두 여기 및 트래핑 레이저 조명, 발광 대역 통과 필터를 선택합니다. 참고 : 우리의 실험에서 우리는 Atto532 염료로 우리의 단백질을 표지 및 100 nm의 대역폭을 600 nm에서 중심 대역 통과 방출 필터를 사용합니다.

3 미세 유체

버퍼 교환 및 '아령'조립, 즉,이 광학적으로 포획 된 마이크로 사이에 단일 DNA 분자의 정박, 주문 제작 층류 채널 흐름의 정확한 제어를 달성하려면시스템이 개발되어야한다. 이는 유동 챔버, 압력 저장조 및 압력 제어 시스템 (도 2)에 의해 구성된다.

  1. 플로우 셀 준비
    참고 : 단백질-DNA 상호 작용에 단일 분자 실험에 사용 유량 용기는 4 병렬 버퍼 플로우를 허용하는, 바람직하게는 4 입구와 콘센트 1 개를 가지고, 다른 실험에 필요한 구성 요소 중 하나를 포함하는 각 일 : 구슬, DNA를, 단백질, 및 이미지 버퍼를 형광 - 표지. 유동 채널의 구성 요소의 분리는 아령의 효율적인 조립을 할 수 있습니다. 더욱이, 이미징 채널은 몇 나노 미터 정도의 정밀도를 가진 DNA-결합 단백질의 위치 파악에 필요한 높은 신호 대 잡음비를 확산 단백질로부터 배경 형광을 방지하고 달성하는 것이 유용하다.
    1. 유입구 (4)와 하나의 출구를 만들기 위해 다이아몬드 팁 현미경 슬라이드 (76 X 76 X 1mm)에서 드릴 직경이 1mm 구멍.
    2. 청소 일전자 현미경은 에탄올로 슬라이드 삽입 O-링 및 액세스 홀을 둘러싸는 슬라이드에 접착 링 포트 중앙. 이 접착 과정을 방해 할 지문을 방지하기 위해이 단계에서 장갑을 착용하는 것이 필수적입니다.
    3. 슬라이드에 NanoPorts 클램프, 완전 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 180 ° C로 예열 된 오븐에 넣습니다.
    4. 종이에 플로우 셀의 윤곽 패턴을 그린다. 채널 ~ 3mm 폭하고 현미경 슬라이드의 구멍의 위치와 일치한다.
    5. 파라 필름의 두 조각의 상단에있는 그림을 놓고 메스로 그린 윤곽선을 따라 선명하고 연속 가공을합니다. 형성하는 돌기를 제거합니다. 단지 깨끗한 지원을 보장하는 데 사용되는 하부 파라 필름 층을 버린다.
    6. 거꾸로 금속 지원에 첨부 된 NanoPorts를 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
    7. 조심스럽게 확인 일을, 구멍 파라 필름 챔버 개요를 정렬파라 필름에서 챔버의 입구와 출구를 obtrude하지 않습니다.
    8. 청소 현미경 커버 슬립 (62 X 56 X 0.15 mm)로 커버 조심스럽게 실을 둘러싼 과잉 파라 필름을 제거합니다.
    9. 거기에 일정한 압력을 적용하는 흐름 셀의 상단에 이전에 120 ° C로 가열이 열 블록을, 놓습니다. 파라 필름은 약 25 분 동안 녹여 보자.
  2. 압력 탱크 및 버퍼 용기
    압력 탱크는 플렉시 글라스 (또는 이와 유사한 것)로 만든 여섯 버퍼 용기의 숙박 시설을 허용해야합니다. 적어도 두 개의 여분의 버퍼를 갖는 용기의 가능성은 기기의 유연성을 향상시킨다. 갇힌 공기 방울의 투명 용기 상당히 흐름 시스템 처리에 도움이 튜브 및 문제 해결을합니다. 플런저는 이전에 제거 된 멸균 일회용 팁 루어 로크 시린지 (2.5 ml)을, 좋은 버퍼 컨테이너와 입구 튜빙과 쉽게 연결할 수있다. 있는지 확인전체 유체 부피는 압력 탱크, 부드럽고 안정한 유동을 얻는 것이 필수 조건 내부 공기량에 비해 작다.
    1. 실험 중 또는 해제 버퍼 흐름을 선회에 대한 버퍼 용기의 출구에 차단 밸브를 연결합니다.
    2. 현미경 무대에 흐름 전지를 탑재합니다. 폴리 에테르 에테르 케톤 튜브 (내경 ~ 150 μm의)와 플랜지가 피팅 유량 용기 입구에 차단 밸브를 연결합니다. 튜브 및 흐름 셀의 NanoPort 어셈블리 사이의 연결로 플루오르 에틸렌 프로필렌 튜브 ~ 3cm (내경 ~ 500 μm의)를 추가합니다. 이 단계는 유리 플로우 셀 또는 NanoPort 박리의 파손을 방지하기 위해 상기 챔버 입구 버퍼 유량을 감소하는 것이 필수적이다. 큰 내경 튜브의 사용은 단독으로, 다른 한편, 생물학적 시료의 큰 볼륨을 필요로한다.
    3. 대기압에서 열린 팔콘 튜브에 유량 용기 콘센트를 연결합니다. 이튜브는 유동 챔버로부터 유출을위한 버퍼 역할을 폐기.
  3. 압력 제어 시스템
    1. 미세 압력 저장조 내부의 공기압을 조정할 수있는 압력 제어 시스템을 구축. 이것은이 컴퓨터 제어 솔레노이드 밸브 번 +0.5 기압 압력 원에 연결 (압축기) 및 대기압 제를 사용하여 수행 할 수있다. 솔레노이드 밸브는 반복적으로 증가 또는 원하는 값에 도달 할 때까지 라인 내의 압력을 감소시키기 위해 약 7 밀리 개방된다. 참고 :이 방법은 카를로스 부스타 20에서 적응하고 스테핑 모터 주사기 펌프 (21)를 사용하는 것보다 더 부드러운 흐름을 산출 하였다.
    2. 압력 탱크에 가해지는 유효 압력을 모니터링하는 사용자 지정 작성 소프트웨어에 의해 제어되는 압력 변환기를 추가합니다. 전형적인 작동 압력은 아령 조립체 및 유동 시스템 부품을 세척 200 밀리바 20 밀리바의 순서이다.

    바이오틴 데 옥시 시티 딘 3 인산과 4 DNA 미행 (비오틴-dCTP)

    DNA 분자는 이상 1 μm의이 갇혀 구슬에 대한 흐름과 고정에서의 확장을 용이하게해야한다. 또한, 긴 DNA는 DNA 결합 단백질을 조명으로부터 IR 트래핑 광을 방지 할 수 있습니다. 이는 IR 광의 흡수를 증가 광표백에 흥분된 발색단 결과에서 특별한 관련성이있다. 참고 : 본 연구에서는 DNA 분자가 3.7 μm의 긴이었다. 분자는 기본 연산자 O1의 세 사본이 보조 사업자 O2와 O3의 각 사본이 포함되어 있습니다. 이러한 서열은 이렇게 포획 구슬과 IR 레이저 빔로부터 등거리 결과, 분자의 중간에 삽입되어있다.

    1. 비오틴-14-dCTP의 60 pmol의 5 배 터미널 deoxynucleotidyl 트랜스퍼 라 (TDT) 버퍼의 4 μL (1 M 칼륨 캘리포니아와 선형 DNA 3'-말단의 1 pmol의 혼합codylate, 125 mM 트리스, 0.05 % (v / v)로 트리톤 X-100, 5 mM의 CoCl2를 20 μL의 총 볼륨) 및 TDT의 1.5 μL 및 DDH 2 O (25 ° C에서의 pH 7.2). 15 분 동안 37 ° C의 혼합물을 품어. 이 DNA 말단 당 최대 60 개의 뉴클레오티드를 추가하면된다. 3'-돌출이 오목 또는 평활 말단보다 더 높은 효율로 꼬리되는 DNA를합니다.
    2. TDT 반응 버퍼에서의 CoCl2를 제거하는 스핀 열 또는 페놀 / 클로로포름 추출 및 후속 에탄올 침전와 꼬리 DNA를 정화.
    3. 정제 한 후, DNA는 몇 주 동안 이상 기간 동안 -20 ° C에서 4 ° C에 보관하지만, 반복 해동과 재 냉동을 방지 할 수 있습니다.

    5 표지 단백질 ATTO532와 티올 그룹

    시스테인 잔기의 수정을 통해 레이블링 단백질의 활동을 변경하지 말아야합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 돌연변이의 lacI, LacIQ231C, whic 사용H는 단백질의 안정성을 방해하지 22 것으로 나타났다 위치 231이 돌연변이는 위치 231에 야생형 및 화학적 변형의 동일한 특성을 보존시 단량체 당 하나의 시스테인을 운반. 참고 : 우리는 ATTO532 말레이 미드와 단백질을 표시.

    1. 단백질이 7.0-7.5 2에서 10 ㎎ / ㎖ 농도 범위와 pH 범위와 버퍼에 용해되어 있는지 확인합니다. NOTE :이 실험에서의 lacI가 인산 칼륨 0.3 M, 5 % 포도당, pH가 7.5 (A 버퍼)에 용해시켰다.
    2. 디졸브 트리스 - (2 - 카르복시 에틸) H 2 O.의 100 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP) TCEP 솔루션은 사용하기 신선한 전에 준비를해야합니다.
    3. 조심스럽게 3 μL의 TCEP와 소용돌이와 단백질의 100 μl를 섞는다.
    4. 낮은 광 조건에서 작동하는 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 N, N 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 색소를 용해. 와동까지 완전히 용해.
    5. 반응 마일X :주의 깊게 단백질 + TCEP와 소용돌이에 염료의 33 μl를 추가합니다. 패스트 스핀 최대한 용액을 수집한다.
    6. 20 ° C에서 진탕 (8000 RPM)에서 2 시간 동안 반응 믹스를 품어 (또는 4 ° CO / N에) 빛으로부터 보호.
    7. L-글루타티온 O. H 2에서 100 ㎎ / ㎖의 최종 농도 (GSH) 환원 용해 반응 혼합물에 3 μl를 첨가하고 15 분 동안 8,000 rpm에서 진탕 배양한다. GSH는 티올 그룹의 반응성을 차단하여 반응을 중지합니다.
    8. 표준 겔 여과 컬럼, 투석 또는 회전 농축기를 이용하여 표지 된 단백질을 정제 하였다. 참고 :이 실험에서, 표시 Laci 팀이 10 kDa의 컷오프 스핀 집중 장치를 사용하여 정제 하였다.
      1. 8000 XG, 1 시간, 4 ° C에서 그것을 버퍼의 최대 12 ml의 반응 혼합물을 희석 집중 장치에 적용, 원심 분리기. 표지의 lacI 따라서 약 500 μL의 최종 부피로 농축시키고, 과량의 염료는 플로로 막을 통과한다w-통해. 플로우 스루 (flow-through) 단계를 반복 5.8.1 최소 세 번 이상 폐기하십시오.
    9. -80 ° C에서 작은 분취 및 저장소로 표시된 단백질을 나눈다. 반복되는 동결 융해을 피하십시오.

    (6) 복합 광학 트랩 및 단일 분자 형광 이미징 실험

    1. 버퍼 컨테이너에 버퍼의 1 ML을 추가하고, 연결 튜브를 씻어 셀 흐름에 200 mbar의 압력을 적용합니다. DNA, 여기에서 다음과 같은 단계에 결합 된 단백질의 확산을 극대화하기 위해,이 낮은 이온 세기 완충액으로 대체 될 수있다 버퍼. 참고 :이 실험에서 우리는 TBE의 0.5 배를 사용했다.
    2. 흐름의 매끄러움을 방해 할 수있는 공기 거품의 존재를 확인합니다. 배출 튜브에 부드러운 영화는 남아있는 거품을 제거하는 데 도움이 될 것입니다.
    3. 20 밀리바에 압력을 낮추고 모든 채널 및 튜브 기포가 분명하고 버퍼가 모든 채널에서 비슷한 속도로 흐르고 있는지 확인합니다.
    4. 300 μL의 최종 볼륨으로 샘플을 준비합니다 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 폴리스티렌 비즈 1.87 μm의; 4 절에 따라 모두 사지에 비오틴 선형 DNA의 20 μM의; Laci 팀의 사량의 300 오후 5 절에 따라 ATTO532으로 표시.
    5. 다음 순서 주사기 용기 중 하나에 각각의 샘플을 추가 구슬 촬상 버퍼 만 (완충액 + 탈산 소제 시스템) 및 제 채널 표지 단백질과 두 번째, 세 번째 채널의 첫 번째 채널, DNA에.
    6. 3 분 동안 200 밀리바에서 흐름을 켜하면 샘플 유동 채널 내에 도착 할 수 있습니다. 그런 다음 20 밀리바에 압력을 줄일 수 있습니다.
    7. 명 시야 조명하에 제 채널을 이미징하는 동안, 2 개의 광 핀셋 켜고 각 트랩의 폴리스티렌 비드 타기.
    8. 다른 구슬이 함정에 빠질 것을 방지하기 위해 상기 제 2 채널로 빠르게 이동합니다. DNA 채널에서 도착 비드 유동의 단부에 의해 쉽게 눈에 띄게되어 있습니다.
    9. O를 사용하여AOD (NE)는,이 광학적으로 갇혀 비드 사이에서 유동하게 연장 된 DNA의 부착을 허용하도록 앞뒤로 다른 비드에 근접하여 하나의 트랩 (비드)를 이동. DNA 아령 형성 할 때에, 정전기 비드 적극적 앞뒤로 트랩에 의해 이동되는 비드의 움직임을 따라 시작한다.
    10. 버퍼 채널로 빠르게 이동하고 버​​퍼 흐름을 끕니다. 하나의 DNA 분자의 존재를 확인하기 위해 강제로 확장 곡선 분석 4,23-25을 수행합니다. 두 개 이상의 분자가 존재하는 경우, 덤벨을 폐기하고, 단계 6.7에서 다시 시작하는 (즉, 힘 - 신장 곡선의 위상을 올리는 enthalpic는 DNA 윤곽 길이보다 짧은 길이에서 발생한다).
    11. 하나의 DNA 아령 구한 후, 다시 흐름을 켜고 단백질 채널에 아령을 이동합니다. DNA와 표지-​​의 lacI의 상호 작용을 모니터링하는 넓은 필드 형광 현미경으로 전환. 흐름을 끄고 수집을 시작합니다.

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Representative Results

성공적인 실험에서, 하나 (또는 그 이상)의 표지 단백질은 DNA 분자 (도 3a)을 따라 / 바인딩 해제 및 / 또는 확산 monodimensional 바인딩 거친다. DNA 분자에 따라 단백질의 지역화는 DNA 서열의 함수로서 운동 매개 변수의 정량화를 허용한다. 1D 확산을 일으키는 버퍼 조건이 적용될 때, 확산 계수 D (1D), 예를 들어, 단백질의 궤적을 따르고, 결정하는 것이 가능하다.

단일 스폿의 정확한 위치는, 각 프레임에서, 더 빠른, 최근 발표 된 알고리즘으로, 대용량 데이터 세트를 처리 할 때 (대안 적 방사형 bidimensional 가우시안 함수와 점 분포 함수 (PSF)를 피팅 또는 의해 결정될 수있다 대칭 센터, RSC) (26, 27). 후자의 방법은 가우스 피팅 일반적으로 비교할 현지화 정밀도를 달성, 이미지의 최대 방사 대칭의 지점을 결정합니다. 보일 예는, 추적 27 자유롭게 접근 할 수 MATLAB 루틴을 통해 달성 될 수있다.

도 3a는 DNA 분자의 중심에 위치한 또 다른의 lacI 분자 특별히 한 오퍼레이터에 결합 된 상태에서 하나의 lacI 분자가 비 특정 DNA 서열을 따라 확산되는 전형적인 실험의 kymogram를 나타낸다.도 3b는 두 개의 위치를 도시 의 lacI 분자는 시간의 함수로서,이 트랩 (X)의 중심을 연결하는 방향 (RSC를 사용하여 얻어진 것). DNA 분자를 따라 확산 분자의 위치에서, 우리는 다음 식에 따라 서로 다른 시간 간격에서 평균 제곱 변위 (MSD)를 계산치 :

식 (1) (1)

N이 어디에 위치들의 총 수를 측정하고 N 측정 인덱스 f를 거 N에 롬 1. 순수한 일차원 브라운 확산 발생시, MSD는에 정비례 N Δt를 두번 확산 계수와 동일한 기울기 (Δt를 두 개의 연속 된 프레임들, 실험의 100 밀리 초 사이의 시간 간격) (MSD (N, N) = 2D nΔt). 4 DNA를 따라 확산 분자 MSD nΔt 대 플롯을 보여줍니다. 단백질의 확산 계수 용이 MSD nΔt VS 플롯의 선형 피팅을 얻을 수있다. 그와 같은 N이 증가로부터 MSD 식을 계산하기위한 점의 개수를 참고. 하나는 결과적으로 감소한다. MSD의 평가에 오류가 따라서 n은 증가한다. 이러한 이유로, 우리는 N = N / 4로 분석을 제한하기로 결정했습니다. 이것은 어차피 많은 연구소에서 사용하는 N / (10)에 비해 매우 큰 값이다.

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할로겐 램프 (H), 콘덴서 (C), 샘플 (S), 압전 변환기 (XY 및 z), 목적 (O), 낮은 배율 카메라 (CCD 200X) 높은 : 그림 1은 실험 장치는 다음과 같이 구성 -magnification 카메라 (BS는 50:50 빔 스플리터 큐브이다) nm의 안정화 피드백에 사용되는 (CCD 2,000X는). 더블 광 핀셋은 삽입 이색 미러 (D2 및 D3) 및 관통 현미경의 광축으로부터 추출 노스 다코타 : 포함하는 빔 스플리터 큐브 (PBS), 음향 광학 편 향기 (AOD), 1,064 nm의의 간섭 필터 (F1과 F2)을 편광 / 2 파장 판을, YAG 레이저 (1,064 nm의), 광 아이솔레이터 (OI) λ, 사분면 검출기 포토 다이오드 (QDP). QDPs에서 신호는 아날로그 - 디지털 변환기 (ADC)를 통해 취득하고 FPGA 보드 정교화되었다. 두 맞춤식 직접 디지털 합성기 (DDS)는 트랩 '위치를 제어 할 수 AODs를 몰았다. 디지털 입출력 보드 (DIO)을 제어각각 압축기 (0.5 기압) 및 주위 압력 (0 기압)에 연결된 두 개의 솔레노이드 밸브 (V1 및 V2)의 구경. LabVIEW 소프트웨어는 압력 측정기 (PM)을 통해 가압 탱크 (C1) 내의 압력을 모니터링하고 자동으로 원하는 압력 레벨에 도달하기 위해 두 밸브 중 하나를 개방. 형광은 여기 Nd를 복제에 의해 제공되었다 : YAG 레이저 (532 nm의) 및 전자 상에 투사 된 이미지를 카메라 (EMCCD)를 곱한. M은 이동 거울, F3 방출 필터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
도 2 (A) 유동 시스템 다이어그램. 압력 제어 시스템은 V1과 V2 연결 압력 측정기 (PM) 및 2 개의 솔레노이드 밸브 (Solenoid Valve)로 구성되어있다0.5 기압 (PRS)에서 각각 주위 압력 (ATM)에 압축기 에디션. X1과 X2는 3 방향 커넥터를 나타낸다. 밸브의 구경은 잘게 4 완충액 용기와 압력 저장조 C1에서 원하는 압력에 도달하도록 조절된다. 각 주입 튜브 채널 유동 챔버의 입구 / 오프 밸브에 독립적 인을 포함한다. 출구 배관은 주위 압력에 배치 폐기물 컨테이너 C2에 접속된다. 도면은 확대되지 않습니다. (B) 멀티 채널 흐름 챔버의 도식 표현합니다. 네 층류 흐름 별도로 기능화 폴리스티렌 비즈, DNA 분자, 영상 버퍼와 표지 단백질을 이동시키다. 두 구슬은 듀얼 광 핀셋으로 잡아서 DNA 그들 사이에 고정 할 수 있도록 DNA 채널로 이동합니다. DNA 힘 - 연장 분석은 이후, DNA는 단백질 채널에서 배양되고, 하나의 DNA 분자의 존재를 확인하는 버퍼 채널에서 수행된다. 삽입 된 마 그니를 보여줍니다최종 분자 구조의 문법을 없애는 버퍼 채널에서 단일 분자 이미징을위한 준비. 도면은 확대되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
신장 된 DNA 분자와 상호 작용하는 단일의 lacI 분자도 3 지역화. (A) kymogram의 세로축은 가로축이 시간 (100 msec의 획득 시간) 동안, DNA 분자에 평행 x 좌표. (B를 나타내고 시간 Laci은 분자의) X 위치입니다. 분자의 위치는 RSC에 의해 결정 하였다. 이미지는 100 밀리 초 노출 시간 및 1.25 × 10 -2 승 cm에서 취득한 -2 EXCI테이션 레이저 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 신장 된 DNA 분자를 따라 확산 단일 Laci은 분자에 대한 시간 MSD의 4 플롯은. MSD는 그림 (b) (적색)로 표시 위치 레코드에서 계산됩니다. 도면에 도시 된 데이터의 선형 회귀로부터 얻어진 확산 계수 D (1D)는 0.030 ± 0.002 μM 2-1.

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Discussion

지난 10 년 동안 단일 분자 조작 및 이미징 기술은 공간과 시간 해상도 측면에서 큰 진전을 보았다. 조작 및 이미징 기법의 조합은 지금 같은 DNA, RNA 또는 세포 골격의 필라멘트와 같은 하나의 생물학적 고분자의 기계적 상태의 제어를 가능하게 강력한 기기의베이스와 같은 중합체와 상호 작용하는 단일 단백질의 동시 위치 파악에 있어요 . 포획 된 중합체의 기계적 조건을 제어하는​​ 것이 특히 중요하다. 사실, 살아있는 세포에서 핵산 연속적 효소와 단백질의 상호 작용에 의한 기계적인 스트레스를 받고있다; 유사하게, 단백질과 상호 작용하는 분자 모터의 복잡한 네트워크는 골격 필라멘트에 장력을 조절한다. 한편, 검출 가능성이 정확하게 핵산과 상호 작용하는 단백질을 지역화 그들의 PO의 함수로서 분자 상호 작용의 측정을 허용DNA 또는 RNA 서열을 따라 구성비.

단일 분자 조작 및 이미징 기술을 결합하여 실험 설정 및 생물학적 구조의 신중한 설계가 필요합니다. 광학 트랩 현탁 중합체 나노 수준의 안정성을 보장하는, 안정된지지를 제공해야한다. 이러한 안정성은 기계 소음의 다양한 소스의 실험 장치의주의 분리를 통해 레이저 포인팅 및 진폭 변동을 최소화하여 도달 할 수 있습니다. 광학 트랩의 정확한 (서브 나노 미터) 운동은 DDSS에 의해 구동 AODs을 사용하여 달성된다. 여기서 우리는 최적화하고 나노 수준에서 광 핀셋 '의 안정성을 확인하는 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

EMCCD 카메라에 결합 간단한 넓은 분야 에피 형광 현미경은 일시 중단 된 고분자와 상호 작용하는 하나의 발색단을 지역화하는 데 사용됩니다. 우리의 실험 분석은 공간 분리 내기를 보장하기 위해 긴 DNA 또는 RNA 분자 (≥6 KBP)로 제한됩니다트래핑 레이저 광 및 형광 프로브를 싸우는. 발색단이 여기 상태 16에있는 동안 실제로 가시적 여기 레이저와 근적외선 레이저 트래핑의 중첩에 의한 근적외선의 흡수 발색단의 광표백 향상으로 이어질 것이다. 덤벨 조립체 더 우리의 상세한 설명을 제공하는 멀티 플로우 셀을 사용하여 수득되는 다른 까다로운 절차이다. 우리는 버퍼 흐름 및 방법 달리 심각하게 손상시킬 수 실험 기포를 방지하는 방법을 최적화하는 방법을 나타내었다. 우리는 단백질 라벨에 스트렙 타비 딘 - 코팅 구슬을 사용하여 아령 조립에 필요한 비타민 B 복합체, 및 프로토콜 DNA 말단의 레이블을위한 프로토콜을 설명했다. 마지막으로, 우리는 신장 된 DNA 분자의 단일 유당 억제 분자의 결합 및 확산 정량화하는 실험을 수행하는 단계별 작업을 보여줍니다.

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Acknowledgments

우리는 샘플 준비에 대한 도움말 미세 유체 및 알레 Tempestini에 대한 도움말 Gijs Wuite, 어윈 JG 피터 맨, 피터 그로스 감사합니다. 이 연구는 N 284464을 °와 Ricerca 2013 RBFR13V4M2 교육, 대학 및 연구 FIRB 2011 RBAP11X42L006, FUTURO의 이탈리아어 자원부에서, 그리고 프레임 워크에 부여 계약에 따라 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이)에 의해 투자되었다 주요 프로젝트 NANOMAX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

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References

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