שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מולקולה בודדת טכניקות (SM) פיתחו במידה רבה בשלושים השנים האחרונות להיענות לצורך להתגבר על חלק מהמגבלות של מדידות מסורתיות, בתפזורת פתרון 1-3. המניפולציה של מולקולות ביולוגיות בודדות יצרה הזדמנות כדי למדוד תכונות מכאניות של biopolymers 4 ולשלוט בפרמטרים מכאני חלבונים 5 ואינטראקציות החלבון-DNA 6,7 של. גילוי הקרינה SM, לעומת זאת, מייצג את הכלי תכליתי להפליא ללימוד פעילות חלבון במבחנת in vivo, שמוביל לאפשרות של איתור ומעקב אחר מולקולות בודדות בדייקנות ננומטר. באמצעות התאמה של מכשיר נקודת התפשטות פונקציה לתמונת SM, למעשה, אחד יכול להשיג לוקליזציה עם דיוק תלוי בעיקר על יחס אות לרעש (SNR) ולהגיע לגבול של כננומטר 8,9. מתודולוגיות אלה למצוא חזקותיישומים בחקר הדינמיקה של חלבוני מנוע, כמו גם של תהליכי דיפוזיה שבבסיס חיפוש יעד במחייב חלבוני DNA. היכולת של קביעת קבועי דיפוזיה כפונקציה של רצף DNA, זמן מגורים ביעד ומדידה מדויקת של אורך DNA חקר במהלך אירועי דיפוזיה חד ממדיים, מייצגת כלי רב עוצמה ללימוד דינמיקת אינטראקציה החלבון-DNA ולבירור של מנגנוני חיפוש יעד ספציפי.

לאחרונה, השילוב של שתי הטכניקות הללו יצר דור חדש של setups הניסיוני 10-14 המאפשר מניפולציה בו זמנית של מצע ביולוגי (למשל נימה אקטין או מולקולת DNA) ואיתור / לוקליזציה של אנזים שותף באינטראקציה (לדוגמא שרירן או חלבון קושר DNA). היתרונות של טכניקות אלה בעיקר לנוח על האפשרות של הפעלת שליטה מכאנית על פני הפולימר הלכוד, וכך ENAבלינג המחקר של דינמיקת אינטראקציה מול כוחות או מומנטים. כמו כן, המתודולוגיה מאפשרת מדידת תגובות ביוכימיות רחוקה מהמשטח, הימנעות אחת המגבלות העיקריות של שיטות קלאסיות SM, כלומר, (שקופית זכוכית או microspheres) את הצורך בקיבוע של המולקולות הנחקרות על משטח.

השילוב של שתי טכניקות מולקולות בודדות דורש התגברות על כמה קשיים טכניים, בעיקר כתוצאה מהדרישות של יציבות מכאנית ויחס אות לרעש הולם (במיוחד כאשר דורש לוקליזציה בדייקנות ננומטר) 15. במיוחד, כאשר צימוד גילוי הקרינה SM עם פינצטה אופטית, הפחתת הרעש וphotobleaching מלייזרי לכידת אינפרא אדום 16 והשליטה של מאגרים ביוכימי להרכבה של הקומפלקסים הביולוגיים וביצועים של המדידות הניסיוניות 11 הם בעלי חשיבות עליונה. כאן, אנו מתארים את השיטות לביצוע מוצלחמדידות בהתקנת לוקליזציה לכידה / SM הקרינה כפולה. המתודולוגיה מאוירת בדוגמא חלבון זה מדכא לקטוז (לאצי) שכותרתו fluorescently (עם Atto532) וזוהה כהוא נקשר למולקולת הדנ"א (לכודה בין שתי פינצטה אופטית) המכיל רצפי אצים ספציפיים מחייבים (כלומר, מפעילים) של. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באיתור מחייב של לאצי לDNA ודיפוזיה לאורך קווי המתאר שלה בתהליך חיפוש היעד. השיטה ישימה לכל שילוב של רצף DNA וחלבון קושר DNA, כמו גם למערכות אחרות (microtubules או סיבי אקטין וחלבוני מנוע אינטראקציה איתם).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 הגדרת פינצטה אופטית עם ננומטר יציבות

ההתקנה הניסיונית חייבת לספק שתי פינצטה אופטית עם מצביע על יציבות בתנודות רמת ננומטר ועוצמת לייזר הלכידה מתחת ל -1%. שילוב של תנאים אלה יבטיח יציבות ננומטר של המשקולת תחת מתח טיפוסי (1 PN - כמה עשרות PN), נוקשות מלכודת (0.1 PN / ננומטר) ורוחב פס מדידה (שיעור רכישת תמונה 20 שניות -1). ערכה של הגדרת הניסוי מתוארת באיור 1.

  1. עיצוב אופטי פינצטה ובניית 15,17:
    1. הר המנגנון הניסיוני על שולחן אופטי עם מבודדים פעילים כדי להפחית את התנודות מכאניות. הר מבנה מיקרוסקופ על מבודדי אלסטומרי לספוג רעש אקוסטי ותהודה מכאנית של מבנה מיקרוסקופ.
    2. הכנס המבודד אופטי בדרכו של לייזר ההשמנה, קרוב למקור הלייזר, לימיןeduce תנודות משרעת אקראיות בשל משוב אופטי.
    3. להפחית את אורך הדרך של לייזר הלכידה ככל האפשר ולהקיף את כל הדרך בקופסא אטומה כדי להפחית תנודות הצבעה הלייזר בשל זרמי אוויר ומערבולות.
    4. צור פינצטה הכפולה אופטית על ידי פיצול מקור לייזר אינפרא אדום קרוב יחיד (Nd: YAG לייזר, 1,064 אורך גל) לשתי קורות עם קיטובים מאונך. אין להשתמש במלכודות-משותף זמן, כי הם גורמים לתנודה של המשקולת תחת מתח 12.
    5. השתמש deflectors acousto אופטי (AODs) מונע על ידי סינתיסייזרים ישירים דיגיטליים (DDSs) כדי לאפשר תנועות עדינות של מלכודת אחת (לפחות) ורגולציה מדויקת של מתח DNA. DDSs לאפשר יציבות מלכודת טובה יותר מאשר מתנדים בשליטת מתח (VCOs).
    6. הכנס שתי דיודות גלאי הרבע (QDPs) במישור המוקד האחורי של הקבל כדי לזהות את המיקום של חרוזים לכודים עם דיוק תת ננומטר.
  2. בדוק שf העצמהluctuations של לייזר ההשמנה בכניסה מיקרוסקופ הוא מתחת ל -1% על ידי שימוש בדיודת אור עם רוחב פס גדול יותר משיעור רכישה של תמונה.
  3. לבדוק את היציבות מצביעה משני לייזרי השמנה:
    1. הכינו חרוזים סיליקה בחיץ פוספט: לדלל 20 μl של חרוזים סיליקה (1.54 מיקרומטר, מוצקים 10%) ל1 מ"ל של אצטון, sonicate 30 שניות, בקצרה מערבולת, ו צנטריפוגות 2 דקות ב 19,000 x גרם. Resuspend באצטון 1 מ"ל ולשטוף חוזרים. Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ פוספט 50 מ"מ, לשטוף 2 פעמים, ולבסוף resuspend ב50 מ"מ חיץ פוספט 100 μl.
    2. לכייל פינצטה אופטית עם חרוזים סיליקה: להכין תא זרימה על ידי הצמדת coverslip לשקופית מיקרוסקופ באמצעות קלטת דו דביקה (כ -60 מיקרומטר עבה). לזרום 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ולחכות 3 דקות. לזרום חרוזים סיליקה בדילול 1 / 1,000 בחיץ פוספט ולאטום את תא הזרימה עם גריז סיליקון. חרוז אחד מלכודת בכל מלכודת ולכייל את המלכודות בשיטת ספקטרום הכח 18. הכינו חרוזים סיליקה בתצטטי pentyl וnitrocellulose: לדלל 20 μl של חרוזים סיליקה (1.54 מיקרומטר, מוצקים 10%) ל1 מ"ל של אצטון, sonicate 30 שניות, בקצרה מערבולת, ו צנטריפוגות 2 דקות ב 19,000 x גרם. Resuspend באצטון 1 מ"ל ולשטוף חוזרים. Resuspend ב 1 מ"ל של אצטט pentyl ולשטוף 2 פעמים. לבסוף resuspend אותם אצטט pentyl עם nitrocellulose 0.1% מומסים ביצטט pentyl.
    3. מורחים 2 μl של חרוזים 1.54 מיקרומטר קוטר סיליקה מומסים בnitrocellulose 0.1% אצטט pentyl על פני השטח של coverslip (24 x 24 מ"מ) באמצעות coverslip שני (24 x 60 מ"מ). צרף את coverslip לשקופית מיקרוסקופ באמצעות שתי חתיכות של נייר דו צדדי כדי ליצור תא זרימה. מלא את זרימת התאים עם חיץ פוספט 50 מ"מ ולאטום אותו עם גריז סיליקון.
    4. חרוז סיליקה תמונה אחת במיקרוסקופיה brightfield בהגדלה 2,000X. שדה הראייה צריך להיות מיקרומטר 7 X 5 שנרכש ב768 x 576 פיקסל, כך שתמונת חרוז יש קוטר של 190 עמ 'ixels. לפצות מרחף תרמית עם תוכנת משוב ש, כמו נ"צ. 17, את מחשבת את מיקום XY מcentroid התמונה וz מהטבעות העקיפה ומתקן מרחף נע שלב piezo עם ננומטר דיוק או טוב יותר.
    5. חפיפת מרכז המלכודת נשארת עם מרכז חרוז (רמות אות XY מQDP חייבת להיות זהות נמדד במהלך הכיול) ולמדוד את רעש העמדה וסטיית התקן שלה מQDP. חזור על המדידה למלכודת הנכונה.

.2 מולקולה בודדת לוקליזציה עם דיוק ננומטר

  1. עיצוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו15,19 הבנייה
    1. השתמש ביעילות קוונטית גבוהה וCCD-מוכפל אלקטרון כדי להגיע ליחסי אות לרעש גבוהים הנדרשים לדיוק לוקליזציה ננומטר.
    2. בחר אופטיקה כדי לקבל גודל ~ 80 ננומטר פיקסל תמונה (לדוגמא, הגדלת תמונה ~ 200X עם גודל פיקסל מצלמה של 16 מיקרומטר). זה suffiבמידה מספקת קטן להזניח את שגיאת לוקליזציה בשל pixelation 8, אבל גדול מספיק כדי לאסוף מספר לא מבוטל של פוטונים לפיקסל.
    3. כמקור עירור, להשתמש באור הלייזר שהוא unpolarized (על ידי עובר דרך סיבים אופטיים שאינו-שמירה על קיטוב) או מקוטב מעגלי (על ידי עובר דרך λ / 4 waveplate) על מנת למקסם את העירור של chromophores אחת, ללא קשר לנטייתם.
    4. בחר מסנני bandpass הפליטה שיעילות חתוכים שני אורות לייזר העירור והשמנה. הערה: בניסויים שלנו אנחנו כותרתו החלבון שלנו עם צבע Atto532 ומשמשים מסנן פליטת bandpass מרוכז ב ננומטר 600 עם 100 רוחב פס ננומטר.

.3 מיקרופלואידיקה

כדי להשיג שליטה מדויקת של חילופי חיץ והרכבה 'מטומטם', כלומר, העיגון של מולקולת DNA חד בין שני microspheres הלכוד אופטי, זרימה רבת ערוצים למינרית בנויות מותאמת אישיתמערכת חייבת להיות מפותחת. זה מורכב על ידי זרימת מערכת בקרת לחץ (איור 2) קאמרי, לחץ מאגר ו.

  1. הכנת תא זרימה
    הערה: תא הזרימה המשמש לניסויי מולקולה בודדת באינטראקצית החלבון-DNA יש רצוי 4 פתחי הכניסה ויציאה 1, כדי לאפשר לעד 4 תזרים חיץ מקביל, כל אחד מהם מכיל אחד מהמרכיבים השונים הנדרשים לניסוי: חרוזים, DNA, fluorescently שכותרתו חלבון, וחיץ הדמיה. הפרדה של הרכיבים בזרימת הערוצים מאפשרת הרכבה יעילה של המשקולת. יתר על כן, ערוץ ההדמיה הוא שימושי כדי למנוע הקרינה רקע מחלבונים לשדר ולהשיג את יחס אות לרעש הגבוה הנדרש ללוקליזציה של החלבון קושר DNA עם דיוק מסדר גודל של כמה ננומטרים.
    1. חורי מקדח 1 מ"מ קוטר בשקופית מיקרוסקופ (76 x 76 x 1 מ"מ) עם יהלומים-קצה, על מנת ליצור 4 פתחי הכניסה ויציאה אחת.
    2. ה נקייהמיקרוסקופ האלקטרוני שקופיות עם אתנול ולמרכז את היציאה עם O-הטבעת מוכנסת וטבעת הדבק בשקופית המקיפה את חורי הגישה. זה הוא יסוד ללבוש כפפות במהלך שלב זה, כדי למנוע טביעות אצבעות, שיפריעו לתהליך ההדבקה.
    3. הצמד את NanoPorts לשקופית, ולמקם אותו בתנור שחומם מראש ב 180 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר התקשרות מלאה.
    4. צייר את תבנית קווי המתאר של תא הזרימה על פיסת נייר. הערוצים צריכים להיות ~ רחבים 3 מ"מ ולהתאים את עמדת חורים בשקופית מיקרוסקופ.
    5. מניחים את הציור על גבי שתי חתיכות של Parafilm, ועם אזמל לבצע קיצוצים חדים ומתמשכים לאורך קו המתאר נמשך. הסר את כל בליטה שנוצרה. מחק את שכבת Parafilm נמוכה יותר, אשר רק משמשת להבטחת תמיכה נקייה.
    6. מניחים את שקף מיקרוסקופ המכיל NanoPorts המצורף הפוכה בתמיכה מתכתית.
    7. בזהירות ליישר את קווי המתאר תא Parafilm עם החורים, מה שהופך את ה בטוחהבparafilm לא obtrude פתחי הכניסה ויציאה של התא.
    8. כסה עם coverslip ניקה מיקרוסקופ (62 x 56 x 0.15 מ"מ) ולהסיר Parafilm עודף המקיף את התא בזהירות.
    9. מניחים שני בלוקים חום, מחוממים בעבר ב120 ° C, על גבי תא הזרימה להפעיל לחץ קבוע על זה. בואו Parafilm להמס כ 25 דקות.
  2. מאגר לחץ ומכולות חיץ
    מאגר הלחץ צריך להיות עשוי מפרספקס (או דומה) ולאפשר אירוח של שש מכולות חיץ. האפשרות שיש לפחות שתי מכולות חיץ נוספות משפרת את גמישות כלי. שים לב שמכל שקוף וצינורות במידה ניכרת לסייע בטיפול בזרימת מערכת ופתרון בעיות של בועות אוויר שנלכדו. המזרקים luer סטרילי וחד פעמי נעילת קצה (2.5 מ"ל), שממנו הבוכנות הוסרו בעבר, הם מיכל חיץ טוב ולאפשר חיבור קל עם צינורות היניקה. ודא שנפח הנוזל הכולל הוא קטן בהשוואה לבתוך מאגר הלחץ, תנאים הכרחיים להשגת זרימה חלקה ויציבה נפח האוויר.
    1. חבר שסתומי כיבוי ביציאה של מכולות החיץ להפיכת זרימת החיץ או לבטל במהלך הניסויים.
    2. הר תא הזרימה על הבמה מיקרוסקופ. חבר את שסתומי הכיבוי לפתחי כניסת תא זרימה עם צינורות polyetheretherketone (קוטר ~ 150 מיקרומטר הפנימי) ואבזרי flangeless. להוסיף ~ 3 סנטימטר של צינורות פרופילן אתילן פלואור (קוטר ~ 500 מיקרומטר הפנימי) כזיקה בין צינורות ומכלולי NanoPort של תא הזרימה. צעד זה הוא הכרחי על מנת לצמצם את זרימת החיץ בכניסה החדר, כדי למנוע שבירה של תא הזרימה או ניתוק NanoPort מהזכוכית. השימוש בצינורות בקוטר פנימי גדולים לבד, ומצד שני, היה דורשים כמויות ענק של דגימות ביולוגיות.
    3. חבר את שקע תא זרימה לצינור פלקון פתוח בלחץ אטמוספרי. זהצינור משמש כלרשות לחיץ זורם מתוך תא הזרימה.
  3. מערכת בקרת לחץ
    1. לבנות מערכת בקרת לחץ מסוגלת דק התאמת לחץ האוויר בתוך מאגר הלחץ. ניתן לעשות זאת על ידי השימוש בשני שסתומים מבוקרת מחשב סולנואיד, אחד מחובר למקור לחץ +0.5 כספומט (מדחס) ושנייה אחת ללחץ אטמוספרי. שסתומים סולנואידים נפתחים שוב ושוב לכ 7 אלפית שניים כדי להגדיל או להקטין את הלחץ בקו עד שיגיע לערך הרצוי. הערה: גישה זו הותאמה מקרלוס בוסטמנטה 20, וזה מניב תזרים חלק יותר מאשר באמצעות משאבת מזרק מנוע דריכה 21.
    2. להוסיף מתמר לחץ נשלט על ידי תוכנה אישית בכתב לפקח על הלחץ האפקטיבי שהופעל על מאגר הלחץ. לחצי עבודה אופייניים הם בסדר הגודל של 20 mbar להרכבת משקולת ו200 mbar לשטיפת רכיבי מערכת זרימה.

    .4 DNA טאי-לינג עם Biotinylated Deoxycytidine טריפוספט (ביוטין-dCTP)

    מולקולת הדנ"א צריכה להיות יותר מ 1 מיקרומטר כדי להקל על הארכתה על פי תזרים ועיגון לחרוזי לכודים. יתר על כן, DNA ארוך ימנע אור לכידת IR ממאיר את החלבון הקושר DNA. זה רלוונטי במיוחד משום שקליטה של ​​IR אור מתוצאות chromophore נרגשות בphotobleaching המוגבר. הערה: במחקר הנוכחי, מולקולת DNA הייתה ארוכה 3.7 מיקרומטר. המולקולה מכילה שלושה עותקים של המפעיל העיקרי O1 ועותק אחד של כל אחד משני מפעילי העזר, O2 וO3. רצפים אלה הוכנסו באמצע המולקולה, ולכן תוצאה במרחק שווה כ מחרוזי לכודים וקרן לייזר אינפרא אדום.

    1. מערבבים pmol 1 של DNA 3'-קצוות ליניארי עם 60 pmol של ביוטין-14-dCTP, 4 μl של חיץ 5x מסוף deoxynucleotidyl transferase (TDT) (ca M אשלגן 1codylate, 125 מ"מ טריס, 0.05% (v / v) טריטון X-100, 5 מ"מ CoCl 2 (pH 7.2 ב25 ° C)) ו1.5 μl של TDT וDDH 2 O בהיקף כולל של 20 μl. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. זה יגרום תוספת של עד 60 נוקלאוטידים לגפי DNA. הערה DNA ש3'-סככות הם זנב עם יעילות גבוהה יותר מאשר קצוות שקועי או בוטים.
    2. לטהר DNA זנב עם עמודות ספין או פנול / חילוץ כלורופורם ומשקעי אתנול שלאחר מכן להסיר CoCl 2 ממאגר תגובת TDT.
    3. לאחר טיהור, ניתן לאחסן DNA על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות או ב-20 מעלות צלזיוס למשך תקופות ארוכות יותר, אך להימנע הפשרה וrefreezing חוזרים ונשנים.

    חלבון תיוג .5 תיאול קבוצות עם ATTO532

    תיוג באמצעות שינוי של שאריות ציסטאין אסור לשנות את הפעילות של החלבון. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו משמשים מוטציה לאצי, LacIQ231C, which נושא רק ציסטאין אחד לכל מונומר בעמדה 231. מוטציה זו שומרת על אותם מאפיינים של הסוג בר ושינויים כימיים בעמדה 231 הוכח שלא להתערב ביציבות חלבון 22. הערה: אנו כותרתו החלבון עם maleimide ATTO532.

    1. ודא כי החלבון מומס בחיץ עם pH הנע 7.0-7.5 ועם ריכוז הנע בין 2 ל -10 מ"ג / מ"ל. הערה: בניסויים אלה, לאצי היו מומס בפוספט אשלגן גלוקוז 0.3 M, 5%, pH 7.5 (מאגר).
    2. לפזר Tris- (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine (TCEP) לריכוז סופי של 100 מ"ג / מ"ל בH 2 O. פתרון TCEP חייב להיות מוכן טרי לפני השימוש.
    3. מערבבים של החלבון עם TCEP 3 μl ומערבולת בזהירות 100 μl.
    4. ממיסים את הצבע בN, N -dimethylformamide (DMF) לריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל לעבוד בתנאי אור נמוכים. מערבולת מומסת עד לחלוטין.
    5. מיל תגובהx: הוסף 33 μl של צבע לחלבון + TCEP ומערבולת בזהירות. ספין מהיר כדי לאסוף כמה שיותר פתרון אפשרי.
    6. דגירה את תערובת התגובה למשך 2 שעות שבייקרה (8,000 סל"ד) בשעה 20 ° C (או ב4 CO ° / N), מוגן מפני אור.
    7. לפזר L-גלוטתיון מופחת (GSH) לריכוז סופי של 100 מ"ג / מ"ל בH 2 O. הוסף 3 μl לתערובת התגובה ולדגור על שייקר ב8,000 סל"ד במשך 15 דקות. GSH יהיה לעצור את התגובה על ידי חסימת תגובתיות של קבוצות תיאול.
    8. לטהר את החלבון שכותרתו באמצעות עמודות סטנדרטי סינון ג'ל, דיאליזה או ריכוז ספין. הערה: בניסויים אלו, אצי שכותרתו היה מטוהר באמצעות 10 ריכוז ספין הפסקת kDa.
      1. לדלל את תערובת התגובה עם עד 12 מ"ל של חיץ, להחיל אותו על מכשיר concentrator, ו צנטריפוגות זה ב8,000 XG, 1 שעות, 4 ° C.. האצים שכותרתו כך מרוכז לנפח סופי של כ -500 μl ועודפי הצבע עובר את הקרום בפלהw-דרך. מחק את הזרימה דרך וחזור על שלב 5.8.1 לפחות שלוש פעמים.
    9. מחלקים את החלבון שכותרתו לתוך aliquots קטנים וחנות ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.

    .6 משולבת אופטי השמנה וניסויים דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדת

    1. הוסף 1 מ"ל של חיץ למכולות החיץ ולהחיל 200 לחץ mbar לשטוף את צינורות חיבור וזרימת תא. על מנת למקסם את הדיפוזיה של החלבון מחייב את DNA, כאן ובשלבים הבאים, חיץ עשוי להיות מוחלף עם חיץ כוח יוני נמוך. הערה: בניסויים אלו, השתמשנו 0.5x TBE.
    2. לבדוק את קיומו של בועות אוויר, שעלול לשבש את הזרימה חלקה. קפיצי עדינים על הצינור לשקע יעזרו להסיר את כל בועות שנותרו.
    3. להקטין את הלחץ ל20 mbar ולוודא שכל הערוצים והצינורות ברורים מבועות אוויר והחיץ זורם עם מהירויות דומות בכל הערוצים.
    4. הכן את הדגימות לנפח סופי של μl 300: חרוזי פוליסטירן streptavidin מצופה 1.87 מיקרומטר; 20 PM של DNA ליניארי, biotinylated על שני הגפיים על פי סעיף 4; 300 PM של tetramer האצים שכותרתו עם ATTO532 לפי סעיף 5.
    5. להוסיף כל דגימה לאחת מכולות המזרק לפי הסדר הבא: חרוזים בערוץ הראשון, DNA בערוץ השני, שלישי עם חיץ ההדמיה בלבד (מערכת + נבלות חמצן חיץ) וחלבון הנקרא בערוץ הרביעי.
    6. הפעל את הזרימה ב200 mbar במשך 3 דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע בתוך ערוץ הזרימה. לאחר מכן להפחית את הלחץ ל20 mbar.
    7. בעוד ההדמיה הערוץ הראשון תחת תאורה בשדה בהירה, לעבור על שתי פינצטה אופטית ולתפוס חרוז קלקר בכל מלכודת.
    8. לנוע במהירות לערוץ השני, כדי למנוע שחרוזים אחרים ליפול לתוך המלכודות. שים לב שההגעה בערוץ DNA היא מורגשת בקלות עד סוף זרימת חרוז.
    9. באמצעות one AOD, להעביר מלכודת אחת (חרוז) הלוך ושוב בקרבתו של חרוז האחר כדי לאפשר את הקובץ המצורף של DNA מורחב הזרימה בין שני חרוזים לכודים אופטי. כאשר משקולת DNA נוצר, חרוז סטטי מתחיל הבא התנועה של חרוז שהוא פעיל נע הלוך ושוב על ידי המלכודת.
    10. לנוע במהירות לערוץ החיץ ולכבות את זרימת החיץ. לבצע ניתוח עקומת כוח הארכת 4,23-25 ​​כדי לאמת את הנוכחות של מולקולת DNA חד. אם מולקולה יותר מפעם אחת היא הווה (כלומר, enthalpic, העלאת שלב של עקומת כוח ההארכה מתרחש באורך קצר יותר מאורך גובה DNA), לבטל את המשקולת ולהתחיל שוב מצעד 6.7.
    11. ברגע שמשקולת DNA בודדת מתקבלת, להפעיל את הזרימה שוב ולהזיז את המשקולת לערוץ החלבון. לעבור למיקרוסקופ פלואורסצנטי השדה הרחב לעקוב אחר האינטראקציה של הכותרת לאצי עם DNA. כבה את הזרימה ולהתחיל רכישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסוי מוצלח, חלבונים שכותרת אחת (או יותר) עוברים מחייבים / דיפוזיה לא מחייבת ו / או monodimensional לאורך מולקולת הדנ"א (איור 3 א). לוקליזציה של חלבונים לאורך מולקולת הדנ"א מאפשרת כימות של פרמטרים הקינטית כפונקציה של רצף DNA. כאשר תנאי חיץ גורמים דיפוזיה 1D מיושמים, ניתן לעקוב אחר מסלולי חלבון, ולקבוע, למשל, מקדם הדיפוזיה D 1D.

המיקום המדויק של נקודה אחת, בכל מסגרת, ניתן לקבוע על ידי התאמת פונקצית מורחים פוינט (כוחות הביטחון הפלסטיניים) עם פונקצית גאוס bidimensional או, לחלופין, בעת טיפול בערכת נתונים גדולה, עם אלגוריתם מהיר יותר, שפורסם לאחרונה (רדיאלי מרכז סימטריה, RSC) 26,27. השיטה השנייה קובעת את נקודת הסימטריה רדיאלית המקסימלי של התמונה, להשגת דיוק לוקליזציה שהוא בדרך כלל דומה עם הולם גאוס. בboמקרי ה, יכולים להיות מושגת על מעקב דרך שגרת MATLAB שניתן לגשת באופן חופשי 27.

איור 3 א מציג kymogram של ניסוי טיפוסי שבו מולקולה לאצי אחד מפזרת לאורך רצפי DNA שאינם ספציפיים בזמן אחר מולקולת אצים קשורה באופן ספציפי למפעיל אחד, הממוקם במרכזה של מולקולת הדנ"א. איור 3 ב מציג את עמדתו של שני מולקולות אצים (שהושגו באמצעות RSC) לאורך כיוון חיבור המרכזים של שתי מלכודות (x), כפונקציה של זמן. מהעמדה של המולקולה לשדר לאורך מולקולת הדנ"א, חישבנו את ממוצע כיכר העקירה (MSD) במרווחי זמן שונים בהתאם למשוואה הבאה:

משוואת 1 (1)

כאשר N הוא המספר הכולל של עמדות נמדד וn הוא f מדד מדידה הולכת rom 1 עד N. במקרה של דיפוזיה בראונית חד-הממדית הטהורה, MSD הוא ביחס ישר לn Δt (Δt הוא מרווח הזמן בין שתי מסגרות ברציפות, בניסויים שלנו 100 אלפיות שניות), עם שיפוע שווה לפעמיים מקדם הדיפוזיה (MSD (n, N) = 2D 1 nΔt). איור 4 מראה את עלילת MSD vs nΔt למולקולה לשדר לאורך הדנ"א. ניתן להשיג בקלות מקדם הדיפוזיה של החלבון ליניארי בכושר של עלילת MSD vs nΔt. יצוין, כי נכון n עליות, את מספר הנקודות לחישוב MSD ממשוואה. 1 כתוצאה מכך פוחת. השגיאה בהערכה של MSD ובכך מגבירה עם n. מסיבה זו, בחרנו להגביל את הניתוח שלנו לn = N / 4. זה בכל מקרה ערך די גדול בהשוואה לN / 10 בשימוש על ידי מעבדות רבות.

tp_upload / 51,446 / "width =" 51446fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1 ההתקנה הניסיונית מורכבת: מנורת הלוגן (H), הקבל (C), מדגם (S), מתרגמים piezo (XY ו Z), מטרה (O), מצלמה נמוכה הגדלה (CCD 200X) וגבוהה המצלמה -magnification (CCD 2,000X) המשמש למשוב ננומטר-הייצוב (BS הוא קוביית מפצל 50:50 קורה). פינצטה אופטית זוגית מוכנסת וחולצה מן הציר האופטי של המיקרוסקופ דרך מראות dichroic (D2 וD3) ו כולל: Nd: YAG לייזר (1,064 מייל ימי), מבודד אופטי (OI), λ / 2 waveplates, קיטוב קוביות מפצל אלומה (PBS), deflectors acousto אופטי (AOD), 1,064 מסנני התאבכות ננומטר (F1 ו F2), גלאים רבע דיודות (QDP). אותות מQDPs נרכשו באמצעות ממיר (ADC) אנלוגי, דיגיטלי והרחיבו עם לוח FPGA. שני סינתיסייזרים שהותקן ישירים דיגיטליים (DDS) נסעו AODs לשלוט עמדה "מלכודות. קלט פלט דיגיטלי לוח (DIO) מבוקרצמצם של שני שסתומי סולנואיד (V1 ו V2) מחוברים למדחס (+0.5 ATM) ולחץ סביבתי (+0 ATM), בהתאמה. תוכנת Labview מעקב הלחץ בתוך מאגר הלחץ (C1) באמצעות מד לחץ (PM) ונפתחה באופן אוטומטי באחת משני שסתומים כדי להגיע לרמת הלחץ הרצויה. עירור הקרינה סופק על ידי Nd משוכפל: YAG לייזר (ננומטר 532) והתמונה המוקרנת על אלקטרון כפול מצלמה (EMCCD). M הוא ראי מטלטלין, F3 מסנן פליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
תרשים 2 מערכת () זרימת איור. מערכת לחץ השליטה מורכבת על ידי מד לחץ (PM) ושני שסתומים סולנואיד V1 ו V2 להתחברed למדחס ב+0.5 כספומט (PRS) וללחץ הסביבה (ATM), בהתאמה. X1 וX2 מייצגים מחברים 3 כיוונים. הצמצם של השסתומים הוא מותאם היטב כדי להגיע ללחץ הרצוי בC1 מאגר הלחץ עם 4 מכולות חיץ. כל צינור כניסה כולל עצמאי / כיבוי שסתום בכניסה של זרימה רבת ערוצים קאמריים. צינורות לשקע מחובר לC2 מיכל פסולת ממוקם בלחץ הסביבה. ציורים לא בקנה מידה. (ב) ייצוג סכמטי של זרימה רבת ערוצים קאמריים. ארבעה תזרים מינרית בנפרד translocate חרוזים פונקציונליות קלקר, מולקולות DNA, חיץ הדמיה וחלבונים שכותרתו. שני חרוזים נתפסים עם פינצטה אופטית כפולה ועברו לערוץ DNA כדי לאפשר DNA עיגון ביניהם. ניתוח כוח הארכת DNA מתבצע בערוץ החיץ כדי לאמת את הנוכחות של מולקולת DNA חד ו, רק לאחר מכן, DNA הוא מודגרות בערוץ החלבון. מראה הבלעה Magnification של המבנה המולקולרי הסופי, מוכן להדמית מולקולה בודדת בערוץ החיץ. ציורים לא בקנה מידה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 לוקליזציה של מולקולות בודדות לאצי אינטראקציה עם מולקולת הדנ"א מתוחה. () הציר האנכי של kymogram מייצגת את x לתאם, במקביל למולקולת DNA, ואילו הציר האופקי הוא הזמן (זמן רכישת msec 100). (B עמדת X) של המולקולה לאצי לעומת זמן. העמדה של המולקולות נקבעה על ידי RSC. תמונות נרכשו ב100 זמן חשיפה אלפיות שני ו1.25 x 10 -2 ס"מ W -2 exciעוצמת לייזר tation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 מגרש של MSD vs הזמן למולקולה בודדת אצים לשדר לאורך מולקולת הדנ"א מתוחה. MSD מחושב משיא העמדה המיוצג באיור 3 (אדום). מקדם הדיפוזיה D 1D, המתקבל מרגרסיה ליניארית של הנתונים מתוארים בתרשים, הוא 0.030 ± 0.002 מיקרומטר 2 שניות -1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעשור האחרון, טכניקות מניפולציה וההדמיה מולקולה בודדות שראו התקדמות גדולה במונחים של רזולוציה מרחב ובזמן. השילוב של טכניקות מניפולציה והדמיה הוא בבסיס של מכשירים רבי עוצמה שמאפשר כעת את השליטה בתנאים המכני של פולימר ביולוגי יחיד, כגון חוטי DNA, RNA או cytoskeletal, והלוקליזציה בו זמנית של חלבונים בודדים אינטראקציה עם אותו הפולימר . שליטה התנאים מכאניים של הפולימר שנלכד היא של עניין מיוחד. למעשה, בתאים חיים, חומצות גרעין ברציפות עוברות לחץ מכאני שנגרם על ידי אינטראקציה אנזימים וחלבונים; באופן דומה, רשת מורכבת של חלבוני אינטראקציה ומנועים מולקולריים מודולציה מתח על חוטי cytoskeletal. מצד השני, את האפשרות לזהות ודווקא בתרגום חלבוני אינטראקציה עם חומצות גרעין, מאפשר המדידה של אינטראקציות מולקולריות כפונקציה של פוsition לאורך רצף DNA או RNA.

שילוב טכניקות מניפולציה והדמיה מולקולה בודדת דורש תכנון קפדני של הגדרת הניסוי והמבנים הביולוגיים. מלכודות אופטיות חייבות לספק תמיכה יציבה, שתבטיח את יציבות ברמת ננומטר של הפולימר המושעה. ניתן להגיע יציבות כזו דרך בידוד זהיר של המנגנון הניסיוני ממקורות הרבים של רעש מכאני ועל ידי צמצום הצבעה לייזר ותנודות משרעת. תנועות מדויקות (תת ננומטר) של המלכודות אופטי מושגות באמצעות AODs מונע על ידי DDSs. הנה, הדגמנו פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לייעל ולבדוק את היציבות "פינצטה אופטית ברמת ננומטר.

מיקרוסקופיה עלית הקרינה פשוט רחב בתחום מצמידים את המצלמה EMCCD משמשת למקם chromophores היחיד אינטראקציה עם הפולימר המושעה. assay הניסויי שלנו מוגבל לDNA הארוך או מולקולות RNA (≥6 KBP) כדי להבטיח הימור הפרדה המרחביתWeen קרן לייזר הלכידה ובדיקת הניאון. למעשה, סופרפוזיציה של לייזר הלכידה הקרוב אינפרא אדום עם לייזר העירור הגלוי תוביל לphotobleaching משופר של chromophores עקב ספיגה של אור אינפרא אדום הקרוב ואילו chromophore נמצא במצב הנרגש 16. הרכבה משקולת היא הליך מסובך אחר, כי הוא יותר טוב שהושג באמצעות תזרים תאים רבי ערוצים, שבם אנו סיפקנו תיאור מפורט. אנחנו הצבענו איך לייעל את זרימת החיץ וכיצד למנוע בועות אוויר, אשר אחרת יכול להתפשר ברצינות הניסויים. אנחנו תיארנו פרוטוקולים לתיוג הגפיים DNA עם ביוטין, אשר נדרש להרכבת משקולת באמצעות חרוזים streptavidin מצופה, ופרוטוקולים לתיוג חלבון. לבסוף, הדגמנו את פעילות צעד אחר צעד לביצוע ניסויים שבהם מחייבים ודיפוזיה של מולקולה מדכאת קטוז יחיד על מולקולת הדנ"א מתוחה הוא לכמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים Gijs Wuite, ארווין JG פיטרמן, ופיטר גרוס לעזרה עם מיקרופלואידיקה וAlessia Tempestini לעזרה עם הכנת מדגם. מחקר זה מומן על ידי תכנית האיחוד האירופי המסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) על פי הסכם מענק N ° 284,464 ומהמשרד האיטלקי לחינוך, אוניברסיטות והמחקר FIRB 2,011 RBAP11X42L006, Futuro בRicerca 2,013 RBFR13V4M2, ובמסגרת של פרויקט NANOMAX הדגל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
  2. Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
  3. Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
  4. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  5. Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
  6. Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
  7. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
  8. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  9. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  10. Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
  11. Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
  13. Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
  14. van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
  15. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
  16. Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
  17. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  18. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
  19. Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
  20. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
  21. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
  22. Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
  23. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
  24. van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
  25. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
  26. Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
  27. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics