Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Biology

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Summary

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

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Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

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Abstract

Introduction

Molécula individual (SM) técnicas han evolucionado mucho en los últimos treinta años para responder a la necesidad de superar algunas de las limitaciones de las mediciones de soluciones tradicionales, a granel 1.3. La manipulación de las moléculas biológicas individuales ha creado la oportunidad para medir las propiedades mecánicas de los biopolímeros 4 y controlar los parámetros mecánicos de proteína-proteína 5 y proteína-DNA 6,7. Detección de fluorescencia SM, por otro lado, representa una herramienta muy versátil para el estudio de actividad de la proteína in vitro e in vivo, dando lugar a la posibilidad de localizar y rastrear moléculas individuales con precisión nanométrica. A través del punto de ajuste de amplio función del instrumento a la imagen SM, de hecho, se puede lograr la localización con una precisión dependiendo principalmente de la relación señal a ruido (SNR) y alcanzando un límite de alrededor de un nanómetro 8,9. Estas metodologías se encuentran potenteaplicaciones en el estudio de la dinámica de las proteínas motoras, así como de los procesos de difusión subyacentes búsqueda de objetivos en las proteínas de unión al ADN. La capacidad de determinar constantes de difusión como una función de la secuencia de ADN, tiempo de residencia en el objetivo y con precisión la medición de la longitud del ADN explorado durante los eventos de difusión unidimensionales, representa una poderosa herramienta para el estudio de la dinámica de interacción de proteínas de ADN y para la investigación de los mecanismos de búsqueda de objetivo específico.

Recientemente, la combinación de estas dos técnicas se ha producido una nueva generación de montajes experimentales 10-14 que permitan la manipulación simultánea de un sustrato biológico (por ejemplo, un filamento de actina o una molécula de ADN) y la detección / localización de una enzima interacción socio (por ejemplo, miosina o una proteína de unión al ADN). Las ventajas de estas técnicas se basan principalmente en la posibilidad de ejercer el control mecánico sobre el polímero atrapado, por lo tanto enabling el estudio de la dinámica de interacción frente a fuerzas o pares. Además, la metodología permite la medición de las reacciones bioquímicas lejos de la superficie, evitando una de las principales limitaciones de los métodos clásicos SM, es decir, la necesidad de inmovilización de las moléculas en estudio sobre una superficie (portaobjetos de vidrio o microesferas).

La combinación de dos técnicas de moléculas individuales es necesario superar varias dificultades técnicas, fundamentalmente como consecuencia de las exigencias de estabilidad mecánica y SNR adecuado (sobre todo cuando se requiere la localización con precisión nm) 15. En particular, si se acoplan detección por fluorescencia SM con pinzas ópticas, la reducción de ruido y photobleaching de los láseres infrarrojos captura 16 y el control de los buffers bioquímicos para el ensamblaje de los complejos biológicos y el rendimiento de las mediciones experimentales 11 son de suma importancia. A continuación, describimos los métodos para realizar con éxitomediciones en una configuración de localización de captura / SM fluorescencia dual. La metodología se ilustra con el ejemplo de la proteína represora lactosa (LacI) marcado con fluorescencia (con Atto532) y se detectó ya que se une a una molécula de ADN (atrapado entre dos pinzas ópticas) que contiene secuencias específicas LacI de unión (es decir, operadores). Se demuestra la eficacia del método en la detección de la unión de LacI al ADN y la difusión a lo largo de su contorno en el proceso de búsqueda de destino. El método es aplicable a cualquier combinación de secuencia de ADN y proteína de unión a ADN, así como a otros sistemas (microtúbulos o filamentos de actina y las proteínas motoras que interactúan con ellos).

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Protocol

1. Pinzas Ópticas instalación con nanómetros de Estabilidad

El montaje experimental debe proporcionar dos pinzas ópticas con señalar la estabilidad en las fluctuaciones del nivel e intensidad nanómetros del láser captura por debajo del 1%. La combinación de estas condiciones será garantizar la estabilidad del nanómetro de la mancuerna en tensión típica (1 pN - pocas decenas de pN), trampa de rigidez (0,1 pN / nm) y ancho de banda de medición (velocidad de adquisición de imágenes de 20 s-1). Un esquema de la configuración experimental se representa en la Figura 1.

  1. Diseño óptico pinzas y construcción 15,17:
    1. Monte el aparato experimental sobre una mesa óptica con aisladores de activos para reducir las vibraciones mecánicas. Montar la estructura microscopio sobre aisladores elastoméricos para absorber el ruido acústico y resonancias mecánicas de la estructura microscopio.
    2. Insertar un aislador óptico en la trayectoria del láser de captura, cerca de la fuente láser, para reducir fluctuaciones de amplitud al azar debido a realimentación óptica.
    3. Reducir la longitud de la trayectoria del láser de captura tanto como sea posible y encerrar todo el camino en una caja sellada para reducir las fluctuaciones de puntero láser debido a corrientes de aire y turbulencia.
    4. Crear pinzas ópticas dobles divide una única fuente de láser en el infrarrojo cercano (Nd: YAG, 1064 nm de longitud de onda) en dos haces con polarizaciones ortogonales. No utilice trampas de tiempo compartido, ya que causa la oscilación de la mancuerna en tensión 12.
    5. Utilice deflectores acústico-ópticos (AODS) impulsados ​​por directos sintetizadores digitales (DDS) para permitir los movimientos finos de (al menos) una trampa y una regulación precisa de la tensión de ADN. DDS permite una mejor estabilidad trampa de osciladores controlados por voltaje (VCO).
    6. Inserte dos fotodiodos detectores cuadrante (QDPs) en el plano focal posterior del condensador para detectar la posición de las perlas atrapados con exactitud sub-nm.
  2. Compruebe que la intensidad de fluctuations del láser de atrapamiento en la entrada microscopio están por debajo de 1% usando un fotodiodo con un ancho de banda mayor que la tasa de adquisición de imágenes.
  3. Compruebe que señala la estabilidad de los dos láseres de captura:
    1. Preparar perlas de sílice en tampón fosfato: Diluir 20 l de perlas de sílice (1,54 m, 10% de sólidos) en 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, agitar brevemente, y centrifugar 2 min a 19.000 x g. Volver a suspender en 1 ml de acetona y de lavado de repetición. Volver a suspender en 1 ml de tampón fosfato 50 mM, lavar 2 veces, y finalmente volver a suspender en 100 l de tampón fosfato 50 mM.
    2. Calibrar las pinzas ópticas con perlas de sílice: preparar una celda de flujo adjuntando un cubreobjetos a un portaobjetos de microscopio utilizando cinta de doble pegajosa (aproximadamente 60 m de espesor). Flujo 1 mg / ml de BSA y esperar 3 min. Fluyen perlas de sílice diluido 1/1000 en tampón de fosfato y sellan la cámara de flujo con grasa de silicona. Trampa una perla en cada trampa y calibrar las trampas utilizando el método del espectro de potencia 18. Preparar perlas de sílice en acetato de pentilo y nitrocelulosa: Diluir 20 l de perlas de sílice (1,54 m, 10% de sólidos) en 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, agitar brevemente, y centrifugar 2 min a 19.000 x g. Volver a suspender en 1 ml de acetona y de lavado de repetición. Resuspender en 1 ml de acetato de pentilo y lavar 2 veces. Finalmente ellos resuspender en acetato de pentilo con 0,1% de nitrocelulosa disuelto en acetato de pentilo.
    3. Spread 2 l de perlas de sílice 1,54 m de diámetro disueltos en acetato de pentilo + 0,1% de nitrocelulosa sobre la superficie de un cubreobjetos (24 x 24 mm) utilizando un segundo cubreobjetos (24 x 60 mm). Coloque el cubreobjetos a un portaobjetos de microscopio utilizando dos trozos de cinta adhesiva de doble cara para crear una celda de flujo. Llene la celda de flujo con tampón fosfato 50 mM y sellarlo con grasa de silicona.
    4. Imagen del grano uno de sílice en la microscopía de campo claro con un aumento de 2,000x. El campo de visión debe ser de 7 x 5 m adquirida a 768 x 576 píxel, por lo que la imagen del grano tiene un diámetro de 190 pixels. Compensar derivas térmicas con un software de retroalimentación que, como en la ref. 17, calcula la posición xy desde el centroide de la imagen y z de los anillos de difracción y corrige derivas en movimiento una etapa piezo-nm con exactitud o mejor.
    5. Traslape el centro de la trampa a la izquierda con el centro del talón (los niveles de señal xy del QDP deben ser del mismo medido durante la calibración) y medir el ruido de la posición y su desviación estándar de la QDP. Repita la medición de la trampa de la derecha.

2. Una molécula de localización con nanómetros Precisión

  1. Diseño Microscopía de fluorescencia y construcción 15,19
    1. Utilice una alta eficiencia cuántica y CCD de electrones multiplicado para llegar a los altos índices de señal a ruido necesarias para la precisión de localización nanómetros.
    2. Elige la óptica para obtener un tamaño de píxel de la imagen ~ 80 nm (por ejemplo, una ampliación de la imagen ~ 200X con un tamaño de píxel de la cámara de 16 micras). Esta es sufisuficientemente pequeña como para descuidar error de localización debido a la pixelación 8, pero lo suficientemente grande como para recoger un considerable número de fotones por píxel.
    3. Como fuente de excitación, utilizar la luz láser que es no polarizada (pasando a través de una fibra óptica no mantenedora de polarización) o polarizada circularmente (pasando a través de un λ / 4 placa de onda) para maximizar la excitación de cromóforos individuales, independientemente de su orientación.
    4. Elija filtros de paso de banda de emisión estrangulan eficientemente ambas luces láser de excitación y captura. Nota: En nuestros experimentos hemos denominado nuestra proteína con tinte Atto532 y utilizamos un filtro de emisión de paso de banda centrado en 600 nm con un ancho de banda de 100 nm.

3. microfluídica

Para lograr un control preciso de intercambio de tampón y montaje 'mancuerna', es decir, el anclaje de una sola molécula de ADN entre dos microesferas ópticamente atrapados, un flujo laminar multicanal construido a medidasistema debe ser desarrollado. Esta está compuesta por una cámara de flujo, un depósito de presión y un sistema de control de presión (Figura 2).

  1. Preparación de células de flujo
    NOTA: La cámara de flujo utilizado para experimentos de una sola molécula de ADN interacción proteína preferiblemente tiene 4 entradas y 1 salida, para permitir hasta 4 flujos de búfer en paralelo, cada uno que contiene uno de los diferentes componentes necesarios para el experimento: gotas, ADN, proteínas, y tampón de formación de imágenes por fluorescencia marcado. La separación de los componentes en los canales de flujo permite un montaje eficiente de la mancuerna. Por otra parte, el canal de formación de imágenes es útil para evitar la fluorescencia de fondo a partir de proteínas que se difunden y alcanzar la alta relación señal a ruido requerida para la localización de la proteína de unión a ADN con una precisión del orden de unos pocos nanómetros.
    1. De taladro de diámetro 1 mm en el portaobjetos de microscopio (76 x 76 x 1 mm) con una punta de diamante, con el fin de crear 4 entradas y una salida.
    2. º Cleane portaobjetos con etanol y centrar el puerto con la junta tórica insertada y el anillo de adhesivo en la diapositiva que rodea los orificios de acceso. Es fundamental el uso de guantes durante este paso para evitar dejar huellas, que perturbarían el proceso de pegado.
    3. Sujete los NanoPorts a la diapositiva, y colóquelo en el horno precalentado a 180 ° C durante 1 hora para permitir la unión completa.
    4. Dibuje el patrón de contorno de la celda de flujo en un pedazo de papel. Los canales deben ser ~ 3 mm de ancho y que coincida con la posición de los agujeros en el portaobjetos de un microscopio.
    5. Coloque el dibujo en la parte superior de dos piezas de Parafilm, y con un bisturí hacer fuertes recortes y continuas a lo largo de la línea trazada. Retire cualquier protuberancia formada. Desechar la capa Parafilm inferior, que sólo se utiliza para garantizar un soporte limpio.
    6. Colocar el portaobjetos de microscopio que contiene los adjuntos NanoPorts boca abajo en el soporte metálico.
    7. Alinee con cuidado el contorno cámara Parafilm con los agujeros, asegurándose ªen la parafina no entrometerse las entradas y salida de la cámara.
    8. Cubrir con un cubreobjetos de microscopio limpiado (62 x 56 x 0,15 mm) y retirar con cuidado el exceso de Parafilm que rodea la cámara.
    9. Coloque dos bloques de calor, calentado previamente a 120 ° C, en la parte superior de la celda de flujo para aplicar una presión constante sobre el mismo. Deje que el Parafilm derretir aproximadamente 25 min.
  2. Depósito de presión y los recipientes tampón
    El depósito de presión debe ser de plexiglás (o similar) y permitir un alojamiento de seis contenedores de amortiguamiento. La posibilidad de tener al menos dos recipientes de amortiguación adicionales mejora la flexibilidad del instrumento. Tenga en cuenta que los envases transparentes y tubos ayudar considerablemente en el manejo del sistema y solución de problemas de flujo de burbujas de aire atrapadas. Jeringas luer estéril y desechable bloqueo de punta (2,5 ml), a partir de la cual los émbolos se han quitado anteriormente, son buenos contenedores de amortiguamiento y permiten una fácil conexión con el tubo de entrada. Asegúrese de queel volumen total de fluido es pequeño comparado con el volumen de aire en el interior del depósito de presión, una condición esencial para obtener un flujo suave y estable.
    1. Conecte las válvulas de cierre en la salida de los contenedores de amortiguamiento para convertir el flujo de tampón o desactivarse durante los experimentos.
    2. Monte la celda de flujo en la platina del microscopio. Conecte las válvulas de cierre de las entradas de la cámara de flujo con tubo de polieteretercetona (diámetro interior ~ 150 m) y accesorios sin pestañas. Añadir ~ 3 cm de tubo de etileno propileno fluorado (diámetro interior ~ 500 micras) como un enlace entre la tubería y los conjuntos de NanoPort de la celda de flujo. Este paso es esencial para reducir el flujo de tampón a la entrada de la cámara para evitar la rotura de la célula de flujo o NanoPort desprendimiento del vidrio. El uso de tubos de gran diámetro interior solo, por otra parte, requeriría grandes volúmenes de muestras biológicas.
    3. Conectar la salida de la cámara de flujo a un tubo Falcon abierto a presión atmosférica. Estetubo sirve como disposición para la memoria intermedia que fluye fuera de la cámara de flujo.
  3. Sistema de control de presión
    1. Construir un sistema de control de presión capaz de ajustar con precisión la presión de aire en el interior del depósito de presión. Esto se puede hacer mediante el uso de dos válvulas de solenoide controladas por ordenador, uno conectado a una fuente de presión de 0,5 atm (compresor) y la segunda a la presión atmosférica. Las electroválvulas se abren repetidamente durante aproximadamente 7 ms para aumentar o disminuir la presión en la línea hasta que se alcance el valor deseado. NOTA: este método es una adaptación de Carlos Bustamante 20, y se produce un flujo más suave que el uso de una bomba de inyección motor paso a paso 21.
    2. Añadir un transductor de presión controlado por un software personalizado escrito para controlar la presión efectiva ejercida sobre el depósito de presión. Presiones de trabajo típicas son del orden de 20 mbar para el montaje pesa y 200 mbar para el lavado de los componentes del sistema de flujo.

    4. ADN Tailing con Biotinylated Deoxycytidine trifosfato (biotina-dCTP)

    La molécula de ADN debe ser de más de 1 m para facilitar su extensión bajo flujo y el anclaje a las bolas atrapadas. Por otra parte, un ADN larga evitará que la luz captura IR de la iluminación de la proteína de unión al ADN. Esto es de especial relevancia porque la absorción de la luz infrarroja de un emocionado resultados cromóforos en aumento fotoblanqueo. NOTA: En el presente estudio, la molécula de ADN fue de 3,7 m de largo. La molécula contiene tres copias del operador principal O1 y una copia de cada uno de los dos operadores auxiliares, O2 y O3. Estas secuencias se han insertado en el medio de la molécula, lo que da aproximadamente equidistante de las perlas atrapados y rayos láser de IR.

    1. Mezclar 1 pmol de ADN 3'-ends lineales con 60 pmol de biotina-14-dCTP, 4 l de buffer de Terminal (TdT) 5x desoxinucleotidil transferasa (1 ca M de potasiocodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) de Triton X-100, 5 mM CoCl 2 (pH 7,2 a 25 ° C)) y 1,5 l de TdT y ddH 2 O hasta un volumen total de 20 l. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 15 min. Esto dará lugar a la adición de hasta 60 nucleótidos por la extremidad de ADN. Tenga en cuenta que el ADN 3'-voladizos son colas con mayor eficiencia que los extremos ahuecados o contundentes.
    2. Purificar el ADN de cola con columnas de centrifugación o extracción con fenol / cloroformo y precipitación con etanol posterior para eliminar CoCl2 del tampón de reacción TdT.
    3. Después de la purificación, el ADN se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas o a -20 ° C durante períodos más largos, pero evitar la descongelación repetida y volver a congelar.

    5. Etiquetado Proteína grupos tiol con ATTO532

    Etiquetado través de la modificación de residuos de cisteína no debe alterar la actividad de la proteína. Para superar este problema, se utilizó un mutante LacI, LacIQ231C, which lleva sólo una cisteína en la posición por monómero 231. Este mutante conserva las mismas características de la de tipo salvaje y modificaciones químicas en la posición 231 se ha demostrado que no interfiera con la estabilidad de proteínas 22. NOTA: Hemos marcado la proteína con ATTO532 maleimida.

    1. Asegúrese de que la proteína se disuelve en un tampón con un pH que oscila desde 7,0 hasta 7,5 y con una concentración que varía de 2 a 10 mg / ml. Nota: En estos experimentos, LacI se disolvió en fosfato de potasio 0,3 M, 5% de glucosa, pH 7,5 (tampón A).
    2. Disolver Tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP) a una concentración final de 100 mg / ml en H 2 O. TCEP solución debe prepararse de nuevo antes de su uso.
    3. Mezclar 100 l de la proteína con 3 l TCEP y agitar cuidadosamente.
    4. Se disuelve el colorante en N, N-dimetilformamida (DMF) a una concentración final de 10 mg / ml que trabaja en condiciones de poca luz. Vortex hasta que esté completamente disuelta.
    5. Mi reacciónx: Añadir 33 l de medio de contraste para la proteína + TCEP y agitar cuidadosamente. Giro rápido para recoger la mayor cantidad posible de solución.
    6. Incubar la mezcla de reacción durante 2 horas en un agitador (8000 rpm) a 20 ° C (o a 4 ° CO / N), protegido de la luz.
    7. Disolver L-glutatión reducido (GSH) a una concentración final de 100 mg / ml en H 2 O. Añadir 3 l de la mezcla de reacción y se incuba en el agitador a 8000 rpm durante 15 min. GSH se detendrá la reacción mediante el bloqueo de la reactividad de los grupos tiol.
    8. Se purifica la proteína marcada usando columnas de filtración en gel estándar, diálisis o concentradores de espín. NOTA: En estos experimentos, etiquetados LacI se purificó utilizando 10 kDa concentradores de giro de corte.
      1. Se diluye la mezcla de reacción con un máximo de 12 ml de tampón A, aplicarla al dispositivo concentrador, y se centrifuga a 8.000 xg que, a 1 h, 4 ° C. El LacI así marcado se concentró hasta un volumen final de aproximadamente 500 l y el exceso de tinte pasa la membrana en el flow-through. Deseche el filtrado y repita el paso 5.8.1 al menos tres veces.
    9. Divida la proteína marcada en pequeñas alícuotas y almacenar a -80 ° C. Evite congelar y descongelar repetidamente.

    6. combinado óptico reventado y una sola molécula de experimentos de imagen de fluorescencia

    1. Añadir 1 ml de tampón A a los contenedores de tampón y de aplicar una presión de 200 mbar a lavar los tubos de conexión y celda de flujo. Para maximizar difusión de la proteína de unión sobre el ADN, aquí y en los siguientes pasos, tampón A puede ser sustituido con un tampón de fuerza iónica baja. NOTA: En estos experimentos, se utilizó 0,5 x TBE.
    2. Verificar la presencia de burbujas de aire, lo que podría alterar la suavidad del flujo. Un golpecito suave en el tubo de salida le ayudará a eliminar las burbujas restantes.
    3. Disminuir la presión a 20 mbar y verificar que todos los canales y tubos son claras de burbujas de aire y el buffer de flujos con velocidades similares en todos los canales.
    4. Preparar las muestras a un volumen final de 300 l: perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina 1,87 m; 20 pM de ADN lineal, con biotina en ambos extremos de acuerdo a la sección 4; 300 pM de LacI tetramer etiquetado con ATTO532 de acuerdo con la sección 5.
    5. Añadir a cada muestra de uno de los contenedores de jeringa en el siguiente orden: perlas en el primer canal, el ADN en el segundo tercio de canal, con el tampón de imagen sólo (tampón A sistema eliminador de oxígeno +) y la proteína marcada en el cuarto canal.
    6. Girar el flujo en al 200 mbar durante 3 min para dejar que las muestras llegan en el interior del canal de flujo. Luego reducir la presión a 20 mbar.
    7. Mientras que la formación de imágenes del primer canal en iluminación de campo brillante, encender las dos pinzas ópticas y coger una bola de poliestireno en cada trampa.
    8. Mueva rápidamente al segundo canal para evitar que otros granos caen en las trampas. Tenga en cuenta que la llegada en el canal de ADN es fácilmente perceptible por el final del flujo de talón.
    9. El uso one AOD, mover una trampa (perla) hacia atrás y adelante en la proximidad del otro talón para permitir la unión del ADN ampliado de flujo entre los dos talones ópticamente atrapados. Cuando se forma una pesa de ADN, el cordón estática comienza siguiendo el movimiento del talón que se mueve activamente hacia atrás y adelante por la trampa.
    10. Mueva rápidamente al canal de amortiguación y apagar el flujo de buffer. Realizar un análisis de la curva de fuerza-extensión 4,23-25 ​​para verificar la presencia de una sola molécula de ADN. Si más de una molécula está presente (es decir, la entálpico, elevando fase de la curva de fuerza-extensión se produce a una longitud más corta que la longitud de contorno de ADN), descartar la mancuerna y empezar de nuevo desde el paso 6.7.
    11. Una vez que se obtiene una sola mancuerna ADN, encienda el flujo de nuevo y mover la mancuerna al canal de proteína. Cambiar a amplia microscopía de campo de fluorescencia para monitorizar la interacción de la etiqueta-LacI con el ADN. Apague la corriente y comenzar la adquisición.

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Representative Results

En un experimento exitoso, uno (o más) proteínas marcadas se someten a la unión / unbinding difusión y / o monodimensional a lo largo de la molécula de ADN (Figura 3A). La localización de proteínas a lo largo de la molécula de ADN permite la cuantificación de los parámetros cinéticos como una función de la secuencia de ADN. Cuando se aplican condiciones de tampón que causan difusión 1D, es posible seguir trayectorias de proteína, y determinar, por ejemplo, el coeficiente de difusión D 1D.

La posición exacta de un solo punto, en cada trama, se puede determinar mediante el ajuste de la función de dispersión del punto (PSF) con una función de Gauss bidimensional o, alternativamente, al manipular un conjunto de datos grande, con un algoritmo más rápido, recientemente publicado (Radial Simetría Center, RSC) 26,27. El último método determina el punto de simetría radial máxima de la imagen, la consecución de una precisión de localización que es típicamente comparable con la guarnición de Gauss. En bocasos th, el seguimiento se puede lograr a través de rutinas de MATLAB que se puede acceder libremente 27.

La figura 3A muestra una kymogram de un experimento típico en el que una sola molécula LacI se difunde a lo largo de las secuencias de ADN no específicas mientras que otra molécula de LacI se une específicamente a un operador, que se encuentra en el centro de la molécula de ADN. Figura 3B muestra la posición de los dos moléculas LacI (obtuvieron utilizando RSC) a lo largo de la dirección que conecta los centros de las dos trampas (x), como una función del tiempo. Desde la posición de la molécula de difusión a lo largo de la molécula de ADN, se calculó el Mean Square Desplazamiento (MSD) en diferentes intervalos de tiempo de acuerdo con la siguiente ecuación:

Ecuación 1 (1)

donde N es el número total de posiciones medidas y n es el índice de medición f va rom 1 a N. En caso de la difusión browniano unidimensional puro, el MSD es directamente proporcional a n Dt (Delta t es el intervalo de tiempo entre dos tramas consecutivas, 100 mseg en nuestros experimentos), con una pendiente igual a dos veces el coeficiente de difusión (MSD (n, N) 2D = 1 nΔt). Figura 4 muestra el gráfico MSD vs nΔt para la molécula de ADN a lo largo de la difusión. El coeficiente de difusión de la proteína se puede obtener fácilmente a partir de un ajuste lineal de la trama MSD nΔt vs. Tenga en cuenta que a medida que n aumenta, el número de puntos para el cálculo de la ecuación MSD. 1 en consecuencia disminuye. El error en la evaluación de la MSD por tanto, aumenta con n. Por esta razón, se optó por limitar nuestro análisis a n = N / 4. Esto es de todos modos un valor bastante grande en comparación con el N / 10 utilizado por muchos laboratorios.

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Figura 1. El montaje experimental consta de: lámpara halógena (H), un condensador (C), la muestra (S), traductores piezoeléctricos (xy y, z), objetivo (O), una cámara de bajo aumento (200X CCD) y un alto -magnification cámara (CCD 2,000x) que se utiliza para la retroalimentación nm-estabilización (BS es un cubo divisor de haz 50:50). pinzas ópticas dobles se inserta y se extrae desde el eje óptico del microscopio a través de espejos dicroicos (D2 y D3) y comprender: Nd: YAG (1064 nm), aislador óptico (OI), λ / 2 waveplates, polarizando cubos divisor de haz (PBS), deflectores acústico-ópticos (AOD), 1.064 filtros interferenciales nm (F1 y F2), detector de cuadrante fotodiodos (qdp). Las señales de QDPs se adquirieron a través de un convertidor (ADC) de analógico a digital y elaborados con un tablero FPGA. Dos sintetizadores digitales directos hechos a medida (DDS) expulsaron a los ordenadores delegados para controlar la posición trampas '. Una tarjeta de entrada-salida digital (DIO) controla laapertura de dos válvulas de solenoide (V1 y V2) conectado a un compresor (0,5 atm) y la presión ambiente (0 atm), respectivamente. Un software Labview monitoriza la presión dentro del depósito de presión (C1) a través de un medidor de presión (PM) y abre automáticamente una de las dos válvulas para alcanzar el nivel de presión deseado. Excitación de la fluorescencia fue proporcionada por un duplicado láser Nd: YAG (532 nm) y la imagen proyectada en un electrón multiplicada cámara (EMCCD). M es un espejo móvil, F3 un filtro de emisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura diagrama 2 (A) Sistema de Flujo. El sistema de control de presión se compone de un medidor de presión (PM) y dos válvulas de solenoide V1 y V2 se conectaned a un compresor a 0,5 atm (PRS) y a la presión ambiente (ATM), respectivamente. X1 y X2 representan conectores de 3 vías. La abertura de las válvulas se ajusta finamente para alcanzar la presión deseada en la presión del depósito C1 con 4 contenedores de amortiguamiento. Cada tubo de entrada independiente incluye una válvula on / off en la entrada de la cámara de flujo multicanal. El tubo de salida está conectado al contenedor de residuos C2 colocado a presión ambiente. Los dibujos no están a escala. (B) Representación esquemática de la cámara de flujo multicanal. Cuatro flujos laminares translocan separado perlas de poliestireno funcionalizados, moléculas de ADN, buffer de imágenes y proteínas marcadas. Dos perlas son capturados con pinzas ópticas duales y se trasladó al canal de ADN para permitir el anclaje del ADN entre ellos. Un análisis de la fuerza de extensión de ADN se lleva a cabo en el canal de tampón para verificar la presencia de una sola molécula de ADN y, justo después, el ADN se incuba en el canal de la proteína. El recuadro muestra una magnificación del constructo molecular final, listo para formación de imágenes de una sola molécula en el canal de tampón. Los dibujos no están a escala. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. localización de moléculas individuales LacI que interactúan con una molécula de ADN estirada. (A) El eje vertical de la kymogram representa la coordenada X, paralela a la molécula de ADN, mientras que el eje horizontal es el tiempo (tiempo de adquisición de 100 ms) (. B ) la posición X de la molécula de LacI vs tiempo. La posición de las moléculas se determinó por RSC. Las imágenes fueron adquiridas en el tiempo de exposición de 100 ms y 1,25 x 10 -2 W cm -2 excitatointensidad del láser tación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Trama de la MSD en función del tiempo para una sola molécula de LacI difusión a lo largo de una molécula de ADN estirada. El MSD se calcula a partir del registro de la posición representada en la Figura 3B (rojo). El coeficiente de difusión D 1D, obtenido a partir de la regresión lineal de los datos representados en la figura, es 0,030 ± 0,002 m 2 seg -1.

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Discussion

En la última década, las técnicas de manipulación y de imágenes de moléculas individuales se han visto grandes avances en términos de resolución espacial y temporal. La combinación de técnicas de manipulación y de imagen está en la base de instrumentos de gran alcance que ahora permiten el control de las condiciones mecánicas de un solo polímero biológico, tales como ADN, ARN o filamentos del citoesqueleto, y la localización simultánea de proteínas individuales interactuar con el mismo polímero . El control de las condiciones mecánicas del polímero atrapado es de particular interés. De hecho, en las células vivas, los ácidos nucleicos están experimentando continuamente la tensión mecánica causada por la interacción enzimas y proteínas; Del mismo modo, una compleja red de proteínas que interactúan y motores moleculares modula la tensión en los filamentos del citoesqueleto. Por otro lado, la posibilidad de detectar y localizar con precisión las proteínas que interactúan con ácidos nucleicos, permite la medición de las interacciones moleculares en función de su posición a lo largo de la secuencia de ADN o ARN.

Combinando técnicas de manipulación y formación de imágenes de una sola molécula requiere un diseño cuidadoso de la configuración experimental y los constructos biológicos. Trampas ópticas deben proporcionar un soporte estable, garantizar la estabilidad a nivel nm del polímero suspendido. Dicha estabilidad se puede llegar a través de una cuidadosa aislamiento del aparato experimental de las numerosas fuentes de ruido mecánico y minimizando señalador láser y fluctuaciones de amplitud. (Sub-nm) movimientos precisos de las trampas ópticas se consiguen utilizando ordenadores delegados impulsados ​​por los DDS. Aquí, ilustramos un protocolo paso a paso para optimizar y controlar la estabilidad pinzas ópticas 'a nivel nm.

Simple-amplio campo microscopía epi-fluorescencia acoplado a una cámara EMCCD se utiliza para localizar cromóforos individuales que interactúan con el polímero suspendido. Nuestro ensayo experimental se limita a los largo de ADN o moléculas de ARN (≥6 kpb) para asegurar una apuesta separación espacialween el rayo láser captura y la sonda fluorescente. De hecho, el láser superposición de atrapamiento del infrarrojo cercano con el láser de excitación visible conduciría a una mayor photobleaching de los cromóforos debido a la absorción de la luz infrarroja cercana, mientras que el cromóforo está en el estado excitado 16. Montaje con mancuernas es otro procedimiento complicado que es mejor obtener usando una celda de flujo multicanal, para lo cual le ofrecemos una descripción detallada. Indicamos cómo optimizar el flujo de tampón y cómo evitar las burbujas de aire, que de otro modo pueden comprometer seriamente los experimentos. Hemos descrito protocolos para el etiquetado de las extremidades de ADN con biotina, que se requiere para el montaje mancuerna usando perlas recubiertas con estreptavidina, y los protocolos para el etiquetado de proteínas. Finalmente, ilustramos operaciones paso a paso para llevar a cabo experimentos en los que la unión y la difusión de una sola molécula de represor lactosa en una molécula de ADN estirada se cuantifica.

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Acknowledgments

Agradecemos a Gijs wuite, Erwin JG Peterman, y Peter Gross para obtener ayuda con la microfluídica y Alessia Tempestini para obtener ayuda con la preparación de muestras. Esta investigación fue financiada por la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (7PM / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 284464 y del Ministerio de Educación, Universidad e Investigación FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro italiano Ricerca 2013 RBFR13V4M2, y en el marco de la NANOMAX proyecto emblemático.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

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References

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