Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Biology

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Summary

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

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Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

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Abstract

Introduction

Einzelmolekül (SM)-Techniken haben sich in den letzten dreißig Jahren entwickelt, um auf die Notwendigkeit der Überwindung einiger der Grenzen der traditionellen, Groß Lösung Messungen 1-3 reagieren. Die Manipulation von einzelnen biologischen Molekülen hat die Möglichkeit, die mechanischen Eigenschaften von Biopolymeren 4 messen und steuern die mechanischen Parameter der Protein-Protein-und Protein-5-DNA-Wechselwirkungen 6,7 erstellt. SM Fluoreszenz-Detektion auf der anderen Seite stellt ein extrem vielseitiges Werkzeug für die Untersuchung der Proteinaktivität in vitro und in vivo, was zu der Möglichkeit der Lokalisierung und Verfolgung einzelner Moleküle mit Nanometer-Präzision. Durch Einpassen des Instruments Point-Spread-Funktion auf die SM Bild in der Tat kann man die Lokalisierung mit einer Genauigkeit hauptsächlich in Abhängigkeit von Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) und dem Erreichen einer Grenze von etwa einem Nanometer 8,9 zu erreichen. Diese Methoden finden leistungsstarkenAnwendungen in der Untersuchung der Dynamik von Motorproteinen, sowie der Zielsuche in der DNA-bindenden Proteinen zugrunde liegenden Diffusionsprozesse. Die Fähigkeit zur Bestimmung Diffusionskonstanten als Funktion der DNA-Sequenz, die Verweilzeit auf dem Ziel und genauen Messen der DNA-Länge während der eindimensionalen Diffusions Ereignisse erforscht sind, ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktion Dynamik und zur Untersuchung der Mechanismen der spezifischen Zielsuche.

Vor kurzem hat die Kombination dieser beiden Techniken eine neue Generation von experimentellen Aufbauten 10-14 ermöglicht die gleichzeitige Manipulation einer biologischen Substrats (zum Beispiel eine Aktin-Filament oder ein DNA-Molekül) und Detektion / Lokalisierung eines interagierenden Partner-Enzym (beispielsweise hergestellt Myosin oder ein DNA-bindendes Protein). Die Vorteile dieser Technik liegen vor allem auf die Möglichkeit der Ausübung mechanischer Kontrolle über die eingefangene Polymer, wodurch ENAbling das Studium der Wechselwirkung Dynamik gegenüber Kräfte oder Drehmomente. Auch ermöglicht die Methodologie Messen biochemischer Reaktionen weit von der Oberfläche, die Vermeidung eines der wichtigsten Einschränkungen der klassischen SM Methoden, also die Notwendigkeit einer Immobilisierung der untersuchten Moleküle auf einer Oberfläche (Glasobjektträger oder Mikrokügelchen).

Die Kombination von zwei einzelnen Molekülen Techniken erfordert Überwindung mehrere technische Schwierigkeiten, vor allem die aus den Anforderungen der mechanischen Stabilität und angemessene SNR 15 (vor allem, wenn die Lokalisierung mit nm Präzision erfordern). Insbesondere dann, wenn die Kopplung SM Fluoreszenzdetektion mit optischen Pinzetten, die Reduzierung von Lärm und die Photobleichung von den Fang Infrarot-Laser 16 und der Kontrolle der biochemischen Puffer für die Montage der biologischen Komplexen und die Leistung der experimentellen Messungen 11 sind von größter Bedeutung. Hier beschreiben wir die Verfahren für erfolgreicheMessungen in einem Dual-Trapping / SM Fluoreszenz-Lokalisierung-Setup. Die Methode ist mit dem Beispiel der Lactose-Repressor-Protein (LacI) fluoreszierend (bei ​​Atto532) markiert und nachgewiesen, wie es ein DNA-Molekül (zwischen zwei optischen Pinzette bewegt) bindet LacI mit spezifischen Bindungssequenzen (dh Betreiber) dargestellt. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Detektion der Bindung an DNA und LacI Diffusion entlang ihrer Kontur in der Zielsuchvorgang. Das Verfahren ist auf jede Kombination von DNA-Sequenz und DNA-bindendes Protein als auch an andere Systeme (Mikrotubuli oder Aktinfilamente und der Motor-Proteine ​​interagieren mit ihnen).

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Protocol

1. Optische Pinzetten-Setup mit Nanometer-Stabilität

Der Versuchsaufbau muss zwei optische Pinzette mit Richtungsstabilität im Nanometerbereich und Intensitätsschwankungen der Fanglaser unter 1% bieten. Kombination dieser Bedingungen wird Nanometer Stabilität der Hantel unter typischen Spannung versichern (1 pN - einige zehn PN), Trap Steifigkeit (0,1 pN / nm) und Messbandbreite (Bildaufnahmerate 20 s -1). Ein Schema der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Optische Pinzetten Design und Konstruktion 15,17:
    1. Montieren Sie die Versuchsapparatur auf einem optischen Tisch mit aktiven Isolatoren, um mechanische Schwingungen zu reduzieren. Montieren Sie das Mikroskop Struktur auf Elastomerisolatoren, um akustische Störungen und mechanischen Resonanzen des Mikroskops Struktur absorbieren.
    2. Legen eines optischen Isolators in der Bahn des Fanglaser, in der Nähe der Laserquelle, um Reduce zufällige Amplitudenschwankungen durch optische Rückmeldung.
    3. Reduzieren Sie die Pfadlänge der Fanglaser so viel wie möglich und legen Sie den gesamten Pfad in einem verschlossenen Kästchen, um Laser-Zeigeschwankungen durch Luftströmungen und Turbulenzen zu reduzieren.
    4. Doppel erstellen optische Pinzetten, indem ein einzelner Nahinfrarot-Laserquelle (Nd: YAG-Laser, 1064 nm) in zwei Strahlen mit orthogonalen Polarisationen. Verwenden Sie keine Zeit-Shared-Fallen, weil sie dazu führen, Schwingung der Hantel unter Spannung 12.
    5. Verwenden Sie akustisch-optische Deflektoren (AODs) durch Direct Digital Synthesizer (DDS) angetrieben, feine Bewegungen von (mindestens) eine Falle und präzise Regulierung der DNA-Spannung zu ermöglichen. DDSs ermöglichen eine bessere Stabilität als Falle spannungsgesteuerte Oszillatoren (VCOs).
    6. Legen Sie zwei Quadrantendetektor Photodioden (QDPs) in der hinteren Brennebene des Kondensators, um die Position der eingefangenen Perlen mit Sub-nm-Genauigkeit zu erfassen.
  2. Überprüfen Sie diese Intensität fluctuations der Fanglaser am Mikroskop Eingang unter 1% unter Verwendung einer Photodiode mit einer Bandbreite größer als die Geschwindigkeit der Bildaufnahme.
  3. Überprüfen Sie zeigt Stabilität der beiden Fanglaser:
    1. Vorbereitung Silicakügelchen in Phosphatpuffer: 20 ul Silicakügelchen (1,54 um, 10% Feststoffe) in 1 ml Aceton 30 s beschallt, kurz vortexen und zentrifugieren 2 min bei 19.000 x g. Resuspendieren in 1 ml Aceton und das Waschen wiederholen. Resuspendieren in 1 ml 50 mM Phosphatpuffer, Wasch 2 Mal und schließlich in 100 ul 50 mM Phosphatpuffer resuspendieren.
    2. Kalibrieren optische Pinzette mit Silica-Perlen: Vorbereitung einer Durchflusszelle, indem ein Deckglas auf einen Objektträger mit doppelseitigem Klebeband (etwa 60 um dick). Fließen 1 mg / ml BSA und 3 min warten. Fließen Siliciumdioxidperlen verdünnt 1/1000 in Phosphatpuffer und die Flusskammer mit Silikonfett zu versiegeln. Falle eine Perle in jedem Falle und kalibrieren die Fallen mit dem Leistungsspektrum Verfahren 18. Vorbereitung Silicakügelchen in Pentyl und Nitrozellulose: Verdünnen von 20 ul Silicakügelchen (1,54 um, 10% Feststoffe) in 1 ml Aceton 30 s beschallt, kurz vortexen und zentrifugieren 2 min bei 19.000 x g. Resuspendieren in 1 ml Aceton und das Waschen wiederholen. Resuspendieren in 1 ml Pentylacetat und wäscht 2 mal. Schließlich resuspendieren sie in Pentylacetat mit 0,1% Nitrocellulose in Pentylacetat aufgelöst.
    3. Verbreiten 2 ul von 1,54 um Durchmesser in Pentylacetat + 0,1% Nitrocellulose gelöst, auf der Oberfläche eines Deckglases (24 x 24 mm) Silicakügelchen mit einem zweiten Deckglas (24 x 60 mm). Befestigen des Deckplättchens auf einem Objektträger unter Verwendung von zwei Stücken von doppelseitigem Klebeband auf eine Durchflusszelle zu erstellen. Füllen Sie die Durchflusszelle mit 50 mM Phosphatpuffer und verschließen Sie diese mit Silikonfett.
    4. Bild einer Kieselsäure Wulst in Hellfeldmikroskopie bei 2,000X Vergrößerung. Das Sichtfeld ist 7 x 5 um bei 768 x 576 Pixel erfasst, so dass der Wulst Bild hat einen Durchmesser von 190 pixels. Kompensieren thermische Driften mit einem Feedback-Software, die, wie in der ref. 17, berechnet xy-Position von der Bildschwerpunkt und Z aus der Beugungsringe und korrigiert Abweichungen Bewegung eines Piezo-Bühne mit nm-Genauigkeit oder besser.
    5. Überlappen die Mitte links-Falle mit dem Wulst Zentrum (die xy-Signalpegel von der QDP muss gleich bei der Kalibrierung gemessen werden können) und messen die Position Lärm und seine Standardabweichung von der QDP. Wiederholen Sie die Messung für die richtige Falle.

2. Single Molecule Lokalisierung mit Nanometer-Genauigkeit

  1. Fluoreszenzmikroskopie Design und Konstruktion 15,19
    1. Verwenden Sie eine hohe Quanteneffizienz und elektronen multipliziert CCD, um die hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnisse für Nanometer-Lokalisierungsgenauigkeit erforderlich zu erreichen.
    2. Wählen Optik ein Bild Pixelgröße ~ 80 nm erhalten (beispielsweise eine Bildvergrßerung ~ 200X mit einem Kamerapixelgröße von 16 um). Dies ist ausreihinreichend kleine bis Lokalisationsfehler aufgrund Pixelation 8 vernachlässigt, aber groß genug, um eine erhebliche Anzahl von Photonen pro Pixel zu sammeln.
    3. Als Anregungsquelle, Laserlicht, das unpolarisiert ist (indem sie durch eine nicht-polarisationserhaltende optische Faser) oder zirkular polarisiert (Durchleiten durch eine λ / 4 Verzögerungsplatte) der Anregung der einzelnen Chromophore zu maximieren, und zwar unabhängig von ihrer Ausrichtung.
    4. Wählen Emissionsbandpassfiltern, die effizient abgeschnitten beide Anregung und Trapping Laser-Licht. Hinweis: In unseren Experimenten haben wir unsere Protein markiert mit Atto532 Farbstoff und verwendet ein Bandpassemissionsfilter bei 600 nm mit 100 nm Bandbreite zentriert.

3. Mikrofluidik

Um eine genaue Kontrolle der Pufferaustausch und "Hantel" Montage, dh die Verankerung eines einzigen DNA-Molekül zwischen zwei optisch gefangenen Mikrosphären, ein custom-built laminaren Mehrkanalströmung zu erreichenSystem entwickelt werden. Dies wird durch eine Durchflusskammer, einem Druckbehälter und einem Druckregelsystem (Figur 2) zusammengesetzt ist.

  1. Durchflusszelle Vorbereitung
    HINWEIS: Die Flusskammer für Einzelmolekül-Experimente an Protein-DNA-Interaktion verwendet wird, hat vorzugsweise 4 Eingänge und 1 Steckdose, bis zu 4 parallel Pufferströme ermöglichen bis, jeder mit einem der verschiedenen Komponenten für das Experiment benötigt: Perlen, DNA, fluoreszenzmarkierte Protein und Abbildungspuffer. Trennung der Komponenten in den Strömungskanälen ermöglicht eine effiziente Montage der Hantel. Außerdem ist die Bilderzeugungskanal nützlich, den Hintergrund zu diffundieren Proteine ​​zu vermeiden und erreichen das hohe Signal-Rausch-Verhältnis für die Lokalisierung des DNA-bindenden Proteins mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von einigen Nanometern erforderlich.
    1. Bohrer 1 mm Durchmesser Löcher in der Mikroskop-Objektträger (76 x 76 x 1 mm) mit einer Diamantspitze, um 4 Eingängen und einem Ausgang zu erzeugen.
    2. Sauber thE Objektträger mit Ethanol und zentrieren den Hafen mit dem O-Ring eingelegt und die Haftring in der Rutsche rund um die Zugangslöcher. Es ist von grundlegender Bedeutung für Handschuhe bei diesem Schritt tragen, um Fingerabdrücke, die den Prozess stören würde Verkleben zu vermeiden.
    3. Klemmen Sie die Nanoports auf den Schlitten, und legen Sie sie in den Ofen bei 180 ° C für 1 Stunde vorgeheizt, um eine vollständige Befestigung ermöglichen.
    4. Die Kontur Muster der Strömungszelle auf einem Stück Papier. Die Kanäle sollten ~ 3 mm breit sein und passen Sie die Löcher Position auf dem Objektträger.
    5. Legen Sie die Zeichnung auf der Oberseite zwei Stücke von Parafilm und mit einem Skalpell scharf machen und kontinuierliche Schnitte entlang der gezeichneten Kontur. Entfernen Sie alle Ausstülpung gebildet. Entsorgen Sie die untere Schicht Parafilm, der nur verwendet wird, um eine saubere Unterstützung zu garantieren.
    6. Legen Sie die Objektträger mit den beigefügten Nanoports auf den Kopf in den metallischen Träger.
    7. Sorgfältig ausrichten Parafilm Kammer Umriss mit den Löchern, um sicherzustellen, than der Parafilm nicht drängen die Einlässe und Auslass der Kammer.
    8. Abdeckung mit einem gereinigten Objektdeckglas (62 x 56 x 0,15 mm) und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Parafilm die Kammer umgebenden.
    9. Platzieren zwei Wärmeblöcke, die zuvor bei 120 ° C erhitzt, auf der Durchflusszelle auf einen konstanten Druck auf sie anzuwenden. Lassen Sie die Parafilm Schmelze für ca. 25 min.
  2. Druckspeicher und Pufferbehälter
    Der Druckbehälter sollte aus Plexiglas (oder ähnlich) gemacht werden und erlauben Unterbringung von sechs Pufferbehälter. Die Möglichkeit, mit wenigstens zwei zusätzlichen Pufferbehälter erhöht die Flexibilität des Instrumentes. Beachten Sie, dass transparente Behälter und Rohre im Durchflusssystem Handhabung erheblich unterstützen und Fehlerbehebung von eingeschlossenen Luftblasen. Sterile Einweg-Luer-Lock-Spitze Spritzen (2,5 ml), von dem die Kolben zuvor entfernt worden ist, sind gute Pufferbehälter und ermöglichen eine einfache Verbindung mit dem Einlassrohr. Stellen Sie sicher, dassdas Gesamtfluidvolumen klein verglichen mit dem Luftvolumen in dem Druckspeicher, eine wesentliche Voraussetzung für reibungslose und stabile Strömung zu erhalten.
    1. Verbinden Absperrventile am Ausgang der Pufferbehälter zum Drehen des Pufferfluss oder während der Experimente.
    2. Montieren Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch. Verbinden die Absperrventile in die Strömungskammer Einlässe mit Polyetheretherketon-Schlauch (Innendurchmesser ~ 150 um) und flanschlose Armaturen. Als Verbindung zwischen dem Rohr und der NanoPort Anordnungen der Strömungszelle hinzuzufügen ~ 3 cm von fluorierten Ethylen-Propylen-Schlauch (Innendurchmesser ca. 500 um). Dieser Schritt ist wichtig, um die Pufferströmung an dem Kammereingang zu reduzieren, um ein Brechen des Strömungszelle oder NanoPort Ablösen von Glas zu vermeiden. Die Verwendung von großen Rohrdurchmesser Innen allein andererseits große Mengen von biologischen Proben erfordern.
    3. Verbinden der Flusskammer in einen offenen Auslaß-Falcon-Röhrchen bei Atmosphärendruck. DiesRohr dient als Entsorgungs für den Puffer aus dem Flusskammer fließt.
  3. Druck-Kontrollsystem
    1. Aufbau eines Drucksteuersystems in der Lage, eine Feineinstellung des Luftdrucks in dem Druckbehälter. Dies kann durch zwei computergesteuerte Magnetventile, eine an einer +0,5 atm Druckquelle (Kompressor) und die zweite zum Atmosphärendruck durchgeführt werden. Magnetventile werden wiederholt für ungefähr 7 ms zu erhöhen oder zu verringern, den Druck in der Leitung, bis der gewünschte Wert erreicht wird geöffnet. HINWEIS: Dieser Ansatz wurde von Carlos Bustamante 20 angepasst und es ergibt sich ein glatter Durchfluss als mit einem Schrittmotor Spritzenpumpe 21.
    2. Fügen Sie einen Druckwandler mit einem individuell geschriebenen Software gesteuert, um die wirksame Druck auf den Druckbehälter ausgeübt überwachen. Typische Arbeitsdrücke liegen im Bereich von 20 mbar für Hantelanordnung und 200 mbar zum Waschen der Strömungssystemkomponenten.

    4. DNA-Tailing mit biotinyliertem Desoxycytidintriphosphat (Biotin-dCTP)

    Das DNA-Molekül sein sollte mehr als 1 um seine Erweiterung unter Fluss und die Verankerung der eingefangenen Perlen zu erleichtern. Darüber hinaus wird eine lange DNA die IR Einfangen von Licht von den Beleuchtungs DNA-Bindungsprotein zu vermeiden. Dies ist von besonderer Relevanz, da die Absorption von IR-Licht aus einem angeregten Chromophor führt zu einer erhöhten Photobleaching. HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde die DNA-Molekül 3,7 um lang. Das Molekül enthalten drei Kopien des Primär Betreiber O1 und eine Kopie von jedem der beiden Hilfsbetreiber, O2 und O3. Diese Sequenzen sind in der Mitte des Moleküls eingeführt worden ist, wodurch ungefähr gleich weit von den Kügelchen eingefangen und IR-Laserstrahlen.

    1. Mix 1 pmol von linearen DNA-3'-Ende mit 60 pmol Biotin-14-dCTP, 4 ul 5x Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT)-Puffer (1 M Kalium CAcodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl 2 (pH 7,2 bei 25 ° C)) und 1,5 ul TdT und ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 15 min. Dies wird in der Zugabe von bis zu 60 Nukleotiden pro DNA Extremität führen. Beachten Sie, dass DNA-3'-Überhänge sind mit einem höheren Wirkungsgrad als Einbau oder stumpfen Enden tailed.
    2. Reinigen tailed DNA mit Spin-Säulen oder Phenol / Chloroform-Extraktion und anschließender Ethanol-Fällung zu CoCl 2 von der TdT Reaktionspuffer zu entfernen.
    3. Nach der Reinigung kann die DNA bei 4 ° C für mehrere Wochen bei -20 ° C für längere Zeiträume gelagert werden, aber vermeiden maliges Auftauen und Wiedereinfrieren.

    5. Markierungsprotein Thiolgruppen mit Atto532

    Kennzeichnung durch Modifikation von Cysteinresten darf die Proteinaktivität zu verändern. Um dieses Problem zu überwinden, verwendeten wir eine LacI Mutante LacIQ231C, which trägt nur ein Cystein pro Monomer an Position 231. Diese Mutante erhält die gleichen Eigenschaften des Wildtyp-und chemische Modifikationen an Position 231 wurde gezeigt, dass nicht mit Proteinstabilität 22 stören. HINWEIS: Wir markierten das Protein mit ATTO532 Maleimid.

    1. Sicherzustellen, dass das Protein in einem Puffer mit einem pH im Bereich von 7,0 bis 7,5 und mit einer Konzentration im Bereich von 2 bis 10 mg / ml gelöst. HINWEIS: Bei diesen Versuchen wurde LacI in Kaliumphosphat 0,3 M, 5% Glucose, pH 7,5 (Puffer A) gelöst.
    2. Auflösen Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) zu einer Endkonzentration von 100 mg / ml in H 2 O. TCEP-Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.
    3. Mischen 100 ul des Proteins mit 3 ul TCEP und Wirbel sorgfältig.
    4. Löse den Farbstoff in N, N-Dimethylformamid (DMF) zu einer Endkonzentration von 10 mg / ml Arbeits bei schlechten Lichtverhältnissen. Vortex, bis vollständig gelöst ist.
    5. Reaktion mix: Fügen Sie 33 ul Farbstoff an das Protein + TCEP und Wirbel sorgfältig. Fast Spin soviel Lösung wie möglich zu sammeln.
    6. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung für 2 Stunden in einem Shaker (8.000 rpm) bei 20 ° C (oder bei 4 ° CO / N), vor Licht geschützt.
    7. Auflösen L-Glutathion reduziert (GSH) in einer Endkonzentration von 100 mg / ml in H 2 O. Werden 3 ul der Reaktionsmischung und Inkubieren auf dem Schüttler bei 8.000 Upm für 15 min. GSH wird die Reaktion durch die Blockierung der Reaktivität von Thiolgruppen zu stoppen.
    8. Reinigen das markierte Protein mit Standard Gelfiltrations-, Dialyse oder Spin-Konzentratoren. HINWEIS: In diesen Versuchen wurde markiert LacI mit 10 kDa Cutoff Spin Konzentratoren gereinigt.
      1. Verdünne das Reaktionsgemisch mit bis zu 12 ml Puffer A, anwenden, um die Konzentrationsvorrichtung, und es Zentrifuge bei 8000 × g, 1 h, 4 ° C beträgt. Das markierte LacI wird somit auf ein Endvolumen von etwa 500 ul konzentriert und das überschüssige Farbstoff die Membran passiert im flow-durch. Entsorgen Sie die Durchfluss und wiederholen Sie Schritt 5.8.1 mindestens drei Mal.
    9. Teilen Sie die markierten Protein in kleine Teilmengen und bei -80 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.

    6. Kombinierte optische Fallen und Einzelmolekül-Fluoreszenz-Imaging Experimente

    1. 1 ml Puffer A zu den Pufferbehälter und 200 mbar Druck anzuwenden, um die Verbindungsrohre und die Durchflusszelle zu waschen. Diffusion des Bindungsproteins an DNA, hier und in den folgenden Schritten zu maximieren, Puffer A mit einem Puffer niedriger Ionenstärke ersetzt. HINWEIS: In diesen Experimenten verwendeten wir 0.5x TBE.
    2. Überprüfen die Anwesenheit von Luftblasen, welche die Strömung stören könnte Glätte. Ein sanfter Film auf dem Auslaufrohr wird dazu beitragen, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen.
    3. Verringern den Druck auf 20 mbar und sicherstellen, dass alle Kanäle und Rohre sind aus Luftblasen klar und die Puffer fließt mit ähnlichen Geschwindigkeiten in allen Kanälen.
    4. Vorbereitung der Proben auf ein Endvolumen von 300 ul: Streptavidin-beschichtete Polystyrolkügelchen 1,87 um; 20 pM von linearen DNA an beiden Extremitäten nach § 4 biotinyliert; 300 pM LacI Tetramer mit Atto532 nach § 5 gekennzeichnet.
    5. Fügen jeder Probe mit einem der Spritzenbehälter in der folgenden Reihenfolge: Perlen in den ersten Kanal, DNA in der zweiten, dritten Kanal mit der Bildpuffer nur (Puffer A + Sauerstoff-Scavenger-System) und des markierten Proteins in dem vierten Kanal.
    6. Schalten Sie den Flusses auf 200 mbar für 3 Minuten, damit sich die Proben innerhalb des Strömungskanals gelangen. Dann reduzieren Sie den Druck auf 20 mbar.
    7. Während die Abbildung des ersten Kanals unter Hellfeldbeleuchtung, wechseln auf den beiden optischen Pinzette und fangen eine Polystyrol-Kügelchen in jedem Falle.
    8. Bewegen sich schnell auf den zweiten Kanal, um zu vermeiden, dass andere Perlen in die Fallen. Beachten Sie, dass die Ankunft der DNA Kanal wird durch das Ende des Wulstes Strömungs leicht erkennbar.
    9. Verwendung von one AOD, verschieben Sie eine Falle (Perle) in der Nähe des anderen Wulst hin und her, um die Befestigung des Fluss verlängert DNA zwischen den beiden optischen Pinzette Perlen ermöglichen. Wenn ein DNA-Hantel ausgebildet ist, beginnt die statische Wulst gemäß der Bewegung der Raupe, die aktiv von der Falle hin und her bewegt wird.
    10. Bewegen sich schnell auf den Puffer Kanal und schalten Sie den Pufferfluss. Führen eines Kraftdehnungskurve Analyse 4,23-25 ​​um die Anwesenheit eines einzelnen DNA-Moleküls zu überprüfen. Wenn mehr als ein Molekül vorhanden ist (dh die Enthalpie, die Erhöhung Phase des Kraft-Dehnungs-Kurve tritt bei einer Länge kürzer als die DNA-Konturlänge), entsorgen Sie die Hantel und beginnen erneut bei Schritt 6.7.
    11. Sobald ein einzelnes DNA-Hantel erhalten wird, schalten Sie den Durchfluss wieder und bewegen Sie die Hantel auf die Protein-Kanal. Wechseln Sie zu weites Feld der Fluoreszenzmikroskopie, um die Interaktion des markierten-LacI mit DNA überwachen. Schalten Sie den Strom ein und starten Akquisition.

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Representative Results

In einem erfolgreichen Versuch, eine (oder mehrere) markierte Proteine ​​unterziehen Bindung / freibleibend und / oder eindimensionalen Diffusion entlang des DNA-Moleküls (Abbildung 3A). Lokalisierung von Proteinen entlang des DNA-Moleküls ermöglicht die Quantifizierung der kinetischen Parameter als Funktion der DNA-Sequenz. Wenn Pufferbedingungen verursacht 1D Diffusion angewendet werden, ist es möglich, Protein-Trajektorien zu folgen, und zu bestimmen, beispielsweise der Diffusionskoeffizient D 1D.

Die genaue Position einer einzigen Stelle in jedem Rahmen kann durch Anpassen der Point Spread Function (PSF) mit einem zweidimensionalen Gauß-Funktion, oder alternativ bei der Handhabung einer großen Datenmenge, mit einem schnelleren, kürzlich veröffentlichten Algorithmus (Radial bestimmt werden Symmetrie Center, RSC) 26,27. Die letztere Methode wird der Punkt der maximalen radialen Symmetrie des Bildes, das Erreichen einer Lokalisierungsgenauigkeit, die typischerweise vergleichbar mit Gaußsche Anpassung ist. In boten Fällen kann durch Tracking MATLAB-Routinen, die frei 27 zugegriffen werden kann, erreicht werden.

3A zeigt eine Kymogramm eines typischen Experiments, in dem ein einzelnes Molekül LacI diffundiert entlang nicht-spezifische DNA-Sequenzen, während ein anderer LacI Molekül spezifisch an einen Betreiber gebunden, in der Mitte des DNA-Moleküls. 3B zeigt die Position der beiden LacI-Moleküle (unter Verwendung von RSC) entlang der Richtung, die die Zentren der beiden Fallen (x) als eine Funktion der Zeit. Aus der Position des Moleküls Diffundieren entlang des DNA-Moleküls, die wir nach der folgenden Gleichung berechnet die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) in unterschiedlichen Zeitintervallen:

Gleichung 1 (1)

wobei N die Gesamtzahl der Positionen gemessen, und n ist die Indexmessung gehen f ROM 1 bis n ist. Bei reinen eindimensionale Brownsche Diffusion ist der MSD direkt proportional zu n At (At das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Rahmen 100 msec in unseren Experimenten) mit einer Steigung gleich dem doppelten Diffusionskoeffizienten (MSD (n, N) = 2D 1 nΔt). Abbildung 4 zeigt die MSD vs nΔt Grundstück für das Molekül diffundiert entlang der DNA. Der Diffusionskoeffizient des Proteins kann leicht aus einer linearen Anpassung des MSD vs nΔt Stück erhalten werden. Beachten Sie, dass, wenn n zunimmt, die Anzahl der Punkte für die Berechnung MSD aus Gl. 1 folglich abnimmt. Der Fehler bei der Auswertung der MSD erhöht somit mit n. Aus diesem Grund haben wir uns für unsere Analyse auf n = N / 4 zu begrenzen. Das ist sowieso ein recht großer Wert im Vergleich zum N / 10 von vielen Labors verwendet.

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Abbildung 1. Der Versuchsaufbau besteht aus: Halogenlampe (H), Kondensator (C), Probe (S), Piezo-Übersetzer (xy und z), Ziel (O), einer niedrigen Vergrößerung Kamera (CCD-200X) und eine hohe Lineare Wiedergabe-Kamera (CCD 2,000X) zur Stabilisierung nm-Rückkopplung verwendet (BS ist ein 50:50-Strahlteilerwürfel). Doppel optische Pinzette eingesetzt und von der optischen Achse des Mikroskops durch den dichroitischen Spiegel (D2 und D3) extrahiert und umfasst: Nd: YAG-Laser (1.064 nm), optischer Isolator (OI), λ / 2 Verzögerungsplatten, Polarisationsstrahlteilerwürfel (PBS), akustooptische Deflektoren (AOD), 1.064 nm Interferenzfilter (F1 und F2), Quadrantendetektor Photodioden (QDP). Signale von QDPs wurden durch einen Analog-Digital-Wandler (ADC) erworben und ausgearbeitet mit einem FPGA-Board. Zwei maßgeschneiderte direkten digitalen Synthesizer (DDS) trieb die AODs Traps 'Position zu steuern. Eine digitale Eingabe-Ausgabe-Platine (DIO) derÖffnung der beiden Magnetventile (V1 und V2) an einen Kompressor (+0,5 atm) und Umgebungsdruck (0 atm) verbunden. Ein LabVIEW-Software überwacht den Druck im Druckspeicher (C1) über einen Druckmesser (PM) und automatisch öffnete eine der beiden Ventile, um die gewünschte Druckniveau zu erreichen. Fluoreszenzanregung durch eine doppelte Nd: YAG-Laser (532 nm) und die auf ein Elektron projizierten Bildes multipliziert Kamera (EMCCD). M ist ein beweglicher Spiegel, F3 ein Emissionsfilter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. (A) Durchflusssystemdiagramm. Das Drucksteuersystem wird durch ein Druckmessgerät (PM) und zwei Magnetventile V1 und V2 zusammen verbindened einem Kompressor auf +0,5 atm (PRS) und dem Umgebungsdruck (ATM) sind. X1 und X2 stellen 3-Wege-Stecker. Die Öffnung der Ventile wird fein eingestellt, um den gewünschten Druck in dem Druckspeicher mit C1-4-Pufferbehältern zu erreichen. Jedes Einlassrohr umfasst eine unabhängige Ein / Aus-Ventil am Eingang des Mehrkanal-Durchflusskammer. Der Ablaufschlauch ist mit dem Abfallbehälter C2 auf Umgebungsdruck gebracht verbunden. Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. (B) Schematische Darstellung des Mehrkanal-Stromkammer. Vier laminare Strömungen separat transloziert funktionalisierten Polystyrol-Kügelchen, DNA-Moleküle, Imaging-Puffer und markierte Proteine. Zwei Perlen sind mit zwei optischen Pinzette gefangen und in die DNA-Kanal, damit DNA Verankerung zwischen ihnen. Ein DNA-Kraft-Extensionsanalyse in dem Pufferkanal durchgeführt, um die Anwesenheit eines einzelnen DNA-Moleküls zu überprüfen, und nur dann wird die DNA in dem Proteinkanal inkubiert. Der Einschub zeigt eine Magnifizierung der endgültige Molekular Konstrukt, bereit für Einzelmolekül-Imaging in der Pufferkanal. Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3 Lokalisierung einzelner Moleküle LacI Interaktion mit einem gestreckten DNA-Moleküls. (A) Die vertikale Achse des Kymogramm stellt die x-Koordinate, die parallel zu dem DNA-Molekül, während die horizontale Achse die Zeit (100 msec Akquisitionszeit). (B ) X-Position des lacI-Molekül gegen die Zeit. Die Stellung der Moleküle wurde durch RSC bestimmt. Bilder wurden bei 100 ms Belichtungszeit und 1,25 x 10 -2 W cm -2 erworben EXCItation Laserintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Auftragung des MSD gegen die Zeit für einen einzigen Molekül LacI Diffundieren entlang einer gestreckten DNA-Moleküls. Der MSD aus der Position in Figur 3B Rekord (rot) dargestellt, berechnet. Der Diffusionskoeffizient D 1D, aus der linearen Regression der in der Figur dargestellten Daten erhalten wird, ist 0,030 ± 0,002 um 2 sec -1.

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Discussion

In den letzten zehn Jahren haben Einzelmolekülmanipulation und bildgebenden Verfahren große Fortschritte in Bezug auf die räumliche und zeitliche Auflösung zu sehen. Die Kombination der Manipulation und bildgebenden Verfahren ist an der Basis wirksame Instrumente, die nun die Steuerung der mechanischen Bedingungen einer einzelnen biologischen Polymeren wie DNA, RNA oder Zytoskelett-Filamente zu ermöglichen, und der gleichzeitigen Lokalisierung von einzelnen Proteinen in Wechselwirkung mit dem gleichen Polymer . Steuerung der mechanischen Bedingungen der eingeschlossenen Polymer ist von besonderem Interesse. In der Tat, in lebenden Zellen, Nukleinsäuren ständig weiter mechanische Beanspruchung durch Wechselwirkung Enzymen und Proteinen verursacht; Ähnlich ist ein komplexes Netzwerk von wechselwirkenden Proteinen und molekularen Motoren moduliert Spannung Zytoskelettfilamenten. Andererseits ist die Möglichkeit, zu erkennen und genau zu lokalisieren Proteinen in Wechselwirkung mit Nukleinsäuren, ermöglicht die Messung von molekularen Wechselwirkungen in Abhängigkeit von ihrer position entlang des DNA-oder RNA-Sequenz.

Die Kombination von Einzelmolekül-Manipulation und bildgebenden Verfahren erfordert eine sorgfältige Gestaltung der Versuchsaufbau und die biologische Konstrukte. Optischen Fallen muss eine stabile Unterstützung, Gewährleistung nm-Ebene Stabilität des suspendierten Polymer. Diese Stabilität kann durch sorgfältige Isolierung der Versuchsapparatur aus den zahlreichen Quellen von mechanischen Geräuschen und durch Minimierung von Laserzeige und Amplitudenschwankungen erreicht werden. Präzise (sub-nm-) Bewegungen der optischen Fallen werden mit AODs von DDSs angetrieben erreicht. Hier veranschaulicht wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu optimieren und zu prüfen, optische Pinzette "Stabilität in der nm-Ebene.

Einfache Weitfeld Epifluoreszenzmikroskopie mit einem EMCCD Kamera gekoppelt ist, verwendet, um einzelne Chromophore Wechselwirkung mit dem Polymer suspendiert lokalisieren. Unsere experimentellen Test zu lange DNA-oder RNA-Moleküle (≥6 KBP) begrenzt, um eine räumliche Trennung zu gewährleisten Wetteschen den Trapping-Laserstrahls und die fluoreszierende Sonde. In der Tat würde Lagerung des nahen Infrarot Fanglaser mit sichtbaren Erregungslaser zu verbesserten Bleichen der Chromophore aufgrund der Absorption von Nah-Infrarotlicht zu führen, während das Chromophor im angeregten Zustand 16. Hantel Montage ist ein weiteres heikles Verfahren, die besser erhalten wird, mit einem Mehrkanal-Durchflusszelle, für die wir eine detaillierte Beschreibung. Wir angegeben, wie man die Pufferfluss und wie Luftblasen, die sonst ernsthaft gefährden können die Experimente vermeiden zu optimieren. Wir beschriebenen Protokolle zur Markierung der DNA-Enden mit Biotin, das unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kügelchen für Hantelanordnung erforderlich ist, und Protokolle zur Proteinmarkierung. Schließlich illustriert wir Schritt-für-Schritt-Operationen auf Experimente, bei denen die Bindung und die Diffusion einer einzelnen Lactose-Repressor-Molekül auf einer gestreckten DNA-Molekül quantitativ durchzuführen.

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Acknowledgments

Wir danken Gijs wuite, Erwin JG Peterman, und Peter Gross für die Hilfe bei der Mikrofluidik und Alessia Tempestini für die Hilfe bei der Probenvorbereitung. Diese Forschung wurde von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung finanziert n ° 284464 und des italienischen Ministeriums für Bildung, Universität und Forschung FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, und im Rahmen der das Vorzeigeprojekt NANOMAX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

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References

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