Ved at kombinere Single-molekyle manipulation og Imaging for Studiet af protein-DNA interaktioner

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi instrumentering og metoder til påvisning af en enkelt fluorescens-mærkede proteinmolekyler, der interagerer med en enkelt DNA-molekyle udspændt mellem to optisk indespærrede mikrosfærer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Enkelt molekyle (SM) teknikker i høj grad har udviklet sig over de sidste tredive år for at imødekomme behovet for at overvinde nogle af de begrænsninger af traditionelle, bulkopløsning målinger 1-3. Manipulation af enkelte biologiske molekyler er skabt mulighed for at måle mekaniske egenskaber af biopolymerer 4 og styre de mekaniske parametre for protein-protein-5 og protein-DNA-interaktioner 6,7. SM fluorescenspåvisning, på den anden side udgør et utroligt alsidigt værktøj til at studere protein-aktivitet in vitro og in vivo, hvilket fører til muligheden for at lokalisere og spore enkelte molekyler med nanometer præcision. Ved montering af instrumentet point-spread funktion SM billedet, i virkeligheden, kan man udføre lokalisering med en præcision hovedsageligt afhængigt signal-støj-forhold (SNR) og nå en grænse på omkring en nanometer 8,9. Disse metoder finder magtfuldeanvendelser i studiet af dynamikken i motordrevne proteiner, såvel som af de diffusionsprocesser underliggende søgemål i DNA-bindende proteiner. Evnen til at bestemme diffusionskonstanter som en funktion af DNA-sekvensen, opholdstid på målet og nøjagtig måling af DNA længde undersøgt i endimensionale diffusion begivenheder udgør et effektivt værktøj til undersøgelse af protein-DNA-vekselvirkninger dynamik og for undersøgelsen af mekanismerne i specifikke mål søgning.

For nylig er kombination af disse to teknikker fremstilles en ny generation af forsøgsopstillinger 10-14 muliggør samtidig manipulation af et biologisk substrat (for eksempel en actin filament eller et DNA-molekyle) og påvisning / lokalisering af et interagerende partner enzym (for eksempel myosin eller et DNA-bindende protein). Fordelene ved disse teknikker primært hviler på muligheden for at udøve mekanisk kontrol over de fangne ​​polymer således enabling studiet af interaktion dynamik versus kræfter eller momenter. Også den metode tillader måling af biokemiske reaktioner langt fra overfladen, så man undgår en af de vigtigste begrænsninger klassiske SM metoder, nemlig behovet for immobilisering af molekyler under undersøgelse på en overflade (glas slide eller mikrosfærer).

Kombinationen af to enkelte molekyler teknikker kræver overvindelse flere tekniske vanskeligheder, hovedsagelig som følge af kravene i mekanisk stabilitet og tilstrækkelig SNR (især når de kræver lokalisering med nm præcision) 15. Især når kobling SM fluorescensdetektering med optiske pincet, reduktion af støj og fotoblegning fra fældefangst infrarøde lasere 16 og kontrol af biokemiske buffere til samling af de biologiske komplekser og udførelsen af de eksperimentelle målinger 11 er af allerstørste betydning. Her beskriver vi de metoder for succesfuldmålinger i en dobbelt fældefangst / SM Fluorescens lokalisering setup. Metodikken er illustreret med eksempel laktose repressorprotein (LacI) fluorescensmærket (med Atto532) og påvist, da det binder sig til et DNA-molekyle (fanget mellem to optiske pincet), der indeholder specifikke Laci bindende sekvenser (dvs. operatører). Vi demonstrere effektiviteten af ​​metoden til påvisning af binding af LacI til DNA og udbredelse langs dens kontur i målet søgeprocessen. Metoden er anvendelig for enhver kombination af DNA-sekvensen og DNA-bindende protein, samt til andre systemer (mikrotubuli eller actinfilamenter og motoren proteiner, der interagerer med dem).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optisk Pincet Opsætning med nanometer Stabilitet

Forsøgsopstillingen skal give to optiske pincet med pege stabilitet ved udsving nanometer niveau og intensitet trapping laser under 1%. Kombination af disse betingelser vil sikre nanometer stabilitet håndvægt under typiske spænding (1 pn - par snese PN), fælde stivhed (0,1 pN / nm) og målebåndbredde (billedet erhvervelse sats 20 sek -1). En ordning af forsøgsopstillingen er afbildet i figur 1.

  1. Optisk pincet design og konstruktion 15,17:
    1. Monter den eksperimentelle apparat på en optisk bord med aktive isolatorer for at reducere mekaniske vibrationer. Monter mikroskopet struktur på elastomere isolatorer at absorbere akustisk støj og mekaniske resonanser mikroskop struktur.
    2. Indsæt et optisk isolator i vejen for trapping laser, nær laser kilde, til reduce tilfældige amplitude udsving på grund af optisk feedback.
    3. Reducer længden stien trapping laseren så meget som muligt og vedlægge hele stien i en forseglet kasse for at reducere laser pointers udsving på grund af luftstrømme og turbulens.
    4. Opret dobbelte optiske pincet ved at opdele en enkelt nær-infrarødt laser kilde (Nd: YAG-laser, 1.064 nm bølgelængde) i to stråler med ortogonale polariseringer. Brug ikke tidsdelte fælder fordi de forårsager oscillation af håndvægt under spænding 12.
    5. Brug akustisk-optiske deflektorer (delegation bemyndigede anvisningsberettigede) som følge af Direct Digital synthesizere (DDSS), så fine bevægelser af (mindst) en fælde og præcis regulering af DNA spændinger. DDSS tillade en bedre fælde stabilitet end Spænding oscillatorer (VCOs).
    6. Sæt to kvadrant detektor fotodioder (QDPs) i ryggen brændplan kondensatoren til at detektere positionen af ​​de fangne ​​perler med sub-nm nøjagtighed.
  2. Kontroller, at intensiteten fluctuations af fældefangst laser på mikroskop indgangen er under 1% ved hjælp af en fotodiode med en båndbredde større end satsen for billedoptagelse.
  3. Tjek pege stabiliteten af ​​de to fældefangst lasere:
    1. Forbered silicaperler i phosphatbuffer: Fortynd 20 ul silicaperler (1,54 um, 10% tørstof) i 1 ml acetone, sonikeres i 30 sek, vortexes kort, og der centrifugeres i 2 minutter ved 19.000 x g. Resuspender i 1 ml acetone og gentag vask. Resuspender i 1 ml 50 mM phosphatbuffer, vaskes 2 gange, og til sidst resuspenderes i 100 pi af 50 mM fosfatbuffer.
    2. Kalibrere optisk pincet med silicaperler: forberede en flow-celle ved at knytte et dækglas til et objektglas med dobbeltklæbende tape (ca. 60 um tyk). Flow 1 mg / ml BSA og vente 3 min. Flow silicaperler fortyndet 1/1000 i phosphatpuffer og forsegle strømningskammeret med silikonefedt. Trap en perle i hver enkelt fælde og kalibrere fælderne ved hjælp kraftspektret metode 18. Forbered silicaperler i pentyl acetat og nitrocellulose: Fortynd 20 ul silicaperler (1,54 um, 10% tørstof) i 1 ml acetone, sonikeres i 30 sek, vortexes kort, og der centrifugeres i 2 minutter ved 19.000 x g. Resuspender i 1 ml acetone og gentag vask. Resuspender i 1 ml pentylacetat og vaskes 2 gange. Endelig resuspendere dem i pentylacetat med 0,1% nitrocellulose opløst i pentylacetat.
    3. Spred 2 pi 1,54 um diameter silicaperler opløst i pentylacetat + 0,1% nitrocellulose på overfladen af ​​et dækglas (24 x 24 mm) ved hjælp af en anden dækglas (24 x 60 mm). Sæt dækglasset på et objektglas ved anvendelse af to stykker af dobbeltklæbende tape til at skabe et flow-celle. Fyld flow-celle med 50 mM fosfatbuffer og forsegle det med silicium fedt.
    4. Billede en silica perle i lysfeltmikroskopi på 2,000X forstørrelse. Synsfeltet skal være 7 x 5 um erhvervet til 768 x 576 pixel, således at vulsten billedet har en diameter på 190 sixels. Kompensere termiske driver med en feedback-software, der, som i ref. 17 beregner xy position fra billedet tyngdepunkt og z fra diffraktion ringe og korrigerer driver flytter et piezo scene med nm-nøjagtighed eller bedre.
    5. Overlap centrum af venstre fælde med vulsten centrum (XY signalniveauer fra QDP skal være den samme målt under kalibrering), og måle positionen støj og standardafvigelsen fra QDP. Gentag målingen for retten fælde.

2. Single Molecule Lokalisering med nanometer Nøjagtighed

  1. Fluorescensmikroskopi design og konstruktion 15,19
    1. Brug en høj kvante effektivitet og elektron-ganget CCD at nå de høje signal-til-støj-forhold, der er nødvendige for nanometer lokalisering nøjagtighed.
    2. Vælg optik for at få et billede pixelstørrelse ~ 80 nm (for eksempel et forstørrelsen ~ 200X med et kamera pixelstørrelse på 16 um). Det er tilstrækkeligt lille til at forsømme lokalisering fejl på grund af pixelering 8, men tilstrækkeligt stort til at samle et stort antal fotoner per pixel.
    3. Som excitationskilde anvende laserlys, der er upolariseret (ved passage gennem en ikke-polarisationsbevarende optisk fiber) eller cirkulært polariseret (ved passage gennem en λ / 4 waveplate) for at maksimere excitation af enkelte kromoforer, uanset deres orientering.
    4. Vælg emission båndpasfiltre der effektivt cut-off både excitation og fældefangst laserlys. Bemærk: I vores eksperimenter mærkede vi vores protein med Atto532 farvestof og brugte en bandpass emissionsfilter centreret ved 600 nm med 100 nm båndbredde.

3. Microfluidics

For at opnå en præcis styring af buffer udveksling og 'håndvægt' samling, dvs forankringen af et enkelt DNA-molekyle mellem to optisk fanget mikrokugler, en specialbygget laminar multikanal strømningSystemet skal udvikles. Dette er sammensat af et strømningskammer, en tryk-beholder og et tryk kontrolsystem (figur 2).

  1. Forberedelse flowcelle
    BEMÆRK: strømningskammeret anvendes til enkelt-molekyle eksperimenter på protein-DNA interaktion har fortrinsvis 4 indgange og 1 udgang, for at give op til 4 parallelle buffer strømme, som hver indeholder et af de forskellige komponenter, der kræves til eksperimentet: perler, DNA, fluorescens-mærket protein og billeddannelse puffer. Adskillelse af komponenterne i strømmen-kanaler muliggør effektiv samling af håndvægt. Desuden billeddannelse kanal er nyttigt at undgå baggrundsfluorescens fra spredende proteiner og opnå høje signal-til-støj-forhold kræves til lokalisering af DNA-bindende protein med en præcision af størrelsesordenen nogle få nanometer.
    1. Bor huller 1 mm i diameter mikroskopobjektglasset (76 x 76 x 1 mm) med en diamant-spids, for at skabe 4 indgange og én udgang.
    2. Rent the objektglas med ethanol og centrere port med O-ringen isat og limen ringen i dias omkring adgangsforholdene huller. Det er vigtigt at bære handsker under dette trin for at undgå fingeraftryk, hvilket ville forstyrre limningen.
    3. Klemme NanoPorts til dias, og læg den i ovnen forvarmes ved 180 ° C i 1 time for at tillade fuldstændig vedhæftning.
    4. Tegn konturmønstre flowcellen på et stykke papir. Kanalerne skal være ~ 3 mm bred og passer hullerne position på objektglas.
    5. Placer tegningen på toppen af ​​to stykker Parafilm, og med en skalpel lave skarpe og kontinuerlige nedskæringer langs tegnet omrids. Fjern eventuelle fremspring dannet. Kassér den nederste Parafilm lag, der bare bruges til at sikre en ren støtte.
    6. Anbring objektglas indeholdende de vedhæftede NanoPorts hovedet i den metalliske støtte.
    7. Ret omhyggeligt Parafilm kammer omrids med hullerne, og sørg thpå parafilmen ikke obtrude fjorde og udløb af kammeret.
    8. Dæk med en renset mikroskop dækglas (62 x 56 x 0,15 mm) og forsigtigt fjerne overskydende Parafilm omkring kammeret.
    9. Placer to varmeblokke, tidligere opvarmet ved 120 ° C, oven på flowcellen at anvende et konstant tryk på det. Lad Parafilm smelte i ca 25 min.
  2. Pres reservoir og buffer beholdere
    Trykket bør reservoiret fremstillet af plexiglas (eller lignende) og tillade indkvartering af seks buffer beholdere. Muligheden for at have mindst to ekstra buffer beholdere forbedrer fleksibilitetsinstrumentet. Bemærk, at gennemsigtige beholdere og rør betydeligt hjælpe med flow-system, håndtering og fejlfinding af luftbobler. Steril og disponibel luer lock-tip injektionssprøjter (2,5 ml), hvorfra stemplerne tidligere er blevet fjernet, er gode buffer beholdere og tillader en nem forbindelse med indløbet slangen. Sørg for, atvæskevolumen samlede tal er lille sammenlignet med den mængde luft inde bremsebeholderen, en tilstand af afgørende betydning for at opnå jævn og stabilt flow.
    1. Slut afspærringsventiler ved afgangen af ​​buffer beholdere til at dreje buffer strømmen til eller fra under forsøgene.
    2. Monter flowcellen på objektbordet. Tilslut afspærringsventilerne til strømningskammeret indløb med polyetheretherketon slange (indvendig diameter ~ 150 um) og kantfrie fittings. Tilføj ~ 3 cm fluorholdige ethylenpropylen rør (indvendig diameter ~ 500 um) som en kobling mellem slangen og NanoPort samlinger af flow celle. Dette trin er vigtigt at reducere buffer flow ved kammerets indgang for at undgå brud på strømningscellen eller NanoPort løsrivelse fra glasset. Anvendelsen af ​​store indre diameter rør alene, på den anden side ville kræve enorme mængder af biologiske prøver.
    3. Tilslut udløb strømningskammeret til en åben Falcon-rør ved atmosfærisk tryk. Detterør tjener som bortskaffelse bufferen strømmer ud af strømningskammeret.
  3. Trykkontrolsystem
    1. Byg en trykkontrol system, der kan fint justere lufttrykket inde bremsebeholderen. Dette kan gøres ved hjælp af to computer-styrede magnetventiler, hvoraf den ene er forbundet til en 0,5 atm trykkilde (kompressor) og den anden til atmosfærisk tryk. Magnetventiler gentagne gange åbnes for cirka 7 msek for at øge eller mindske trykket i ledningen, indtil den ønskede værdi er nået. BEMÆRK: Denne fremgangsmåde blev tilpasset fra Carlos Bustamante 20, og det giver en mere jævn strøm end at bruge en stepmotor sprøjte pumpe 21.
    2. Tilføj en tryktransducer styres af en brugerdefineret skrevet software til at overvåge den effektive pres på bremsebeholderen. Typiske arbejdstryk er i størrelsesordenen 20 mbar for håndvægt samling og 200 mbar for vask af flowet systemkomponenter.

    4. DNA-hale med biotinyleret deoxycytidintriphosphat (biotin-dCTP)

    DNA-molekylet skal være længere end 1 um for at lette dens forlængelse under flow og forankring til de fangne ​​perlerne. Desuden vil en lang DNA forhindre IR trapping lys fra lysende det DNA-bindende protein. Dette er særlig relevant, fordi absorptionen af ​​IR-lys fra en ophidset kromofor resulterer i øget fotoblegning. BEMÆRK: I den foreliggende undersøgelse, DNA-molekylet var 3,7 um lang. Molekylet indeholdt tre eksemplarer af den primære operatør O1 og én kopi af hver af de to ekstra operatører, O2 og O3. Disse sekvenser er blevet indsat i midten af ​​molekylet, hvilket resulterer omtrent ækvidistante fra de fangne ​​perler og IR laserstråler.

    1. Bland 1 pmol lineære DNA-3'-ender med 60 pmol af biotin-14-dCTP, 4 pi 5x Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) puffer (1 M kalium-cacodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl2 (pH 7,2 ved 25 ° C)) og 1,5 pi TdT og Hedeselskabet 2 O til et samlet volumen på 20 ul. Inkuberes blandingen ved 37 ° C i 15 min. Dette vil resultere i tilføjelsen af ​​op til 60 nukleotider pr DNA-ende. Bemærk, at DNA 3'-overhæng er halet med højere effektivitet end forsænkede eller stumpe ender.
    2. Rens hale-DNA med spinkolonner eller phenol / chloroform-ekstraktion og efterfølgende ethanoludfældning at fjerne CoCl2 fra TdT reaktionspuffer.
    3. Efter oprensning kan DNA opbevares ved 4 ° C i flere uger eller ved -20 ° C i længere perioder, men undgå gentagen optøning og genfrysning.

    5. Mærkning Protein thiolgrupperne med ATTO532

    Mærkning gennem ændring af cysteinrester må ikke ændre det protein aktivitet. For at løse dette problem, vi brugte en LacI mutant LacIQ231C, which bærer kun et cystein pr monomer ved stilling 231. Denne mutant bevarer de samme egenskaber ved vildtype og kemiske modifikationer i position 231 har vist sig ikke at interferere med proteinstabilitet 22. BEMÆRK: Vi mærkede protein med ATTO532 maleimid.

    1. Kontroller, at proteinet er opløst i en puffer med et pH i området fra 7,0 til 7,5 og med en koncentration i intervallet fra 2 til 10 mg / ml. BEMÆRK: I disse eksperimenter blev LacI opløst i kaliumphosphat 0,3 M, 5% glucose, pH 7,5 (buffer A).
    2. Opløses Tris (2-carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (TCEP) til en endelig koncentration på 100 mg / ml i H2O TCEP opløsning skal fremstilles frisk før brugen.
    3. Bland 100 gl af proteinet med 3 pi TCEP og vortex grundigt.
    4. Opløses farvestoffet i N, N-dimethylformamid (DMF) til en endelig koncentration på 10 mg / ml arbejder ved svagt lys. Vortex indtil den er helt opløst.
    5. Reaction mix: Add 33 ul farvestof til proteinet + TCEP og vortex grundigt. Hurtig tur til at indsamle så meget opløsning som muligt.
    6. Inkuberes reaktionsblandingen i 2 timer i et rysteapparat (8000 rpm) ved 20 ° C (eller ved 4 ° CO / N), beskyttet mod lys.
    7. Opløses L-Glutathion reduceret (GSH) til en endelig koncentration på 100 mg / ml i H2O Tilsæt 3 pi til reaktionsblandingen og inkuberes på et rysteapparat ved 8.000 rpm i 15 min. GSH vil stoppe reaktionen ved at blokere reaktiviteten af ​​thiolgrupper.
    8. Renses mærkede protein ved anvendelse af standard gelfiltreringssøjler, dialyse eller spin-koncentratorer. BEMÆRK: I disse eksperimenter blev mærket LacI oprenset ved anvendelse af 10 kDa cutoff spin-koncentratorer.
      1. Fortynd reaktionsblandingen med op til 12 ml buffer A, anvendes det til koncentrator enhed, og centrifugeres den ved 8000 xg 1 time, 4 ° C. Det mærkede LacI er således koncentreret til et slutvolumen på 500 ul og det overskydende farvestof passerer membranen i flow-igennem. Kassér gennemstrømning og gentag trin 5.8.1 mindst tre gange.
    9. Opdel mærkede protein i små portioner og opbevares ved -80 ° C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning.

    6. Kombineret optisk indfangning og Single-molekyle fluorescensimagografi Eksperimenter

    1. Tilsæt 1 ml buffer A til buffer beholdere og anvende 200 mbar til at vaske de forbindende rør og flow celle. For at maksimere diffusionen af ​​det bindende protein på DNA, her og i de følgende trin, buffer A kan erstattes med en buffer med lav ionstyrke. BEMÆRK: I disse forsøg anvendte vi TBE 0.5x.
    2. Kontroller tilstedeværelsen af ​​luftbobler, der kan afbryde strømmen glathed. En blid svirp på udløbsrøret vil hjælpe til at fjerne eventuelle resterende bobler.
    3. Nedsæt trykket til 20 mbar, og kontrollere, at alle kanaler og rør er klart af luftbobler og bufferen flyder med lignende hastigheder i alle kanaler.
    4. Forberede prøverne til et slutvolumen på 300 pi: streptavidin-coatede polystyrenkugler 1,87 um; 20 pM af lineært DNA, biotinyleret på begge ekstremiteter ifølge Afsnit 4; 300 pM LacI tetramer mærket med ATTO532 efter punkt 5.
    5. Tilføj hver prøve til en af ​​sprøjtens beholdere i følgende rækkefølge: perler i den første kanal, DNA i den anden, tredje kanal med billedsensoren kun buffer (buffer A + oxygenfjernende system), og det mærkede protein i den fjerde kanal.
    6. Slå strømmen på 200 mbar i 3 minutter for at lade prøverne ankommer inde i strømningskanalen. Reducere derefter trykket til 20 mbar.
    7. Mens billeddannelse den første kanal under lysfelt belysning, tænde de to optiske pincet og fange en polystyrenkugle i hver enkelt fælde.
    8. Bevæge sig hurtigt til den anden kanal for at undgå, at andre perler falder i fælder. Bemærk, at ankomsten til DNA-kanalen er let mærkbar ved udgangen af ​​perlen flow.
    9. Brug af one AOD, flytte en fælde (perle) frem og tilbage i nærheden af ​​den anden vulst for at tillade fastgørelse af flow-udvidet DNA i mellem de to optisk fangne ​​perler. Når et DNA håndvægt er dannet, starter statisk perle følger bevægelsen af ​​perlen, der aktivt bevæges frem og tilbage af fælden.
    10. Bevæge sig hurtigt til bufferen kanal og slukke for bufferen flow. Udfør en kraft-forlængelse kurveanalyse 4,23-25 ​​at kontrollere tilstedeværelsen af et enkelt DNA-molekyle. Hvis mere end ét molekyle er til stede (dvs. enthalpibidraget, hæve fase af den kraft-forlængelse kurve forekommer ved en kortere end DNA kontur længde), kasseres håndvægte og starte igen fra trin 6.7.
    11. Når et enkelt DNA håndvægt er opnået, tænde for strømmen igen, og flyt håndvægt til proteinet kanal. Skift til bredt felt fluorescensmikroskopi at overvåge interaktionen af ​​mærkede Lacl med DNA. Sluk for strømmen og starte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et vellykket eksperiment, undergår en (eller flere) mærkede proteiner bindende / uforpligtende og / eller monodimensional diffusion langs DNA-molekylet (figur 3A). Lokalisering af proteiner langs DNA-molekylet tillader kvantificering af kinetiske parametre som en funktion af DNA-sekvensen. Når pufferbetingelser forårsager 1D diffusion anvendes, er det muligt at følge protein baner, og bestemme, for eksempel, diffusionskoefficienten D 1D.

Den præcise placering af en enkelt plet, i hver ramme, kan bestemmes ved at montere punktspredningsfunktionen (PSF) med en todimensional Gaussisk funktion eller alternativt ved håndtering af en stor datasæt, med en hurtigere, offentliggjorde for nylig algoritme (Radial Symmetry Center, RSC) 26,27. Sidstnævnte metode bestemmes det punkt af maksimal radial symmetri af billedet, nå en lokalisering præcision, der typisk er sammenlignelig med Gaussisk montering. I Both tilfælde kan sporing opnås gennem MATLAB rutiner, der kan tilgås frit 27.

Figur 3A viser en kymogram af et typisk eksperiment, hvor en enkelt LacI molekyle diffunderer langs ikke-specifikke DNA-sekvenser, mens en anden LacI molekyle specifikt bundet til en operatør, som er placeret i centrum af DNA-molekylet. 3B viser positionen af to LACI-molekyler (opnået ved hjælp af RSC) langs den retning, der forbinder centrene af de to fælder (x) som en funktion af tiden. Fra positionen af ​​molekylet diffunderer langs DNA-molekylet, vi beregnet Mean Square Displacement (MSD) ved forskellige tidsintervaller efter følgende ligning:

Ligning 1 (1)

hvor N er det samlede antal positioner målt og n er målingen indeks går f rom 1 til N. I tilfælde af ren unidimensional brownske diffusion, MSD er direkte proportional med n * t (AT er tidsintervallet mellem to på hinanden følgende rammer, 100 ms i vores eksperimenter), med en hældning svarende til det dobbelte diffusionskoefficienten (MSD (N, N) = 2D 1 nΔt). Figur 4 viser MSD vs nΔt plot for molekylet diffunderer langs DNA. Diffusionskoefficienten af proteinet kan let opnås fra en lineær tilpasning af MSD vs nΔt plot. Bemærk, at n stiger, antallet af point til beregning MSD fra Eq. 1 som følge heraf falder. Fejlen i evalueringen af ​​MSD dermed øger med n. Derfor valgte vi at begrænse analysen til n = N / 4. Det er alligevel en ret stor værdi i forhold til N / 10 anvendes af mange laboratorier.

tp_upload / 51446 / 51446fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Den eksperimentelle opsætning består af: halogenlampe (H), kondensator (C), prøve (S), piezo oversættere (XY og Z), målsætning (O), en lav forstørrelse kamera (CCD 200X) og en høj -magnification kamera (CCD 2,000X) anvendt til feedback nm-stabilisering (BS er en 50:50 stråleseparator terning). er dobbelt optisk pincet indsat og udvindes fra den optiske akse af mikroskopet gennem dichroic spejle (D2 og D3) og omfatter: Nd: YAG-laser (1064 nm) optisk isolator (OI), λ / 2 waveplates, polariserende stråledeler terninger (PBS), akustisk-optiske deflektorer (AOD), 1064 nm interferential filtre (F1 og F2), kvadrant detektor fotodioder (QDP). Signaler fra QDPs blev erhvervet via en analog-til-digital konverter (ADC) og udbygget med en FPGA bord. To specialbyggede direkte digitale synthesizere (DDS) kørte delegation bemyndigede anvisningsberettigede at kontrollere fælder stilling. En digital input-output bord (DIO) kontrolleredeåbning af to ventiler (V1 og V2), der er forbundet til en kompressor (+0,5 atm) og omgivende tryk (0 atm), hhv. En Labview software overvåges trykket i tryklageret (C1) ved hjælp af en trykmåler (PM) og åbnes automatisk en af ​​de to ventiler til at nå det ønskede trykniveau. Fluorescens excitation blev leveret af en duplikeret Nd: YAG-laser (532 nm), og det billede, der projiceres på en elektron multipliceret kamera (EMCCD). M er en bevægelig spejl, F3 en emission filter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. (A) Flow-system diagram. Trykket-styresystem består af en trykmåler (PM) og to magnetventiler V1 og V2 forbindeed til en kompressor ved 0,5 atm (PRS), og omgivende tryk (ATM), hhv. X1 og X2 repræsenterer 3-vejs stik. Åbningen af ​​ventilerne finjusteres for at nå det ønskede tryk i tryklageret C1 med 4 buffer beholdere. Hvert indløb rør omfatter en uafhængig on / off ventil ved indgangen til flerkanals strømningskammeret. Udløbet slange er forbundet til affaldsbeholderen C2 placeret ved omgivelsernes tryk. Tegninger er ikke i målestoksforhold. (B) Skematisk fremstilling af flerkanals strømningskammeret. Fire laminare strømme separat translokere funktionaliserede polystyren perler, DNA-molekyler, billedbehandling buffer og mærkede proteiner. To perler er fanget med dobbelt optisk pincet og flyttede til DNA-kanal til at tillade DNA forankring i mellem dem. Et DNA-kraft-forlængelse analyse udføres i bufferen kanal for at kontrollere tilstedeværelsen af ​​et enkelt DNA-molekyle, og lige bagefter DNA'et inkuberes i proteinet kanal. Det indsatte viser en magnifikation af den endelige molekylære konstruktion, klar til enkelt molekyle billeddannelse i bufferen kanal. Tegninger er ikke målfaste. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Lokalisering af enkelt LACI-molekyler, der interagerer med en strakt DNA-molekyle. (A) lodrette akse kymogram repræsenterer x-koordinaten parallelt med DNA-molekylet, og den vandrette akse er tiden (100 msek erhvervelse tid). (B ) X-position LacI molekyle versus tid. Positionen af ​​molekylerne blev bestemt ved RSC. Billeder blev erhvervet ved 100 ms eksponeringstid og 1,25 x 10 -2 W cm -2 exciførelse laser intensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Plot af MSD vs tid for en enkelt LacI molekyle diffunderer langs en ​​strakt DNA-molekyle. MSD beregnes ud fra den position, som helhed er vist i figur 3B (rød). Diffusionskoefficienten D 1D opnået fra lineær regression af afbildet i figuren data er 0,030 ± 0,002 um 2 sek -1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I det sidste årti, har enkelt molekyle manipulation og billedbehandling teknikker set store fremskridt i form af rumlige og tidsmæssige opløsning. Kombinationen af ​​manipulering og billeddannende teknikker er ved foden af ​​stærke instrumenter, der nu tillader kontrol af de mekaniske betingelser i en enkelt biologisk polymer, såsom DNA, RNA eller cytoskeletale filamenter, og den samtidige lokalisering af enkelte proteiner interagerer med den samme polymer . Styring de mekaniske fanget polymer er af særlig interesse. I virkeligheden, i levende celler, nukleinsyrer kontinuerligt undergår mekanisk stress forårsaget af interagerende enzymer og proteiner; ligeledes et komplekst netværk af interagerende proteiner og molekylære motorer modulerer spænding på cytoskeletale filamenter. På den anden side, til muligheden for at opdage og præcist lokalisere proteiner interagerer med nukleinsyrer, tillader måling af molekylære interaktioner som en funktion af deres position langs DNA-eller RNA-sekvens.

Kombination af enkelt-molekyle manipulation og billedbehandling teknikker kræver omhyggelig udformning af forsøgsopstillingen og de biologiske konstruktioner. Optiske fælder skal give en stabil støtte, der sikrer nm-niveau stabilitet af den suspenderede polymer. En sådan stabilitet kan nås gennem omhyggelig isolering af eksperimentelle apparatur fra de mange kilder til mekanisk støj og ved at minimere laser pege og amplitude udsving. Præcise (sub-nm) bevægelser af de optiske fælder opnås ved hjælp af delegation bemyndigede anvisningsberettigede drevet af DDSS. Her har vi illustreret en trin-for-trin-protokollen til at optimere og kontrollere optisk pincet 'stabilitet på nm-niveau.

Simpel bredt synsfelt epi-fluorescensmikroskopi koblet til en EMCCD kamera anvendes til at lokalisere enkelt kromoforer interagerer med suspenderet polymer. Vores eksperimentelle analyse er begrænset til lange DNA eller RNA-molekyler (≥6 kbp) for at sikre en rumlig adskillelse væddemållem fældefangst laserstråle og fluorescerende probe. Faktisk ville superposition af det nærinfrarøde trapping laser med synlig excitation laser føre til bedre fotoblegning af kromoforerne skyldes absorption af nær-infrarødt lys, mens kromoforen er i den exciterede tilstand 16. Dumbbell samling er en anden vanskelig procedure, der bedre opnås ved hjælp af en multikanal flow-celle, som vi fremlagde en detaljeret beskrivelse. Vi anførte hvordan man kan optimere buffer flow og hvordan man undgår luftbobler, som kan ellers alvorligt at kompromittere forsøgene. Vi beskrev protokoller til mærkning af DNA ekstremiteter med biotin, som er nødvendig for håndvægt montage hjælp streptavidinovertrukne perler, og protokoller for protein mærkning. Endelig har vi illustreret trin-for-trin operationer til at udføre forsøg, hvor den bindende og udbredelsen af ​​en enkelt laktose repressormolekylet på en strakt DNA-molekyle er kvantificeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Gijs wuite Erwin JG Peterman, og Peter Gross efter hjælp til mikrofluidik og Alessia Tempestini hjælp til prøveforberedelse. Denne forskning blev finansieret af Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskudsaftale n ° 284464 og fra det italienske ministerium for uddannelse, universiteter og forskning FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro i Ricerca 2013 RBFR13V4M2, og inden for rammerne af flagskibsprojekt Nanomax.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
  2. Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
  3. Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
  4. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  5. Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
  6. Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
  7. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
  8. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  9. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  10. Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
  11. Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
  13. Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
  14. van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
  15. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
  16. Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
  17. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  18. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
  19. Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
  20. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
  21. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
  22. Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
  23. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
  24. van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
  25. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
  26. Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
  27. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics