में उत्पादित संयोजक Disulfide युक्त जहर प्रोटीन के लिए लागू उच्च Throughput मात्रात्मक अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और शोधन
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB), Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d'Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO), Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

Published 7/30/2014
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Biology
 

Summary

स्क्रीनिंग मात्रात्मक, उच्च throughput अभिव्यक्ति और छोटे पैमाने पर कोलाई संस्कृतियों से संलयन प्रोटीन की विश्लेषणात्मक शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और डाइसल्फ़ाइड युक्त पशु विष प्रोटीन लक्ष्य की अभिव्यक्ति के लिए आवेदन किया है.

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Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

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Abstract

Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल अभिव्यक्ति प्रणाली है. कई प्रोटीन एक अघुलनशील रूप में व्यक्त कर रहे हैं लेकिन, जब से प्रोटीन सफ़ाई कभी कभी चुनौतीपूर्ण है. मुश्किल या कई लक्ष्यों के साथ काम करते हैं इसलिए यह जल्दी से घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए शर्तों की पहचान करने के लिए उच्च throughput (HTP) एक छोटे पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग (1-4 मिलीलीटर संस्कृतियों) का उपयोग करने की सिफारिश की है. प्रयोगशाला के विभिन्न स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कार्यक्रम, एक (पुनः संयोजक प्रोटीन की .1-100 मिलीग्राम / एल संस्कृति की एक सीमा के भीतर) मात्रात्मक और HTP प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रोटीन के हजारों पर लागू किया और मान्य किया गया था के साथ सामना. प्रोटोकॉल एक तरल से निपटने रोबोट के उपयोग के साथ स्वचालित थे लेकिन यह भी विशेष उपकरणों के बिना मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है.

डाइसल्फ़ाइड युक्त विष प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैंचिकित्सकीय दवा सुराग के रूप में अपनी क्षमता के लिए मान्यता बढ़ रही है. वे अत्यधिक शक्तिशाली और चुनिंदा हो सकता है, लेकिन उनके जटिल डाइसल्फ़ाइड बांड नेटवर्क का निर्माण करने के लिए उन्हें चुनौती दे रही है. FP7 यूरोपीय Venomics परियोजना (के एक सदस्य के रूप में www.venomics.eu ), हमारी चुनौती कार्यात्मक विशेषता के लिए उपन्यास विष प्रोटीन के हजारों उत्पादन के उद्देश्य के साथ सफल उत्पादन रणनीति विकसित करने के लिए है. डाइसल्फ़ाइड बांड Isomerase DsbC के redox गुण द्वारा सहायता प्राप्त, हम ई. में ऑक्सीकरण, कार्यात्मक विष पेप्टाइड्स की अभिव्यक्ति के लिए हमारे HTP उत्पादन पाइपलाइन अनुकूलित कोली कोशिका द्रव्य. प्रोटोकॉल भी विविध डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए लागू कर रहे हैं. यहाँ हम हमारे पाइप लाइन पशु विष प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए लागू प्रदर्शित करता है. प्रोटोकॉल के साथ साथ वर्णित के साथ यह घुलनशील डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन एक सप्ताह के रूप में छोटे में प्राप्त किया जा जाएगा संभावना है. यहां तक ​​कि एक छोटे पैमाने से, वें का उपयोग करने की क्षमता हैई पायलट अध्ययन में, या संवेदनशील सूक्ष्म assays के लिए लक्षण वर्णन के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ऑक्सीकरण राज्य मान्य के लिए प्रोटीन शुद्ध किया.

Introduction

जीनोमिक्स की उन्नति और नए प्रोटीन की खोज की दर तेजी से प्रेरित है, उच्च throughput पाइपलाइनों स्क्रीनिंग और इष्टतम प्रोटीन उत्पादन रणनीतियों की पहचान के लिए पारंपरिक तरीकों parallelize करने के लिए विकसित किया गया है. अनुकूलित किया जाना संभावित चर अलग अभिव्यक्ति लक्ष्य संरक्षिकाओं 14,15 के साथ 5, संलयन भागीदारों 6-13, सह अभिव्यक्ति वेरिएंट, 1,2, तापमान 3,4, मीडिया 2,3 उपभेदों, cytoplasmic शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं या periplasmic अभिव्यक्ति 16-18, और शुद्धि बफर घटकों 3. बैच को बैच भिन्नता सीमित है, जबकि उच्च throughput दृष्टिकोण, कई चर या कई लक्ष्यों क्षमता का एक उच्च स्तर के साथ समानांतर में परीक्षण किया जा सकता को लागू करने से. हमारे अनुभव में, रणनीति भी उसी संस्कृति (तापमान, मीडिया, वेंटिलेशन, आदि) और शुद्धि की स्थिति (एक ही निवासियों का उपयोग बड़े पैमाने अप पर अच्छा reproducibility देता हैएन, buffers, आदि). कई उच्च throughput प्लेटफार्मों अर्थात् ऐसे फ्यूजन पार्टनर्स, अभिव्यक्ति उपभेदों या तापमान 19-23 के रूप में अलग मापदंडों के माध्यम से, घुलनशील प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए शर्तों की पहचान करने के लिए पिछले एक दशक में इस्तेमाल किया गया है.

हमने हाल ही में घुलनशील डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन 11 की अभिव्यक्ति के लिए हमारे उच्च throughput प्रदर्शन के दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया. चयनित प्रोटीन विषैला स्रोतों से न केवल थे, लेकिन यह भी पौधों, सूअर, गाय और मानव सहित प्रजातियों में से एक विस्तृत श्रृंखला से डाइसल्फ़ाइड युक्त एंजाइम inhibitors शामिल थे. प्रयोग 12 विभिन्न फ्यूजन भागीदारों और 28 डाइसल्फ़ाइड-जालीदार प्रोटीन की घुलनशीलता और तह पर तीन अलग अभिव्यक्ति उपभेदों के प्रभाव की तुलना में. हम तनाव BL21 में उत्पादन के लिए एक संलयन साथी (DE3) के रूप में DsbC का उपयोग pLysS बेहद outproduced (प्राप्त घुलनशील प्रोटीन की उपज और संख्या दोनों में) तनाव और फ्यूजन के किसी भी अन्य संयोजन 11 का परीक्षण किया है कि प्रदर्शन किया.इस प्रयोग के परिणाम डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्य की अभिव्यक्ति के लिए अधिक अनुकूल एक में (प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है) हमारे मूल सामान्य उच्च throughput पाइपलाइन 22,24 आदत डाल के लिए आधार बनाया. पशु विष से डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन विशेष रुचि के हैं. विष औषधीय और therapeutically संभावित मूल्य के साथ, bioactive पेप्टाइड्स और प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण हैं. हालांकि, डाइसल्फ़ाइड बांड युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति तुच्छ नहीं है. ये प्रोटीन आम तौर पर सात डाइसल्फ़ाइड बांड के लिए एक के बीच में होते हैं, और सक्रिय होने के क्रम में सही डाइसल्फ़ाइड संबंधों पैटर्न के साथ ऑक्सीकरण किया जाना चाहिए. वर्तमान में, मंच FP7 यूरोपीय VENOMICS परियोजना (www.venomics.eu) के हिस्से के रूप में डाइसल्फ़ाइड युक्त पशु विष प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और लक्ष्य के हजारों की उच्च throughput अभिव्यक्ति के लिए उपन्यास प्रोटोकॉल बेंच मार्किंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है . इधर, एक स्वचालित विधिउच्च throughput छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और शोधन (चित्रा 1 देखें) के लिए प्रदान की जाती है डाइसल्फ़ाइड युक्त करने के लिए पशु विष प्रोटीन आवेदन किया. डाइसल्फ़ाइड अमीर पेप्टाइड और प्रोटीन के लिए रणनीति लक्ष्य प्रोटीन के लिए cleavable उसकी DsbC fusions बनाने शुद्धि और redox सक्रिय फ्यूजन साथी, DsbC के लिए एक उनकी-टैग, (देखें चित्र 2) का इस्तेमाल करता है.

प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित के साथ साथ एक तरल से निपटने रोबोट और HTP वैद्युतकणसंचलन का उपयोग स्वचालन है, इन तरीकों एक बुनियादी सेटअप के साथ भी प्रयोगशालाओं महंगे उपकरण के लिए किसी भी शर्त के बिना प्रोटोकॉल का लाभ ले सकते हैं जिसका अर्थ है कि यह भी एक उच्च throughput पुस्तिका दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं . शुद्धि और विश्लेषण (डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन के लिए विशिष्ट नहीं) के लिए परिवर्तन के लिए मैनुअल प्रोटोकॉल कहीं 24 प्रकाशित किया गया है और यहां दोहराया नहीं जाएगा. recombi द्वारा उत्पादित अभिव्यक्ति क्लोन से मैनुअल प्रक्रिया के throughput (,घुलनशील प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण करने के लिए राष्ट्रीय क्लोनिंग 25,) एसडीएस पृष्ठ का पता लगाने के) या 384 (4 x 96 का उपयोग (96 है, (चित्रा 1 देखें)) प्रति सप्ताह संस्कृतियों डॉट धब्बा और एसडीएस पृष्ठ 26 का उपयोग. (जैसे एक कैलिपर GXII LabChip प्रणाली 22 के साथ के रूप में, एक तरल से निपटने रोबोट और डॉट धब्बा 26 या HTP वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर एक अर्द्ध स्वचालित तरीके से प्रदर्शन करते हैं तो यह बढ़ाया जा सकता है इस के साथ साथ वर्णित के रूप में एक सप्ताह से अधिक समानांतर में अप करने के लिए 1,152 (12 x 96) संस्कृतियों, को परिणाम) के विश्लेषण के लिए. नियमित मिलाते इन्क्यूबेटरों पर्याप्त वेंटिलेशन के लिए छोटी कक्षीय उच्च गति मिलाते इन्क्यूबेटरों के उपयोग की जरूरत है, जो 96 (DW96) स्वरूप, (मिलाते हुए गहरे कुएं में उगाई संस्कृतियों के विपरीत इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि संवर्धन गहरे कुएं 24 (DW24) प्रारूप में किया जाता है 800 rpm पर). ऑटो प्रेरण मीडिया 27 का उपयोग भी मार्गदर्शन प्रेरण कदम को नष्ट करने, अभिव्यक्ति सरल करता है. प्रयोगशालाओं पहले से ही पूर्व निर्धारित अभिव्यक्ति और पुरी का उपयोग यहां तक ​​कि जहांदिखाएं शर्तों, इन बस दक्षता में सुधार करने के लिए इस HTP सिस्टम में सीधे हस्तांतरित किया जा सकता है. डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन के लिए उच्च throughput प्रदर्शन पाइपलाइन की एक विस्तृत योजनाबद्ध चित्रा 3 में प्रदान की जाती है. पाइपलाइन में मापदंडों हमें प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे उपयोगी स्थितियों का चयन करने की अनुमति दी है जो व्यापक प्रदर्शन प्रयोगों 11, 22, के आधार पर चयन किया गया था.

कैरेक्टराइजेशन नमूना के माइक्रोग्राम के दसियों पर्याप्त, या संवेदनशील कार्यात्मक assays और बाध्यकारी assays (उदाहरण के लिए, कम मात्रा HTP पैच दबाना सिस्टम 28) के लिए है, जहां पायलट अध्ययन में छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति से सीधे शुद्ध किया टैग प्रोटीन पर प्रदर्शन किया जा सकता है. वही भी टैग और प्रोटीज (रिवर्स चरण HPLC द्वारा, उदाहरण के लिए) को हटा रहे हैं, बशर्ते दरार के बाद untagged ठिकानों पर प्रदर्शन किया जा सकता है. गुणवत्ता नियंत्रण भी (उम्मीद आकार और ऑक्सीकरण सेंट पुष्टि करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता हैखाया) या chromatographic तरीकों () 29 पवित्रता या विविधता पुष्टि करने के लिए. कभी कभी दरार (विशेष रूप से खराब घुलनशील प्रोटीन 30,31 के लिए) अनावश्यक या भी अवांछनीय है टैग, तो इस प्रोटोकॉल दरार में वैकल्पिक है. भले ही, सभी निर्माणों में सीधे (चित्रा 2 और चर्चा देखें) दरार के बाद देशी प्रोटीन का उत्पादन करने के लक्ष्य जीन पूर्ववर्ती एक TEV प्रोटीज दरार साइट (ENLYFQ / [जी] 32) है. फ्यूजन टैग की दरार वांछित है, दरार दक्षता का विश्लेषण करने के लिए छोटे पैमाने पर (क्षालन अंश पर या 'कॉलम पर') का परीक्षण किया जा सकता है, बाद में बड़े पैमाने अप प्रयोगों के लिए पैदावार के विश्वसनीय अनुमान की आवश्यकता है और प्राप्त अगर स्थिति अनुकूलन.

आत्मीयता शुद्धि के दौरान इस्तेमाल मोतियों की मात्रा के लिए दो विकल्पों के प्रयोग के उद्देश्य और उम्मीदों के आधार पर कर रहे हैं. (पायलट assays या एमएस के लिए शुद्ध करने के लिए, या extrapol के लिए जितना संभव हो उतना प्रोटीन कब्जा करने में सक्षम होना करने के लिए) पैमाने अप पैदावार के लिए खाया राल के 200 μl के अंतिम मात्रा प्रणाली की संतृप्ति पहले 1-100 मिलीग्राम / एल संस्कृति की रेंज में घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति, इस्तेमाल किया जाना चाहिए) की धारा 8.1 में (प्रोटोकॉल (ए देखें) . प्रयोग का उद्देश्य घुलनशील प्रोटीन की कम मात्रा का पता लगाने हालांकि, अगर फिर राल के 50 μl के अंतिम मात्रा (बी (प्रोटोकॉल देख 0.1-25 मिलीग्राम / एल संस्कृति की रेंज में घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति, उपयुक्त है ) की धारा 8.2 में).

यदि जरूरी हुआ तो उत्पादन घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए पहचान की शर्तों का उपयोग आगे संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए शुद्ध लक्ष्य के मिलीग्राम मात्रा में प्राप्त करने के लिए, बढ़ाया जा सकता है. AFMB पर इस्तेमाल बड़े पैमाने अप प्रोटोकॉल का विवरण कहीं 22,24 चर्चा की गई है.

प्रयोगात्मक सेटअप, प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम के लिए प्रासंगिक आगे की जानकारी, संशोधनों और मुसीबत शूटिंग और तकनीक की सीमाओं डिस्क में प्रदान की जाती हैंussion. प्रयोगों शुरू होने से पहले चर्चा को पढ़ने के लिए धन्यवाद.

हम हर कदम पर 90% की सफलता दर की उम्मीद प्रोटोकॉल के दौरान (उदाहरण के लिए, संस्कृतियों के कम से कम 90% किसी भी कदम पर हो जाना चाहिए). प्रयोग में किसी भी कदम की सफलता की दर 90% से नीचे गिर जाता है, तो नमूने खारिज कर रहे हैं और प्रयोग निर्माणों का पूरा संग्रह के लिए दोहराया है. यह परीक्षण प्रोटीन पर अत्यधिक निर्भर हो जाएगा लेकिन, जैसा कि इस सफलता दर के रूप में घुलनशील प्रोटीन या 100% दक्षता के साथ फोड़ना कि निर्माणों के अनुपात में व्यक्त कि निर्माणों की संख्या के लिए लागू नहीं है.

रोबोट worktable के सेट अप के लिए विशिष्ट विवरण वैकल्पिक worktable सेट अप के लिए आवश्यक के रूप में हालांकि वे अनुकूलित किया जा सकता है, (यह भी देखें चित्रा 4) प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए प्रदान की जाती हैं. रोबोट हार्डवेयर (Tecan) एक 96 मल्टीचैनल हाथ (MCA96), रोबोट जोड़तोड़ (रोमा) और 8 चैनल तरल से निपटने सिर (के होते हैंLIHA). MCA96 उपयोग सभी कदम भी LIHA कदम के बीच धोया जा करने की आवश्यकता होगी क्योंकि हालांकि वे लंबे समय तक ले जाएगा, एक MCA96 उपलब्ध नहीं है अगर LIHA का उपयोग किया जा सकता है. रोबोट तकनीकी रूप से एक बाँझ वातावरण नहीं है, एंटीबायोटिक दवाओं का समावेश आम तौर पर संक्रमण या बाँझपन के साथ समस्या नहीं हैं कि यह सुनिश्चित करता है.

Protocol

भाग एक: परिवर्तन और टेस्ट अभिव्यक्ति

क्लोनिंग 22 और शुद्धि के लिए परिवर्तन के लिए मैन्युअल प्रक्रिया कहीं 24 चर्चा कर रहे हैं. परिवर्तन प्रोटोकॉल पूरी तरह रोबोट 26 पर किया जा सकता है, लेकिन यह आम तौर पर अधिक समय कुशल इसे स्वयं करने की है. इसलिए प्रोटोकॉल के साथ साथ घोला जा सकता है मैन्युअल रूप से किया गर्मी हैरान परिवर्तन से अभिव्यक्ति precultures और परिवर्तन की चढ़ाना का टीका से शुरू करते हैं. पुस्तिका क्लोनिंग और परिवर्तन की प्रक्रियाओं पर अधिक जानकारी के लिए प्रासंगिक संदर्भ 22,24 देखें.

1. Precultures और चढ़ाना

  1. : रोबोट worktable (पदों के लिए 4 चित्र देखें) तैयार करें
    1. 150 मिलीलीटर बाँझ लेग शोरबा युक्त 300 मिलीलीटर गर्त रखो (एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक / Chloramphenicol (34 माइक्रोग्राम / एमएल), या अन्य उपयुक्त एंटीबायोटिक) की स्थिति 8.
    2. एक बाँझ DW रखोस्थिति 11 में 96. पदों पर 14 से 17 में पर उनके lids के साथ 4x पूर्व तैयार 24 अच्छी तरह से लेग अगर (एएमपी / सीएएम) टिशू कल्चर प्लेट (प्रत्येक कुएं में 2 मिलीलीटर अगर युक्त) रखो.
    3. स्थिति 13 पर (96 परिवर्तन heatshock बाद घोला जा सकता युक्त) परिवर्तन थाली रखो. यह तरल precultures और लेग अगर प्लेटों टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. स्थिति 18 पर बाँझ 200 μl विंदुक युक्तियाँ के एक बॉक्स रखा.
  2. प्रत्येक में 1 मिलीलीटर लेग शोरबा के अंतिम मात्रा की अच्छी तरह से जब तक वहाँ 96 मल्टीचैनल हाथ (MCA96) और 200 μl टिप्स, महाप्राण लेग शोरबा (स्थिति 8) के 200 μl का उपयोग करना, और स्थिति 11 पर DW96 में बांटना. दोहराएँ DW96. यह तरल preculture बन जाएगा.
  3. रोबोट जोड़तोड़ (रोमा) का उपयोग करना, पहले 24 अच्छी तरह से लेग अगर थाली के ढक्कन को हटा दें और चढ़ाना कि थाली के लिए समाप्त हो गया है जब तक (एक होटल वाहक में उदाहरण के लिए) इसे कहीं जगह है.
  4. (LIHA) सिर से निपटने 8 चैनल तरल पदार्थ का उपयोग, टी की तो महाप्राण 50 μl मिश्रणस्थिति 13 में परिवर्तन मिश्रण का वह पहला स्तंभ. परिवर्तन मिश्रण की यह मात्रा अच्छी तरह से लेग अग्रवाल को कवर करने के लिए अभी पर्याप्त है.
  5. (चित्रा 5 में दिखाया गया है) पहले 4 चैनल के साथ, स्थिति 14 पर पहले 24 अच्छी तरह से लेग अगर थाली का पहला स्तंभ पर बांटना.
  6. पिछले 4 चैनल के साथ, पहले 24 अच्छी तरह से लेग अगर थाली के दूसरे स्तंभ पर बांटना.
  7. अच्छी तरह से वितरण के बाद सभी सुझावों को धो लें.
  8. 24 अच्छी तरह से चित्रा 5 में प्रदान की योजना का उपयोग करने के लिए - सभी परिवर्तनों 96 से स्थानांतरित स्थिति 14 में पहली प्लेट पर चढ़ाया गया है जब तक यह प्रक्रिया जारी है.
  9. पहले थाली पूरा हो चुका है एक बार, ढक्कन की जगह और स्थिति 15 पर अगले थाली से ढक्कन हटाने के लिए रोमा का उपयोग करें. अगले 3 प्लेटों के लिए चढ़ाना योजना का उपयोग जारी.
  10. चढ़ाना समाप्त हो जाने के बाद, 1,200 rpm के लिए ते हिला सेट और परिवर्तन मिश्रण का एक समरूप वितरण करने के लिए 1 मिनट के लिए सभी प्लेटें हिला. MCA96 और मूल पिपेट सुझावों का प्रयोग, शेष परिवर्तन मिक्स (स्थिति 13) की तो महाप्राण 60 μl मिश्रण और स्थिति 11 पर लेग शोरबा युक्त DW96 में बांटना.
  11. संस्कृति वेंटिलेशन अनुमति देने के लिए सांस चिपकने वाली फिल्म के साथ DW96 precultures सील.
  12. अधिकतम गति हे / एन (200/800 आरपीएम कक्षीय हिलनेवाला पर निर्भर करता है) में 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में रखें.
  13. लेग अगर प्लेटों ड्राई तक (10 मिनट) बंद उनके lids के साथ एक हुड में रखा जाना चाहिए. तब वे अगली सुबह तक एक 37 डिग्री सेल्सियस थाली इनक्यूबेटर में उलटा रखा जाता है.
  14. अगले दिन, preculture ऑटो प्रेरण मध्यम में और ग्लिसरॉल शेयरों की तैयारी के लिए परीक्षण अभिव्यक्ति टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. एक पीठ के रूप में, एक फ्रिज में अगर प्लेट रखो. यदि आवश्यक हो, अगर प्लेट या ग्लिसरॉल शेयरों से शुरू, परीक्षण अभिव्यक्ति सीधे एक ताजा लेग preculture inoculating द्वारा फिर से किया जा सकता है.

DW24 ZYP के 2. तैयारी-5052 प्लेट्स

नोट: यह प्रक्रिया 4x DW24 प्लेटों के प्रत्येक सेट के लिए पूरा करने के लिए लगभग 5 मिनट लगते हैं.

  1. प्रत्येक घटक के लिए व्यंजनों हैं - 96 संस्कृतियों (464 मिलीलीटर ZY मध्यम, 250 μl 2 एम MgSO 4, 10 मिलीलीटर 50x 5052, 25 एमएल 20x एनपीएस, इसी क्रम में से प्रत्येक को दोहराने के लिए 500 मिलीलीटर ZYP-5052 ऑटो प्रेरण मध्यम श्रृंगार ) 1 टेबल में प्रदान की उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक.
  2. रोबोट worktable तैयार:
    1. स्थिति 5 और 6 पर दो 300 मिलीलीटर troughs, ~ 250 मिलीलीटर मध्यम युक्त प्रत्येक रखो. पदों पर 14 से 17 पर चार बाँझ DW24 प्लेटें रखो. स्थिति 18 पर 200 μl सुझावों रखो.
  3. MCA96 का प्रयोग और 200 μl टिप्स, महाप्राण 200 स्थिति 5 से ZYP-5052 के μl और स्थिति 14 पर पहली DW24 थाली में बांटना. ऐसा 5 बार (4 सुझावों के कुल कुल के लिए एक बार में एक ही कुएं में बांटना होगा 4 मिलीलीटर की). पदों पर शेष 3 एक्स DW24 प्लेटों के लिए दोहराएँ 15-17, Switपिछले दो DW24 प्लेटों के लिए स्थिति 6 में ZYP-5052 के लिए चिंग.

टेस्ट अभिव्यक्ति संस्कृतियों के 3. टीका और विकास

नोट: टीका 4x DW24 प्लेटों के प्रत्येक सेट के लिए पूरा होने में लगभग 10 मिनट लगते हैं, और विकास ओ / एन जारी है

  1. रोबोट worktable तैयार:
    1. स्थिति 11 पर (कदम 1.15 से) precultures युक्त DW96 थाली रखो. पदों पर 14 से 17 में (2.3 कदम से) ZYP-5052 मध्यम युक्त चार DW24 प्लेटें रखो.
  2. चित्रा 5 में प्रदान की योजना का उपयोग कर परीक्षण अभिव्यक्ति संस्कृतियों (1/40 कमजोर पड़ने) टीका लगाना LIHA महाप्राण स्थिति 11 से preculture के 100 μl का उपयोग करना. 96 अच्छी तरह precultures के प्रत्येक स्तंभ के बीच धोने स्टेशन पर पूरी तरह LIHA सिर धो लें.
  3. सांस फिल्म के साथ DW24 प्लेटें सील और 4 घंटे के लिए (200/400 आरपीएम) झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. इस दौरान विकास के चरण का समय है जो glucosमध्यम से ई preferentially 27 समाप्त हो जाएगा.
  4. 17 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में कमी 4 घंटा और ग्लूकोज की कमी के बाद, लैक्टोज यह काम 22 में, BL21 (DE3) pLysS या Rosetta 2 (DE3) pLysS के लिए इष्टतम विकास की स्थिति प्रदान करने, अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए अग्रणी metabolized किया जा शुरू कर देंगे. ओ / एन व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं को छोड़ दो ग्लिसरॉल शेयरों बनाने के लिए शेष preculture का प्रयोग करें.

ग्लिसरॉल शेयरों की 4. तैयारी

नोट: ग्लिसरॉल शेयरों फ्रीजर विफलता के मामले में विभिन्न स्थानों पर जमा होने की triplicates में किया जाना चाहिए.

  1. रोबोट worktable तैयार:
    1. ग्लिसरॉल शेयरों के घर से 7 स्थान 5 में से microtiter प्लेट रखो. स्थिति 8 पर 100% ग्लिसरॉल के 50 एमएल से भरा एक 300 मिलीलीटर गर्त में डाल दिया. स्थिति 11 में प्रत्येक कुएं में (3.2 कदम के बाद) preculture के 800 μl युक्त DW96 रखो. स्थिति 18 पर 200 μl सुझावों रखो.
  2. एक slo का प्रयोगडब्ल्यू आकांक्षा और वितरण की गति, precultures युक्त DW96 में ग्लिसरॉल जोड़ने के लिए MCA96 और 200 μl सुझावों का उपयोग करें.
    1. ग्लिसरॉल के महाप्राण 200 μl (स्थिति से 8).
    2. (स्थिति 11 पर) 150 μl बांटना, पहले तो शेष ग्लिसरॉल टिप के नीचे तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए 20 सेकंड के लिए रोकें. शेष 50 μl बांटना.
  3. वे अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं जब तक एक ही सुझाव का प्रयोग, स्थिति 11 पर DW96 में संस्कृति और ग्लिसरॉल मिश्रण. ग्लिसरॉल के अंतिम एकाग्रता 20% है. महाप्राण 140 DW96 से μl और स्थान 5 में पहली microtiter प्लेट में बांटना.
  4. प्रत्येक शेष microtiter प्लेट के लिए कदम 4.3 दोहराएँ (पदों 6 और 7).
  5. -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक चिपकने वाला टेप और दुकान के साथ प्रत्येक microtiter प्लेट सील निपटान से पहले एक रोगाणुरोधी एजेंट के साथ decontaminating, DW96 में शेष संस्कृति त्यागें.

5. संस्कृतियों के विकास का आकलन

600 आयुध डिपो के रूप में अंतिम वृद्धि दर का आकलन करने के लिए आम तौर पर आवश्यक नहीं है लेकिन हो जाना नहीं है कि किसी भी संस्कृतियों ध्यान दिया जाना चाहिए, (इन परिस्थितियों में 12 के आसपास) सबसे संस्कृतियों के लिए आमतौर पर एक ही है.

  1. (3.4 कदम से) प्रत्येक संस्कृति के 50 μl ले लो और मध्यम के 150 μl युक्त एक फ्लैट तली, स्पष्ट microtiter प्लेट में बांटना.
  2. खाते में 4 गुना कमजोर पड़ने लेने, आयुध डिपो 600 उपाय. बहुत अच्छी तरह से विकसित नहीं किया है कि अगर कोई भी हो, अंतिम विश्लेषण के लिए यह ध्यान दें.

6. प्रकोष्ठों संचय

नोट: यह प्रक्रिया पूरा होने में लगभग 45 मिनट लगते हैं.

  1. 10 मिनट के लिए 3000 XG पर (3.4 कदम से) 4x DW24 प्लेटें अपकेंद्रित्र तो रोगाणुरोधी एजेंट युक्त बर्बादी कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला त्यागने. किसी भी अतिरिक्त मध्यम हटाने के लिए प्लेटें, ऊपर से नीचे, शोषक कागज पर टैप करें.
  2. इस बीच, सेल की 100 मिलीलीटर की तैयारीबफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole पीएच 8, या अन्य वरीय बफर) लाइसोजाइम (अंतिम एकाग्रता 0.25 मिलीग्राम / एमएल) युक्त.
  3. रोबोट worktable तैयार:
    1. स्थान 5 में एक 300 मिलीलीटर गर्त में lysis बफर रखो. स्थिति 11 में एक स्वच्छ DW96 रखो. पदों 14-17 में (कदम 6.1 से) सेल छर्रों युक्त 4 एक्स DW24 प्लेटें रखो. स्थिति 18 पर 200 μl सुझावों रखो.
  4. MCA96 और 200 μl टिप्स, महाप्राण स्थिति 5 से lysis बफर के 125 μl का प्रयोग और (पदों 14-17) प्रत्येक DW24 थाली में बांटना. दोहराएँ. नोट: 4 युक्तियाँ DW24 प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए एक बार में एक ही कुएं में बांटना होगा.
  5. छर्रों resuspend को 15 मिनट के लिए ते हिला (1000 आरपीएम) का उपयोग पदों 14-17 प्लेटें हिलाएँ.
  6. छर्रों resuspended हैं एक बार, 1 (स्थिति 14 पर पहली DW24, के पहले स्तंभ) 4 के लिए, तो एल का उपयोग नमूनों से 550 μl निकालना LIHA के पहले 4 चैनलों का उपयोगLIHA महाप्राण की AST चैनल 4 नमूने के 550 μl 5 (पहली DW24 के दूसरे स्तंभ) 8. स्थिति 11 पर DW96 की पहली पंक्ति में बांटना.
  7. सेल निलंबन के सभी DW96 को सौंप दिया है, जिससे कि कदम 6.6 दोहराएँ.
  8. नमूने के प्रत्येक सेट धोने स्टेशन में LIHA सुझावों को धोने के बाद.
  9. दोहराएँ चित्रा 5 में प्रदान की योजना का उपयोग कर प्रत्येक DW24 थाली में प्रत्येक स्तंभ (पदों 15-17) के लिए 6.6-6.8 कदम. प्लास्टिक की फिल्म के साथ सील.
  10. उसी दिन या अल्पकालिक ठंड, 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान, पर शुद्धि के लिए अन्यथा -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

भाग ख: शोधन और विश्लेषण

7. सेल

नोट: इस कार्यविधि को पूरा करने के लिए लगभग 60 मिनट लगते हैं.

  1. एक एक के लिए मिलाते इनक्यूबेटर में लगभग 15 मिनट और resuspend के लिए एक पानी (आरटी पर या 37 डिग्री सेल्सियस) स्नान में (कदम 6.10 से) जमे हुए सेल निलंबन पिघलना10 मिनट dditional. संस्कृतियों चिपचिपा हो जाना चाहिए.
  2. DNase शेयर के 500 μl लो और 4 MgSO स्टॉक के 1 मिलीलीटर के साथ मिश्रण. मैन्युअल रूप से एक 8 चैनल विंदुक के साथ या रोबोट LIHA साथ, DNase के 10 माइक्रोग्राम / एमएल और 20 मिमी MgSO 4 के अंतिम एकाग्रता देने के लिए, DW96 के प्रत्येक कुएं में 15 μl बांटना.
  3. प्लास्टिक टेप के साथ थाली पुनः सील और एक और 15 मिनट के लिए हिला. इस बिंदु पर संस्कृतियों गैर चिपचिपा होना चाहिए. सभी संस्कृतियों नहीं रह चिपचिपा हैं कि (दृश्य परीक्षा से) ध्यान से जाँच करें. नोट: कुछ संस्कृतियों के नमूने और अतिप्रवाह या की कुल clogging पर एक असमान दबाव पैदा करने, अभी भी (DNase गलती से कुछ कुओं में उचित रूप से तिरस्कृत भूल गया था या नहीं, तो उदाहरण के लिए,), फिल्टर रोकना होगा चिपचिपा हैं, तो यह महत्वपूर्ण है फिल्टर थाली शुद्धि के दौरान हो सकता है.
  4. पूरे सेल lysate, महाप्राण 10 lysate के μl और युक्त एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में बांटना की एसडीएस पृष्ठ के नमूने लिए4x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 10 μl और पानी के 20 μl. 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए denature और विश्लेषण (कुल अंश) तक फ्रीज. एक HTP वैद्युतकणसंचलन प्रणाली उपलब्ध है, तो नमूने इस बजाय नमूना तैयार करने के लिए निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल का पालन पर विश्लेषण किया जा सकता है. नमूनों के विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए धारा 10 में देखते हैं.

8. नी संबंध शुद्धीकरण

ध्यान दें: एक धीमी आकांक्षा गति सभी राल निलंबन pipetting के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, निलंबन काफी मोटी हैं. ओवर सुखाने राल बंधन क्षमता में कमी का परिणाम देगा. शुद्धि के लिए, निर्दिष्ट imidazole सांद्रता निकल आत्मीयता राल को लागू कर रहे हैं. वैकल्पिक आयनों (जैसे, कोबाल्ट) का उपयोग किया जाता है, तो सांद्रता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.

  1. एक - 1-100 मिलीग्राम / एल की रेंज में पता लगाने के लिए नी संबंध शुद्धीकरण (अंतिम राल मात्रा = 200 μl)
    नोट: टीउसके शोधन प्रक्रिया के लिए 4 एक दिन में किया जा सकता है जिसका अर्थ है कि पूरा करने के लिए लगभग 1.5 घंटे लगते हैं.
    1. रोबोट worktable तैयार:
      1. बाध्यकारी बफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole पीएच 8), धोने बफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, 50 मिमी imidazole पीएच 8) और क्षालन बफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी से युक्त 300 मिलीलीटर troughs रखो पदों में NaCl, 250 मिमी imidazole पीएच 8) 6-8, क्रमशः.
      2. राल घोल के लिए स्थान 5 में एक खाली 300 मिलीलीटर गर्त छोड़ दें. स्थिति 9 और 10 डाल थाली धारकों पर. स्थिति 10 में शीर्ष पर एसपीई ब्लॉक और फिल्टर / रिसीवर प्लेट (20 माइक्रोन) के साथ एक DW96 डाल दिया.
      3. स्थिति 14 पर (कदम 7.3 से) lysate युक्त DW96 रखो. स्थिति 18 और 19 में क्रमश: 200 μl विस्तृत बोर सुझावों और 200 μl टिप्स, डाल दिया. एक होटल में धोने और क्षालन के लिए दो अतिरिक्त DW96 प्लेटें रखो. ध्यान दें: एक होटल में उपलब्ध नहीं है, तो वे भी worktable पर एक वैकल्पिक स्थल पर रखा जा सकता है.
    2. तैयार करें 105equilibrated 33% राल घोल की मिलीलीटर (35 मिलीलीटर राल + बाध्यकारी बफर 70 मिलीलीटर). तुरंत प्रक्रिया शुरू होने से पहले स्थान 5 में गर्त में राल निलंबन जोड़ें.
    3. MCA96 और 200 μl विस्तृत बोर सुझावों (स्थिति 18) का उपयोग करना, अच्छी तरह से स्थिति 14 पर lysate युक्त DW96 में राल घोल के 200 μl aspirating और वितरण से पहले स्थान 5 में राल गारा मिश्रण. दो बार दोहराएँ इतना है कि राल घोल के 600 μl प्रत्येक आकांक्षा से पहले राल निलंबन मिश्रण, lysate में जोड़ा गया है.
    4. बाइंडिंग के लिए अनुमति देने के लिए और pelleting से राल को रोकने के लिए स्थिति पर 14 MCA96 का उपयोग कर एक 10 मिनट मिश्रण कदम प्रदर्शन करना.
    5. महाप्राण स्थिति 14 और प्रत्येक आकांक्षा से पहले मिश्रण, 9 स्थिति में फिल्टर प्लेट पर (200 μl बहुत सारी में) 800 μl बांटना से अन्यथा राल DW96 के तल पर बनाए रखा जाएगा.
    6. में थाली के माध्यम से lysate फिल्टर करने के लिए लगभग 90 सेकंड के लिए स्थिति 10 पर पर वैक्यूम मुड़ेंDW96 राल बाहर सूखी नहीं ख्याल रख रही है, प्रवाह के माध्यम से एकत्र करने के लिए. वैक्यूम बंद करें.
    7. राल के सभी फिल्टर थाली में तो इतना है कि दोहराएँ 8.1.5 और 8.1.6 कदम.
    8. रोमा हाथ अगले धोने कदम कचरे को सीधे जाता है, ताकि 9 स्थिति को स्थिति 10 से फिल्टर प्लेट पकड़े एसपीई ब्लॉक कदम है और एक होटल में, एक और साइट (जैसे करने की स्थिति 10 में प्रवाह के माध्यम से युक्त DW96 हस्तांतरण का उपयोग करना प्रक्रिया के अंत तक वाहक).
    9. (स्थिति 19 पर) 200 μl सुझावों का एक नया सेट के साथ, (स्थिति 6 से) बाध्यकारी बफर के 800 μl की कुल के साथ (9 स्थिति में) राल धोने, और बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक स्थिति 9 में वैक्यूम लागू . एक बार फिर दोहराना.
    10. 50 मिमी imidazole धोने को इकट्ठा करने और (स्थिति 10) वापस शीर्ष पर एसपीई ब्लॉक और फिल्टर थाली ले जाने के लिए स्थिति 10 पर एक ताजा DW96 स्थान के लिए रोमा हाथ का प्रयोग करें.
    11. स्थिति 10 पर स्थिति 7 से धोने बफर के 800 μl जोड़ें, बारीबफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक पर निर्वात. निर्वात बंद कर दें.
    12. रोमा के साथ, विशेष खंड और फिल्टर थाली 9 स्थिति को और होटल को धोने का नमूना युक्त DW96 हटाने, और प्रक्रिया के अंत तक एक तरफ रख दें.
    13. बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक (9 स्थिति पर स्थिति 7 से) धो बफर का एक और 800 μl के साथ राल धो लें, वैक्यूम लागू होते हैं. एक बार फिर दोहराना.
    14. स्थिति 10 पर एक ताजा DW96 जगह और क्षालन एकत्र करने के लिए वापस शीर्ष पर एसपीई ब्लॉक और फिल्टर प्लेट स्थान के लिए रोमा का प्रयोग करें.
    15. (9 स्थिति पर स्थिति 8 से) क्षालन बफर के 500 μl की कुल जोडें और 3 मिनट के लिए बगल में सेते हैं. सभी बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक वैक्यूम चालू करें.
    16. वैकल्पिक: अत्यधिक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, एक दूसरे क्षालन कदम 8.1.14 और 8.1.15 के रूप में एक ताजा DW96 में प्रदर्शन किया जा सकता है.
    17. के नमूने लेने के प्रवाह के माध्यम से, एसडीएस पृष्ठ या HTP वैद्युतकणसंचलन के लिए धोने और क्षालन / एस.
      1. HTP वैद्युतकणसंचलन नमूने लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करें. नमूनों के विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए धारा 10 में देखते हैं.
  2. बी - 0.1-25 मिलीग्राम / एल की रेंज में पता लगाने के लिए नी संबंध शुद्धीकरण (अंतिम राल मात्रा = 50 μl)
    नोट: यह शोधन प्रक्रिया के लिए 12 एक दिन में किया जा सकता है जिसका अर्थ है कि पूरा करने के लिए लगभग 30 मिनट लगते हैं.
    1. रोबोट worktable तैयार:
      1. (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole पीएच 8), (,, 50 मिमी imidazole पीएच 8 300 मिमी NaCl 50 मिमी Tris) बफर धोने बाध्यकारी बफर युक्त 300 मिलीलीटर troughs रखोऔर क्रमशः क्षालन बफर (50 मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, 250 मिमी imidazole पीएच 8) पदों में 6-8,.
      2. राल घोल के लिए स्थान 5 में एक खाली 300 मिलीलीटर गर्त छोड़ दें. स्थिति 9 और 10 डाल थाली धारकों पर. स्थिति 10 में शीर्ष पर एसपीई ब्लॉक और फिल्टर / रिसीवर प्लेट (20 माइक्रोन) के साथ एक DW96 डाल दिया.
      3. स्थिति 18 पर. स्थिति 14 पर (कदम 7.3 से) lysate युक्त DW96 रखो और 19 क्रमशः 200 μl विस्तृत बोर सुझावों और 200 μl टिप्स, डाल दिया. एक होटल में क्षालन के लिए एक अतिरिक्त 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट रखो. नोट: यह भी एक होटल में उपलब्ध नहीं है, तो worktable पर एक वैकल्पिक स्थल पर रखा जा सकता है.
    2. Equilibrated 25% राल घोल (12.5 मिलीलीटर राल + 37.5 मिलीलीटर बाध्यकारी बफर) के 50 एमएल तैयार करें. तुरंत प्रक्रिया शुरू होने से पहले स्थान 5 में गर्त में राल निलंबन जोड़ें.
    3. MCA96 और 200 μl विस्तृत बोर सुझावों (स्थिति 18) का उपयोग करना, अच्छी तरह से aspirating और dispe पहले स्थान 5 में राल गारा मिश्रणस्थिति 14 पर lysate युक्त DW96 में राल घोल के 200 μl nsing.
    4. बंधन अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए 1400 rpm पर ते-शेक का उपयोग झटकों के साथ आरटी पर सेते हैं.
    5. महाप्राण स्थिति 14 और स्थिति 10 में फिल्टर की थाली पर विस्तृत बोर सुझावों (स्थिति 18) का उपयोग पूर्ण 1,200 μl (200 μl बहुत सारी में) बांटना. प्रत्येक आकांक्षा से पहले मिश्रण से अन्यथा राल DW96 के तल पर बनाए रखा जाएगा.
    6. इकट्ठा करने के लिए DW96 में थाली के माध्यम से lysate फिल्टर करने के लिए लगभग 30 सेकंड के लिए स्थिति 10 पर पर निर्वात बारी प्रवाह के माध्यम से, राल बाहर सूखी नहीं ख्याल रख रही है. वैक्यूम बंद करें.
    7. रोमा हाथ का उपयोग कर, एक में, अगले धोने कदम कचरे को सीधे जाता है तो उस 9 स्थिति और प्रवाह के माध्यम से स्थिति 10 पर एक और साइट (जैसे युक्त DW96 हस्तांतरण करने की स्थिति में 10 से फिल्टर प्लेट पकड़े एसपीई ब्लॉक स्थानांतरित होटल वाहक) प्रक्रिया के अंत तक.
    8. 200 μ साथ(स्थिति 19) एल टिप्स, (स्थिति 6 से) बाध्यकारी बफर के 800 μl की कुल के साथ (9 स्थिति में) राल धोने, और बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक स्थिति 9 में वैक्यूम लागू होते हैं. दोहराएँ.
    9. 50 मिमी imidazole धोने को इकट्ठा करने और (स्थिति 10) वापस शीर्ष पर एसपीई ब्लॉक और फिल्टर थाली ले जाने के लिए स्थिति 10 पर ताजा DW96 स्थान के लिए रोमा हाथ का प्रयोग करें.
    10. , स्थिति 10 पर स्थिति 7 से धोने बफर के 150 μl जोड़ें बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक पर निर्वात बारी. निर्वात बंद कर दें.
    11. रोमा के साथ 9 स्थिति को एसपीई ब्लॉक और फिल्टर थाली हटाने और होटल को धोने का नमूना युक्त DW96, और प्रक्रिया के अंत तक एक तरफ रख दें.
    12. बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक (9 स्थिति पर स्थिति 7 से) धो बफर का एक और 800 μl के साथ राल धो लें, वैक्यूम लागू होते हैं. दोहराएँ.
    13. स्थिति 9 में microplate स्थान के लिए रोमा का प्रयोग करें और वें इकट्ठा करने के लिए वापस शीर्ष पर एसपीई ब्लॉक और फिल्टर थाली जगहई क्षालन.
    14. (9 स्थिति पर स्थिति 8 से) क्षालन बफर के 190 μl जोड़ें और 3 मिनट के लिए बगल में सेते हैं. सभी बफर के माध्यम से पारित कर दिया गया है जब तक वैक्यूम लागू करें.
    15. एसडीएस पृष्ठ या HTP वैद्युतकणसंचलन के लिए प्रवाह के माध्यम से धो लें और क्षालन के नमूने ले.
      1. प्रवाह के माध्यम से एसडीएस पृष्ठ के नमूने लिए, 4X एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 10 μl और पानी के 20 μl युक्त एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में 10 μl बांटना. धोने और क्षालन के एसडीएस पृष्ठ नमूने के लिए / एस 4x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 10 μl युक्त पीसीआर प्लेटों में 30 μl बांटना. 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए denature और विश्लेषण जब तक फ्रीज.
      2. HTP वैद्युतकणसंचलन नमूने लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करें. नमूनों के विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए धारा 10 में देखते हैं.

9. टैग विखंडन (वैकल्पिक)

  1. कदम 8.1.15 (और 8 से eluted प्रोटीन (को TEV प्रोटीज (2 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.1/10 के अनुपात में 1.16) या कदम 8.2.14) (v / v).
  2. आर टी (या तापमान के प्रति संवेदनशील प्रोटीन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) कोमल झटकों के साथ हे / एन सेते हैं.
  3. दरार के अंत में 10 4x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के μl या HTP वैद्युतकणसंचलन नमूने लिए निर्माता के निर्देशों का पालन युक्त एक पीसीआर थाली में 30 μl बांटना.
  4. एक 96 अच्छी तरह से 0.22 माइक्रोन फिल्टर प्लेट के माध्यम से (कदम 9.2 से) शेष दरार मिश्रण फ़िल्टर और इकट्ठा घुलनशील प्रवाह के माध्यम से एक DW96 में वैक्यूम लगाने से. इस धारा 8.1 और 8.2 में क्षालन कदम के लिए की तरह, तरल से निपटने रोबोट पर वैक्यूम साइटों में से एक (जैसे, स्थिति 10) पर किया जा सकता है. इस दरार के दौरान उपजी है कि किसी भी प्रोटीन को हटा.
  5. छानने के बाद, 4x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 10 μl युक्त एक पीसीआर थाली में 30 μl बांटना या HTP वैद्युतकणसंचलन नमूने के रूप में तैयार करते हैं. यह अनुमति देता है दरार से पहले प्रोटीन की तुलना, दरार और सोल के बाद मिश्रणuble प्रोटीन दरार के बाद शेष और बाद में बड़े पैमाने अप प्रयोगों में अपेक्षित परिणाम के अच्छे संकेत देता है. नमूनों के विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए धारा 10 में देखते हैं.

परिणाम के 10. विश्लेषण

  1. एसडीएस पृष्ठ, ऐसे कैलिपर LabChip के रूप में डॉट धब्बा या HTP वैद्युतकणसंचलन प्रणाली पर शुद्धि के नमूनों का विश्लेषण करके घुलनशील प्रोटीन व्यक्त निर्माणों को पहचानें.
    1. घुलनशील प्रोटीन के उत्पादन निर्माणों की पहचान करने के लिए पहली क्षालन नमूनों का विश्लेषण करें. घुलनशील निर्माणों की पहचान कर रहे हैं, तो ज्यादातर मामलों में केवल क्षालन नमूने विश्लेषण पर बिताए समय को कम करने, विश्लेषण कर रहे हैं.
    2. प्रोटीन क्षालन में नहीं है, तो इसे व्यक्त की गई थी और राल को ठीक तरह से बाध्य नहीं किया था, तो धोने और प्रवाह के माध्यम से नमूनों को देखने के लिए चला रहे हैं.
    3. कोई घुलनशील प्रोटीन प्रोटीन व्यक्त किया गया था देखने के लिए अगर रन पूरे सेल lysate पता लगाया जा सकता है जहां निर्माणों के लिए.
      नोट: यहाँ एक सीमा है कि अगर पीब्याज की rotein ऊपर पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति के स्तर मौजूद नहीं है, यह प्रोटीन को देखने के लिए संभव नहीं हो सकता है और एक झूठी नकारात्मक करने के लिए ले जा सकता है. यह प्रोटीन छड़ी और आत्मीयता राल पर वेग और यह एक झूठी नकारात्मक करने के लिए या के तहत आकलन सिफारिश प्रोटोकॉल (इस काम में एक दुर्लभ घटना) का उपयोग कर उपज का नेतृत्व कर सकता करने के लिए यह हमेशा संभव है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. प्रोटीन (एक सफेद गोली के कुछ ही मिनट / घंटा क्षालन के बाद दिखाई देता है) क्षालन पर precipitates घटना में है कि यह बफर संरचना (उदाहरण के लिए, नमक एकाग्रता) बदलने के लिए और / या अनुकूलन करने के लिए एक अंतर स्कैनिंग fluorimetry परख प्रदर्शन करने की सिफारिश की है बफ़र्स. राल का एक छोटा सा नमूना भी एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में resuspended और एक प्रोटीन राल पर बनाए रखा जा रहा है पता लगाने के लिए उबला हुआ जा सकता है.
    4. प्रोटीन व्यक्त नहीं किया गया था लेकिन 600 आयुध डिपो regrow और संस्कृति reanalyze इतना ऊंचा नहीं था अगर कोशिकाओं, हो जाना एक नई अभिव्यक्ति की रणनीति को आगे बढ़ाने, या अगर किया. >
    5. दरार के नमूनों का विश्लेषण किया जाए तो प्रत्येक निर्माण विश्लेषण आसान बनाने के लिए, दरार से पहले एक आसन्न गलियों में दरार के बाद दिखाया जा सकता है, ताकि वे एक पक्ष द्वारा साइड ढंग से विश्लेषण किया जाना चाहिए.
  2. क्षालन एकाग्रता की प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव देता है एक विधि का उपयोग कर जब तक, मात्रा का ठहराव 280 एनएम (A280) पर absorbance को मापने के द्वारा सकारात्मक नमूने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
    1. उच्चतम व्यक्त घुलनशील निर्माणों की पहचान करने के क्रम में प्रोटीन उपज का एक अनुमान प्रदान करने के लिए, खाते में प्रोटीन का गुणांक विलुप्त होने ले रही है और एक रिक्त रूप क्षालन बफर का उपयोग, A280 उपाय.
    2. घुलनशील पैदावार के सबसे विश्वसनीय तुलना के लिए, यह धारा 5 में लिया गया है जो (600 आयुध डिपो माप का उपयोग) संस्कृति का घनत्व, द्वारा पैदावार को सामान्य करने की सिफारिश की है. सभी संस्कृतियों लगभग उसी घनत्व की वृद्धि हुई है, सामान्यीकरण नहीं है आवश्यक.
ई "> 11. गुणवत्ता नियंत्रण

  1. नमूने तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा / एमएस) द्वारा क्षालन या दरार नमूना से सीधे विश्लेषण किया जा सकता है.
  2. वैकल्पिक रूप से, ZipTip पिपेट सुझावों या तरल क्रोमैटोग्राफी तरीकों का उपयोग कर (imidazole और मौजूद हो सकता है कि किसी भी बफर लवण दूर करने के लिए) पहले फीका बनाना, फिर मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान (MALDI-TOF) या electrospray ionization (का उपयोग का विश्लेषण ईएसआई) मास स्पेक्ट्रोमेट्री.
  3. छोटे पैमाने पर कार्यात्मक अध्ययन उम्मीद के रूप में प्रोटीन का कार्य है अगर जाँच करने के लिए किया जा सकता है. बड़ी मात्रा में समारोह के लिए आवश्यक हैं, एक बड़े पैमाने अप संस्कृति बनाया जा सकता है और बड़े संस्कृति आकार और ऑक्सीकरण राज्य में एक बार से परीक्षण किया समारोह छोटे पैमाने पर पुष्टि की गई है.

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम VENOMICS पाइपलाइन से 96 डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए 6 चित्र में दिखाया गया. प्रोटीन तो अवशेषों की संख्या बढ़ रही है डाइसल्फ़ाइड बांड की बढ़ती संख्या से व्यवस्थित कर रहे हैं. पेप्टाइड्स एक उसके टैग और DsbC संलयन साथी के साथ cytoplasm में व्यक्त किया गया. सिफारिश की संस्कृति शर्तों का उपयोग करते हैं, 12 के एक आयुध डिपो के 600 सामान्य रूप से हासिल की है. पेप्टाइड्स निकल आत्मीयता राल के 50 μl के अंतिम मात्रा के साथ प्रोटोकॉल 8.2-B उपयोग कर शुद्ध कर रहे थे, तो ~ 25 मिलीग्राम / एल संलयन प्रोटीन की एक अधिकतम इस प्रयोग में पता लगाया जा सकता है.

चित्रा 6A कैलिपर LabChip प्रणाली (दरार से पहले फ्यूजन दिखा) और संलयन प्रोटीन की मिलीग्राम / एल संस्कृति में उपज के निष्कर्षों पर आधारित स्कोरिंग प्रणाली (0.1-2 मिलीग्राम / एल संस्कृति के स्तर में, 2 से वैद्युतकणसंचलन परिणाम से पता चलता है 10 मिलीग्राम / एल संस्कृति, 10 से 25 मिलीग्राम / एल संस्कृति और कोई टी का पता चला.) के रूप में उम्मीद cleaved DsbC टैग आम तौर पर नहीं बल्कि 27 केडीए से, लगभग 32 केडीए रन पर ध्यान दें. इसी तरह, DsbC fusions भी अपेक्षा से अधिक लगभग 5 केडीए चलाते हैं. लक्ष्य का एक बहुत कुछ के लिए हम बरकरार संलयन (ऊपरी बैंड) देखने के लिए न केवल, लेकिन यह भी फ्यूजन साथी लड़की (कम बैंड). इन लक्ष्यों में से कुछ के लिए संस्कृति शर्तों के अनुकूलन अकेले DsbC अंतिम उपज की वृद्धि की अनुमति की तुलना में बरकरार संलयन (ऊपरी बैंड) के अनुपात में सुधार कर सकते हैं. स्कोरिंग केवल बरकरार संलयन के स्तर पर आधारित है. केवल 16 96 से बाहर प्रोटीन संलयन स्तर पर नहीं पाया जा सकता. यह 83% की समग्र सफलता के स्तर से मेल खाती है. पता लगाया जा सकता है कि 80 प्रोटीन की, इनमें से 45 2 मिलीग्राम / एल संस्कृति (56%) की तुलना में अधिक से अधिक स्तर पर पाया गया. (इस उदाहरण में प्रोटोकॉल 8.2 बी ~ 25 मिलीग्राम / एल संलयन प्रोटीन की एक अधिकतम पता लगाया जा सकता का उपयोग हालांकि) लक्ष्य और फ्यूजन पर निर्भर करता है, प्रोटीन पैदावार 2-100 मिलीग्राम / एल संस्कृति की रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं.

टी "> वर्तमान डाइसल्फ़ाइड बांड की संख्या (चित्रा 6B में दिखाया गया है) द्वारा सफलता के विश्लेषण से सबसे कम सफलता स्तर 6 डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्यों के लिए 66% होने के साथ (1 और 7 के बीच) का परीक्षण डाइसल्फ़ाइड बांड की सभी नंबरों के लिए उचित सफलता से पता चलता है बांड. isoelectric बिंदु और अवशेषों की संख्या (चित्रा 6C में दिखाया गया है) पर आधारित अभिव्यक्ति सफलता के वितरण के विश्लेषण से दोनों को सफलतापूर्वक व्यक्त लक्ष्य और साजिश में फैले हुए नहीं पाया गया है कि लक्ष्य के साथ, तकनीक के लिए कोई विशेष पूर्वाग्रह को दर्शाता है.

चित्रा 6D डीटीटी के साथ नमूने की कमी से पहले और बाद में, एक ही लक्ष्य के लिए electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई एमएस) से प्राप्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों का एक उदाहरण दिखाता है. आम तौर पर, इस तरह के एक व्यापक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण हालांकि पूरी तरह से demonstratio के प्रयोजनों के लिए, (एक कम नमूना विश्लेषण करने की आवश्यकता नहीं होगी) निष्पादित करने की जरूरत नहीं होगीn हमने परिणाम दोनों से पता चला है. पता चला लक्ष्य 4 डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ एक 5.7 केडीए डाइसल्फ़ाइड युक्त विष प्रोटीन होता है. बाईं तरफ स्पेक्ट्रम यह आगे के हस्तक्षेप के बिना दरार और desalting के बाद किया गया, जैसा कि पूर्व डीटीटी के साथ कमी करने के लिए प्रोटीन के लिए परिणाम से पता चलता है. दाहिने हाथ की ओर स्पेक्ट्रम किसी भी अतिरिक्त डीटीटी दूर करने के लिए desalting द्वारा पीछा डीटीटी के साथ कमी के बाद प्रोटीन से पता चलता है. प्रयोगात्मक जनता को इसी आयनों प्रत्येक आयन के लिए स्पेक्ट्रम और पद पर तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं हरे रंग में दिखाया गया है. इन आयनों के लिए गणना की प्रयोगात्मक जनक जनता (प्रोटीन के लिए पूर्व में कमी (डीटीटी) को और कमी (+ डीटीटी) के बाद) तालिका में दिखाए जाते हैं. जनता 8 दा के एक बड़े पैमाने पर अंतर प्रदर्शनी (पूर्व में कमी और कम नमूना के लिए 5717.6 दा को नमूना के लिए 5709.6 दा). 2 दा का एक जन फर्क, 1 ऑक्सीकरण डाइसल्फ़ाइड बांड की उपस्थिति से मेल खाती है (उम्मीद है) इसलिए 8 दा के एक बड़े पैमाने पर अंतर 4 डाइसल्फ़ाइड बांड की उपस्थिति को दर्शाता मेंगैर कम नमूना.

चित्रा 1
वर्णित अर्द्ध स्वचालित उपकरण के साथ उच्च throughput अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, 96-384 शर्तों पुस्तिका तरीकों का उपयोग कर एक सप्ताह में एक ही व्यक्ति द्वारा परीक्षण किया जा सकता है, या अप करने के लिए 1,152 शर्तों. अभिव्यक्ति plasmids कई लक्ष्यों को एक समय में उप क्लोन किया जा सकता है, ताकि एक पुनर्संयोजन क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं. एक बार घुलनशील अभिव्यक्ति की स्थिति की पहचान की गई है और प्रदर्शन किया दरार, अगर वांछित, प्रोटीन ऑक्सीकरण और पवित्रता, microassays और / या बड़े पैमाने पर उत्पादन की जांच करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण के लिए आगे बढ़ सकते हैं.

चित्रा 2 चित्रा 2. यूनिवर्सल recombinational क्लोनिंग के लिए योजनाबद्ध और डिजाइन का निर्माण. लक्ष्य प्रविष्टि क्लोन से, कई अभिव्यक्ति वैक्टर एक उच्च throughput फैशन (एक सप्ताह में करने के लिए 6 x 96 प्रविष्टि क्लोन) में एक ही प्रयोग में उप क्लोन किया जा सकता है. व्यक्त प्रोटीन निकल आत्मीयता शुद्धि के लिए एक उसके टैग encodes. DsbC (cytoplasmic अभिव्यक्ति के लिए अपने periplasmic संकेत अनुक्रम कमी) फ्यूजन साथी घुलनशीलता और / या सहायता तह और लक्ष्य प्रोटीन की सही ऑक्सीकरण बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है. टैग दरार वांछित है लक्ष्य कोडन अनुक्रम एक एन टर्मिनल TEV प्रोटीज साइट (ENLYFQ) शामिल करना चाहिए ध्यान दें. ऊपर छोड़ दिया पर बैठाना पीसीआर या जीन संश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है, जो एक दाता वेक्टर और लक्ष्य दृश्यों, का उपयोग प्रविष्टि क्लोन के उत्पादन से पता चलता है. एंट्री क्लोन भी वाणिज्यिक प्रविष्टि क्लोन संग्रह से प्राप्त किया जा सकता है. एकाधिक recombinational क्लोनिंग सिस्टम उपलब्ध हैं, हालांकि हम गेटवे syste उपयोगमी, योजनाबद्ध रूप में दिखाया गया.

चित्रा 3
कई डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्यों के लिए चित्रा 3. उच्च throughput प्रदर्शन पाइपलाइन. लक्ष्य शुरू में BL21 (DE3) pLysS ई. के cytoplasm में उनकी-DsbC fusions के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ऑटो प्रेरण मध्यम (ZYP-5052) का उपयोग कर 37/17 डिग्री सेल्सियस पर कोलाई. शोधन HTP वैद्युतकणसंचलन (या डॉट धब्बा / एसडीएस पृष्ठ के साथ) द्वारा घुलनशील निर्माणों का पता लगाने के द्वारा पीछा निकल राल पर किया जाता है. अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के पहले दौर असफल हो, तो वैकल्पिक संस्कृति की स्थिति की कोशिश कर रहे हैं. निर्माणों पर्याप्त उच्च पैदावार, microassays और गुणवत्ता नियंत्रण में घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन तो किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो,, बड़े पैमाने पर उत्पादन चलाया जा सकता है. घुलनशील पैदावार काफी अधिक नहीं हैं, जहां लक्ष्य के लिए, अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग वैकल्पिक रणनीति के साथ जारी रख सकते हैंभारतीय नौसेना पोत और फिर तापमान अन्य फ्यूजन भागीदारों और periplasmic अभिव्यक्ति. वैकल्पिक कदम धराशायी बक्से के संकेत हैं.

चित्रा 4
HTP मंच के लिए चित्रा 4. रोबोट Worktable सेटअप. वैकल्पिक Worktables भी इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हमारे तरल से निपटने रोबोट worktable के लेआउट, दिखाया गया है उपलब्ध बराबर साइटों रहे हैं प्रदान की. सेटअप (8 चैनल तरल से निपटने सिर (LIHA)), 4 पदों के साथ दो microplate वाहकों प्रत्येक (MP4, 1-4 और 5-8 पदों), 2 पदों के साथ एक निर्वात स्टेशन के लिए एक धोने स्टेशन (था) के होते हैं एक वाहक (, ते-शेकर्स 14-15 और 16-17 पदों) 2 पदों के साथ दो प्लेट शेकर्स प्रत्येक, 3 पदों के साथ एक microplate वाहक (एमपी 3, 11-13 पदों), (ते-Vacs, 9 और 10 पदों) और 3 पदों के साथ डिस्पोजेबल सुझावों के लिए (दिति, 18-20 पदों). इसके अलावाफिर से दो होटल गहरे कुएं प्लेटों के लिए वाहक और () नहीं दिखाया microplates के लिए एक है. तरल से निपटने रोबोट पर स्थापित हार्डवेयर डिस्पोजेबल टिप्स, चारों ओर पर प्लेट्स / उपकरण है कि चाल तय सुझावों के साथ एक 8 चैनल तरल से निपटने सिर (LIHA) और एक रोबोट जोड़तोड़ (रोमा) के साथ प्रयोग के लिए एक 96 मल्टीचैनल हाथ (MCA96) है worktable. पदों की नंबरिंग प्रोटोकॉल भर में जाना जाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. चार 24 अच्छी तरह प्लेटें में एक भी 96 अच्छी तरह से थाली से स्थानांतरित करने के लिए योजनाबद्ध.

चित्रा 6
चित्रा 6. प्रतिनिधि परिणाम 96 डाइसल्फ़ाइड युक्त विष समर्थक की अभिव्यक्ति स्क्रीन के लिए दिखाए जाते हैंteins. प्रोटीन कोशिका द्रव्य में उनकी-DsbC fusions के रूप में व्यक्त की और निकल राल के 50 μl (प्रोटोकॉल 8.2 बी) का उपयोग कर शुद्ध किया गया. ए) अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग परिणाम, आभासी जेल दिखा और अभिव्यक्ति उपज के लिए स्कोरिंग. आभासी जेल में विपरीत बहुत ही बेहोश हो या तीव्र बैंड के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए लेन करने वाली लेन समायोजित किया गया है. कुछ लक्ष्यों के लिए दो बैंड के ऊपरी बैंड में डाइसल्फ़ाइड बांड की संख्या की तुलना में). बी अकेले फ्यूजन टैग को इसी बरकरार संलयन प्रोटीन और कम बैंड के लिए प्रत्येक अभिव्यक्ति के स्तर पर व्यक्त प्रोटीन का अनुपात, इसी देखा जा सकता है कि नोट प्रोटीन. प्रत्येक समूह में प्रोटीन की वास्तविक संख्या ग्राफ. सी) पर overlayed है isoelectric बिंदु (पीआई) और अवशेषों की संख्या के आधार पर अभिव्यक्ति के स्तर का वितरण. डी) एक 5.7 केडीए डाइसल्फ़ाइड युक्त विष के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों का एक उदाहरण 4 डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ प्रोटीन. पर स्पेक्ट्रमबाएं हाथ की ओर से पहले डीटीटी के साथ कमी और दाहिने हाथ की ओर स्पेक्ट्रम के लिए प्रोटीन डीटीटी के साथ कम और फिर desalted प्रोटीन से पता चलता है दिखाता है. प्रयोगात्मक जनता को इसी आयनों तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं और उनके कार्य हरे रंग में दिखाया गया है. पूर्व में कमी करने और कमी के बाद तालिका में दिखाया गया है और एजेंट को कम करने के अलावा पहले ऑक्सीकरण प्रोटीन की उपस्थिति के लिए इसी 8 दा के एक बड़े पैमाने पर अंतर प्रदर्शन कर रहे प्रोटीन के लिए प्रयोगात्मक जनता. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें .

घटक नुस्खा टिप्पणी
ZY ~ 928 मिलीलीटर
10 ग्राम tryptone
5 ग्राम खमीर निकालने
925 मिलीलीटर पानी
मिक्स और फिर बाँझ आटोक्लेव. 2 एम 4 MgSO 100 मिलीलीटर
49.3 जी 4 MgSO · 7 2 हे
~ 60 मिलीलीटर पानी
जब तक भंग हिलाओ तो बाँझ आटोक्लेव.
50x 5052 1 एल
250 ग्राम ग्लिसरॉल
730 मिलीलीटर पानी
25 ग्राम ग्लूकोज
100 ग्राम α-लैक्टोज
, अनुक्रम में जोड़ें सभी को भंग कर दिया जब तक गर्मी पर हलचल तो बाँझ आटोक्लेव.
20x एनपीएस 1 एल
900 मिलीलीटर पानी
66 ग्राम (एनएच 4) 2 अतः 4
136 ग्राम के.एच. 2 पीओ 4
142 ग्राम ना 2 4 HPO
अनुक्रम में जोड़ें और सभी भंग तो बाँझ आटोक्लेव जब तक हलचल.

ZYP-5052 मध्यम के घटकों के लिए तालिका 1. पकाने की विधि.

Discussion

घुलनशील, जोड़, कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोई एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल है. , लागत और समय कुशल होना कई लक्ष्यों के साथ काम कर रहे ज्यादातर प्रयोगशालाओं या प्रोटीन कोर सुविधाओं इसलिए लक्ष्य के बहुमत के लिए एक घुलनशील सक्रिय प्रोटीन प्राप्त करने के लिए चर का सबसे अच्छा 'सामान्य' संयोजन खोजने के लिए स्क्रीनिंग उच्च throughput प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग करें. हम डाइसल्फ़ाइड युक्त पेप्टाइड और प्रोटीन 11 के घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए एक आम तौर पर लागू फ्यूजन साथी होने के रूप में DsbC की पहचान की है. DsbC fusions और उच्च तरीकों का उपयोग करना, एक सप्ताह के भीतर कई लक्ष्यों के घुलनशील अभिव्यक्ति 11 देखा जा सकता है और फिर इस तरह के परिचय में चर्चा की उन के रूप में अतिरिक्त चर,, आगे अनुकूलन की आवश्यकता है कि उन ठिकानों पर बाद के दौर में जांच की जा सकती है. यहाँ बताया प्रोटोकॉल डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन और पेप्टाइड्स की अभिव्यक्ति के उद्देश्य से कर रहे हैं. हालांकि, उपयोगकर्ताओं के लिए विस्तार करने के इच्छुकएक उच्च throughput ढंग से ress गैर जालीदार प्रोटीन, इसी प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित किया गया है और कहीं 22,24 पाया जा सकता है.

उच्च throughput सेटअप घुलनशील अभिव्यक्ति या एक ही समय में कई लक्ष्य जीन के लिए (विभिन्न फ्यूजन टैग सहित) अभिव्यक्ति निर्माणों की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए विभिन्न प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग सहित आवेदन की एक संख्या, (के लिए आदर्श है या एकाधिक अभिव्यक्ति की सफलता दर को बेहतर बनाने के क्रम में एक ही लक्ष्य) के लिए निर्माण करती है. मंच भी लक्ष्य की एक बड़ी संख्या पर नए प्रोटोकॉल की बेंच मार्किंग और सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य अनुप्रयोगों का एक भी मुश्किल लक्ष्य के लिए वेरिएंट की स्क्रीनिंग, उदाहरण के लिए, सभी orthologs या एक ही परिवार के सदस्य हैं, या एक प्रयोग में एक ही लक्ष्य की म्यूटेंट के एक पैनल के उत्पादन की सफलता का परीक्षण करने में शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल भी सह अभिव्यक्ति वैक्टर (बुद्धि के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया हैघंटे एक नीचे खींच और सही जटिल गठन और stoichiometry 33 पुष्टि करने के लिए और अधिक गहन biophysical विश्लेषण के बाद प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों के प्रारंभिक लक्षण वर्णन अनुमति देने के लिए) केवल प्रोटीन टैग किया. शुद्ध प्रोटीन की मात्रा सूक्ष्म assays (कार्यात्मक परीक्षण, प्रोटीन डीएनए 34 या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays) के लिए कभी कभी उपयुक्त है. उच्च throughput अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग रणनीति के लिए कई फायदे हैं: (i) के लक्ष्यों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण करने की क्षमता या एक ही प्रयोग में चर की एक बड़ी संख्या है, (द्वितीय) लिमिटेड बैच को बैच विभिन्नता, (iii) सादगी और (v) स्वचालन के लिए क्षमता है, और ट्रैकिंग (vi) सादगी, बड़े पैमाने पर गहरे कुओं, (चतुर्थ) scalability और reproducibility का उपयोग कर एक छोटे पैमाने पर काम कर रहा है और व्यक्तिगत ट्यूब की (कोई लेबलिंग, कम से निपटने में आसानी ) मिश्रण में व्यक्तिगत ट्यूबों की हैंडलिंग के साथ तुलना थाली प्रारूप का उपयोग कर या क्लोन के आदान प्रदान जब शुरू की गलतियों.

24 देखें. अधिकतम दक्षता के लिए, यह लक्ष्य की बड़ी संख्या के उप क्लोनिंग को आसान बनाने के लिए, उच्च throughput क्लोनिंग के लिए एक उपयुक्त प्रणाली के लिए फायदेमंद है. VENOMICS परियोजना के प्रारंभिक चरण के लिए, हम प्रति सप्ताह क्लोन के सैकड़ों की एक गति से किसी भी गंतव्य वेक्टर में subcloning की अनुमति देता है कि बहुमुखी गेटवे पुनर्संयोजन प्रणाली 25 का उपयोग. गेटवे पुनर्संयोजन क्लोनिंग के लिए प्रोटोकॉल Invitrogen वेबसाइट पर पाया जा सकता है. उच्च throughput क्लोनिंग के लिए अन्य विकल्पों की 37 क्लोनिंग बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग (एलआईसी) 35,36 और प्रतिबंध से मुक्त (आरएफ) शामिल हैं. प्रविष्टि क्लोन संग्रह से, टेम्पलेट डीएनए से पीसीआर द्वारा सहित, अभिव्यक्ति के लिए लक्ष्य जीन को प्राप्त करने के कई तरीके हैं या के रूप मेंVENOMICS परियोजना के लिए चुना रणनीति है जो कृत्रिम जीन है,. कृत्रिम जीन जीन और जीन संश्लेषण के प्रत्येक के अंत पर पुनर्संयोजन साइटों के साथ आदेश दिया जा सकता है लक्ष्य जीन अनुक्रम की आसान कोडोन अनुकूलन (दुर्लभ ई. कोलाई codons बाहर करने के लिए) की अनुमति देता है. यह सिफारिश की है, लेकिन जरूरी नहीं है. दुर्लभ codons की एक उच्च संख्या, Rosetta 2 (अत्यधिक ई. कोलाई में व्यक्त नहीं कर रहे हैं कि दुर्लभ codons के लिए tRNAs किया जाता है) (DE3) pLysS होते हैं कि कोडोन अनुकूलन के बिना लक्ष्य के लिए BL21 (DE3) pLysS से बेहतर उपयुक्त हो सकता है. कोशिका द्रव्य का सामान्य रूप से कम करने के वातावरण में डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी है कि सीमा उपलब्ध उपभेदों हैं, हमारे हाथ में है कि वे नियमित रूप से ई. के रूप में सफल नहीं किया गया है कोली 11 उपभेदों.

विश्लेषणात्मक पैमाने संबंध शुद्धीकरण घुलनशील संलयन प्रोटीन की वसूली और पैदावार यों के क्रम में परीक्षण अभिव्यक्ति संस्कृतियों से किया जाता है. मात्रात्मक डेटा वें पर प्राप्त किया जा सकता हैसंस्कृति की 100 मिलीग्राम / एल - 0.1 की एक सीमा के भीतर व्यक्त संलयन प्रोटीन की ई घुलनशील पैदावार. एक लक्ष्य घुलनशील नहीं है, तो अलग फ्यूजन भागीदारों पीछा कर रहे हैं, इससे पहले वैकल्पिक अभिव्यक्ति और प्रेरण तापमान, उपभेदों या मीडिया का परीक्षण किया जा सकता है. डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन की घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए, हम पहले से cytoplasmic अभिव्यक्ति 11 के लिए DsbC> DsbA> जीएसटी> MBP> TRX> उनकी-टैग के रूप में फ्यूजन भागीदारों के प्रभाव स्थान पर रहीं. Periplasmic अभिव्यक्ति डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्य का सफल तह सहायता कर सकते हैं कि एक और संभावना है. periplasm कोशिका द्रव्य से एक कम कम करने के वातावरण है और डाइसल्फ़ाइड संबंधों की सहायता के लिए उपयोगी redox संरक्षक होता है. DsbC, DsbA, और MBP प्रोटीन सामान्य रूप से उनके periplasmic संकेत दृश्यों से periplasm के लिए स्थानीय कर रहे हैं. इस तह की सहायता के लिए periplasmic अंतरिक्ष के लिए डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्य निर्देशित करने के लिए इन टैग का फायदा उठाने का अवसर प्रदान करता है. असभ्य लक्ष्यों के लिए, अगले कदम के पी के लिए किया जाएगा(यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है और यहाँ 3 से 9 चर्चा नहीं होगी) solubilize और refold, समावेश शरीर से अघुलनशील उसके टैग लक्ष्य urify. यह केवल एक या दो डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ लक्ष्य के लिए काफी आसान हो सकता है, लेकिन डाइसल्फ़ाइड बांड बढ़ जाती है की संख्या के रूप में तेजी से और अधिक मुश्किल हो जाता है सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, और विशेष रूप से चार या अधिक डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लिए, यह इस तरह खमीर, कीट या स्तनधारी अभिव्यक्ति के रूप में और अधिक जटिल उत्पादन प्रणालियों प्रयास करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.

Miniaturization और स्वचालन के क्षेत्र में प्रगति के साथ, HTP इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगशाला-on-a-चिप टेक्नोलॉजीज 28 निस्संदेह कार्यात्मक विश्लेषण के लिए भविष्य का रास्ता हो जाएगा. हम (शायद संरचनात्मक अध्ययन के अपवाद के साथ) इस बड़े पैमाने पर संस्कृतियों के लिए आवश्यकता नकारना होगा सबसे प्रयोजनों के लिए कि कल्पना. छोटे पैमाने संस्कृतियों अभिव्यक्ति की स्थिति स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह भी suf प्रदान करने में सक्षम हो जाएगा न केवलficient इन छोटी कार्यात्मक assays के लिए नमूने के बराबर है. कार्यात्मक विशेषता के लिए पर्याप्त मात्रा में समानांतर में कई लक्ष्यों का उत्पादन करने की क्षमता संवर्धन और प्लेटफार्मों के इन तरह के प्रयोग की लागत कम होगी, पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति और लक्षण अधिक लागत और समय प्रभावी हो जाएगा.

प्रोटोकॉल के साथ साथ FP7 यूरोपीय VENOMICS परियोजना के प्रारंभिक चरण में डाइसल्फ़ाइड युक्त पेप्टाइड और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए लागू किया गया है. विष अक्सर दिलचस्प औषधीय क्षमता है कि bioactive पेप्टाइड्स का बहुत अच्छा स्रोत हैं. हालांकि, उनके उत्पादन की वजह से उनके जटिल डाइसल्फ़ाइड संबंध पैटर्न और छोटे आकार के लिए चुनौतीपूर्ण है. इस के साथ साथ वर्णित की तरह उच्च throughput प्लेटफार्मों का उपयोग कर, VENOMICS परियोजना प्रकृति में मनाया विविधता को पुन: पेश करने के लिए 10,000 उपन्यास विष पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय उत्पन्न करना है. इस पुस्तकालय डाइसल्फ़ाइड आर के लक्षण वर्णन के लिए दोहन किया जाएगानई दवाओं के विकास के उद्देश्य के साथ संभावित औषधीय या चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ आईसीएच पेप्टाइड्स. मंच वर्तमान VENOMICS परियोजना में उपयोग के लिए नए प्रोटोकॉल बेंच मार्किंग और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है.

Acknowledgements

इस काम VENOMICS परियोजना, सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 स्वास्थ्य 2011-2015) के माध्यम से 278,346 ° यूरोपीय परियोजना अनुदान एन द्वारा समर्थित किया गया. VENOMICS परियोजना यूरोप में कई अनुसंधान संस्थानों और कंपनियों के बीच एक सहयोग है:

AFMB, ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालय (फ्रांस), सीईए Saclay (फ्रांस), NZYTech (पुर्तगाल), SistemasGenomicos (स्पेन), यूनिवर्सिटी डी लीग (बेल्जियम), VenomeTech (फ्रांस), Vitamib (फ्रांस), न्यूजीलैंड फार्मा (डेनमार्क)

इस काम एकीकृत स्ट्रक्चरल बायोलॉजी (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01 के लिए फ्रेंच इंफ्रास्ट्रक्चर द्वारा समर्थित किया गया.

लेखकों को भी वीडियो की शूटिंग के लिए तैयारी के साथ सहायता के लिए श्री जेरेमी Turchetto धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

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References

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