Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied

Biology
 

Summary

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

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Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

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Abstract

Escherichia coli (E. coli) ist das am weitesten verbreitete Expressionssystem für die Produktion von rekombinanten Proteinen für die strukturelle und funktionelle Untersuchungen. , Reinigung von Proteinen ist jedoch manchmal eine Herausforderung, da viele Proteine ​​in einer unlöslichen Form exprimiert wird. Bei der Arbeit mit schwer oder mehrere Ziele empfiehlt es sich daher um einen hohen Durchsatz (HTP)-Protein-Expression Screening auf einem kleinen Maßstab (1-4 ml-Kulturen) verwenden, um schnell Bedingungen für lösliche Expression zu identifizieren. Um mit den verschiedenen Programmen strukturelle Genomik des Labors, einer quantitativen (in einem Bereich von 0,1 bis 100 mg / L Kultur von rekombinanten Protein) und HTP-Protein-Expression Screening-Protokoll wurde auf Tausenden von Proteinen umgesetzt und validiert bewältigen. Die Protokolle wurden unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungsroboter kann aber auch manuell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden.

Disulfid-reichen Gift Proteine ​​gewinnenzunehmende Anerkennung für ihr Potenzial als therapeutische Leitstrukturen. Sie können sehr potenter und selektiver sein, aber ihre komplexen Disulfidbrücke Netzwerke machen sie schwierig zu produzieren. Als Mitglied des Europäischen Venomics FP7-Projekt ( www.venomics.eu ), ist unsere Herausforderung, erfolgreiche Produktionsstrategien mit dem Ziel, Tausende von neuen Giftproteine ​​für funktionelle Charakterisierung zu entwickeln. Durch die Redox-Eigenschaften der Disulfidbindungsisomerase DsbC unterstützt, passten wir unsere HTP Produktionsrohrleitung für die Expression von oxidierten funktionellen Gift-Peptiden in E. coli Zytoplasma. Die Protokolle sind auch für die Herstellung von verschiedenen Disulfid-reiche Proteine. Hier zeigen wir unsere Pipeline für die Produktion von Tiergift-Proteine ​​angewendet. Mit den hierin beschriebenen Protokollen ist es wahrscheinlich, dass lösliche Disulfid-reichen Proteinen in weniger als einer Woche erhalten werden. Selbst aus einem kleinen Maßstab, gibt es das Potenzial, um th verwendenE gereinigte Proteine ​​für die Validierung der Oxidationszustand durch Massenspektrometrie, zur Charakterisierung in Pilotstudien oder für empfindliche Mikro-Assays.

Introduction

Durch die Weiterentwicklung der Genomik und Beschleunigung des Entdeckung neuer Proteine ​​motiviert, haben eine hohe Durchsatzrohrleitungen entwickelt, um traditionelle Ansätze für das Screening und die Identifizierung der optimalen Proteinproduktionsstrategien parallelisieren. Potential Variablen optimiert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf unterschiedlichen Expressionsstämme 1,2, Temperatur 3,4, 2,3 Medien, Ziel Varianten 5, 6-13 Fusionspartner, die Co-Expression mit Chaperonen 14,15 cytoplasmatische oder periplasmatischen Expression 16-18, und Reinigungspuffer 3 Komponenten. Durch die Implementierung von Hochdurchsatz-Methoden, viele Variablen oder viele Ziele können parallel mit einem hohen Maß an Effizienz getestet werden, bei gleichzeitiger Begrenzung von Charge zu Charge Variation. Nach unserer Erfahrung gibt die Strategie auch eine gute Reproduzierbarkeit auf Scale-up mit der gleichen Kultur (Temperatur, Medien, Belüftung, etc.) und Reinigungsbedingungen (gleiche Resin, Puffer, etc.). Mehrere Hochdurch Plattformen in den letzten zehn Jahren verwendet worden, um Bedingungen für lösliche Proteinexpression zu identifizieren, und zwar durch Variieren von Parametern wie Fusionspartner Expressionsstämmen oder Temperatur 19-23.

Wir haben vor kurzem nutzten unsere Hochdurchsatz-Screening-Ansatz für die Expression von löslichen Disulfid-reiche Proteine ​​11. Die ausgewählten Proteine ​​waren nicht nur aus giftigen Quellen, aber auch eingeschlossen Disulfid-reichen Enzyminhibitoren aus einer Vielzahl von Arten, einschließlich Pflanzen, Schweine, Kühe und Menschen. Das Experiment wurde die Wirkung von 12 verschiedenen Fusionspartnern und drei verschiedenen Expressionsstämme auf die Löslichkeit und Faltung von Disulfid-28 retikuliert Proteinen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendung DsbC als Fusionspartner für die Produktion in den Stamm BL21 (DE3) pLysS erheblich outproduced (sowohl in der Ausbeute und der Anzahl der erhaltenen löslichen Proteine) jede andere Kombination von Stamm und Fusion 11 getestet. DieErgebnisse dieses Experiments war die Basis für die Anpassung unserer ursprünglichen allgemeinen Hochdurchsatz-Pipeline (die für die Expression Screening einer Vielzahl von Proteinen verwendet wurde) 22,24 in eine besser geeignet für die Expression von Disulfid-reichen Zielen. Disulfid-reiche Proteine ​​aus Tiergiften sind von besonderem Interesse. Gifte sind eine komplexe Mischung von bioaktiven Peptiden und Proteinen, mit potentiellen Wert pharmakologisch und therapeutisch. Allerdings ist die Expression der Disulfidbindung-enthaltenden Proteinen, die nicht trivial. Diese Proteine ​​enthalten im allgemeinen zwischen 6.59 Disulfidbindungen und muss mit den korrekten Disulfid-Bindungsmuster, um aktiv zu sein, oxidiert werden. Derzeit ist die Plattform für das Screening der Expression einer großen Anzahl von Disulfid-reiche Tiergift-Proteine, die als Teil der Europäischen VENOMICS FP7-Projekt (www.venomics.eu) und Benchmarking-Roman Protokolle für die Hochdurchsatz-Expression von Tausenden von Zielen verwendet . Hier ein automatisiertes Verfahrenist für die Hochdurchsatz-Klein Expressions-Screening und Reinigung (siehe Abbildung 1) vorgesehen angewendet zu Disulfid-reiche Tiergift-Proteine. Die Strategie für die Disulfid-reiche Peptide und Proteine ​​verwendet eine HIS-Tag zur Aufreinigung und der redoxaktiven Fusionspartner, DsbC, die Schaffung spaltbare HIS-DsbC Fusionen an die Zielproteine ​​(siehe Abbildung 2).

Während der Schwerpunkt der Protokolle hier ist die Automatisierung mit Hilfe eines Liquid-Handling-Roboter und HTP-Elektrophorese sind diese Methoden auch für einen hohen Durchsatz manuelle Ansatz, was bedeutet, dass auch Laboratorien mit einer Grundeinstellung können die Vorteile der Protokolle ohne Voraussetzung für die teure Ausrüstung zu nehmen . Hand Protokolle für die Transformation, um die Reinigung und Analyse (nicht spezifisch für Disulfid-reiche Proteine) an anderer Stelle 24 veröffentlicht worden und werden hier nicht wiederholt werden. Der Durchsatz der manuellen Verfahren (von Expressionsklon durch Rekombination erzeugtnationalen Klonen 25, um die Analyse der löslichen Protein-Ebene) ist 96 (unter Verwendung von SDS-PAGE-Detektion) oder 384 (4 x 96, mit Dot-Blot und SDS-PAGE 26) Kulturen pro Woche (siehe Abbildung 1). Dies kann erhöht werden, wenn in einer halbautomatischen Weise (unter Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter und Dot-Blot-26 oder HTP-Elektrophorese, wie mit einem Caliper GXII LabChip System 22 durchgeführt werden, für die Analyse der Ergebnisse) auf bis zu 1.152 (12 x 96)-Kulturen, die parallel über eine Woche, wie hierin beschrieben. Die Kultur wird in 24 Tiefbrunnen (DW24)-Format durchgeführt, so dass die regelmäßige Schüttelinkubatoren kann im Gegensatz zu Kulturen in tiefe gut gewachsen 96 (DW96)-Format, das die Verwendung von kurzen Orbital High-Speed-Schüttelinkubatoren für ausreichende Belüftung notwendig (Schütteln verwendet werden bei 800 rpm). Der Einsatz von Auto-Induktion Medien 27 vereinfacht auch Ausdruck, wodurch die manuelle Induktionsschritt. Selbst dort, wo Labors vordefinierten Ausdruck und puri nutzen bereitsfizierung Bedingungen, können diese direkt in diese HTP-System übertragen werden einfach um die Effizienz zu verbessern. Eine detaillierte schematische Darstellung des Hochdurchsatz-Screening-Pipeline für Disulfid-reiche Proteine ​​ist in Fig. 3 vorgesehen. Die Parameter in der Pipeline wurden basierend auf umfangreichen Screening-Experimenten 11, 22, die uns erlaubte, die nützlichsten Bedingungen für die Proteinproduktion zu wählen ausgewählt.

Charakterisierung kann auf markierten Proteine ​​direkt aus Klein Ausdrücke in Pilotstudien wo Zehn Mikrogramm Probe genügt, oder für empfindliche funktionelle Assays und Bindungsstudien (zum Beispiel Low-Volume-Patch-Clamp-Systemen HTP 28) gereinigt, durchgeführt werden. Das gleiche kann auch auf den unbezeichnet Ziele nach der Spaltung durchgeführt werden, wenn das Etikett und Protease entfernt werden (z. B. durch Umkehrphasen-HPLC). Die Qualitätskontrolle kann auch durch Massenspektrometrie (um die erwartete Größe und Oxidation st bestätigenate) oder chromatographische Methoden (Reinheit oder Heterogenität bestätigen) 29. Manchmal markieren Spaltung ist unnötig oder sogar unerwünscht ist (besonders für schlecht lösliche Proteine ​​30,31), so dass in diesem Protokoll Spaltung ist optional. Unabhängig davon, in allen Konstrukten gibt es eine TEV Protease-Schnittstelle (ENLYFQ / [G] 32) unmittelbar vor dem Zielgens auf native Protein nach Abspaltung erzeugen (siehe Abbildung 2 und Diskussion). Wenn die Spaltung der Fusions Tag gewünscht wird, kann die Spaltung (in der Elutionsfraktion oder "on column") im kleinen Maßstab zu analysieren Effizienz getestet werden, Bedingungen zu optimieren, falls erforderlich und erhalten zuverlässige Schätzungen der Erträge für nachfolgende Anlagen Experimenten.

Es gibt zwei Optionen für das Volumen der Perlen während der Affinitätsreinigung verwendet werden, abhängig von den Zielen und den Erwartungen des Experiments. Um so viel Protein wie möglich zu erfassen (für Pilottests oder MS zu reinigen, oder Extrapol seinaß für Scale-up-Ausbeuten) ein Endvolumen von 200 &mgr; l des Harzes verwendet werden, die den Nachweis des löslichen Proteins in dem Bereich von 1-100 mg / l Kultur vor der Sättigung des Systems (siehe Protokoll (A) in Abschnitt 8.1) . Wenn das Ziel des Experiments ist die Detektion von geringen Mengen an löslichen Proteinen, dann ist jedoch ein Endvolumen von 50 ul Harz geeignet, die den Nachweis des löslichen Proteins im Bereich von 0,1-25 mg / L Kultur (siehe Protokoll (B ) in Abschnitt 8.2).

Die Produktion kann hochskaliert werden, falls erforderlich, auf Milligramm-Mengen gereinigt Ziele für weitere strukturelle und funktionelle Studien mit, die für lösliche Expression identifiziert Bedingungen zu erhalten. Die Details der Scale-up-Protokolle auf AFMB verwendet haben, an anderer Stelle 22,24 diskutiert.

Weitere Einzelheiten mit Bezug auf die Versuchsaufbau kritischen Schritte in dem Protokoll sind Modifikationen und Fehlersuche und Grenzen der Technik in der Scheibe vorgesehen istussion. Bitte lesen Sie die Diskussion vor Beginn der Experimente.

In den Protokollen erwarten wir eine Erfolgsrate von 90% in jedem Schritt (zum Beispiel mindestens 90% der Kulturen müssen zu einem bestimmten Schritt zu wachsen). Wenn die Erfolgsrate einer Stufe in dem Experiment unter 90% werden die Proben verworfen und das Experiment wird für die vollständige Sammlung von Konstrukten wiederholt. Jedoch ist dieses Erfolgsrate nicht auf die Anzahl der Konstrukte, die als lösliche Proteine ​​oder der Anteil von Konstrukten, die mit 100% Effizienz spalten, zu exprimieren, wie dies in hohem Maße von den getesteten Proteine ​​sein.

Die konkreten Details für das Set-up des Roboterarbeitstisch sind für jedes Protokoll vorgesehen ist (Abbildung 4 siehe auch), aber sie können als geeignet für alternative Arbeitstisch-Set-ups erforderlich. Der Roboter-Hardware (Tecan) besteht aus einer 96-Multichannel-Arm (MCA96), Roboter-Manipulator (Roma) und der 8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa). Alle Schritte Verwendung der MCA96 kann auch über die LiHa wenn ein MCA96 nicht verfügbar ist, aber sie wird länger dauern, weil die LiHa müssen zwischen den Schritten gewaschen werden. Während der Roboter technisch nicht sterilen Umgebung, die Aufnahme von Antibiotika im allgemeinen gewährleistet, dass es keine Probleme mit der Verschmutzung oder Sterilität.

Protocol

Teil A: Transformation und Expression-Test

Manuelle Verfahren zur Klonierung und Transformation 22, um die Reinigung anderer Stelle 24 diskutiert. Das Transformationsprotokoll vollständig auf dem Roboter 26 durchgeführt werden, aber es ist in der Regel zeiteffizienter, es manuell tun. Deshalb hier die Protokolle beginnen Inokulation der Expressions Vorkulturen und Überzug der Transformation von der Hitze geschockt Transformation mischt manuell. Für weitere Details zu den manuellen Klonen und Transformationsverfahren auf die entsprechenden Verweise 22,24.

1. Vorkulturen und Oberflächen

  1. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch (siehe Abbildung 4 für Positionen):
    1. Legen Sie eine Schale mit 300 ml 150 ml sterile LB-Brühe (mit Ampicillin (100 ug / ml) ergänzt / Chloramphenicol (34 ug / ml) oder einem anderen geeigneten Antibiotikum) in Position 8.
    2. Legen Sie eine sterile DW96 an Position 11. Legen 4x vorbereiteten 24-Well-LB-Agar (Amp / Cam) Gewebekulturplatten (mit 2 ml Agar in jedem gut) mit ihren Deckel auf den Positionen 14 bis 17.
    3. Setzen Sie den Transformationsplatte (mit der Transformation 96 mischt nach Hitzeschock) auf Position 13. Dieser wird verwendet, um die flüssigen Vorkulturen und LB-Agar-Platten impfen werden. Setzen Sie ein Feld von 200 ul sterile Pipettenspitzen an Position 18.
  2. Verwendung des 96-Multichannel-Arm (MCA96) und 200 ul Spitzen absaugen 200 ul LB-Medium (Position 8) und Abgeben in die DW96 an Position 11. Wiederholen, bis ein Endvolumen von 1 ml LB-Medium in jede Vertiefung die DW96. Dies wird die flüssige Vorkultur zu werden.
  3. Mit dem Roboter-Manipulator (Roma), entfernen Sie den Deckel der erste 24-Loch LB-Agar-Platte und legen Sie es an anderer Stelle (zB in einem Hotel Träger), bis die Plattierung für diese Platte fertig.
  4. Mit der 8-Kanal-Liquid Handling (LiHa) Kopf, mischen und dann gründlich absaugen 50 ul ter erste Spalte der Transformationsansatz auf Position 13. Dieses Volumen von Transformationsmischung ist gerade genug, um den LB-Agar gut abzudecken.
  5. Mit den ersten 4 Kanälen, verzichtet auf die erste Spalte der ersten 24-Well-LB-Agar-Platte in der Position 14 (wie in Fig. 5 gezeigt).
  6. Mit den letzten 4 Kanäle, verzichten auf die zweite Spalte der ersten 24-Loch LB-Agar-Platte.
  7. Nach der Abgabe gründlich waschen alle Tipps.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Transformationen auf der ersten Platte an Position 14 überzogen worden, die Übertragung von 96 - bis 24-well mit dem Schema in Abbildung 5 vorgesehen.
  9. Sobald die erste Platte abgeschlossen ist, verwenden Sie die RoMa, um den Deckel zu ersetzen, und entfernen Sie den Deckel von der nächsten Platte in Position 15. Fahren Sie mit der Beschichtungssystem für die nächsten 3 Tafeln.
  10. Sobald Beschichtung fertig ist, setzen die Te-Shake-1.200 rpm und schütteln alle Platten für 1 min, um eine homogene Verteilung der Transformationsmischung haben. Mit der MCA96 und die Original-Pipettenspitzen, mischen und dann gründlich absaugen 60 ul der verbleibenden Transformationsmischung (Position 13) und verzichtet in den DW96, die LB-Brühe an Position 11.
  11. Verschließen Sie die DW96 Vorkulturen mit atmungsaktiven Klebefolie zur Kultur Belüftung zu ermöglichen.
  12. In einer 37 ° C Schüttelinkubator bei Höchstgeschwindigkeit O / N (200/800 rpm je nach Orbitalschüttler).
  13. Die LB-Agar-Platten sollten in einer Haube mit ihren Deckeln aus, bis trocken (10 min) platziert werden. Dann werden sie in einem 37 ° C Inkubator Platte umgekehrt gebracht werden bis zum nächsten Morgen.
  14. Am nächsten Tag wird die Vorkultur verwendet, um den Testausdruck in auto-Induktionsmedium und zur Herstellung von Glycerinstammkulturen zu beimpfen. Setzen Sie die Agar-Platten im Kühlschrank, als Backup. Wenn nötig, ausgehend von den Agar-Platten oder die Glycerin Aktien, der Testausdruck könnte neu gemacht werden durch die direkte Inokulation einer frischen LB Vorkultur.

2. Vorbereitung der DW24 ZYP-5052 Platten

HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 5 min, für jeden Satz von 4x DW24 Platten abzuschließen.

  1. Make-up 500 ml ZYP-5052 Auto-Induktionsmedium für jede Wiederholung von 96 Kulturen (464 ml ZY Medium, 250 ul 2 M MgSO 4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS in dieser Reihenfolge - die Rezepte für jede Komponente sind in Tabelle 1) mit den geeigneten Antibiotika ergänzt.
  2. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch:
    1. Legen Sie zwei 300 ml Mulden, die jeweils ~ 250 ml Medium an Position 5 und 6. Legen vier sterile DW24 Platten an den Positionen 14 bis 17 Jahren. Legen Sie 200 ul Tipps an Position 18.
  3. Mit der MCA96 und 200 ul Tipps, absaugen 200 ul ZYP-5052 von Position 5 und verzichten in den ersten DW24 Platte an Position 14. Tun Sie dies, insgesamt 5-mal (4 Tipps werden in einem einzigen gut auf einmal für eine Gesamt verzichten von 4 ml). 15 bis 17, Schalt Wiederholen Sie für die restlichen 3 x DW24 Platten an den Positionenching an den ZYP-5052 an Position 6 für die letzten zwei DW24-Platten.

3. Inokulation und Wachstum der Testausdruck Kulturen

HINWEIS: Impfung dauert etwa 10 min für jeden Satz von 4x DW24 Platten zu vervollständigen, und das Wachstum setzt O / N.

  1. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch:
    1. Legen Sie die Platte mit den DW96 Vorkulturen (aus Schritt 1.15) an Position 11. Legen Sie die vier Platten, die ZYP DW24-5052 Medium (aus Schritt 2.3) an den Positionen 14 bis 17 Jahren.
  2. Mit der LiHa absaugen 100 ul der Vorkultur von Position 11, die Testexpressionskulturen (1/40 Verdünnung) mit dem Schema in Abbildung 5 vorgesehen impfen. Gründlich waschen LiHa Kopf an der Waschstation zwischen jeder Spalte der 96-Loch-Vorkulturen.
  3. Verschließen Sie die DW24-Platten mit atmungsaktiven Folie und bei 37 ° C unter Schütteln (200/400 rpm) für 4 Stunden. Dies ist der Zeitpunkt der Wachstumsphase, während welcher glucose aus dem Medium aufgebraucht werden bevorzugt 27 sein.
  4. Reduzieren Sie die Temperatur auf 17 ° C Nach 4 Stunden und Ausscheidung von Glucose, Lactose wird beginnen, metabolisiert werden, was zu Induktion der Expression, die Bereitstellung der optimalen Wachstumsbedingungen für BL21 (DE3) pLysS oder Rosetta 2 (DE3) pLysS, die in dieser Arbeit 22. Lassen Sie die Zellen, die O / N ausdrücken Nutzen Sie die verbleibenden Vorkultur in Glycerin Aktien zu machen.

4. Herstellung von Glycerin-Stocks

HINWEIS: Glycerin Vorräte sollten in dreifacher Ausführung an verschiedenen Orten im Fall von Gefrierausfall gespeichert werden.

  1. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch:
    1. Setzen Mikrotiterplatten an Position 5 bis 7, um die Glycerinstammzubringen. Setzen Sie ein 300 ml Trog mit 50 ml 100% Glycerin in Position 8 gefüllt. Setzen Sie ein DW96 mit 800 ul Vorkultur (nach Schritt 3.2) in jedem gut an Position 11. Put 200 ul Tipps an Position 18.
  2. Mit einem slow Aufnahme und Abgabe Geschwindigkeit, verwenden Sie die MCA96 und 200 ul Tipps, Glycerin in der DW96 mit den Vorkulturen hinzufügen.
    1. Saugen Sie 200 ul Glycerin (von Position 8).
    2. Verzichtet werden 150 ul (an Position 11), dann für 20 Sekunden warten, bis das restliche Glycerin zu der Unterseite der Spitze zu erreichen. Verzichten die verbleibenden 50 ul.
  3. Mit den gleichen Spitzen, mischen Sie die Kultur und Glycerin in DW96 an der Position 11, bis sie gründlich gemischt werden. Die Endkonzentration von Glycerin ist 20%. Saugen Sie 140 ul von der DW96 und verzichten in den ersten Mikrotiterplatte an Position 5.
  4. Wiederholen Sie Schritt 4.3 für jede verbleibende Mikrotiterplatte (Positionen 6 und 7).
  5. Siegel jede Mikrotiterplatte mit Kunststoffklebeband und bei -80 ° C Entsorgen Sie die Restkultur im DW96, Dekontamination mit einem antimikrobiellen Mittel vor der Entsorgung.

5. Beurteilung der Wachstum der Kulturen

600 zu beurteilen ist in der Regel für die meisten Kulturen (etwa 12 in diesen Bedingungen) die gleichen, aber alle Kulturen, die nicht wachsen sollten beachtet werden.

  1. Nehmen Sie 50 ul jeder Kultur (aus Schritt 3.4) und verzichtet in einem flachen, klaren Mikrotiterplatte mit 150 ul Medium.
  2. Messung der OD 600 unter Berücksichtigung der 4-fachen Verdünnung. Wenn es welche gibt, die nicht sehr gut zu wachsen hat, notieren Sie diese für die endgültige Analyse.

6. Ernte der Zellen

Hinweis: Diese Prozedur dauert etwa 45 Minuten in Anspruch.

  1. Zentrifugieren Sie die 4x DW24 Platten (aus Schritt 3.4) bei 3.000 g für 10 min dann den Überstand verwerfen in einen Abfallbehälter, antimikrobielle Mittel. Tippen Sie auf die Teller, auf den Kopf, auf saugfähigem Papier, um überschüssiges Medium zu entfernen.
  2. In der Zwischenzeit werden 100 ml LysePuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8, oder eine andere bevorzugte Puffer) Lysozym (Endkonzentration 0,25 mg / ml) enthält.
  3. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch:
    1. Setzen Sie die Lyse-Puffer in einem 300 ml-Trog an Position 5. Ein sauberes DW96 an Position 11. Legen Sie die 4 x DW24-Platten, die die Zellpellets (aus Schritt 6.1) in den Positionen 14-17. Setzen Sie 200 ul Tipps an Position 18.
  4. Mit der MCA96 und 200 ul Tipps, absaugen 125 ul Lysepuffer von Position 5 und verzichten in jedes DW24 Platte (Positionen 14-17). Wiederholen. HINWEIS: 4 Tipps werden in einem einzigen und auf einmal für ein Gesamtvolumen von 1 ml in jede Vertiefung der DW24 Platten verzichten.
  5. Schütteln Sie die Platten an den Positionen 14 bis 17 mit der Te-Shake (1000 rpm) für 15 min, um die Pellets zu suspendieren.
  6. Sobald die Pellets resuspendiert werden, mit den ersten 4 Kanäle der LiHa bis 550 ul von Proben ansaugen 1 bis 4 (die erste Spalte der ersten DW24, an Position 14), wird unter Verwendung der lAST 4 Kanäle des LiHa absaugen 550 ul der Proben 5 bis 8 (die zweite Spalte der ersten DW24). Dispense in die erste Reihe des DW96 an Position 11.
  7. Wiederholen Schritt 6.6, so dass der gesamte Zellsuspension wird auf die DW96 übertragen.
  8. Nach jedem Satz Proben waschen LiHa Tipps in der Waschstation.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 6,6 bis 6,8 erreicht für jede Spalte in jeder DW24 Platte (Positionen 15-17) mit dem Schema in Fig. 5 vorgesehen. Dichtung mit Kunststofffolie.
  10. Zur Reinigung am gleichen Tag oder kurzfristige Einfrieren bei -80 ° C für mindestens 1 Stunde, sonst bei -20 ° C lagern

Teil B: Reinigung und Analyse

7. Zell-Lyse

Hinweis: Diese Prozedur dauert etwa 60 Minuten in Anspruch.

  1. Auftauen der gefrorenen Zellsuspensionen (aus Schritt 6.10) in ein Wasserbad (bei RT oder 37 ° C) für ungefähr 15 min und resuspendieren in einem Schüttelinkubator für eineW eitere 10 min. Die Kulturen sind zu zähflüssig.
  2. Nehmen Sie 500 ul DNase Lager und mischen Sie es mit 1 ml MgSO 4 stock. Manuell mit einer 8-Kanal-Pipette oder mit dem Roboter LiHa verzichten 15 ul in jede Vertiefung der DW96, um eine Endkonzentration von 10 ug / ml DNase und 20 mM MgSO 4 zu ergeben.
  3. Re-Siegel der Platte mit Kunststoffband und schütteln für weitere 15 min. An dieser Stelle sollten die Kulturen nicht-viskos sein. Prüfen Sie sorgfältig (durch Sichtprüfung), dass alle Kulturen sind nicht mehr viskos. Hinweis: Dies ist kritisch, wenn einige Kulturen noch viskos (beispielsweise, wenn die DNase wurde versehentlich vergessen oder nicht in geeigneter Weise in einigen Vertiefungen verteilt), wird der Filter verstopft, Erzeugen eines ungleichmäßigen Druck auf den Proben-und Überlauf-oder Gesamt Verstopfen der Filterplatte kann während des Reinigungs passieren.
  4. Für SDS-PAGE Proben des gesamten Zell-Lysats, absaugen 10 ul Lysat und Abgeben in eine 96-Well-PCR-Platten, enthaltend10 &mgr; l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer und 20 ul Wasser. Denaturierung für 3 min bei 95 ° C und einfrieren, bis die Analyse (Gesamt-Fraktion). Wenn ein HTP-Elektrophorese-System verfügbar ist, können die Proben auf diese statt der folgenden Hersteller empfohlenen Protokoll für die Probenvorbereitung analysiert werden. Zu weiteren Details über die Analyse der Proben siehe Abschnitt 10.

8. Ni Affinitätsreinigung

HINWEIS: Eine langsame Aspiration Geschwindigkeit sollte zum Pipettieren alle Harz-Suspensionen eingesetzt werden, wie die Aufhängungen sind ziemlich dick. Über Trocknen des Harzes wird in einer Verringerung der Bindungskapazität führen. Zur Reinigung werden die angegebenen Konzentrationen für Imidazol Nickelaffinitätsharz. Wenn alternative Ionen (zB Kobalt) verwendet werden, dann sollten die Konzentrationen entsprechend angepasst werden.

  1. A - Ni-Affinitätsreinigung zur Detektion im Bereich von 1-100 mg / L (endgültige Harzvolumen = 200 ul)
    HINWEIS: Tseine Reinigungsverfahren dauert etwa 1,5 Stunden in Anspruch, was bedeutet, dass bis zu 4 kann an einem Tag durchgeführt werden.
    1. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch:
      1. Setz 300 ml Mulden enthält Bindungspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8), Waschpuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol, pH 8) und Elutionspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8) in den Positionen 6 bis 8, auf.
      2. Hinterlasse einen leeren 300 ml Trog an Position 5 für die Harzaufschlämmung. An Position 9 und 10 Put-Plattenhalter. An Position 10 legte eine DW96 mit der SPE und Filter / Empfänger-Platte (20 um) an der Spitze.
      3. Setzen Sie den DW96, die das Lysat (aus Schritt 7.3) an Position 14. An Position 18 und 19 stellen die 200 ul weite Bohrung Tipps und 200 ul-Tipps auf. Legen Sie zwei Ersatz DW96-Platten für die Wäsche und die Elution in einem Hotel. HINWEIS: Sie können auch an einem anderen Ort auf dem Arbeitstisch gestellt werden, ob ein Hotel ist nicht verfügbar.
    2. Bereiten 105äquilibriert ml 33% Harz-Aufschlämmung (35 ml + 70 ml Harzbindungspuffer). Fügen Sie die Harzsuspension in die Wanne in Position 5 unmittelbar vor Beginn des Verfahrens.
    3. Mit der MCA96 und 200 ul weite Bohrung Spitzen (Position 18), mischen die Harzaufschlämmung an Position 5 gründlich vor Aufnahme und Abgabe von 200 ul Harzaufschlämmung in den DW96, die das Lysat an Position 14. Zweimal wiederholen, so dass 600 ul Harzaufschlämmung hat zum Lysat hinzugefügt, das Mischen der Harzsuspension vor jeder Bestrebung.
    4. Durchführen einer 10 Minuten Mischschritt mit dem MCA96 an Position 14, um die Bindung zu ermöglichen und um das Harz aus Pelletier verhindern.
    5. Aspirat von Position 14 zu verzichten und 800 ul (in 200 ul Lose) auf die Filterplatte an Position 9, Mischen vor jeder Aspiration sonst wird das Harz auf dem Boden der DW96 beibehalten werden.
    6. Schalten Sie das Vakuum auf der Position 10 für ca. 90 Sekunden, um das Lysat durch die Platte in den FilterDW96, um den Durchfluss zu sammeln, dabei nicht austrocknen des Harzes. Schalten Sie das Vakuum aus.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 8.1.5 und 8.1.6, so dass der gesamte Harz wird dann in der Filterplatte.
    8. Mit der Roma-Arm zu bewegen, die SPE-Block hält die Filterplatte von Position 10 auf Position 9, so dass der nächste Waschschritt geht direkt an die Abfall-und überweisen Sie den DW96 des Durchflusses enthält an Position 10 zu einer anderen Seite (zB in ein Hotel Träger) bis zum Ende des Verfahrens.
    9. Mit einem neuen Satz von 200 ul Spitzen (an Position 19), Waschen des Harzes (an Position 9) mit einem Gesamtvolumen von 800 &mgr; l Bindungspuffer (von Position 6) und lege ein Vakuum an der Position 9, bis der Puffer durchlaufen . Wiederholen einmal.
    10. Verwenden Sie die RoMa Arm, um eine frische DW96 an Position 10 platzieren, um die 50 mM Imidazol Wasch sammeln und bewegen Sie die SPE-Block und Filterplatte wieder an der Spitze (Position 10).
    11. In 800 ul Waschpuffer von Position 7 auf Position 10, drehen Sie denVakuum an, bis der Puffer durchlaufen hat. Schalten Sie das Vakuum aus.
    12. Mit der ROMA, entfernen Sie die SPE-Block und Filterplatte auf Position 9 und der DW96 des Wasch Probe, die zum Hotel, und halten Sie sie beiseite, bis zum Ende des Verfahrens.
    13. Das Harz mit weiteren 800 &mgr; l Waschpuffer (von Position 7 auf Position 9), lege ein Vakuum, bis der Puffer durchlaufen hat. Wiederholen einmal.
    14. Verwenden Sie die RoMa, um eine frische DW96 an Position 10 platzieren und legen Sie die SPE-Block und Filterplatte wieder an der Spitze, um die Elution zu sammeln.
    15. Hinzufügen insgesamt 500 &mgr; l Elutionspuffer (von Position 8 auf Position 9) und Inkubation in situ für 3 min. Schalten Sie die Vakuum, bis alle Puffer durchlaufen hat.
    16. Optional: Für hoch Expression von Proteinen, eine zweite Elution kann in eine frische DW96 wie in den Schritten 8.1.14 und 8.1.15 durchgeführt werden.
    17. Nehmen Sie Proben von der Durchfluss, Waschen und Elution / s für die SDS-PAGE-Elektrophorese oder HTP.
      1. Für HTP-Elektrophorese-Proben, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Zu weiteren Details über die Analyse der Proben siehe Abschnitt 10.
  2. B - Ni-Affinitätsreinigung zur Detektion in dem Bereich von 0,1-25 mg / L (endgültige Harzvolumen = 50 ul)
    HINWEIS: Dieser Reinigungsvorgang dauert ca. 30 min in Anspruch, was bedeutet, dass bis zu 12 an einem Tag durchgeführt werden.
    1. Bereiten Sie die Roboter Arbeitstisch:
      1. Setz 300 ml Mulden enthält Bindungspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8), Waschpuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol, pH 8)und Elutionspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8) in den Positionen 6 bis 8, auf.
      2. Hinterlasse einen leeren 300 ml Trog an Position 5 für die Harzaufschlämmung. An Position 9 und 10 Put-Plattenhalter. An Position 10 legte eine DW96 mit der SPE und Filter / Empfänger-Platte (20 um) an der Spitze.
      3. Setzen Sie den DW96, die das Lysat (aus Schritt 7.3) an Position 14. An Position 18 und 19 setzen 200 ul weite Bohrung Tipps und 200 ul-Tipps auf. Setzen Sie ein Ersatz 96-well Mikrotiterplatten für die Elution in einem Hotel. HINWEIS: Dies könnte auch an einem anderen Ort auf dem Arbeitstisch gestellt werden, ob ein Hotel ist nicht verfügbar.
    2. Vorbereitung 50 ml equilibriert 25% Harz-Aufschlämmung (12,5 ml Harz + 37,5 ml Bindungspuffer). Fügen Sie die Harzsuspension in die Wanne in Position 5 unmittelbar vor Beginn des Verfahrens.
    3. Mit der MCA96 und 200 ul weite Bohrung Spitzen (Position 18), mischen die Harzaufschlämmung an Position 5 gründlich, bevor Ansaugen und dispensing 200 ul Harzaufschlämmung in den DW96, die das Lysat an Position 14.
    4. Inkubation bei RT unter Schütteln mit der Te-Shake-bei 1400 rpm für 10 min Bindung zu ermöglichen.
    5. Absaugen von Position 14 und 1200 verzichten die volle ul (in 200 ul Plätze) über die weite Bohrung Spitzen (Position 18) auf der Filterplatte an Position 10. Mischen Sie vor jedem Aspiration sonst wird das Harz an der Unterseite des DW96 beibehalten werden.
    6. Schalten Sie das Vakuum auf der Position 10 für ca. 30 Sekunden, um das Lysat durch die Platte in die DW96 filtern, sammeln die Durchfluss, dabei nicht austrocknen des Harzes. Schalten Sie das Vakuum aus.
    7. Mit der Roma-Arm, bewegen Sie den SPE-Block hält die Filterplatte von Position 10 auf Position 9, so dass der nächste Waschschritt geht direkt an die Abfall-und überweisen Sie den DW96 des Durchflusses an Position 10 zu einer anderen Seite (z. B. enthält, in eine Hotelträger) bis zum Ende des Verfahrens.
    8. Mit den 200 μl-Tipps (an Position 19), waschen Sie den Harz (an Position 9) mit einer Gesamtfläche von 800 ul Bindungspuffer (von Position 6), und wenden Sie das Vakuum an Position 9, bis der Puffer durchlaufen hat. Wiederholen.
    9. Verwenden Sie die RoMa Arm um die frische DW96 an Position 10 platzieren, um die 50 mM Imidazol Wasch sammeln und bewegen Sie die SPE-Block und Filterplatte wieder an der Spitze (Position 10).
    10. In 150 ul Waschpuffer von Position 7 auf Position 10, drehen Sie das Vakuum auf, bis der Puffer durchlaufen hat. Schalten Sie das Vakuum aus.
    11. Mit der ROMA entfernen Sie die SPE-Block und Filterplatte auf Position 9 und der DW96 des Wasch Probe, die zum Hotel, und halten Sie sie beiseite, bis zum Ende des Verfahrens.
    12. Das Harz mit weiteren 800 &mgr; l Waschpuffer (von Position 7 auf Position 9), lege ein Vakuum, bis der Puffer durchlaufen hat. Wiederholen.
    13. Verwenden Sie die RoMa die Mikro an Position 9 platzieren und legen Sie die SPE-Block und Filterplatte wieder an der Spitze, um th zu sammelnE Elution.
    14. Add 190 ul Elutionspuffer (von Position 8 auf Position 9) und Inkubation in situ für 3 min. Setzen Sie das Vakuum, bis alle Puffer durchlaufen hat.
    15. Nehmen Sie Proben des Durchfluss, Wasch-und Elution für die SDS-PAGE-Elektrophorese oder HTP.
      1. Für SDS-PAGE Proben der Durchfluss, verzichtet werden 10 &mgr; l in eine 96-Well-PCR-Platten mit 10 &mgr; l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer und 20 ul Wasser. Für SDS-PAGE-Proben der Wasch und Elution / s verzichten zu 30 ul PCR-Platten mit 10 &mgr; l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer. Denaturierung für 3 min bei 95 ° C und einfrieren, bis die Analyse.
      2. Für HTP-Elektrophorese-Proben, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Zu weiteren Details über die Analyse der Proben siehe Abschnitt 10.

9. Tag Spaltung (Optional)

  1. Hinzufügen des TEV-Protease (2 mg / ml) zu der eluierten Proteins (aus Schritt 8.1.15 (und 8.1.16) oder Schritt 8.2.14) in einem Verhältnis von 1/10 (v / v).
  2. Inkubieren bei Raumtemperatur (oder 4 ° C für temperaturempfindliche Proteine) O / N unter leichtem Schütteln.
  3. Am Ende der Spaltung verzichten 30 ul in ein PCR-Platte mit 10 ul 4x SDS-PAGE-Probenpuffer oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die HTP-Elektrophorese-Proben.
  4. Filtern der verbleibenden Spaltgemisch (aus Stufe 9.2) durch eine 96-Well-Filterplatte 0,22 um und sammeln das lösliche Durchströmung in einem DW96 durch Anlegen des Vakuums. Dies kann in einer der Vakuumstellen (z. B. Position 10) auf der Flüssigkeitshandhabungsroboter wie für die Elution Schritte in den Abschnitten 8.1 und 8.2 durchgeführt werden. Dies beseitigt jedes Protein, das während der Spaltung fällt.
  5. Nach der Filtration verzichten 30 ul in ein PCR-Platte mit 10 ul 4x SDS-PAGE-Probenpuffer oder bereiten als HTP-Elektrophorese-Proben. Dies ermöglicht den Vergleich der Protein vor der Spaltung, die Mischung nach der Spaltung und der Soluble Protein nach der Abspaltung verbleibenden und gibt gute Hinweise auf die zu erwartenden Ergebnisse in nachfolgenden Scale-up-Experimente. Zu weiteren Details über die Analyse der Proben siehe Abschnitt 10.

10. Auswertung der Ergebnisse

  1. Identifizieren der Konstrukte lösliches Protein exprimieren, durch Analyse der Reinigungsproben auf SDS-PAGE, Dot-Blot oder HTP-Elektrophorese-System wie dem Bremssattel Chip gelangen.
    1. Analysieren Sie die Elution Proben zunächst auf Konstrukte Herstellung lösliches Protein zu identifizieren. In den meisten Fällen nur die Elution Proben analysiert werden, wenn löslichen Konstrukte identifiziert werden, um die Zeit auf der Analyse verbracht zu minimieren.
    2. Wenn das Protein nicht in der Elution laufen die Wasch-und Durchfluss-Proben zu sehen, wenn es exprimiert wird und nicht richtig an das Harz binden.
    3. Für Konstrukte, in denen kein lösliches Protein detektiert werden Lauf des gesamten Zell-Lysats, um zu sehen, wenn das Protein exprimiert wurde.
      HINWEIS: Eine Einschränkung ist hier, dass, wenn die protein der Verzinsung nicht über dem Hintergrund Expressionsniveaus zu präsentieren, kann es nicht möglich sein, das Protein zu sehen und könnte zu einem falsch-negativen führen. Es ist zu beachten, dass es immer möglich, Proteine ​​zu haften und fallen auf das Affinitätsharz und dies könnte zu einem falsch negativen oder Unterschätzung der Ausbeute unter Verwendung des empfohlenen Protokoll (ein seltenes Ereignis in dieser Arbeit) führt. In dem Fall, dass das Protein nach der Elution ausfällt (ein weißes Pellet ist ein paar Minuten / Stunden nach der Elution sichtbar) ist es empfehlenswert, der Pufferzusammensetzung (z. B. Salzkonzentration) zu ändern und / oder führen eine Differential-Scanning-Fluorimetrie Assay zu optimieren Puffer. Eine kleine Probe des Harzes kann auch in der SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert und gekocht, um festzustellen, ob ein Protein auf dem Harz zurückgehalten werden.
    4. Wenn das Protein nicht exprimiert, aber die Zellen haben wachsen, verfolgen eine neue Strategie Ausdruck, oder wenn die OD 600 war nicht hoch genug nachwachsen und erneut analysieren die Kultur. >
    5. Wenn Spaltung Proben analysiert werden sollen, sollten sie in einer Seite-an-Seite-Weise analysiert werden, so dass jedes Konstrukt kann, bevor eine Spaltung nach der Spaltung in benachbarten Fahrspuren angezeigt werden, um die Analyse zu vereinfachen.
  2. Es sei denn, mit einem Verfahren, die eine direkte Quantifizierung der Eluierung Konzentration gibt, sollte Quantifizierung für positive Proben durch Messung der Absorption bei 280 nm (A280) durchgeführt werden.
    1. Messung der A280, wobei die Extinktionskoeffizienten des Proteins berücksichtigt und mit dem Elutionspuffer als lassen, um eine Abschätzung der Proteinausbeute um die höchsten exprimierenden Konstrukten löslichen identifizieren.
    2. Für die meisten zuverlässigen Vergleich von löslichen Ausbeuten, wird empfohlen, um die Ausbeuten durch die Dichte der Kultur (OD 600 mit der Messung), die in Abschnitt 5 genommen wurde, zu normalisieren. Wenn alle Kulturen stieg auf ungefähr der gleichen Dichte ist nicht Normalisierungs erforderlich.
e "> 11. Qualitätskontrolle

  1. Proben können direkt von der Elution oder Spaltung Probe durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC / MS) analysiert werden.
  2. Alternativ mit ZipTip Pipettenspitzen oder Flüssigkeitschromatographie-Verfahren entsalzen ersten (Imidazol und alle Puffersalze, die vorhanden sein können, zu entfernen) und dann analysiert unter Verwendung von Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) oder Elektrospray-Ionisation ( ESI) Massenspektrometrie.
  3. Kleines funktionelle Studien durchgeführt, um zu prüfen, ob die Funktion des Proteins ist, wie erwartet. Wenn größere Mengen sind für die Funktion notwendig, kann ein Scale-up-Kultur gemacht werden und die Funktion von der größeren Kultur einmal Größe und Oxidationszustand getestet haben im kleinen Maßstab bestätigt.

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse sind in Fig. 6 für das Screening von Expressions 96 Disulfid-reiche Proteine ​​vom VENOMICS Pipeline gezeigt. Die Proteine ​​werden durch zunehmende Anzahl von Disulfidbindungen dann zunehmende Anzahl an Resten angeordnet sind. Die Peptide wurden in das Zytoplasma mit einer HIS-tag und DsbC Fusionspartner ausgedrückt. Bei Verwendung der empfohlenen Kulturbedingungen wird eine OD 600 von 12 normalerweise erreicht. Die Peptide wurden unter Verwendung von 8,2-Protokoll-B mit einem Endvolumen von 50 &mgr; l Nickelaffinitätsharz gereinigt, so dass ein Maximum von ~ 25 mg / l Fusionsprotein konnte in diesem Versuch festgestellt werden.

Figur 6A zeigt das Ergebnis der Elektrophorese aus dem Bremssattel LabChip System (welches die Fusion vor der Spaltung) und dem Bewertungssystem basierend auf einer Extrapolation in mg / l Kultur des Fusionsproteins zu erhalten (in Anteilen von 0,1 bis 2 mg / l Kultur, 2 10 mg / l Kultur, 10 bis 25 mg / l Kultur und kein t festgestellt.) Beachten Sie, dass die gespaltene DsbC Tag läuft normalerweise bei etwa 32 kDa, 27 kDa anstatt wie erwartet. Ebenso sind die DsbC Fusionen führen auch rund 5 kDa höher als erwartet. Für viele der Ziele, die wir sehen, nicht nur die intakte Fusions (Oberband), sondern auch der Fusionspartner allein (Unterband). Für einige dieser Ziele die Optimierung der Kulturbedingungen kann das Verhältnis des intakten Fusions (Oberband) im Vergleich zu DsbC allein ermöglicht eine Erhöhung der endgültige Ertrag zu verbessern. Das Scoring nur auf der Ebene der intakten Fusions basiert. Nur 16 der 96 Proteine ​​konnten nicht an der Fusionsebene nachgewiesen werden. Dies entspricht einer Gesamterfolg Niveau von 83%. Von den 80 Proteinen, die nachgewiesen werden konnte, 45 von diesen wurden in Konzentrationen von mehr als 2 mg / L Kultur (56%) festgestellt. Je nach Ziel und Fusion werden Proteinausbeuten in der Regel im Bereich von 2-100 mg / L Kultur (obwohl in diesem Beispiel unter Verwendung des Protokolls 8.2 B ein Maximum von ~ 25 mg / l Fusionsprotein detektiert werden kann).

t "> Eine Analyse des Erfolgs von Anzahl der vorhandenen Disulfidbrücken (in 6B gezeigt) zeigt angemessenen Erfolg für alle Zahlen der getesteten Disulfidbrücken (zwischen 1 und 7), wobei die niedrigste Erfolgsniveau auf 66% für die Ziele, die 6 Disulfid Bindungen. Eine Analyse der Verteilung der Expressions Erfolg durch isoelektrische Punkt und der Anzahl der Reste (in Fig. 6C gezeigt) zeigt keine besondere Vorliebe für die Technik, mit beiden erfolgreich exprimiert Ziele und Ziele, die nicht erkannt wurden während der Auftragung verstreut.

Fig. 6D zeigt ein Beispiel der Ergebnisse der Massenspektrometrie Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS) für ein einzelnes Ziel erhalten wird, vor und nach Reduktion der Probe mit DTT. Normalerweise würde eine solche erschöpfende Massenspektrometrieanalyse nicht durchgeführt werden müssen (eine reduzierte Probe nicht analysiert werden müssen), aber für die Zwecke der gründlichen demonstration wir beide Ergebnisse gezeigt. Die dargestellte Ziel ist ein 5,7 kDa Disulfid-reichen Giftprotein mit 4 Disulfidbrücken. Das Spektrum auf der linken Seite zeigt die Ergebnisse für das Protein vor der Reduktion mit DTT, wie es nach der Spaltung und Entsalzung ohne weitere Eingriffe. Das Spektrum auf der rechten Seite zeigt die Protein nach Reduktion mit DTT, gefolgt von Entsalzen, um überschüssiges DTT zu entfernen. Die, die den experimentellen Massen-Ionen sind mit Pfeilen auf das Spektrum und die Bezeichnung für jedes Ion markiert ist grün dargestellt. Die für diese Ionen berechnet Versuchs den Massen (für das Protein vor der Reduktion (-DTT) und nach Reduktion (+ DTT)) sind in der Tabelle gezeigt. Die Massen (5709,6 Da für die Probe vor der Reduktion und 5717,6 Da für die reduzierte Probe) zeigen eine Massendifferenz von 8 Da. Eine Massendifferenz von 2 Da entspricht der Gegenwart von 1 Disulfidbrücke oxidiert, damit eine Massendifferenz von 8 Da die Anwesenheit von 4 Disulfid-Bindungen (wie erwartet) inder nicht-reduzierten Probe.

Figur 1
1. Schematische Darstellung des Expressions-Screening mit hohem Durchsatz Protokoll. Unter Verwendung dieses Protokolls 96-384 Bedingungen können von einer einzigen Person in einer Woche mit manuellen Verfahren getestet werden, oder bis zu 1.152 Bedingungen mit der beschriebenen halbautomatischen Ausrüstung. Expressionsplasmide werden mit einer Rekombination Klonen Technologie, so dass zahlreiche Ziele können auf einmal subkloniert errichtet. Sobald löslichen Expressionsbedingungen wurden identifiziert und Spaltung durchgeführt wird, wenn gewünscht, kann das Protein auf die Qualitätskontrolle gehen, um die Oxidation und Reinheit im Mikro und / oder Großproduktion zu überprüfen.

Figur 2 Abbildung 2. Schematische für den universellen rekombinatorische Klonen und konstruieren Design. Aus den Zieleintrag Klone können mehrere Expressionsvektoren werden in einem einzigen Experiment in einem Hochdurchsatzverfahren (bis zu 6 x 96 Klone Eintrag in einer Woche) subkloniert. Das exprimierte Protein kodiert für ein HIS-Tag für Nickel-Affinitätsreinigung. Die DsbC (fehlt seiner periplasmatische Signalsequenz für Cytoplasmaexpression) Fusionspartner wird verwendet, um die Löslichkeit und / oder Hilfe Faltung und korrekte Oxidation des Zielproteins zu erhöhen. Beachten Sie, dass die Zielkodierungssequenz sollte ein N-terminales TEV-Protease-Erkennungsstelle (ENLYFQ) enthalten, wenn tag Spaltung gewünscht wird. Der Einschub links oben zeigt die Herstellung der Eintrag Klone unter Verwendung einer Donor-Vektor und die Zielsequenzen, die durch PCR oder Gen-Synthese erhalten werden können. Eintrag Klone können auch von kommerziellen Entry-Klon Sammlungen erhalten werden. Mehrere rekombinatorische Klonen Systeme verfügbar sind, aber wir nutzen die Gateway-system, wie in dem Schema gezeigt.

Fig. 3
3. Hochdurchsatz-Screening-Pipeline für mehrere Disulfid-reiche Ziele. Ziele werden zunächst als HIS-DsbC-Fusionen in das Zytoplasma der BL21 (DE3) pLysS E. ausgedrückt coli bei 37/17 ° C unter Verwendung von Auto-Induktionsmedium (ZYP-5052). Reinigung von Nickel Harz, gefolgt vom Nachweis von löslichen Konstrukte HTP-Elektrophorese (oder Dot-Blot / SDS-PAGE) durchgeführt. Wenn die erste Runde der Expressions-Screening nicht erfolgreich ist, werden alternative Kulturbedingungen versucht. Wenn Konstrukte erzeugen lösliche Proteine ​​in hohen Ausbeuten im Mikro und Qualitätskontrolle durchgeführt werden kann und, falls erforderlich, können die Großproduktion verfolgt werden. Für Ziele, wo die Renditen löslich sind nicht hoch genug ist, können Expressions-Screening mit alternativen stra weiterIns und Temperaturen dann andere Fusionspartner und periplasmatischen Ausdruck. Optionale Schritte sind durch gestrichelte Kästen dargestellt.

Fig. 4
Abbildung 4. Robot Arbeitstisch Setup für die HTP-Plattform. Das Layout der Liquid-Handling-Roboter-Arbeitstisch angezeigt wird, obwohl alternative Arbeitstische können auch verwendet werden, wenn es gleichwertige Sites. Das Setup besteht aus einer Waschstation (WS) für die (8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa)), zwei Mikroträgern mit jeweils 4 Positionen (MP4, Positionen 1-4 und 5-8), eine Vakuumstation mit 2 Positionen (Te-Sauger, Positionen 9 und 10), ein Mikroträger mit 3 Positionen (MP3, Positionen 11-13), zwei Plattenschüttler mit 2 Positionen jeweils (Te-Shakers, Positionen 14-15 und 16-17) und ein Träger für Einwegspitzen mit 3 Positionen (DiTi, Positionen 18-20). Neben derre sind zwei Hotel-Träger für Deep Well Platten und eine für Mikroplatten (nicht gezeigt). Die auf der Liquid-Handling-Roboter installierte Hardware ist ein 96-Mehrkanal-Arm (MCA96) zur Verwendung mit Einwegspitzen, einem 8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa) mit festen Spitzen und einem Roboter-Manipulator (Roma), die Platten / Geräte herum bewegt der Arbeitstisch. Die Nummerierung der Positionen ist in der gesamten Protokoll bezeichnet.

Figur 5
Abbildung 5. Schema für die Übertragung von einer einzigen 96-Well-Platte in vier 24-Well-Platten.

Fig. 6
Abbildung 6. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck Bildschirm von 96 Disulfid-reich pro Gift gezeigtProteine. Die Proteine ​​wurden als HIS-DsbC Fusionen im Zytoplasma exprimiert und mit 50 ul Nickel Harz (Protokoll 8.2-B) gereinigt. A) Expression Screening-Ergebnisse und zeigt virtuelle Gel und erzielte für die Expressionsausbeute. Der Kontrast in der virtuellen Gel Spur-zu-Spur angepasst, um für sehr schwache oder starke Bänder zu kompensieren. Beachten Sie, dass für einige Ziele zwei Bänder zu sehen ist, die obere Bande, die dem intakten Fusionsprotein und der unteren Bande, die dem Fusions Tag allein. B) der Anteil der Proteine ​​in jedem Expressionsniveau exprimiert, verglichen mit der Anzahl der Disulfidbindungen in das Protein. Die tatsächliche Anzahl von Proteinen in jeder Gruppe auf dem Graphen. C) überschichtet Die Verteilung der Expressionslevel basierend auf isoelektrischen Punkt (pI) und die Anzahl von Resten. D) ein Beispiel für die Massenspektrometrie-Ergebnisse für ein 5,7 kDa Disulfid-reichen Gift Protein mit 4 Disulfidbrücken. Das Spektrum aufdie linke Seite zeigt das Protein vor der Reduktion mit DTT und das Spektrum auf der rechten Seite zeigt das Protein mit DTT reduziert und dann entsalzt. Die, die den experimentellen Massen-Ionen sind mit Pfeilen markiert und deren Zuordnungen sind in grün dargestellt. Die experimentellen Massen für das Protein vor der Reduktion und nach der Reduktion sind in der Tabelle dargestellt und zeigen eine Massendifferenz von 8 Da, entsprechend der Anwesenheit von oxidierten Protein vor Zugabe des Reduktionsmittels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur sehen .

Komponente Rezept Kommentar
ZY ~ 928 ml
10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
925 ml Wasser
Mischen und dann im Autoklaven zu sterilisieren. 2 M MgSO 4 100 ml
49,3 g MgSO 4 · 7H 2 O
~ 60 ml Wasser
Rühren, bis gelöst, dann im Autoklaven zu sterilisieren.
50x 5052 1 L
250 g Glycerin
730 ml Wasser
25 g Glukose
100 g α-Lactose
In der Reihe über Hitze rühren, bis alle gelöst und dann im Autoklaven zu sterilisieren.
20x NPS 1 L
900 ml Wasser
66 g (NH 4) 2 SO 4
136 g KH 2 PO 4
142 g Na 2 HPO 4
In der Reihe und rühren, bis alles gelöst und dann im Autoklaven zu sterilisieren.

Tabelle 1. Rezept für Komponenten ZYP-5052 Medium.

Discussion

Es gibt kein einziges universelles Protokoll für die Expression von löslichen, gefalteten, funktionellen Proteinen. Um kosten-und zeiteffizient sein, die meisten Labors oder Proteinkern Einrichtungen die Arbeit mit mehreren Zielen verwenden daher einen hohen Durchsatz-Screening-Protein-Expression, um die besten "Generika" Kombination von Variablen, um ein lösliches aktives Protein für die Mehrheit der Ziele zu erhalten finden. Wir haben DsbC als ein allgemein anwendbares Fusionspartner für die lösliche Expression von Disulfid-reichen Peptide und Proteine ​​11 identifiziert. Verwendung DsbC Fusionen und Hochdurchsatzverfahren, innerhalb einer Woche die lösliche Expression mehrerer Ziele beobachtet werden, und dann 11 zusätzliche Variablen, wie sie in der Einleitung erwähnt, kann in nachfolgenden Runden auf die Ziele, die eine weitere Optimierung erforderlich gescreent werden. Die hier beschriebenen Protokolle werden bei der Expression von Disulfid-reiche Proteine ​​und Peptide gerichtet. Für Anwender, die expresse nicht-netzartige Proteine ​​in einem Hochdurchsatz-Art und Weise haben sich die entsprechenden Protokolle zuvor veröffentlicht worden und kann an anderer Stelle 22,24 gefunden werden.

Der hohe Durchsatz Aufbau ist ideal für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Screening einer großen Anzahl von verschiedenen löslichen Proteine ​​zur Expression und Screening einer großen Anzahl von Expressionskonstrukten (einschließlich verschiedener Fusions Tags) für mehrere Zielgene gleichzeitig ( oder mehrere Expressionskonstrukte für ein einzelnes Ziel), um die Erfolgsquote zu verbessern. Die Plattform kann auch für den Leistungsvergleich und Validierung neuer Protokolle auf einer großen Anzahl von Zielen verwendet werden. Andere Anwendungen umfassen das Screening von Varianten für eine schwieriges Ziel, z. B. Orthologen oder alle Mitglieder der gleichen Familie oder den Erfolg der Herstellung einer Gruppe von Mutanten von einem einzelnen Ziel in einem Experiment getestet. Dieses Protokoll wurde auch in Kombination mit Co-Expressionsvektoren (wit verwendeth eine einzige markierte Protein), um die Pull-down-und vorläufige Charakterisierung von Protein-Protein-Komplexe, gefolgt von gründlicher biophysikalische Analyse, um die korrekte Stöchiometrie der Komplexbildung und 33 bestätigen lassen. Die Menge an Protein gereinigt ist manchmal für Mikrotests (Funktionstests, Protein-DNA-34 oder Protein-Protein-Interaktionsassays). Es gibt mehrere Vorteile bei der Hochdurchsatz-Screening Strategie Ausdruck: (i) die Fähigkeit, eine Vielzahl von Zielen zu testen, oder eine große Anzahl von Variablen in einem einzigen Experiment, (ii) begrenzt Batch-zu-Batch-Variante (iii) Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit, die an einem kleineren mit Tiefbrunnen, (iv) die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit bei größeren Maßstab, (v) das Potenzial für die Automatisierung, und (vi) Einfachheit der Verfolgung und Handhabung (keine Kennzeichnung von einzelnen Röhren, weniger Fehler bei der Verwendung der Platten-Format als mit der Handhabung von Einzelrohren in der Misch-oder Austausch von Klonen) eingeführt.

24. Für maximale Effizienz, ist es vorteilhaft, ein geeignetes System zur Hochdurchsatz-Klonen haben, um die Unter Klonen einer großen Anzahl von Zielen zu vereinfachen. Für die Anfangsphase des VENOMICS Projekt nutzen wir die vielseitige Gateway-Rekombination System 25, die Subklonierung in einem Tempo, von Hunderten von Klonen pro Woche können in einem beliebigen Ziel-Vektor. Protokolle für die Gateway-Rekombination Klonen auf der Invitrogen Website. Weitere Alternativen für die Hochdurchsatz-Klonen sind Ligation-unabhängigen Klonen (LIC) 35,36 und restriktionsfreie (RF) 37 Klonen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Zielgene zur Expression von Entry-Klon Sammlungen zu erhalten, auch durch PCR aus DNA-Matrize, oder alssynthetische Gene, die die für das Projekt ausgewählt VENOMICS Strategie ist. Synthetische Gene können mit Rekombinationsstellen an jedem Ende des Gens und Gensynthese bestellen können leicht Codon-Optimierung des Zielgens Sequenz (E. coli seltene Codons auszuschließen). Dies ist empfehlenswert, aber nicht notwendig. Für Ziele ohne Codon-Optimierung, die eine hohe Anzahl von seltenen Codons, Rosetta 2 (DE3) pLysS (die tRNAs für seltene Codons, die nicht hoch in E. coli exprimiert werden, trägt) enthalten kann besser geeignet als BL21 (DE3) pLysS ist. Zwar gibt es Stämme zur Verfügung, die die Reduktion von Disulfidbindungen in der Regel reduzierenden Umgebung des Cytoplasmas zu begrenzen, in der Hand haben sie nicht so erfolgreich gewesen wie normale E. coli-Stämme 11.

Analytische Skala Affinitätsreinigung von den Testausdruck Kulturen, um die löslichen Fusionsproteine ​​zu erholen und zu quantifizieren, die Renditen durchgeführt. Quantitative Daten können auf th erhaltene löslich Ausbeuten der Fusionsproteine ​​in einem Bereich von 0,1 ausgedrückt - 100 mg / l Kultur. Wenn ein Ziel nicht löslich ist, können alternative Expression und Induktionstemperaturen, Belastungen oder Medien getestet, bevor verschiedenen Fusionspartnern verfolgt werden. Für lösliche Expression von Disulfid-reiche Proteine, die zuvor den Effekt der Fusionspartner auf Platz wir als DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-Tag für Cytoplasmaexpression 11. Periplasmatische Ausdruck ist eine weitere Möglichkeit, die die erfolgreiche Faltung von Disulfid-reich Ziele helfen können. Das Periplasma ist eine weniger reduzierenden Umgebung als Zytoplasma und enthält nützliche Redox-Chaperone zu Disulfidbrücken zu unterstützen. DsbC, DsbA und MBP-Proteine ​​werden normalerweise in das Periplasma durch die periplasmatische Signalsequenzen lokalisiert. Dies bietet die Möglichkeit, diese Tags nutzen, um die Disulfid-reich Ziele in den periplasmatischen Raum, um Falten zu unterstützen lenken. Für unlösbare Ziele wäre der nächste Schritt purify des unlöslichen His-markierten Ziel aus Einschlusskörpern, Solubilisierung und Rückfaltung (dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokoll und wird hier nicht diskutiert werden 3 9). Dies kann ziemlich einfach für Ziele mit nur ein oder zwei Disulfid-Bindungen, aber wird immer schwieriger, da die Anzahl der Disulfidbindungen erhöht. Alternativ und insbesondere für Proteine ​​und Peptide, die mit vier oder mehr Disulfidbindungen, kann es vorteilhaft sein, um komplexere Herstellungssystemen, wie Hefe-, Insekten-oder Säuger-Expressions versuchen.

Mit den Fortschritten in der Miniaturisierung und Automatisierung, wird HTP Elektrophysiologie Lab-on-a-Chip-Technologien 28 zweifellos der Weg der Zukunft für funktionelle Analysen sein. Wir sehen, dass für die meisten Zwecke (vielleicht mit Ausnahme der Strukturuntersuchungen), wird dies die Notwendigkeit für große Kulturen zu negieren. Kleinkulturen nicht nur nützlich für das Screening von Expressionsbedingungen, sondern auch in der Lage, suf bereitzustellenchend Probenmengen für diese miniaturisierten Funktionstests. Die Möglichkeit, mehrere Ziele parallel in ausreichenden Mengen für die funktionelle Charakterisierung produzieren wird die Kosten für die Kultivierung und Verwendung dieser Art von Plattformen zu senken, wird die Expression und Charakterisierung von rekombinanten Proteinen mehr kosten-und zeit wirksam.

Die Protokolle haben hier auf den Ausdruck von Disulfid-reichen Peptide und Proteine ​​in der Anfangsphase des RP7 Europäischen VENOMICS Projekt angewendet. Gifte sind eine ausgezeichnete Quelle von bioaktiven Peptiden, die oft interessante pharmakologische Potential. Allerdings ist ihre Produktion anspruchs aufgrund ihrer komplexen Disulfid-Bindungsmuster und klein. Mit Hochdurchsatz-Plattformen wie das hier beschrieben wird, zielt das Projekt VENOMICS, um eine Bibliothek von 10.000 neuartige Peptide Gift erzeugen, um die Vielfalt in der Natur beobachtet reproduzieren. Diese Bibliothek wird für die Charakterisierung von Disulfid-R ausgenutzt werden,ICH Peptide mit potentiellen pharmakologischen oder therapeutischen Anwendungen mit dem Ziel der Entwicklung neuer Medikamente. Die Plattform wird derzeit für das Benchmarking und Validierung neuer Protokolle für die Verwendung in der VENOMICS Projekt verwendet.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der VENOMICS Projekt, Europäische Projektzuschuss N ° 278346 über das Siebte Rahmenprogramm (RP7 GESUNDHEIT 2011-2015) unterstützt. Die VENOMICS Projekt ist eine Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Forschungseinrichtungen und Unternehmen in Europa:

AFMB, Aix-Marseille Université (Frankreich), CEA Saclay (Frankreich), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Universität Lüttich (Belgien), VenomeTech (Frankreich), Vitamib (Frankreich), Zealand Pharma (Dänemark)

Diese Arbeit wurde von der Französisch-Infrastruktur für integrierte Strukturbiologie (FRISBI) ANR-10-InSb-05 bis 01 unterstützt.

Die Autoren möchte auch Herrn Jeremy Turchetto für die Unterstützung bei den Vorbereitungen für die Dreharbeiten des Videos bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

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References

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