Høy gjennomstrømning Kvantitativ Expression Screening og rensing Anvendt til Rekombinant Disulfide-rike Venom proteiner som produseres i

Biology
 

Summary

En protokoll for kvantitativ høy gjennomstrømning ekspresjon screening og analytisk rensing av fusjonsproteiner fra småskala Escherichia coli-kulturer er beskrevet og anvendt for ekspresjon av disulfid-rik animalsk venom protein mål.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) er det mest brukte ekspresjonssystem for produksjon av rekombinante proteiner for strukturelle og funksjonelle studier. Imidlertid rensende proteiner er noen ganger vanskelig, siden mange proteiner er uttrykt i en uoppløselig form. Når du arbeider med vanskelige eller flere mål det er derfor anbefalt å bruke høy gjennomstrømming (HTP) protein uttrykk screening på en liten skala (1-4 ml kulturer) for å raskt identifisere forhold for løselig uttrykk. For å takle de ulike strukturelle genomikk programmer av lab, en kvantitativ (innenfor et område på 0,1-100 mg / L kultur av rekombinant protein) og HTP protein uttrykk screening protokoll ble gjennomført og godkjent for tusenvis av proteiner. Protokollene ble automatisert ved bruk av en væskehåndtering robot, men kan også utføres manuelt uten spesialutstyr.

Disulfide rike gift proteiner er stadigøkende anerkjennelse for sitt potensial som terapeutisk legemiddel fører. De kan være svært potent og selektiv, men deres komplekse disulfidbinding nettverk gjør dem utfordrende å produsere. Som et medlem av FP7 europeiske Venomics prosjekt ( www.venomics.eu ), er vår utfordring å utvikle vellykkede produksjonsstrategier med sikte på å produsere tusenvis av nye gift proteiner for funksjonell karakterisering. Hjulpet av redoks egenskaper disulfidbinding isomerase DsbC, vi tilpasset vår HTP produksjonsrørledningen for uttrykket av oksiderte, funksjonelle gift peptider i E. coli cytoplasma. Protokollene er også anvendelig til produksjon av forskjellige disulfid-rik proteiner. Her viser vi vår rørledning brukt til produksjon av animalsk venom proteiner. Med de protokoller som er beskrevet her er det sannsynlig at oppløselige disulfid rike proteiner vil oppnås på så lite som en uke. Selv fra en liten skala, det er mulighet for å bruke the renset proteiner for å validere oksydasjonstilstand ved massespektrometri, for karakterisering i pilot-studier, eller for følsomme mikro-analyser.

Introduction

Motivert av fremme av genomikk og akselererende hastighet av oppdagelsen av nye proteiner, har høy gjennomstrømning rørledninger er utviklet for å parallelize tradisjonelle tilnærminger for screening og identifisering av optimale protein produksjonsstrategier. Potensielle variable som skal optimaliseres omfatter, men er ikke begrenset til, varierende uttrykk stammer 1,2, temperatur 3,4, media 2,3, target-varianter 5, fusjonspartnere 6-13, co-ekspresjonssystemer med anstand 14,15, cytoplasmatisk eller periplasmiske uttrykk 16-18, og rensing bufferkomponenter tre. Ved å implementere store gjennomgangs tilnærmingene, mange variabler eller flere mål kan bli testet i parallell med en høy grad av effektivitet, samtidig som den begrenser batch-til-batch-variant. I vår erfaring, strategien gir også god reproduserbarhet ved oppskalering bruker samme kultur (temperatur, media, lufting, etc.) og rensing forhold (samme Resin, buffere, etc.). Flere high throughput plattformer har blitt brukt i det siste tiåret til å identifisere forhold for løselig protein uttrykk, nemlig gjennom varierende parametere som fusjonspartnere, uttrykk stammer eller temperatur 19-23.

Vi har nylig brukt vår high throughput screening tilnærming for uttrykket av løselige disulfide rike proteiner 11. De merkede proteiner ble ikke bare fra giftige kilder, men også med disulfid-rik enzyminhibitorer fra en lang rekke arter, inkludert planter, griser, kuer og mennesker. Eksperimentet sammenlignet effekten av 12 forskjellige fusjonspartnere og tre forskjellige ekspresjonsvektorer belastninger på løseligheten og folding av 28 disulfid-retikulert proteiner. Vi viste at bruk DsbC som en fusjonspartner for produksjon i belastningen BL21 (DE3) pLysS vesentlig outproduced (i både yield og antall løselige proteiner innhentet) enhver annen kombinasjon av belastning og fusjon testet 11. DenResultatene av dette forsøk var grunnlaget for tilpasning vårt opprinnelige generelt høy gjennomstrømning rørledningen (som har blitt brukt for ekspresjon screening av et stort utvalg av proteiner) 22,24 i en mer egnet for ekspresjon av disulfid-rik mål. Disulfid rike proteiner fra dyr gifter er av særlig interesse. Gifter er en kompleks blanding av bioaktive peptider og proteiner, med potensiell verdi farmakologisk og terapeutisk. Imidlertid er ekspresjon av disulfide bond-proteiner inneholdende ikke trivielt. Disse proteinene inneholder vanligvis mellom 1-7 disulfidbindinger, og må oksyderes med de riktige disulfid-bindingsmønster for å være aktiv. For tiden er den plattform som benyttes for screening ekspresjonen av et stort antall disulfid rike dyre venom proteiner som en del av FP7 European VENOMICS Project (www.venomics.eu) og referansemåling nye protokoller for høy gjennomstrømning ekspresjon av flere tusen mål . Her er en automatisert fremgangsmåteer anordnet for høy gjennomstrømning småskala ekspresjon screening og rensing (se figur 1) benyttes for å disulfid rike animalske venom proteiner. Strategien for disulfide rike peptider og proteiner benytter en HIS-tag for rensing og redoks-aktiv fusjonspartner, DsbC, skaper spaltbare HIS-DsbC fusjoner til målet proteiner (se figur 2).

Mens fokuset i protokollene er her automatisering ved hjelp av en væske håndtering robot og HTP elektroforese, disse metodene er også egnet for en høy gjennomstrømming manuell tilnærming, noe som betyr at selv laboratorier med en grunnleggende oppsett kan dra nytte av protokollene uten noen forutsetning for kostbart utstyr . Manuelle protokoller for omdanning til rensing og analyse (ikke spesifikke for disulfid-rike proteiner) er i andre 24 og vil ikke bli gjentatt her. Gjennomstrømningen av manuell prosedyre (fra uttrykket klone, produsert av recombinasjonal kloning 25, til analyse av oppløselige proteinnivåer) er 96 (ved hjelp av SDS-PAGE-deteksjon) eller 384 (4 x 96, ved hjelp av dot blot-og SDS-PAGE-26) kulturer per uke (se figur 1). Dette kan økes hvis det utføres i en semi-automatisert måte (ved hjelp av en væske håndtering robot og dot blot 26 eller HTP-elektroforese, for eksempel med en kaliper GXII LabChip system 22 for analyse av resultater) til opp til 1152 (12 x 96) kulturer i parallell over en uke, som beskrevet heri. Dyrking utføres i dyp brønn 24 (DW24) format, slik at regelmessige risting inkubatorer kan brukes i kontrast til kulturer som dyrkes i dyp brønn 96 (DW96) format, noe som nødvendiggjør bruk av korte bane høy hastighet, risting, kuvøser for tilstrekkelig lufting (risting ved 800 rpm). Bruk av autoinduksjon media 27 forenkler også uttrykket, eliminerer manuell induksjon trinnet. Selv der laboratorier bruker allerede forhåndsdefinerte uttrykk og Purifiserforhold, kan disse overføres direkte inn i dette HTP systemet rett og slett for å øke effektiviteten. Et detaljert skjema av den høye throughput screening rørledning for disulfid-rike proteiner er gitt i figur 3.. Parametrene i rørledningen ble valgt basert på omfattende screeningseksperimenter 11, 22, som tillot oss å velge de mest nyttige forhold for protein produksjon.

Karakterisering kan utføres på merkede proteiner renset direkte fra småskala uttrykk i pilotstudier der titalls mikrogram prøven er tilstrekkelig, eller for sensitive funksjonelle analyser og analyser (for eksempel lavt volum HTP patch clamp systemer 28) bindende. Det samme kan også bli utført på de ukodede mål etter spalting, forutsatt at tag og protease er fjernet (for eksempel ved reversfase-HPLC). Kvalitetskontroll kan også utføres ved massespektrometri (for å bekrefte den forventede størrelse og oksidasjon stspiste) eller kromatografiske metoder (for å bekrefte renhet eller heterogenitet) 29. Noen ganger tagge cleavage er unødvendig eller uønsket (spesielt for dårlig løselig protein 30,31), så i denne protokollen cleavage er valgfritt. Uansett, i alle konstruksjoner er det en TEV protease spaltningssete (ENLYFQ / [G] 32) direkte forut for målgenet for å produsere naturlige protein etter spaltning (se figur 2 og diskusjon). Hvis spalting av fusjon tag er ønskelig, kan cleavage testes (på elueringsfraksjon eller 'på kolonnen') på den lille skala for å analysere effektiviteten, optimalisere forholdene ved behov og få pålitelige estimater av avkastning for påfølgende oppskalering eksperimenter.

Det er to alternativer for volumet av perler brukt under affinitetsrensing, avhengig av mål og forventninger til forsøket. For å kunne fange opp så mye protein som mulig (for å rense for pilot analyser eller MS, eller å extrapolspiste for oppskalering utbytter) et endelig volum på 200 pl av harpiks som skal brukes, slik at påvisning av oppløselig protein i området fra 1 til 100 mg / l kultur før metning av systemet (se protokoll (A) i avsnitt 8.1) . Imidlertid, hvis det formål av forsøket er deteksjon av lave mengder av oppløselige proteiner, og et sluttvolum på 50 pl av harpiks er egner seg, som tillater deteksjon av oppløselige proteiner i området fra 0,1 til 25 mg / l kultur (se protokoll (B ) i avsnitt 8.2).

Produksjonen kan skaleres opp, hvis det er nødvendig, for å få milligram mengder av renset mål for ytterligere strukturelle og funksjonelle studier ved bruk av de betingelser som er identifisert for oppløselig ekspresjon. Detaljene i skala-up protokollene som brukes på AFMB har vært diskutert andre steder 22,24.

Ytterligere detaljer er relevante for den eksperimentelle oppsettet, kritiske trinnene i protokollen, modifikasjoner og feilsøking og begrensninger i teknikken gitt i platenussion. Vennligst les diskusjonen før du begynner forsøkene.

Gjennom protokollene vi forventer en suksessrate på 90% på hvert trinn (for eksempel, må minst 90% av de kulturer vokse til enhver trinn). Hvis suksessrate på hvilket som helst trinn i forsøket faller under 90% av prøvene blir forkastet, og forsøket gjentas for hele samlingen av konstruksjoner. Dette er imidlertid suksessraten ikke egnet til antall konstruksjoner som uttrykker som løselige proteiner eller andelen av konstruksjoner som spalter med 100% effektivitet, da dette vil være svært avhengig av de proteiner som ble testet.

De spesifikke detaljene for oppsett av roboten arbeidsbord er oppgitt for hver protokoll (se også figur 4), men de kan tilpasses etter behov for alternativ arbeidsbord set-ups. Roboten hardware (Tecan) består av en 96 flerkanals-arm (MCA96), robotmanipulator (Roma), og 8-kanals væskehåndtering hode (Liha). Alle trinn utnytte MCA96 kan også utføres ved hjelp av Liha hvis en MCA96 er ikke tilgjengelig, men de vil ta lengre tid fordi Liha må vaskes mellom hvert trinn. Mens roboten er teknisk sett ikke er et sterilt miljø, inkludering av antibiotika generelt sikrer at det ikke er problemer med forurensning eller sterilitet.

Protocol

Del A: Transformasjon og Test Expression

Manuelle rutiner for kloning 22 og transformasjon til rensing er omtalt andre steder 24. Omformingen protokollen kan være fullt utføres på roboten 26, men det er vanligvis mer tidseffektivt å gjøre det manuelt. Derfor protokollene heri begynne fra inokulering av uttrykket prekulturer og plettering av transformasjonen fra varmesjokkerte transformasjon blander gjøres manuelt. For ytterligere detaljer om de manuelle kloning og transformasjon prosedyrer se relevante referanser 22,24.

En. Prekulturer og plating

  1. Forbered roboten arbeidsbord (se figur 4 for stillinger):
    1. Plasser en 300 ml trau inneholdende 150 ml steril LB-næringsløsning (supplert med ampicillin (100 ug / ml) / kloramfenikol (34 ug / ml), eller andre passende antibiotikum) i posisjon 8..
    2. Sett en steril DW96 i posisjon 11. Sett 4x pre-forberedt 24-vel LB agar (Amp / CAM) vevskulturplater (som inneholder 2 ml agar i hver brønn) med sine lokk på i posisjonene 14 til 17.
    3. Sett transformasjonsplate (inneholdende 96 transformasjon blander etter heatshock) ved posisjon 13.. Dette vil bli brukt til å inokulere den flytende prekulturer og LB agarplater. Sett en boks av sterile 200 mL pipette tips på 18. plass.
  2. Bruk av 96-flerkanals-arm (MCA96) og 200 mL tips, aspirat 200 pl LB-næringsløsning (posisjon 8), og dispensere inn i DW96 ved posisjon 11.. Gjenta inntil det er et sluttvolum på 1 ml LB-næringsløsning i hver brønn av den DW96. Dette vil bli den flytende forkulturen.
  3. Ved hjelp av robot manipulator (Roma), ta av lokket på den første 24-vel LB agar plate og plassere den et annet sted (for eksempel på et hotell carrier) til plating er ferdig for denne platen.
  4. Bruke 8-kanals væske håndtering (Liha) hode, bland deretter aspirer 50 pl av tHan første kolonnen for transformasjon blanding ved posisjon 13.. Dette volumet av transformasjons blanding er akkurat nok til å dekke LB-Agar godt.
  5. Med de første fire kanaler, dispensere på den første kolonne i den første 24-brønns LB agarplate ved stilling 14 (som vist i figur 5).
  6. Med de siste fire kanaler, dispensere til den andre kolonnen for den første 24-brønns LB agarplate.
  7. Vask alle tips grundig etter utlevering.
  8. Fortsett denne prosessen inntil alle transformasjoner er blitt belagt på den første plate i stilling 14, overføres fra 96 - til 24-brønn ved hjelp av ordning gitt i figur 5..
  9. Når den første platen er ferdig, bruker romfolket for å erstatte lokket og ta av lokket fra den neste platen i posisjon 15. Fortsette å bruke plating ordningen for de neste tre plater.
  10. Når plating er ferdig, sett Te-Shake til 1200 rpm og riste alle platene i 1 min å ha en homogen fordeling av transformasjon mix. Bruke MCA96 og de opprinnelige pipetter, bland deretter aspirer 60 mL av de resterende transformasjon mix (posisjon 13) og dispensere inn i DW96 inneholder LB buljong i posisjon 11.
  11. Forsegle DW96 prekulturer med pustende selvklebende film for å tillate kultur lufting.
  12. Plasser i en 37 ° C risteinkubator ved maksimal hastighet O / N (200/800 rpm avhengig shaker orbital).
  13. LB agar plater bør plasseres i en hette med sine lokk av før tørk (10 min). Så de er plassert invertert i en 37 ° C plate inkubator til følgende morgen.
  14. Den neste dag, er forkulturen brukes til å vaksinere testen uttrykket i auto-induksjon medium og for utarbeidelse av glyserol aksjer. Sett agarskålene i kjøleskap, som en back up. Hvis det er nødvendig, ved å starte fra agarplater eller glyserol aksjer, test ekspresjon kunne være re-gjøres ved å inokulere en frisk LB forkulturen direkte.

2. Utarbeidelse av DW24 Zyp-5052 Plates

MERK: Denne prosedyren tar ca 5 minutter å fullføre for hvert sett med 4x DW24 plater.

  1. Gjør opp 500 ml Zyp-5052 auto-induksjon medium for hver replikat av 96 kulturer (464 ml ZY middels, 250 mL 2 M MgSo4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, i den rekkefølgen - oppskrifter for hver komponent er gitt i tabell 1) supplert med de egnede antibiotika.
  2. Forbered roboten arbeidsbord:
    1. Sett to 300 ml trau, hver inneholdende ~ 250 ml medium i posisjon 5 og 6. Satt fire sterile DW24 platene i posisjonene 14 til 17. Sett 200 ul tips i 18-stillingen.
  3. Bruke MCA96 og 200 mL tips, aspirer 200 mL av Zyp-5052 fra stillingen fem og dispensere inn den første DW24 plate i posisjon 14. Gjør dette totalt 5 ganger (4 tips vil påføre inn i en enkelt brønn på en gang for en total av 4 ml). Gjenta for de resterende 3 x DW24 plater i posisjonene 15 til 17, elekching til Zyp-5052 ved posisjon 6 for de to DW24 siste plater.

Tre. Inoculation og Vekst av testen uttrykket kulturer

MERK: Inoculation tar ca 10 min å gjennomføre for hvert sett med 4x DW24 plater, og veksten fortsetter O / N.

  1. Forbered roboten arbeidsbord:
    1. Sett DW96 plate som inneholder prekulturer (fra trinn 1,15) i posisjon 11. Sett de fire DW24 plater som inneholder Zyp-5052 medium (fra trinn 2,3) i posisjonene 14 til 17.
  2. Bruke Liha aspirer 100 mL av forkulturen fra posisjon 11 å vaksinere testen uttrykket kulturer (1/40 fortynning) bruker ordningen gitt i figur 5. Vask Liha hodet grundig på vaskestasjonen mellom hver kolonne av 96-brønns prekulturer.
  3. Forsegl DW24 plater med pustende film og inkuberes ved 37 ° C med risting (200/400 rpm) i 4 timer. Dette er den tiden av vekstfase der gluke fra mediet vil fortrinnsvis bli tømt 27.
  4. Senk temperaturen til 17 ° C. Etter fire timer og uttømming av glukose, vil laktose begynner å bli metabolisert, noe som fører til induksjon av uttrykk, og gir optimale vekstvilkår for BL21 (DE3) pLysS eller Rosetta 2 (DE3) pLysS, i dette arbeidet 22. La cellene til å uttrykke O / N. Bruk de rester forkulturen å gjøre glyserol aksjer.

4. Utarbeidelse av glyserol aksjer

MERK: glyserol aksjer bør gjøres i triplicates å lagres på forskjellige steder i tilfelle fryser svikt.

  1. Forbered roboten arbeidsbord:
    1. Sett mikrotiterplater i posisjon 5 til 7 for å huse de glyserol aksjer. Plasser en 300 ml trau fylt med 50 ml 100% glyserol ved posisjon 8.. Sette en DW96 inneholdende 800 pl av forkulturen (etter trinn 3.2) i hver brønn i posisjon 11.. Sett 200 ul tips i 18-stillingen.
  2. Ved hjelp av en slow aspirasjon og utlevering hastighet, bruk MCA96 og 200 mL tips å legge glyserol inn i DW96 inneholder prekulturer.
    1. Aspirer 200 ul av glyserol (fra posisjon 8).
    2. Tilsett 150 ul (i posisjon 11) først, og deretter en pause på 20 sekunder for å tillate den gjenværende glycerol til å nå bunnen av spissen. Tilsett de resterende 50 mL.
  3. Ved hjelp av de samme tips, bland kulturen og glycerol i DW96 ved posisjon 11 inntil de er grundig blandet. Den endelige konsentrasjonen av glyserol er 20%. Sug 140 pl fra den DW96 og dispensere inn i den første mikrotiterplate ved posisjon 5.
  4. Gjenta trinn 4.3 for hver gjenværende mikrotitreringsplate (posisjonene 6 og 7).
  5. Tett hver mikrotitreringsplate med plast teip og oppbevar ved -80 ° C. Kast de resterende kultur i DW96, dekontaminering med et antimikrobielt middel før avhending.

5. Vurdere veksten av kulturer

600 er vanligvis den samme for de fleste kulturer (rundt 12 i disse forholdene), men noen kulturer som ikke vokser bør bemerkes.

  1. Ta 50 ul av hver kultur (fra trinn 3.4) og dispensere inn i en flatbunnet, klar mikrotiterplate inneholdende 150 ul medium.
  2. Mål OD 600, tar hensyn til 4-fold fortynning. Hvis det er noen som ikke vokser veldig godt, merk dette for den endelige analysen.

6. Høsting av celler

MERK: Denne prosedyren tar ca 45 minutter å fullføre.

  1. Sentrifuger 4x DW24 plater (fra trinn 3.4) ved 3000 xg i 10 min og deretter kaste supernatanten i en avfallsbeholder inneholdende antimikrobielt middel. Trykk platene, opp-ned, bort på tørkepapir for å fjerne overflødig medium.
  2. I mellomtiden forbereder 100 ml lysisbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8, eller et annet foretrukket buffer) inneholdende lysozym (endelig konsentrasjon 0,25 mg / ml).
  3. Forbered roboten arbeidsbord:
    1. Sett lysis buffer i en 300 ml trau i posisjon fem. Sett en ren DW96 i posisjon 11. Sett 4 x DW24 plater som inneholder celle pellets (fra trinn 6.1) i posisjonene 14-17. Sett 200 mL tips på 18. plass.
  4. Bruke MCA96 og 200 mL tips, aspirer 125 mL av lysis buffer fra posisjon 5 og dispensere i hver DW24 plate (posisjoner 14-17). Gjenta. MERK: 4-tips vil påføre inn i en enkelt brønn på en gang for et sluttvolum på 1 ml i hver brønn av DW24 platene.
  5. Rist platene i posisjonene 14 til 17 ved hjelp av Te-Shake (1000 rpm) i 15 min for å resuspendere pelleten.
  6. Når pelletene resuspendert, bruker de første fire kanaler av Liha til å aspirere 550 pl fra prøvene 1 til 4 (første kolonne i den første DW24, i posisjon 14), og deretter å bruke lAST fire kanaler av Liha aspirer 550 mL av prøvene 5 til 8 (den andre kolonnen i første DW24). Tilsett inn i den første raden i DW96 ved posisjon 11..
  7. Gjenta trinn 6.6, slik at alle cellesuspensjonen blir overført til DW96.
  8. Etter hvert sett av prøver vaske Liha tips i vaskestasjonen.
  9. Gjenta trinn 6.6 til 6.8 i hver kolonne i hver DW24 plate (posisjoner 15-17) ved hjelp av ordning gitt i figur 5.. Tetning med plastfolie.
  10. For rensing på samme dag eller kortvarig frysing, lagring ved -80 ° C i minst 1 time, på annen måte lagres ved -20 ° C.

Del B: Rensing og analyse

7. Cellelysis

MERK: Denne prosedyren tar rundt 60 minutter å fullføre.

  1. Tines de frosne cellesuspensjoner (fra trinn 6.10) i et vann-bad (ved romtemperatur eller 37 ° C) i omtrent 15 min og resuspender i en risteinkubator for en aNDRE 10 min. Kulturene skal bli tyktflytende.
  2. Ta 500 mL av DNase lager og bland det med en ml MgSo4 lager. Manuelt med en 8-kanal pipette eller med robot Liha, dispensere 15 ul i hver brønn av DW96, for å gi en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml DNase og 20 mM MgSo4.
  3. Re-forsegle plate med plastbånd og ristes i ytterligere 15 min. På dette punkt i kulturer bør være ikke-viskøs. Sjekk nøye (ved visuell undersøkelse) at alle kulturer er ikke lenger tyktflytende. MERK: Dette er kritisk, hvis noen kulturer som fremdeles tyktflytende (for eksempel hvis DNase ble tilfeldigvis glemt eller ikke utlevert på riktig måte i noen brønner), filteret vil tette, genererer et ujevnt press på prøvene og overløp eller total tilstopping av filterplaten kan skje i løpet av rensingen.
  4. For SDS-PAGE prøver av hele celle-lysat, aspirat 10 pl av lysatet og dispensere i en 96-brønners PCR-plate som inneholder10 pl 4 x SDS-PAGE prøvebuffer og 20 ul vann. Denaturere i 3 min ved 95 ° C og fryses inntil analyse (total fraksjon). Hvis en HTP elektroforese system er tilgjengelig, kan prøvene analyseres på dette stedet etter fabrikantens anbefalte protokoll for prøveopparbeidelse. For ytterligere detaljer vedrørende analyse av prøvene se § 10.

8. Ni Affinitetsrensing

MERK: En langsom hastighet aspirasjon bør brukes for pipettering alle harpiks suspensjoner, som suspensjoner er ganske tykk. Over-tørking av harpiksen vil resultere i en reduksjon i bindingskapasitet. For rensing, de spesifiserte imidazol konsentrasjoner gjelder for nikkel affinitet harpiks. Hvis alternative ioner (f.eks kobolt) brukes, da konsentrasjonene bør justeres tilsvarende.

  1. A - Ni affinitetsrensing for deteksjon i området fra 1 til 100 mg / L (sluttharpiksvolum = 200 ul)
    MERK: Tsin rensemetode tar rundt 1,5 time for å fullføre, noe som betyr at opp til 4 kan utføres på en dag.
    1. Forbered roboten arbeidsbord:
      1. Sett 300 ml trau som inneholder bindingsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), vaskebuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8) og elueringsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) i posisjon 6 til 8, henholdsvis.
      2. La tomme 300 ml trau i posisjon 5 for harpiksen oppslemning. I posisjon 9 og 10 put tallerkenstativ. I posisjon 10 sette en DW96 med SPE blokk og filter / mottaker plate (20 mm) på toppen.
      3. Sett DW96 inneholder lysatet (fra trinn 7.3) på 14. plass. Ved posisjon 18 og 19 satte de 200 mL brede bore tips og 200 mL tips, henholdsvis. Sett to reserve DW96 plater for vask og eluering på et hotell. MERK: De kunne også bli satt på et alternativt sted på arbeidsbordet hvis et hotell er utilgjengelig.
    2. Forbered 105ml ekvilibrert 33% resin slurryen (35 ml harpiks + 70 ml bindingsbuffer). Legg harpiksen suspensjonen til trauet ved posisjon 5 umiddelbart før begynnelsen av prosedyren.
    3. Ved hjelp av MCA96 og 200 pl vide boringer tips (posisjon 18), blanding av harpiksen oppslemmingen ved posisjon 5 grundig før aspirering og dispensering av 200 pl av harpiks slurry inn i DW96 inneholdende lysat ved posisjon 14.. Gjenta to ganger slik at 600 pl av harpiks slurry har blitt lagt til lysatet, blande harpiks suspensjon før hver aspirasjon.
    4. Utfør en 10 min blandetrinn ved hjelp av MCA96 i posisjon 14 for å tillate binding og for å hindre harpiksen fra pelletisering.
    5. Sug fra stilling 14 og dispenser 800 ul (i 200 ul masse) på filterplaten i posisjon 9, blanding før hver aspirasjon ellers harpiksen vil bli holdt tilbake ved bunnen av DW96.
    6. Drei vakuum på i posisjon 10 for omtrent 90 sek for å filtrere lysat gjennom platen inn i detDW96 å samle gjennomstrømning, tar seg ikke å tørke ut harpiks. Slå av vakuum av.
    7. Gjenta trinn 8.1.5 og 8.1.6, slik at all harpiksen er da i filterplaten.
    8. Ved hjelp av rom-armen beveger SPE blokken holde filterplaten fra stilling 10 til stilling 9, slik at den neste vasketrinn går direkte til avfallet og overføre DW96 inneholder gjennomstrømning i posisjon 10 til et annet område (for eksempel inn i et hotell carrier) til slutten av prosedyren.
    9. Med et nytt sett med 200 mL tips (ved stilling 19), vaskes harpiksen (i posisjon 9) med i alt 800 pl bindingsbuffer (fra stilling 6), og anvende vakuum ved posisjon 9 til bufferen har passert . Gjenta en gang til.
    10. Bruk roma armen for å plassere en frisk DW96 i posisjon 10 for å samle inn 50 mM imidazol vask og flytte SPE blokk og filterplaten tilbake på toppen (posisjon 10).
    11. Legg 800 mL vaskebuffer fra posisjon 7 på posisjon 10, snuvakuum på inntil bufferen har passert gjennom. Slå vakuum off.
    12. Med ROMA, fjerne SPE blokk og filterplate i stilling 9 og DW96 inneholder vaske prøven til hotellet, og holde det til side til slutten av prosedyren.
    13. Vask harpiksen med ytterligere 800 ul vaskebuffer (fra stilling 7 til stilling 9), påføre vakuum inntil bufferen har passert gjennom. Gjenta en gang til.
    14. Bruk roma å plassere en frisk DW96 i posisjon 10 og plasser SPE blokk og filterplaten tilbake på toppen for å samle elusjonen.
    15. Til en total på 500 pl elueringsbuffer (fra stilling 8 til stilling 9) og inkuberes in situ i 3 min. Slå på vakuum inntil all buffer har passert gjennom.
    16. Valgfritt: For høyt uttrykke proteiner, en annen elueringsoppløsning kan utføres i en fersk DW96 som i trinn 8.1.14 og 8.1.15.
    17. Ta prøver av gjennomstrømning, vask og eluering / s for SDS-PAGE eller HTP elektroforese.
      1. For HTP elektroforeseprøver, følg produsentens anvisninger. For ytterligere detaljer vedrørende analyse av prøvene se § 10.
  2. B - Ni affinitetsrensing for deteksjon i området fra 0,1 til 25 mg / L (sluttharpiksvolum = 50 ul)
    NB: Denne renseprosess tar ca 30 min for å fullføre, noe som betyr at opp til 12 kan utføres på en dag.
    1. Forbered roboten arbeidsbord:
      1. Sett 300 ml trau som inneholder bindingsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), vaskebuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8)og elueringsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) i posisjon 6 til 8, henholdsvis.
      2. La tomme 300 ml trau i posisjon 5 for harpiksen oppslemning. I posisjon 9 og 10 put tallerkenstativ. I posisjon 10 sette en DW96 med SPE blokk og filter / mottaker plate (20 mm) på toppen.
      3. Sett DW96 inneholder lysatet (fra trinn 7.3) på 14. plass. Ved posisjon 18 og 19 satt 200 mL brede bore tips og 200 mL tips, henholdsvis. Sett en ekstra 96-brønn mikrotiterplate for elueringen på et hotell. MERK: Dette kan også bli satt på et alternativt sted på arbeidsbordet hvis et hotell er utilgjengelig.
    2. Forbered 50 ml ekvilibrert 25% harpiks oppslemming (12,5 ml harpiks + 37,5 ml bindingsbuffer). Legg harpiksen suspensjonen til trauet ved posisjon 5 umiddelbart før begynnelsen av prosedyren.
    3. Bruke MCA96 og 200 mL brede bore tips (posisjon 18), bland harpiksoppslemmingen i posisjon 5 grundig før aspirere og dispernsing 200 pl av harpiks slurry inn i DW96 inneholdende lysat ved posisjon 14..
    4. Inkuber ved RT med risting ved hjelp av Te-Shake ved 1400 rpm i 10 min for å tillate binding.
    5. Sug fra stilling 14 og dispensere den fulle 1,200 mL (i 200 ul masse) ved hjelp av de brede borings tips (posisjon 18) på filterplaten i posisjon 10.. Bland før hver aspirasjon ellers harpiksen vil bli holdt tilbake ved bunnen av DW96.
    6. Slå vakuumet på i posisjon 10 for ca 30 sek å filtrere lysatet gjennom platen inn i DW96 å samle gjennomstrømning, tar seg ikke å tørke ut harpiks. Slå av vakuum av.
    7. Ved hjelp av rom-arm, bevege SPE blokken holde filterplaten fra stilling 10 til stilling 9, slik at den neste vasketrinn går direkte til avfallet og overføre DW96 inneholder gjennomstrømning i posisjon 10 til et annet område (for eksempel inn i en Hotellet carrier) til slutten av prosedyren.
    8. Med de 200 μl tips (ved stilling 19), vaskes harpiksen (i posisjon 9) med i alt 800 pl bindingsbuffer (fra stilling 6), og anvende vakuum ved posisjon 9 til bufferen har passert gjennom. Gjenta.
    9. Bruk roma armen for å plassere den friske DW96 i posisjon 10 for å samle inn 50 mM imidazol vask og flytte SPE blokk og filterplaten tilbake på toppen (posisjon 10).
    10. Legg 150 mL vaskebuffer fra posisjon 7 på posisjon 10, slå vakuum på inntil bufferen har gått gjennom. Slå vakuum off.
    11. Med ROMA fjerne SPE blokk og filterplate i stilling 9 og DW96 inneholder vaske prøven til hotellet, og holde det til side til slutten av prosedyren.
    12. Vask harpiksen med ytterligere 800 ul vaskebuffer (fra stilling 7 til stilling 9), påføre vakuum inntil bufferen har passert gjennom. Gjenta.
    13. Bruk roma å plassere mikro i posisjon 9 og plasser SPE blokk og filterplaten tilbake på toppen for å samle the eluering.
    14. Legg 190 pl elueringsbuffer (fra stilling 8 til stilling 9) og inkuberes in situ i 3 min. Bruk vakuum inntil all buffer har passert gjennom.
    15. Ta prøver av gjennomstrømning, vask og eluering for SDS-PAGE eller HTP elektroforese.
      1. For SDS-PAGE prøver av gjennomstrømning, dispensere 10 ul i en 96-brønners PCR-plate som inneholder 10 ul 4X SDS-PAGE prøvebuffer og 20 ul vann. For SDS-PAGE prøver av vask og eluering / s dispensere 30 ul i PCR-plater inneholdende 10 pl 4 x SDS-PAGE prøvebuffer. Denaturere i 3 min ved 95 ° C og fryses inntil analyse.
      2. For HTP elektroforeseprøver, følg produsentens anvisninger. For ytterligere detaljer vedrørende analyse av prøvene se § 10.

9. Tag Kløv (valgfritt)

  1. Tilsett TEV protease (2 mg / ml) til den eluerte protein (fra trinn 8.1.15 (og 8.1.16) eller trinn 8.2.14) i et forhold på 1/10 (v / v).
  2. Inkuber ved RT (eller 4 ° C i temperatur-sensitive proteiner) O / N med forsiktig risting.
  3. På slutten av cleavage dispensere 30 mL i en PCR-plate som inneholder 10 mL av 4x SDS-PAGE prøvebuffer eller følg produsentens instruksjoner for HTP elektroforeseprøver.
  4. Filtrer den gjenværende spaltning blanding (fra trinn 9.2) gjennom en 96-brønns 0,22 mikrometer filter-plate, og samle det oppløselige gjennomstrømning i en DW96 ved å anvende vakuum. Dette kan gjøres på en av de vakuumsider (f.eks posisjon 10) på væskehåndtering robot, som for elueringen trinnene i § § 8.1 og 8.2. Dette fjerner protein som utfelt under cleavage.
  5. Etter filtrering, dispensere 30 pl i en PCR-plate som inneholder 10 pl 4 x SDS-PAGE prøvebuffer eller forberede som HTP elektroforeseprøver. Dette tillater sammenligning av proteinet før spalting, av blandingen etter spalting og soluble protein som gjenstår etter spalting og gir gode indikasjoner på de forventede resultater i påfølgende oppskalering eksperimenter. For ytterligere detaljer vedrørende analyse av prøvene se § 10.

10.. Analyse av resultater

  1. Identifiser de konstruerer uttrykker løselig protein ved å analysere rensing prøver på SDS-PAGE, dot blot eller HTP elektroforese system som Sylinder LabChip.
    1. Analyser elusjonen prøvene først å identifisere konstruksjoner produsere løselig protein. I de fleste tilfeller bare eluering prøver analyseres dersom oppløselige konstruksjoner er identifisert for å minimalisere tiden som brukes på analysen.
    2. Dersom proteinet ikke er i elueringen, drevet vaske og gjennomstrømnings prøver for å se om den ble uttrykt og ikke binder på riktig måte til harpiksen.
    3. For konstruksjoner hvor det ikke oppløselige protein kan detekteres kjøre hele cellelysat for å se om protein ble uttrykt.
      MERK: En begrensning er at dersom protein av interesse er ikke tilstede over bakgrunns ekspresjonsnivåer, kan det ikke være mulig å se protein og kan føre til en falsk negativ. Det må bemerkes at det alltid er mulig for proteiner for å holde fast og utfelles på affinitets-harpiks, og dette kan føre til en falsk negativ eller undervurdering av utbyttet ved hjelp av den anbefalte protokoll (en sjelden hendelse i dette arbeid). I det tilfelle at proteinet utfelles ved eluering (en hvit pellet er synlig noen få minutter / timer etter eluering) er det anbefalt å endre buffersammensetning (for eksempel saltkonsentrasjon) og / eller utføre en differensiell scanning fluorimetry assay for å optimalisere buffere. En liten prøve av harpiksen kan også bli resuspendert i SDS-PAGE prøvebuffer og kokt for å oppdage om et protein som blir beholdt på harpiksen.
    4. Dersom proteinet ikke ble uttrykt men cellene fikk vokse, føre en ny strategi for ekspresjon, eller hvis OD 600 ikke var høy nok til gjenvekst, og Analyser på nytt kulturen. >
    5. Ved spalt-ningsprøver som skal analyseres, bør de bli analysert i et side-ved-side-måte, slik at hver enkelt konstruksjon kan påvises før spalting en etter spalting i tilstøtende baner, for å forenkle analysen.
  2. Med mindre ved hjelp av en metode som gir direkte kvantifisering av elueringen konsentrasjon, bør mengdebestemmelse utføres for positive prøver ved å måle absorbansen ved 280 nm (A280).
    1. Mål A280, tar utryddelse co-effektive av proteinet hensyn og bruke elueringsbuffer som en blank, for å gi et estimat av proteinmengde for å identifisere de høyeste uttrykker løselige konstruksjoner.
    2. For den mest pålitelige sammenlignings av løselige utbytter, er det anbefalt å normalisere utbyttene av tettheten av kulturen (ved hjelp av OD-måling 600), som ble tatt ved punkt 5. Hvis alle kulturer vokste til omtrent samme tetthet, er ikke normalisering nødvendig.
e "> 11. Quality Control

  1. Prøvene kan analyseres direkte fra eluering eller spalting prøve ved væskekromatografi-massespektrometri (LC / MS).
  2. Alternativt avsalte første (for å fjerne imidazol og eventuelle buffersalter som kan være tilstede) ved hjelp ZipTip pipettespisser eller væskekromatografi fremgangsmåter, og deretter analyseres ved hjelp av matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) eller electrospray ionisering ( ESI) massespektrometri.
  3. Småskala funksjonelle studier kan utføres for å kontrollere om funksjonen av proteinet er som forventet. Hvis større mengder er nødvendig for funksjonen, kan en skala opp kultur gjøres og funksjonstestet fra den større kulturen når størrelsen og oksydasjonstilstand er blitt bekreftet ved liten skala.

Representative Results

Representative resultater er vist i figur 6 for ekspresjon screening av 96 disulfid-rik proteiner fra VENOMICS rørledningen. Proteinene er arrangert ved å øke antallet av disulfidbindinger og deretter økende antall rester. Peptidene ble uttrykt i cytoplasma med et HIS-tag og DsbC fusjonspartner. Når du bruker de anbefalte kultur vilkår, er en OD 600 av 12 normalt oppnådd. Peptidene ble renset ved anvendelse av protokollen 8,2-b med et sluttvolum på 50 pl av nikkel affinitets-harpiks, slik at et maksimum på ~ 25 mg / L-fusjonsprotein kan bli detektert i dette eksperimentet.

Figur 6A viser elektroforese resultatet fra Caliper LabChip system (som viser sammensmelting før spaltning), og poengsystemet basert på ekstrapolering for å gi i mg / l kultur av fusjonsproteinet (i nivåer på 0,1 til 2 mg / l kultur, 2 til 10 mg / l kultur, 10 til 25 mg / l kultur og uten t oppdaget.) Legg merke til at den kløyvde DsbC tag normalt kjører på rundt 32 kDa, snarere enn 27 kDa som forventet. Tilsvarende DsbC fusjoner også kjøre rundt 5 kDa høyere enn forventet. For mange av de målene vi ikke bare se intakt fusjon (øvre band), men også fusjonspartner alene (nedre band). For noen av disse mål å optimalisere betingelsene kultur kan forbedre forholdet mellom det intakte fusjons (øvre bånd) i forhold til DsbC alene tillater en økning av det endelige utbyttet. Scoringen er basert bare på nivået av intakt fusjon. Kun 16 av 96 proteiner kunne ikke påvises ved fusjon nivå. Dette tilsvarer en total suksess nivå på 83%. Av de 80-proteinene som kunne påvises, ble 45 av disse detekteres ved nivåer som er større enn 2 mg / l kultur (56%). Avhengig av target-og fusjon, proteinutbytter er vanligvis i området fra 2 til 100 mg / l kultur (selv om det i dette eksemplet ved å bruke den protokoll 8.2 B maksimum ~ 25 mg / L-fusjonsprotein kan bli detektert).

t «> En analyse av suksess ved antall disulfidbindinger som finnes (vist i figur 6B) viser rimelig vellykket for alle antall disulfidbindinger som ble testet (mellom 1 og 7), som har det laveste nivå lykkes å være 66% for mål som inneholder 6 disulfid obligasjoner. en analyse av fordelingen av uttrykket suksess basert på isoelektrisk punkt og antall rester (vist i figur 6C) viser ingen spesiell skjevhet for teknikken, med både hell uttrykt mål og mål som ikke ble oppdaget spredt over hele tomten.

Figur 6D viser et eksempel på de massespektrometri resultatene oppnådd fra electrospray ionisering Massespektrometri (ESI-MS) for et enkelt mål, før og etter reduksjon av prøven med DTT. Normalt vil en slik uttømmende massespektrometri-analyse ville ikke trenger å bli utført (redusert prøve ville ikke trenger å bli analysert), men for formålene i grundig demonstration vi har vist begge resultatene. Målet vises er en 5,7 kDa disulfid-rik gift protein med 4 disulfidbindinger. Spekteret til venstre viser resultatene for protein før reduksjon med DTT, som det var etter spalting og avsalting uten ytterligere inngrep. Spekteret på høyre side viser proteinet etter reduksjon med DTT, etterfulgt av avsalting for å fjerne eventuelt overskudd DTT. De ioner som svarer til den eksperimentelle massene er markert med piler på spektrum og betegnelsen for hvert ion er vist i grønt. De eksperimentelle moder masser beregnet for disse ioner (for protein før reduksjonen (-DTT) og etter reduksjon (+ DTT)) er vist i tabellen. Massene (5709,6 Da for prøven før reduksjon og 5717,6 Da for den reduserte prøven) utviser en masseforskjell på 8 Da. En masseforskjell på 2 Da tilsvarer tilstedeværelse av en oksydert disulfidbinding, er derfor en masseforskjell på 8 Da indikerer nærværet av 4 disulfidbindinger (som forventet) iden ikke-reduserte prøven.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av høy gjennomstrømming uttrykk screening protokoll. Ved hjelp av denne protokollen, kan 96-384 forholdene bli testet av en enkelt person i én uke ved hjelp av manuelle metoder, eller opp til 1152 forhold med den beskrevne semi-automatisert utstyr. Ekspresjonsplasmider blir konstruert ved hjelp av en rekombinasjon kloningsteknologi, slik at tallrike mål kan være sub-klonet på en gang. Når oppløselige ekspresjonsvektorer forhold har blitt identifisert og spalting utføres, hvis ønskelig, kan proteinet videre til kvalitetskontroll for å kontrollere oksydasjon og renhet, microassays og / eller i storskalaproduksjon.

Fig. 2 Figur 2. Skjematisk for universell recombinational kloning og konstruere design. Fra målposten kloner, kan flere ekspresjonsvektorene være sub-klonet i et enkelt eksperiment i en høy gjennomstrømning fashion (opptil 6 x 96 kloner hindringene i en uke). Den uttrykte protein koder for et HIS tag for nikkel affinitetsrensing. Den DsbC (mangler den periplasmiske signalsekvens for cytoplasmatisk ekspresjon) fusjonspartner anvendes for å øke løseligheten og / eller hjelpemiddel folding og riktig oksidasjon av målproteinet. Legg merke til at target-kodende sekvens bør inneholde en N-terminal TEV protease side (ENLYFQ) hvis tag spalting er ønsket. Det innfelte øverst til venstre viser produksjonen av inngangs kloner ved hjelp av en giver vektor og mål-sekvenser, noe som kan bli oppnådd ved PCR-eller gen-syntese. Entry kloner kan også fås fra kommersielle oppføring klone samlinger. Flere recombinational kloning systemene er tilgjengelige, men vi utnytte Gateway system, som vist i den skjematiske.

Figur 3
Figur 3. Høy throughput screening rørledning for flere disulfide rike mål. Målene er i utgangspunktet uttrykt som HIS-DsbC fusjoner i cytoplasma av BL21 (DE3) pLysS E. coli ved 37/17 ° C ved hjelp av autoinduksjon medium (Zyp-5052). Rensing utføres på nikkel-harpiks, etterfulgt av deteksjon av oppløselige konstruksjoner med HTP elektroforese (eller med dot blot / SDS-PAGE). Hvis den første runden av uttrykk screening er mislykket, er alternative kultur vilkår prøvd. Hvis konstruerer produsere løselige proteiner i høy nok avkastning, microassays og kvalitetskontroll kan utføres og, om nødvendig, kan storskala produksjon bli forfulgt. For mål hvor løselige avkastning ikke er høy nok, kan uttrykk screening fortsette med alternative strains og temperaturer deretter andre fusjonspartnere og periplasmic uttrykk. Valgfritt trinn er indikert med stiplede bokser.

Figur 4
Figur 4. Robot arbeidsbord oppsett for HTP-plattformen. Utformingen av vår væskehåndtering robot arbeidsbord er vist, selv om alternative arbeidsbord kan også brukes forutsatt at det er tilsvarende nettsteder tilgjengelig. Oppsettet består av en vaskestasjon (WS) for den (8-kanals væskehåndtering hodet (Liha)), to mikro bærere med fire posisjoner hver (MP4, posisjonerer 1-4 og 5-8), et vakuum stasjon med to stillinger (Te-støvsugere, posisjonerer 9 og 10), en mikrobærer med tre stillinger (MP3, posisjonerer 11-13), to plate shakers med to stillinger hver (Te-Shakers, posisjonerer 14-15 og 16-17) og en operatør for engangsspisser med tre stillinger (DITI, posisjonerer 18-20). I tilleggre er to hotellskip for dypbrønnsplater og en for mikroplater (ikke vist). Maskinvare som er installert på den flytende håndtering robot er en 96-flerkanals arm (MCA96) for bruk med engangsspisser, en 8-kanals væskehåndtering hodet (Liha) med faste tips og en robotmanipulator (Roma) som beveger plater / utstyr rundt på arbeidsbordet. Nummereringen av posisjonene er referert til i løpet av protokollen.

Figur 5
Figur 5. Skjematisk for overføring fra en enkelt 96-brønners plate i fire 24-brønners plater.

Figur 6
Figur 6. Representative resultater er vist i uttrykket skjermen av 96 disulfid-rik venom proproteiner. Proteinene ble uttrykt som HIS-DsbC fusjoner i cytoplasma og renset ved hjelp av 50 mL av Nickel harpiks (Protocol 8.2-B). A) Expression screening resultater, viser virtuelle gel og scoret for uttrykket avkastning. Kontrasten i den virtuelle gel er justert lane-to-lane for å kompensere for veldig svake eller intense band. Legg merke til at for noen mål to bånd kan sees, det øvre bånd tilsvarende det intakte fusjonsprotein, og det nedre båndet som svarer til fusjonen signal alene. B) Andelen av proteiner uttrykt ved hvert uttrykk nivå i forhold til antallet disulfidbindinger in proteinet. Det faktiske antall av proteiner i hver gruppe er overlappet på grafen. C) Fordelingen av ekspresjonsnivåene basert på isoelektrisk punkt (pI) og antallet rester. D) Et eksempel på massespektrometri resultater for en 5,7 kDa disulfid-rik venom protein med 4 disulfidbindinger. Spekteret påpå venstre side viser proteinet før reduksjon med DTT og spekteret på høyre side viser proteinet redusert med DTT og deretter avsaltet. De ioner som svarer til den eksperimentelle massene er merket med piler og deres oppgaver er vist i grønt. De eksperimentelle masser for protein før reduksjon og etter reduksjon er vist i tabellen, og oppviser en masseforskjell på 8 Da, tilsvarende tilstedeværelsen av oksydert protein før tilsetning av reduksjonsmiddel. Trykk her for å vise en større versjon av denne figuren .

Komponent Oppskrift Kommentar
ZY ~ 928 ml
10 g trypton
5 g gjærekstrakt
925 ml vann
Bland og deretter autoklaveres å sterilisere. 2 M MgSO 4 100 ml
49,3 g MgSo4 · 7H 2 O
~ 60 ml vann
Rør til det er oppløst da autoklav å sterilisere.
50x 5052 1 L
250 g glyserol
730 ml vann
25 g glukose
100 g α-laktose
Legg i rekkefølge, oppstuss over varme til alle oppløst da autoklav å sterilisere.
20x NPS 1 L
900 ml vann
66 g (NH 4) 2 SO 4
136 g KH 2 PO 4
142 g Na 2 HPO 4
Legg i rekkefølge og rør til alt oppløst da autoklav å sterilisere.

Tabell 1. Oppskrift for komponenter av Zyp-5052 medium.

Discussion

Det er ingen enkelt universalprotokoll for uttrykket av løselig sammenklappet, funksjonelle proteiner. For å være kostnads-og tidsbesparende, de fleste laboratorier eller protein kjernefasiliteter som arbeider med flere mål bruker derfor høy gjennomstrømning protein uttrykk screening for å finne den beste "generisk" kombinasjon av variabler for å oppnå en løselig aktiv protein for de fleste av målene. Vi har identifisert DsbC som å være en generelt anvendbar fusjonspartner for den oppløselige ekspresjon av disulfid rike peptider og proteiner 11. Ved hjelp DsbC fusjoner og høy gjennomstrømning metoder, innen en uke, de oppløselige uttrykk for flere mål kan observeres 11 og deretter flere variabler, slik som de som er diskutert i innledningen, kan bli vist i de etterfølgende runder på de mål som krever ytterligere optimalisering. De protokoller som er beskrevet her er rettet mot ekspresjonen av disulfid rike proteiner og peptider. Men for brukere som ønsker å expRESS ikke retikulerte proteiner i en høy gjennomstrømning måte, har de tilsvarende protokoller blitt publisert tidligere, og kan finnes andre steder 22,24.

Den høye gjennomstrømning oppsettet er ideell for en rekke anvendelser, herunder screening av et stort antall forskjellige proteiner for oppløselig ekspresjon eller screening av et stort antall ekspresjonskonstruksjoner (inkludert ulike fusjons tags) i flere målgener samtidig ( eller multiple ekspresjonskonstruksjoner for et enkelt mål) for å forbedre suksessrate. Plattformen kan også brukes for referansemåling, og validering av nye protokoller på et stort antall av mål. Andre anvendelser inkluderer screening av varianter for en enkelt vanskelig mål, f. eks, alle orthologs eller medlemmer av den samme familien, eller for å teste effekten på produksjonen av et panel av mutanter av et enkelt mål i ett eksperiment. Denne protokollen er også blitt brukt i kombinasjon med ko-ekspresjonsvektorer (with en merket protein) for å tillate at rullegardin og foreløpig karakterisering av protein-protein-komplekser fulgt av grundigere biofysiske analyse for å bekrefte korrekte kompleksdannelse og støkiometri 33.. Mengden av protein renset noen ganger er egnet for mikro-assays (funksjonstester, protein-DNA 34 eller protein-protein interaksjon assays). Det er flere fordeler med en høy gjennomstrømning uttrykket screeningstrategi: (i) evnen til å teste et stort antall av mål, eller et stort antall variabler i et enkelt eksperiment, (ii) begrenset batch-til-batch-variant, (iii) enkelhet og jobbe på en mindre skala ved hjelp av dype-brønner, (iv) skalerbarhet og reproduserbarhet på større skala, (v) potensial for automatisering, og (vi) enkelhet med sporing og håndtering (ingen merking av enkelte rør, mindre feil innført ved bruk av plate-format enn ved behandlingen av enkelte rør i blanding eller utveksling av kloner).

24. For maksimal effektivitet, er det gunstig å ha et egnet system for høy gjennomstrømming kloning, for å forenkle den sub-kloning av et stort antall mål. For den innledende fasen av VENOMICS prosjektet, vi utnytte den allsidige Gateway rekombinasjon system 25 som gjør at subkloning i hvilken som helst destinasjon vektor i et tempo på hundrevis av kloner per uke. Protokoller for Gateway rekombinasjon kloning kan bli funnet på Invitrogen nettstedet. Andre alternativer for høy gjennomstrømming kloning inkluderer ligation uavhengig kloning (LIC) 35,36 og begrensning-fri (RF) kloning 37. Det er flere måter å få målet gener for uttrykk, blant annet ved PCR fra mal DNA, fra oppføring klone samlinger eller somsyntetiske gener, som er den valgte strategi for VENOMICS prosjektet. Syntetiske gener kan bestilles med rekombinasjonsseter på hver ende av genet og genet syntese tillater enkel kodon optimalisering av målgenet sekvens (for å utelukke sjeldne E. coli-kodoner). Dette er anbefalt, men ikke avgjørende. For mål uten kodonet optimalisering som inneholder et høyt antall sjeldne kodon, Rosetta 2 (DE3) pLysS (som bærer tRNAs for sjeldne kodon som ikke er høyt uttrykt i E. coli) kan være bedre egnet enn BL21 (DE3) pLysS. Mens det er stammer er tilgjengelige som begrenser den reduksjon av disulfidbindinger i det normalt reduserende miljøet i cytoplasma, i hende at de ikke vært så vellykket som vanlig E. coli stammer 11.

Analytisk skala affinitetsrensing utføres fra testen uttrykket kulturer for å utvinne de løselige fusjonsproteiner og kvantifisere utbytter. Kvantitative data kan hentes på the løselige avkastning av fusjonsproteiner uttrykt innenfor et område på 0,1 til 100 mg / L av kultur. Hvis et mål er ikke løselig, kan alternative uttrykk og induksjons temperaturer, stammer eller media testes før ulike fusjonspartnere blir forfulgt. For løselig uttrykk for disulfide rike proteiner, vi tidligere rangert effekten av fusjonspartnere som DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-tag for cytoplasmatiske uttrykk 11. Periplasmiske uttrykk er en annen mulighet som kan hjelpe en vellykket bretting av disulfid-rik mål. Den periplasma er en mindre reduserende omgivelse enn i cytoplasma og inneholder nyttige redoks anstand for å bistå disulfid binding. DsbC, DsbA, og MBP proteiner er vanligvis lokalisert til periplasma av sine periplasmiske signalsekvenser. Dette gir mulighet til å utnytte disse kodene for å dirigere disulfide rike mål til periplasmic plass for å bistå folding. For låste mål, vil neste steg være å purify den uløselige HIS-merket mål fra inkludering organer, oppløse opp og igjen (dette er utenfor omfanget av denne protokollen, og vil ikke bli diskutert her 3 9). Dette kan være ganske enkelt for mål med bare ett eller to disulfidbindinger, men blir stadig vanskeligere etter hvert som antallet av disulfidbindinger øker. Alternativt, og spesielt for proteiner og peptider med fire eller flere disulfidbindinger, kan det være gunstig å prøve mer kompliserte produksjonssystemer som for eksempel gjær, insekt eller pattedyr uttrykk.

Med fremskritt innen miniatyrisering og automatisering, vil HTP elektrofysiologi lab-on-a-chip teknologier 28 utvilsomt være veien for fremtiden for funksjonelle analyser. Man ser for seg at for de fleste formål (kanskje med unntak av strukturelle studier) vil oppheve behovet for storskalakulturer. Småskala kulturer vil ikke bare være nyttig for screening uttrykk forhold, men også være i stand til å gi SUFstrekkelig mengder av utvalget for disse miniatyriserte funksjonelle analyser. Evnen til å produsere flere mål i parallell i tilstrekkelige mengder for funksjonell karakterisering vil redusere omkostningene ved dyrkning, og ved å bruke denne type plattformer, vil ekspresjon og karakterisering av rekombinante proteiner blir mer kostnadseffektiv og tidseffektiv.

Protokollene her har blitt brukt til uttrykk av disulfide rike peptider og proteiner i den innledende fasen av FP7 europeiske VENOMICS prosjektet. Gifter er en utmerket kilde til bioaktive peptider som ofte har interessante farmakologiske potensial. Imidlertid er deres fremstilling vanskelig på grunn av deres kompliserte disulfid-bindingsmønstre og liten størrelse. Ved hjelp av high-throughput plattformer som det som er beskrevet her, sikter VENOMICS prosjektet å generere et bibliotek på 10.000 nye gift peptider å reprodusere mangfoldet observert i naturen. Dette biblioteket vil bli utnyttet for karakterisering av disulfid-rich peptider med potensial farmakologiske eller terapeutiske bruksområder med sikte på å utvikle nye legemidler. Plattformen blir nå brukt for benchmarking og validering av nye protokoller for bruk i VENOMICS prosjektet.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av The VENOMICS prosjektet, europeisk prosjekt stipend N ° 278346 gjennom det sjuende rammeprogram (FP7 HELSE 2011-2015). Den VENOMICS Prosjektet er et samarbeid mellom flere forskningsinstitusjoner og bedrifter i Europa:

AFMB, Aix-Marseille Université (Frankrike), CEA Saclay (Frankrike), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spania), Universitetet de Liege (Belgia), VenomeTech (Frankrike), Vitamib (Frankrike), Sjælland Pharma (Danmark)

Dette arbeidet ble støttet av den franske Infrastruktur for Integrert strukturbiologi (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01.

Forfatterne vil også takke Mr. Jeremy Turchetto for å bistå med forberedelsene til innspillingen av videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 Forthcoming.
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics