Komplett ryggmärgsskada och Brain Dissection protokoll för Efterföljande Wholemount

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Lampreys återvinna locomotion efter en fullständig ryggmärgsskada. Men vissa ryggrads utskjutande nervceller är bra regeneratorer och andra inte. Denna uppsats belyser tekniker för bostäder havsnejonöga larver (och nyligen omvandlade vuxna), som producerar kompletta ryggmärgs transections och förbereda wholemount hjärnor och ryggmärg för in situ hybridisering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Barreiro-Iglesias, A., Zhang, G., Selzer, M. E., Shifman, M. I. Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey. J. Vis. Exp. (92), e51494, doi:10.3791/51494 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Efter en fullständig ryggmärgsskada, är havs nejonöga vid första paralyserad under nivån för transektion. Men de återhämta locomotion efter flera veckor, och detta åtföljs av kort avstånd regenerering (några mm) av propriospinal axoner och spinal utskjutande axoner från hjärnstammen. Bland de 36 stora identifierbara spinal utskjutande nervceller, vissa är bra regeneratorer och andra är dåliga regeneratorer. Dessa nervceller kan lättast identifieras i wholemount CNS preparat. För att förstå de neuron inneboende mekanismer som gynnar eller hämmar Axon förnyelse efter skada i ryggradsdjur CNS, vi bestämmer skillnader i genuttryck mellan de goda och dåliga regeneratorer, och hur uttrycket påverkas av ryggmärgstransektion. Denna uppsats belyser tekniker för bostäder larver och nyligen omvandlade vuxna nejonöga havet i färskvattentankar, producerar kompletta ryggmärgs transections enligt mikroskopisk syn och förbereda brain och ryggmärgs wholemounts för in situ hybridisering. I korthet är djur som hålls vid 16   ° C och sövdes i 1% Benzocaine i nejonöga Ringer. Ryggmärgen är transected med iridektomi sax via ett rygg strategi och djuret får återhämta sig i färskvattentankar vid 23 ° C. För in situ hybridisering, djuren reanesthetized och hjärnan och rep avlägsnas via en rygg strategi.

Introduction

I däggdjur ryggmärgsskada (SCI) är ett förödande tillstånd som leder till permanent förlust av funktion nedanför skadeplatsen, eftersom skadade axoner inte regenerera igenom traumat zonen och återkoppla till sina lämpliga mål. Till skillnad från däggdjur, nejonöga återställa rörelseförmåga efter en fullständig ryggmärgsskada. 1 Intressant nejonöga har en uppsättning 36 ryggmärgen utskjutande nervceller som är individuellt identifierbar hela montering hjärnpreparat på grund av deras stora storlek 2,3 (figur 1) . Alla dessa spinal-utskjutande nervceller är axotomiserade genom en högnivå komplett ryggmärgen transektion. Tidigare studier i vår grupp och andra har visat att även i närvaro av funktionell återhämtning efter SCI vissa av dessa neuroner visar en mycket låg förnyelseförmåga (de anses "dåliga regeneratorer"), medan andra regenerera brukar deras axon genom webbplatsen för skada (de anses "good regeneratorer "). 2,3 Denna egenskap gör nejonöga en intressant ryggradsdjur modell för att studera skillnaderna i genuttryck mellan bra och dåliga regenerator- spinal utskjutande nervceller som i sin tur leder till skillnaderna i den inneboende regenerativ förmåga nervceller som försöker förnya sina axoner i samma yttre miljön. 1

Med hjälp av denna modell har vi tidigare visat att spinal utskjutande nervceller med låg regenerativ förmåga show uttryck för axonal vägledning molekyl receptorer som UNC5 4,5 och neogenin, 6 som förmedlar den hämmande verkan av netrin och RGM respektive. Dessutom, genom att använda denna metod vår grupp har också visat att endast de goda regeneratorerna visar en återhämtning av uttrycket av neurofilament efter skadan och under regenereringsprocessen. Nyligen, Busch och Morgan 7 har visat genom immunofluorescens att de dåliga regeneratorerna visar en increased uttryck för synuklein efter skada, som har samband med författarna på det faktum att de "dåliga regenerator-" spinal utskjutande nervceller långsamt dör efter en fullständig ryggmärgstransection 5,7,8. Så har nejonöga modell av en komplett ryggmärgsskada uppstått som en mycket användbar modell för att förstå vad som gör en ryggmärgs utskjutande neuron en "dålig regenerator" efter axotomy.

För att genomföra våra studier vi utför en komplett ryggmärgstransection kirurgi protokoll och en bakre hjärn dissektion vid önskade tidpunkter efter skada för att utföra wholemount in situ hybridisering. I det aktuella metod artikeln presenterar vi ett detaljerat protokoll för att kunna utföra en komplett ryggmärgsskada kirurgi i larv nejonöga, den efterföljande underhåll av djuren och den slutliga hjärnan dissekering och förberedelse av hjärnan för ett wholemount in situ hybridisering. Ett detaljerat protokoll för att peR formwholemount in situ hybridisering i hjärnan hos larv nejonöga har tidigare rapporterats. 9 Dessutom detta protokoll för ryggmärgsskador och hjärn dissektion kan också användas för att därefter behandla hjärnan för immunohistokemi eller andra histologiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se tabell 1 för alla material som används i detta protokoll.

Experiment godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Temple University.

1. Djur

  1. Skaffa vildtyp larver havet nejonöga (Petromyzon marinus L.), 10-14 cm i längd (4-7 år) från bäckar utfodring Lake Michigan, från biflöden till Delawarefloden (Pennsylvania) eller strömmar i Maine.
  2. I laboratoriet, underhålla larver i grupper om 50 till 100 djur i 50 gallon sötvatten tankar vid 16 ° C. Linje tankarna med en tum av grus för larverna att gräva i, och vattnet är träkol filtreras och luftkonditionerade med luftstenar i minst 48 timmar för att ta bort klor och andra föroreningar innan du placerar nejonöga i dem. Det finns ingen anledning att mata djuren, som återvinner sin egen detritus, fram till dagen för användning.

2 Complete SpinalSladdtransection

  1. Innan ryggmärgen kirurgi förbereda en nejonöga Ringer-lösning med följande sammansättning: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM MgCl2 och 10 mM Tris-buffert; pH 7,4.
  2. För att utföra ryggmärgen transection, placera larver i en liten behållare som skall bedövas med 1% tricaine metansulfonat i iskall Ringers lösning.
  3. När sövda plats djuren i en petriskål hälften fylld med Sylgard (silikon) och använda 4 insekt stift (0,15 mm diameter) för att hålla djuren på plats för operation (en är placerad vid nosen på djuret, en i svansen och två vid nivån för den 5: e Gill). Fyll petriskål nästan upp till toppen med Ringer-lösning. Placera skålen med larven på is när de utför operationen under stereomikroskop.
  4. För att utföra ryggmärgen transektion en dorsal, mittlinjen, gör ett längsgående snitt med en skalpell (# 11) vid nivån för den 5: egill att visualisera ryggmärgen. Initialt huden är öppen genom att sätta spetsen av skalpellblad uppåt och därefter muskelvävnaden skärs mycket försiktigt tills ryggmärgen kan ses från ovan. Fashion två krokar från insekter stift och använda dem för att hålla kroppsväggarna öppna när de utför ryggmärgen transektion.
  5. Helt transekt ryggmärgen i nivå med den 5: e gill med hjälp av en sax (Castroviejo 8 #), sätt saxen vinkelrätt mot ryggmärgen. Ryggmärgen måste helt transected med ett rent snitt. Visualisera Ryggmärgen skurna ändar i stereomikroskop för att bekräfta att ryggmärgen är helt transected. Därefter, justera de skurna ändarna av ryggmärgen efter transektion med hjälp av en pincett (nr 5).
  6. Efter utförande ryggmärgen transection stänga såret i den dorsala kroppsväggen med ett par fina pincett och placera larverna på is under 1 h för att tillåta såret to torka. Lägg en bit filterpapper mellan isen och larverna och dra den med nejonöga Ringer-lösning. Den låga temperaturen håller djuren vid liv samtidigt som det tillåter såret lufttorka vilket bidrar till att förhindra infektioner.
  7. Sedan överföra larver till små tankar (1 larv per tank) med iskallt vatten i 24 timmar.
  8. Undersök den skadade larver 1 dag efter spinaltran till beteendemässigt bekräftar att det inte finns någon rörelse kaudalt om skadestället. En ryggmärg transection anses fullständig om larven kan flytta endast dess huvud rostralt till skadestället (vid nivån för den 5: e Gill). Om så är fallet larverna kan nu överföras till tankar (1 larv per tank) med sötvatten i rumstemperatur (23 ° C) för att tillåta dem att återhämta sig under de valda tidpunkterna.
  9. Under återhämtningsperioden byta vatten varje 2 till 3 dagar.

3 Brain Dissection och Beredning avhjärnan för in situ hybridisering

  1. Vid de önskade tidpunkter efter skadan åter söva larver havet nejonöga och plats och stift dem i petriskål med Ringer-lösning för att utföra hjärnan dissekering som ovan.
  2. Att dissekera hjärnan ut, först göra en tvärgående snitt med skalpell mellan näsborren och tallkottkörteln orgel. Härifrån börjar skära den vävnad som omger hjärnan med hjälp av ett par Castroviejo sax medan du håller den med en pincett.
  3. När hjärnan är utsatt, ta bort choroid plexus med hjälp av en pincett och använda krokarna för att sprida huvudet av djuret och exponera kranialnerver. Sedan skär ryggmärgen tvären med Castroviejo sax. Håll ryggmärgen med en pincett när du använder en annan pincett att kapa kranialnerver att dissekera hjärnan ut.
  4. Efter dissektion, sätta hjärnan på en liten bit av silikon och håll den i läge genom att sätta 2 insect stiften i lukt lökar och 1 i ryggmärgen. Sedan skär den bakre och cerebrotectal commissures i hjärnan längs ryggens mittlinje med saxen och avleda de Alar plattorna i sidled och stift dem platt mot silikon med 4 insekt stift (Figur 2).
  5. Överför bit silikon med hjärnan till ett rör innehållande 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) för att vara fast vid rums temparature för 3 tim på en rotator.
  6. Efter fixering använder hjärnan för wholemount hybridisering in situ såsom beskrivits tidigare (Swain et al., 1994). Hjärnor från kontroll eller skenopererade djur bör köras alltid parallellt med hjärnorna från skadade djur. Den wholemounted larver hjärnan kan studeras med in situ hybridisering på grund av dess platta och tunna formen och även på grund av avsaknaden av myelin 10, vilket gör att hjärnan ganska genomskinligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som ett exempel på de resultat som kan erhållas vid användning av denna metod, representativa bilder av wholemounted hjärnor visar uttrycket av de neogenin transkript i identifierbara ryggmärgs-utskjutande neuroner i kontroll och två veckor efter lesion larvhavs nejonöga visas i figur 2. Läsarna hänvisas till en tidigare studie 6 rapporterar sambandet mellan uttrycket av neogenin efter en fullständig ryggmärgstransektion och regenerativ förmåga identifierbara ryggmärgen utskjutande nervceller i havsnejonöga för fullständig information. I korthet har resultaten visat att efter skadan det sker förändringar i uttrycket av neogenin receptorn i identifierbara spinal utskjutande nervceller. Två veckor efter en komplett ryggmärgstransection den neogenin receptorn är preferentiellt uttryckta i dåliga regeneratorer, som M1, I1, I2, I4, eller MTH neuroner (se figur 2B) Dessa resultat visar resultatetav protokollet och föreslår att neogenin receptorn kan involveras i den misslyckade regenereringen av dessa celler.

Figur 1
Figur 1: Schematisk bild av en rygg havsutsikt lamprey hjärnan som visar var identifierbara reticulospinal nervceller. Reproduceras från Barreiro-Iglesias och Shifman. 5 För förkortningar, se lista nedan.

Figur 2
Figur 2 Mikrofotografier av dorsala vyer av det mogna larv havsnejonöga hjärna som visar uttrycket av neogenin transkriptet i kontroll (A) och 2 veckor efter skada (b) djur. Notera i B att efter skadan på neogenin transkript företrädesvis uttrycks i nervceller kända för att vara dåliga regeneratorer (t.ex. M1, I1, I2, I4 och MTH neuroner). Observera också närvaron av hålen efter de pinnar som används för att hålla hjärnan (pilar). Läsarna hänvisas till den tidigare studien från Shifman och medarbetare. 6 För förkortningar, se lista nedan.

FÖRKORTNINGAR

B (B1-B6) Müller celler i bulbära regionen (mitten rhombencephalic retikulära nucleus)
hab.-ped. tr. habenulopeduncular vägarna
I1-I6 Muller celler av isthmic regionen
JagX glossofaryngeal motor nucleus
inf. infundibulum
ISTH. Retic. isthmic retikulära bildningen
M1-M4 Müller-celler 1-4
Mth Mauthner cell
mth ' extra Mauthner cell
smi sulcus medianus underlägsen
Vm trigeminal motor nucleus
X vagal motor nucleus

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att genomföra en fullständig ryggmärgstransektion och bakre hjärn dissektion i larv havet nejonöga. Detta förfarande gör det möjligt att analysera skillnader i genuttryck mellan identifierbara ryggmärg utskjutande nervceller efter ryggmärgsskada med hjälp av en hel-mount hjärnan in situ hybridisering. Det kritiska steget i förfarandet är rätt prestanda för en komplett ryggmärgstransektion, som kan styras genom att observera de skurna ändarna av ryggmärgen under stereomicrocope och bekräftade 24 h senare genom att försiktigt trycka på nosen av larven med ett par pincett för att se om det finns någon rörelse kaudalt om skadestället. Det är också viktigt för återhämtning av det djur som saxen används för kirurgi inte är rakt på sak och att en enda och rena snitt görs för att helt transekt ryggmärgen.

Överlevnaden av djuren efter skadan är mycket förbättras genom att hålla animals på is under operationen och under den timme som används för att tillåta såret att lufttorka och sedan i iskallt vatten för första 24 tim. Efter denna period såret är stängt och djuren kan redan överföras till tankar med färskvatten vid rumstemperatur.

Larv nejonöga får återhämta sig i rumstemperatur och inte på sin vanliga kall temperatur eftersom en större majoritet av djuren återhämta hela rörelsebeteende funktion efter skadan vid högre temperaturer. 11 Återvinningen av ett normalt mönster för förflyttning observeras 8 till 10 veckor efter det att fullständig ryggmärgstransektion.

Efter att ha utfört en komplett ryggmärgstransektion och hjärnan dissektion på de valda tidpunkterna larv hjärnor kan bearbetas inte bara för att göra en hel-mount in situ hybridisering som visas (figur 2), men även för andra histologiska metoder som immunohistokemi ( t.ex. 7 (t ex 8) eller detektering av aktiverade kaspaser med hjälp fluorokroma märkt kaspashämmare. 5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine methane sulfonate Spectrum TR108 Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice
Scalpel #3 Fine Science Tools (FST) 10003-12
Blades for scalpel: #11 Fine Science Tools  10011-00
Castroviejo scissors #8 Fine Science Tools  15002-08
Forceps #4 & #5 Dumont, Switzerland Roboz RS4955 #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges
Dissecting Microscope Olympus SZ51
Sylgard Dow Corning Co. 184
Insect pins 0.15, 0.20 mm Austerlitz No catalogue # 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body
7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps Fisher Scientific 03-337-1
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Science (EMS) 19210 Dilute to 4% in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
  2. Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
  3. Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
  4. Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
  5. Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
  6. Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
  7. Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
  8. Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
  9. Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
  10. Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
  11. Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics