Dinamik Ca Otomatik Analizi
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca 2 + sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre içi Ca 2 + sinyalleri sık floresan Ca 2 + göstergesi boyalar ve mikroskopi teknikleri ile incelenmiştir. Bununla birlikte, Ca 2 + görüntüleme de niceliksel veri analizi, zaman alıcı ve önyargı tabidir. Ilgi (ROI) algılama bölgeye dayalı otomatik sinyal analizi algoritmaları tek boyutlu çizgi tarama ölçümleri için uygulanan olmuştur, ama iki-boyutlu görüntü dizilerinin optimize kimlik ve İB'nin analizini entegre hiçbir geçerli algoritma yoktur. Burada, resim dizilerinin hızlı elde edilmesi ve ROI analizi için bir algoritma tarif edilmektedir. Bu elips optimum ROI yerleşimini belirlemek amacıyla gürültü filtre sinyallerine uygun kullanır, ve genlik, süre ve mekansal yayılma Ca 2 + sinyal parametrelerini hesaplar. Bu algoritma ImageJ (NIH) bir yazılım için serbestçe kullanılabilir eklenti olarak hayata geçirildi. Birlikte açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar için yazılmış analizi komut ile,Bu yaklaşım, deneysel çıktı hızlı istatistiksel analiz yapmak için yüksek kapasiteli bir boru hattı sağlar. Yazarlar bu analiz protokolün kullanımı fizyolojik Ca 2 + sinyal bir daha tam ve tarafsız karakterizasyonu yol açacağını göstermektedir.

Introduction

Ca 2 + molekülü ve sitozolik Ca 2 + düzeyleri yüksek regüle edilen sinyalizasyon bir yerde ikinci bir elçisidir. Hücre içi Ca 2 + sinyalleri karmaşık ve izole geçişlerini, salınımlar ve dalgalar 1 çoğaltım dahil - 4. Ca 2 + mekansal ve zamansal kontrol Fizyolojik sinyal özgüllüğünü altında yatan düşünce, ve bu nedenle Ca 2 + sinyal şekillerinin analizi birden fazla alanlarda 5 araştırmacılara büyük ilgi olduğunu.

Bu tür Flu-4 ve Fura-2 ile Ca 2 + göstergesi boyalar genel olarak 5-12 floresan mikroskobu ile hücre içi Ca2 + sinyalleri ölçmek için kullanılır. 16 - Genellikle, geçici Ca 2 + sinyalleri zamana bağımlı kullanıcı tanımlı bir alanda ortalama floresan değişiklikler, ya da ilgi bölgesi (ROI) 5,6,13 olarak değerlendirilir. Şu anda, manuel ROI analizi zaman alıcı ve emek hem de bir19 - birçok İB'leri belirlemek ve tekrarlayan hesaplamaları 17 gerçekleştirmek için kullanıcılar gerektirir çünkü da oldukça kapsamlıdır. Bu teknikler aynı zamanda yapay sinyal modları ve düşük genlikli veya yaygın sinyallerinin 18,20 dışlanma tanıtımı dahil olmak üzere, önemli kullanıcı hatası tabi olabilir.

, Otomatik ROI algılama algoritmaları önceden optimum ROI yerleşimi belirlemek için istatistiksel yaklaşımlar çeşitli kullanarak uygulanan olmuştur, ama genellikle çizgi tarama ya da sözde-line zaman 17 tek bir mekansal boyut analizi kısıtlar tarama görüntüleri analiz sınırlı olmuştur 19-22. Ayrıca, birçok mevcut algoritmaları Ca periyodik, lokalize transientler dan yayılan dalgalar 23,24 aralığında 2 + serbest olaylar çeşitliliğini kapsayacak şekilde yeterli değildir. Fizyolojik Ca 2 + sinyalleri kapsamlı değerlendirme genellikle daha önemli görüntü artif varlığı ile komplikebirçok deneysel sistemlerde gürültü ayrımcılığa sinyalini karıştıran hareket.

Daha önce, Ca otomatik ROI algılama algoritması çözüm 2 + (Sağlık, Bethesda, MD National Institutes), gelişmiş ve 25,26 valide NIH ImageJ yazılım için bir eklenti olarak uygulanan geçici algılama sinyal. LC_Pro denilen Bu algoritma, iki-boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri Ca 2 + sinyal geçişlerini kapsayan İB'leri tanımlamak ve analiz etmek için tasarlanmıştır. İşte pratik bir deneysel protokol ve domuz koroner arter endotelyumda algoritmanın bir uygulama temsili gösteri kullanılabilir grafik çıktısı oluşturmak için açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar kullanarak ek komutlar ile sağlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Gemi Diseksiyon ve Görüntüleme

  1. Martens ve diğ 27 de tarif edildiği gibi iç çocuk domuz Hasat doku. Bir polidimetilsiloksanın (PDMS) HEPES fizyolojik tuzlu su solüsyonu (PSS) tamponlu içeren alt diseksiyon çanak içine hasat domuz sağ ventrikülleri yerleştirin.
    1. Bir stereomikroskopta yardımıyla, incelemek ve çevre kardiyak doku katmanlarından damar segmentini kaldırarak forseps ve yaylı makas kullanılarak çevreleyen dokudan koroner arter (~ 8 mm uzunluk, 0.5 mm çap) sol ön inen bir bölümünü kaldırın. NOT: damar duvarı delmek değil dikkat edin.
    2. Diseksiyon çanak içine PDMS bloğu (1 x 0.5 x 0.5 cm) yerleştirin, ve alt iğnelemekle bir iğne kullanın. Mikro iğnelerin şekillendirme, oniki ~ 0.3 cm uzunluk kesimleri içine yaklaşık 40 mikron çaplı tungsten tel kesme ve çanak bu yerleştirin. Forseps kullanılarak, bir micropi ile blok damar segmentinin bir ucunu güvenlin.
    3. Dikkatle damar lümenine küçük yaylı makas yerleştirin ve tamamen açmak için geminin bir tarafında aşağı uzunlamasına kesilir. Endotel yukarıya açılan damar segmentini yönlendirin.
    4. Damar düz bir dikdörtgen oluşturur, öyle ki engellemek için açılan damar segmentinin sınırları güvence altına almak için, geri kalan mikro iğnelerin kullanın. NOT: Micropin üstleri 90 ° eğildi ve blok yüzeyi ile aynı hizada kadar takılmalıdır. Care gerilmeden olmadan damar hazırlık uzatmak için alınmalıdır; Nihai genişliği ~ başlangıç ​​esnetilmemiş genişliğini 1.5x edilmelidir.
    5. 134 NaCl, KCl 6: a HEPES içinde pluronik (% 0.03) ile DMSO içinde çözülmüş Fluo-04:00 (10 uM) karıştırılarak Fluo-04:00 yükleme çözeltisi küçük bir hacmi (~ 1 ml) hazırlayın mM ihtiva eden PSS (tamponlu , 1 MgCİ, 10 HEPES, 10 glukoz) ve karanlıkta oda sıcaklığında yaklaşık 40 dakika boyunca yükleme çözeltisi içine bütün bir blok yerleştirin.
    6. Yükleme işleminden sonra, HEPES tamponlu blok yıkayın5-10 dakika için PSS.
    7. HEPES PSS'ye tamponlu içeren bir coverglass alt odasına 50-100 mikron kalınlığında ayırıcılar üzerine bloğunu monte edin. NOT: Metal pimler ayırıcılar olarak kullanılan ve damar segment aşağı bakacak ve aralıklarına değmiyor emin olabilir.
    8. Konfokal görüntüleme için donatılmış bir inverted mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve endotel hücre tabakası üzerine odaklanır.
    9. ~ 3 20X büyütme dakika ve konfokal görüntü sırası aquisition yazılımını kullanarak saniyede ~ 8 kare hızı için bazal göreceli floresan yakalama zaman atlamalı görüntü dizileri.
    10. Bazal floresans kayıt ~ 3 dakika sonra, bir HEPES addtional 3 dakika için aynı tampon HEPES içinde PSS çözündürüldü, Madde P (100 pM) hacimle (~ 1 ml), ve bir kayıt ile PSS tamponlu çözelti değiştirin.

2.. Otomatik Analizi

  1. 8 bit, g konfokal toplama yazılımı floresan kalsiyum aktivitesinin görüntü dizisi (ler) RenderHiçbir ölçekli bilgi rayscale '. tif' formatındaki dosyalar.
  2. Açık ImageJ, dosya menüsünde 'açık' tıklayın ve ImageJ görüntü dizisi (ler) görüntülemek için explorer penceresinde uygun görüntü dizisini seçin.
  3. Görüntü sekans (lar) içinde faaliyet mekansal yayılma üst ve alt sınırları tahmin etmek için dikdörtgen ROI aracını kullanarak, uygun bir ROI çapı belirler. NOT: ortalama dikdörtgen çapı ROI çapı için uygun bir seçimdir.
  4. Bilgisayarın sabit sürücüsünde yeni bir klasör oluşturun ve klasörü dizine görüntü dizisi (s) ekleyebilirsiniz.
  5. ImageJ, 'Eklentiler' penceresini tıklayın, ardından analizi başlatmak için 'LC_Pro tıklayın.
  6. ROI çap değerini girin ve filtre eşik değerini (0.05 veya 0.01) seçin.
  7. 'Ilaç tedavisi' onay kutusunu tıklayın ve hemen önce ve sonra ilaç ilave edildi (saniye) zaman noktası değerleri girin.
  8. 'Tamam' düğmesini tıklayın vedosya gezgini penceresine görüntü dizisi dizini girin.

3.. Grafik Çıktı

  1. Den R sürüm 3.0.2 indir http://www.r-project.org/ .
  2. R. 32 bit sürümünü açın
  3. "Dosya", daha sonra 'açık komut tıklayın ve grafiksel deney raporları oluşturmak için' traceplot.R 'R komut seçin.
  4. 'Paketler' seçerek kalibre ve gplots paketleri yüklemek, 'paketleri yüklemek', ve uygun sistemlerin paketleri seçerek.
  5. 'Change directory' komutu ardından, 'dosya' tıklayın ve LC_Pro analiz çıkışına karşılık dizini seçmek için kaşif penceresini kullanın.
  6. Komut penceresinde tıklatın ve sonra da 'çalışan tüm' komut dosyasını çalıştırmak için komut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Özel bir algoritma, LC_Pro, gelişmiş ve Ca otomatik analizini gerçekleştirmek amacıyla hayata geçirildi konfokal görüntü dizileri üzerinde 2 + dinamikleri. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, algoritma A) algılar ve dinamik Ca parça siteleri ardışık işleme modülleri kullanır 2 + <0.01), gürültü, B) aktif bölge merkezlerinde otomatik olarak (ROI) bölgeleri tanımlar ve istatistiksel (p yukarıda değiştirmek C) Belirli bir olay parametreleri belirlemek için ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları hesaplamak. Algoritmasının bir grafik bakış bilinen yoğunluğu ve konumu bilgisayar oluşturulan Gauss darbelerini (Şekil 2) kullanılarak gösterilir. Sinyal bakliyat (Şekil 2A ve B) bir standart normal dağılım için z-skoru kullanarak ikili dönüştürüldü, ve en uygun elips sinyal eşiğin üstünde piksel loci (Şekil 2C) ayrıldı. Elips sıralama algoritması saptamaya kullanıldıne iyi ROI yerleştirme (Şekil 2B). ROI zamana karşı şiddeti sonra ölçüldü ve genlik, süre ve mekansal yayılması sinyal parametreleri (Şekil 2E) hesaplanmıştır anlamına gelir. Bu analiz yaklaşımı, bozulmamış vasküler endotel hücre Ca 2 + dinamikleri değerlendirmek için uygulandı. Özellikle, konfokal görüntüleme Şekil 3'te tarif edildiği gibi açılmış domuz koroner arterlerde uygulandı ve algoritma farklı Ca 2 + parametrelerini ölçmek için offline kullanılmıştır. (, 100 pM SP) ve LC_Pro analiz daha sonra gerçekleştirilmiştir, bu deneylerde, sürekli kayıtları endotel uyarıcı, P maddesi eklenmesinden önce ve sonra yapılmıştır. Her ROI içinde sinyalini ölçekleme için, taban deney süresi boyunca ROI yoğunluğunun doğrusal regresyonları (Şekil 4) olarak elde edilmiştir. Yani sinyal yoğunluğu değerleri her ROI (Şekil 4A) için hesaplanan ve ortalama yukarıdaki değerler trunc idi ortalamaya oluşturulacağı ve bir doğrusal regresyon sinyal temel (Şekil 4B) yaklaşık olarak uygulandı. Son olarak, ham yoğunluk değerleri taban (Şekil 4C) üzerinden katlı değişim değerleri dönüştürmek için regresyon çizgisinin değeri ile bölünmüştür. 5. endotelyum (Şekil 5A), Ca 2 + bağımlı floresans görüntüleri de dahil olmak üzere, temsili bir deney göstermektedir, SP tedavi öncesi ve sonrası ikili örneklenmiş alan (Şekil 5B) içinde tespit toplam Ca 2 + sinyali maskeler ve her ROI (Şekil 5C) ortalama floresan kayıtları birikir. Daha sonraki parametre analizi R yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Oluşan histogramlar olay genlik, süre ve mekansal yayılması (Şekil 6) SP yükseltici etkisini göstermektedir.

560/51560fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 1.. Algoritma süreçlerinin Sinyal akış şemaları (bu rakam Francis ve ark izni ile elde edilmiştir.) 24. Görüntü işleme, olay işleme ve ilgi bölgesi (ROI) işleme: algoritma üç bölüme organize edildi. Görüntü dizileri akış zincirinin içine girdi, ve olay istatistik son çıktı olarak üretilir. Algoritması görüntü işleme (A) fonksiyonu bir standart normal dağılım ve İmageJ partikül analizi için z-skoru kullanarak, eşikleme ile en uygun elips listesine girdi görüntü dizisi dönüştürür. Olay işleme (B) zaman olay "siteler" içine elips yerleri düzenleyerek optimum ROI konumunu belirlemek için kullanılan bir sıralama altprogram. Sonra yoğunluk ölçümleri her ROI alınır demek, her olay ve site için istatistiksel parametreler ROI işlemi alt (C <hesaplanırNihai çıkış üretmek için)> / strong. BKGD, arka plan; AVG, ortalama. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Bir bilgisayar tarafından oluşturulan Gauss darbe kullanarak otomatik ROI edinimi ve sinyal tespiti Şekil 2. Gösterme (bu rakam Francis ve ark izni ile uyarlanmıştır.) 24. Tek bir bilgisayar tarafından oluşturulan sinyal darbe (A) rastgele arka plan gürültü içinde gömülü idi. Gri skala görüntü dizisi statik bir arka plan piksel değerleri (B) çıkarmak için süzüldü ve P eşik piksel yoğunluk değerlerini kullanarak ikili dönüştürüldü <standart puanı (C) tarafından hesaplanan 0.05. ImageJ partikül analizi AlgoritmaMS daha sonra her bir çerçeve içinde piksel mahallere en uygun üç nokta atamak için görüntü dizisine uygulanmıştır. Bir roman algoritma ayrık geçici "olaylar" olarak grup elips için kullanılan ve ortalama elips merkezine (D) göre her ROI için en uygun konumunu belirlemek oldu. Kullanıcı tanımlı yarıçaplı bir ROI sonra her pozisyonda (noktalı daire) yerleştirilir. Bir ROI içinde ortalama yoğunluk değerleri, her çerçeve için hesaplanmış ve bir lineer temel yaklaşımını kullanarak tartılır. Karşılık gelen bir ROI izleme (E) için standart puanın tanımlanan tepe genliği P yukarıda yerel maksimum <0.05 olarak belirlenmiştir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3,. Porci ne koroner arter diseksiyonu protokolü. Koroner arter (1. görüntü, noktalı daire) sol ön inen yaklaşık 0.5 mm çap x 8 mm uzunluk dalları çevreleyen myokardın disseke edildi. Gemi kesimleri adventisyal dokuyu çevreleyen kesilmiş ve küçük makas (2 resim) ile uzunlamasına kesilmiştir. Sonra, açılan damarlar ince tungsten teller (3 resim) kullanarak PDMS blok düz tuş edildi. Monte edilmiş damar parçaları, Fluo-4 Ca 2 + gösterge boyası yüklendi yıkandı ve daha sonra bir coverglass dipli bir görüntüleme odasına yerleştirildi. Görüntüler 20X büyütme toplandı (488 ex., 510 em.) Ters bir konfokal mikroskop kullanılarak saniyede 8.0 kare. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

0/51560fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 4. ROI şiddeti temel bir yaklaşım anlamına gelir. Her ROI için zaman ölçümleri (düz çizgiler) göre ortalama yoğunluğu takiben, ham yoğunluk değerleri aşağıdaki temel yaklaşım metodu kullanılarak F/F0 ölçeklenir. Kontrol süresi boyunca ortalama sinyal yoğunluğu (kesik çizgi) kullanıcı tanımlı kontrol ve tedavi aralık değeri (A) hesaplanır. Zamana bağlı sinyal yoğunluğu eğrisi uyumu ikinci taban aktivitesi filtre kontrol ortalama yoğunluğu ortalama kontrol yoğunluğu üzerinde kesilir ve bir lineer regresyon edilen eğrisi (noktalı çizgiler) (B) üzerinde gerçekleştirilir. Son olarak, ham yoğunluk değerleri hesaplanan doğrusal taban (C) tartılır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.


Şekil 5. Temsilcisi bazal LC_Pro analizi sonuçları ve Ca 2 + dinamiklerini uyarılan. Bir madde P-uyarılmış örnekleme aralığı (A, sağ panel ardından bazal örnekleme aralığı (A, sol panel) bir giriş görüntü sırası Zaman atlamalı görüntüleri ) gri tonlarında gösterilmiştir. Zaman atlamalı görüntü bazal için en uygun elips dizileri ve aralıkları (B) LC_pro tarafından işlenip edildi uyarılır. Son olarak, ilgi alanları (ROI) her otomatik olarak konumlandırılmış bölgeden zamana bağımlı ölçekli yoğunluk eğrileri (C) gösterilmektedir.

Şekil 6,
Şekil 6. Histogramstemsili bir deney parametre dağılımlarının (Şekil 4). Tepe genlik parametreleri (F/F0) den histogramlar, ½ max (sn) süresi ve maksimum mekansal hem de kontrol için spread (mikron 2) (sol sütun) ve Madde P-uyarılmış temsili bir deney (sağ sütun) olaylardı grafiksel LC_pro gelen çıkış işlemek için R kullanılarak işlenir. Özellikle, madde P stimülasyon olayların sayısını genişletti ve Mann-Whitney U testi (p <0.01) ile ortanca genlik ve süresi önemli bir sağa kaymaya neden oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücresel ve çok hücreli düzeyde karmaşık Ca 2 + sinyalleri çözme titiz deneysel ve analitik yaklaşımlar gerektirir. Burada, bir yaklaşım Ca 2 + bağımlı floresans çözülmesi konfokal resim dizileri sunulan spesifik durumda sağlam hücre alanları içinde istatistiksel olarak ilgili Ca 2 + sinyalleri tespit eder ve miktarını belirler otomatik analizine tabi tutulur ve bu süre de açıklanan, bir arter kademeli bir izole edildi domuz kalbinden, tutturulmuş konfokal görüntüleme tabi Ca 2 + göstergesi Flu-04:00 ile yüklü endoteli, ortaya çıkarmak için açılan ve özel algoritması LC_Pro ile değerlendirildi. Bu algoritma 1 için tasarlanmıştır) algılar ve dinamik Ca pist siteleri 2 + <0.01) gürültü, 2) aktif bölge merkezlerinde otomatik) (ROI ilgi bölgeleri tanımlamak, ve 3) ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları analiz istatistiksel (p yukarıda değiştirmek Belirli olay parametreleri belirlemek için. Yaklaşım, kullanıcı hatası ve önyargı önemli ölçüde azaltarak çevrimdışı analiz süresini azaltmak ve temsili profilleri veya desenleri ayırt için bir alan üzerinde sinyallerin tam bir dizinini sağlayarak biyolojik sinyal araştırmanın önemli sınırlamalar üstesinden gelir. LC_Pro Çıktı ayrıca yüksek kaliteli grafik çıkışı dahil olmak üzere bireysel deneyler için tam parametre raporlar sağlayan, R komut ile işlenir.

Çeşitli adımlar tanımlanan teknik uygun performansı için önemlidir. Doku diseksiyonu prosedürü (adım 1.1.1) denüdasyonu veya endotel hücre tabakasının zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Ayrıca, görüntü dizileri düzgün çalışması için faiz algoritma otomatik bölge için uygun formatta (adım 2.1) olmalıdır. Dosya ile ilgili ölçek bilgi varsa Örneğin, ilgi bölgeleri yanlış ziyade ölçekli birim yerlerde daha, piksel yerle göre alınacaktır. Ayrıca, uygun bir yeniden seçimiİlgi çaplı gion doğru bir görüntü dizisi içinde floresan faaliyet otomatik analiz yapmak için çok önemlidir. Çok büyük bir çapa ince sinyalleri hariç neden olur ise çok küçük bir çap değeri, gereksiz ölçümlerine neden olabilir.

Bu tekniğin potansiyel tuzaklar öncelikle kaydedilen görüntü dizileri vardiya xy ve yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlara neden olabilir ki, doygunluk ve / veya ağartma sinyal otomatik analiz hassasiyeti ile ilgilidir. Boyutlu sürükleniyor ya da vardiya yığın kayıt yazılımı ve tedirginlikler tanıtıldı aralıklarla doğru amaçlı kullanılmasıyla doğrudan ele alınabilir. Gri seviyesi ve ROI çapı parametreleri de ham veri setleri standardize etmek amacıyla veri toplama bölgesinin önceden belirli bir preparasyon için optimize edilebilir.

Herhangi bir dinamik floresan sinyali için standart bir yaklaşım olarak görür, çünkü, analiz h tarifere bir uygulama çeşitli vücut için uygundur. Damar olarak, bu yöntem, bazal altında birden fazla vasküler yatak karakteristik fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yöntemleri tanımlamak için kullanılır ve koşulları 25,26 stimüle edilmektedir. Ayrıca, Ca 2 + dalgaların otomatik izleme uygulanmaktadır. Sonuçta, bu tür küresel otomatik analizi ve mekansal karmaşık biyo-sinyalleri deşifre ve yeni hücre ve çoklu hücre modellerinin kurulmasında önemli bir temel taşı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen Sağlık Hibeler HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 ve MOP-93.676.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12, (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5, (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31, (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49, (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5, (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113, (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44, (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451, (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127, (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63, (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34, (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90, (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76, (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293, (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303, (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20, (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19, (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, (2), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics