Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Hier een nieuwe regio van belang analyse protocol gebaseerd op het sorteren van best-fit ellipsen toegewezen aan regio's positief signaal binnen twee-dimensionale time beeld lapse sequenties wordt aangetoond. Dit algoritme kan onderzoekers in staat te stellen volledig kunnen onderzoeken fysiologische Ca 2 +-signalen met een minimale input van de gebruiker en vooringenomenheid.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intracellulaire Ca2 + signalen worden vaak bestudeerd fluorescente Ca2 + indicator kleurstoffen en microscopische technieken. Echter, kwantitatieve analyse van Ca 2 + beeldgegevens is tijdrovend en onder voorspanning. Geautomatiseerde signaalanalyse algoritmes gebaseerd op de regio van belang (ROI) detectie is geïmplementeerd voor een-dimensionale lijn scan metingen, maar er is geen stroom algoritme dat geoptimaliseerd identificatie en analyse van ROI in twee-dimensionaal beeld sequenties integreert. Hier een algoritme voor snelle acquisitie en analyse van ROI in beeld sequenties wordt beschreven. Het maakt gebruik van ellipsen passen aan lawaai gefilterde signalen om een optimale ROI plaatsing bepalen en berekent Ca 2 +-signaal parameters van amplitude, duur en ruimtelijke spreiding. Dit algoritme werd geïmplementeerd als een vrij beschikbare plugin voor ImageJ (NIH) software. Samen met analyse scripts geschreven voor de open source statistische verwerking software R,Deze aanpak zorgt voor een hoge capaciteit pijpleiding voor het uitvoeren van snelle statistische analyse van de output. De auteurs suggereren dat het gebruik van deze analyse protocol leidt tot een meer volledige en onpartijdige karakterisering van fysiologische Ca2 +-signalen.

Introduction

Ca 2 + is een alomtegenwoordige tweede boodschapper signalering molecuul en cytosolische Ca 2 + niveaus zijn sterk gereguleerd. Intracellulaire Ca 2 +-signalen zijn complex en omvatten geïsoleerde transiënten, trillingen en golven propageren 1-4. Ruimtelijke en tijdelijke besturing van Ca2 + wordt gedacht fysiologische signaal specificiteit ten grondslag liggen, en derhalve de analyse van Ca2 + signaal patronen van groot belang voor onderzoekers in meerdere velden 5.

Ca 2 +-indicator kleurstoffen zoals Fluo-4 en Fura-2 worden gewoonlijk gebruikt om intracellulaire Ca2 +-signalen meten met fluorescentiemicroscopie 5-12. Meestal worden tijdelijke Ca 2 +-signalen geëvalueerd als tijdsafhankelijke veranderingen in de gemiddelde fluorescentie binnen een door de gebruiker gedefinieerde gebied of regio van belang (ROI) 5,6,13 - 16. Momenteel handmatige ROI-analyse is zowel tijdrovend en arbeidsintensief inSpannend, want het vereist dat gebruikers veel ROI's te identificeren en uit te voeren repetitieve berekeningen 17-19. Deze technieken kunnen ook onderhevig zijn aan aanzienlijke fouten van gebruikers, met inbegrip van de invoering van kunstmatige signaal modes en uitsluiting van lage amplitude of diffuse signalen 18,20.

Geautomatiseerde ROI detectie algoritmen eerder zijn uitgevoerd met verschillende statistische benaderingen optimale ROI plaatsing bepalen, maar over het algemeen beperkt tot de analyse van lijn scan of pseudo-line scans, die analyse beperkt tot een ruimtelijke dimensie tijd 17 19-22. Daarnaast hebben veel bestaande algoritmen niet toereikend zijn om de diversiteit van de Ca 2 + gebeurtenissen release die variëren van periodieke, gelokaliseerde transiënten op teeltmateriaal golven 23,24 omvatten. Uitgebreide evaluatie van fysiologische Ca 2 +-signalen wordt vaak verder gecompliceerd door de aanwezigheid van aanzienlijke image artifhandelen die verwart signaal om discriminatie ruis in veel experimentele systemen.

Voorheen, een geautomatiseerde ROI algoritme oplossing Ca2 + signaal transiëntdetectie, uitgevoerd als een plugin voor NIH ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD), werd ontwikkeld en gevalideerd 25,26. Dit algoritme, genaamd LC_Pro, werd ontworpen om ROI allesomvattende Ca 2 + transiënten signaal in twee-dimensionale time lapse beeld sequenties te identificeren en te analyseren. Hier een praktische experimentele protocol en representatieve demonstratie van een toepassing van het algoritme in varkens coronaire endotheel is voorzien, met extra postprocessing met behulp van de open source statistische verwerking software R bruikbare grafische output te genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vessel Dissection en Imaging

  1. Oogst weefsel van binnenlandse juveniele varkens zoals beschreven in Martens et al. 27. Plaats geoogst varkens rechterventrikel in een polydimethylsiloxaan (PDMS) bodem dissectie schotel met HEPES gebufferde fysiologische zoutoplossing (PSS).
    1. Met behulp van een stereomicroscoop, ontleden en verwijderen van een segment van de linker anterieure dalende kransslagader (~ 8 mm lengte, 0,5 mm diameter) van omringende weefsel met behulp van een tang en veer schaar door het verwijderen van het segment vaartuig het omringende hartweefsel lagen. OPMERKING: Zorg ervoor dat de vaatwand niet doorboren.
    2. Plaats een PDMS blok (1 x 0,5 x 0,5 cm) in de dissectie schaal, en gebruik een naald om het vastmaken aan de bodem. Snij een ongeveer 40 micrometer diameter wolfraam draad in twaalf ~ 0,3 cm lengte segmenten, vormen micropins, en plaats deze in de schotel. Behulp van een tang, veilig ene uiteinde van het segment vaartuig naar het blok met een micropin.
    3. Steek kleine lente een schaar in het lumen van het vat, en snijd lengterichting langs een kant van het schip om het volledig te openen. Richt het geopende vat segment met de endotheel omhoog.
    4. Gebruik de resterende micropins de randen van de geopende bloedvatsegment veilig blokkeren zodat het vaartuig vormt een vlakke rechthoek. OPMERKING: Micropin toppen moeten worden gebogen tot 90 ° en ingebracht tot gelijk met het blok oppervlak. Zorg moeten worden genomen om de voorbereiding vat uitrekken zonder overstrekken; uiteindelijke breedte moet worden ~ 1,5 x het starten zonder rek breedte.
    5. Bereid een klein volume (~ 1 ml) van TL 04:00 beladingsoplossing door mengen Fluo-4 AM (10 uM) opgelost in DMSO met pluronic (0,03%) in een HEPES gebufferde PSS (die in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glucose) en plaats het gehele blok in de laad oplossing gedurende ongeveer 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    6. Na het laden, was het blok in HEPES gebufferdPSS gedurende 5-10 minuten.
    7. Monteer het blok op 50-100 um dikke afstandhouders in een dekglaasje onderste kamer met HEPES gebufferd PSS. OPMERKING: Metalen kunnen worden gebruikt als afstandhouders en waarborgen het segment schip naar beneden en de afstandhouders niet raken.
    8. Plaats de ruimte op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust voor confocale beeldvorming en focus op de endotheliale cellaag.
    9. Capture time beeld lapse sequenties van basale relatieve fluorescentie voor ~ 3 min bij 20x vergroting en een beeldsnelheid van ~ 8 beelden per seconde met behulp van beeld confocale sequence acquisitie software.
    10. Na ca. 3 min. opnametijd basale fluorescentie vervangen HEPES gebufferde PSS oplossing met hetzelfde volume (~ 1 ml) van Substantie P (100 pM) opgelost in HEPES gebufferd PSS, en opnemen van een additionele 3 minuten.

2. Geautomatiseerde analyse

  1. Render afbeelding sequentie (s) van fluorescente calcium activiteit van confocale acquisitie software als 8 bit, grayscale '. tif'-bestanden zonder schaal informatie.
  2. Open ImageJ, klikt u op 'open' in het menu Bestand, en selecteer de juiste reeks beelden in de verkenner om het beeld sequentie (s) in ImageJ bekijken.
  3. Bepaal een geschikte ROI diameter met het rechthoekige ROI gereedschap te schatten de bovenste en onderste grenzen van de ruimtelijke spreiding van activiteit in het beeld sequentie (s). OPMERKING: De gemiddelde rechthoekige doorsnede is een geschikte keuze voor ROI diameter.
  4. Maak een nieuwe map op de harde schijf, en voeg het beeld sequentie (s) in de map directory.
  5. In ImageJ, klikt het venster 'plugins', klik op 'LC_Pro' om de analyse te starten.
  6. Voer de waarde diameter ROI en selecteer het filter drempelwaarde (ofwel 0,05 of 0,01).
  7. Klik op het selectievakje 'medicamenteuze behandeling' en voer het tijdstip waarden onmiddellijk vóór en na de drug werd toegevoegd (in seconden).
  8. Klik op 'ok', envoer de beeldsequentie directory in de file explorer venster.

3. Grafische uitvoer

  1. Download R versie 3.0.2 van http://www.r-project.org/ .
  2. Open de 32 bits versie van R.
  3. Klik op "bestand", vervolgens 'open script' en selecteer de 'traceplot.R' R-script voor het genereren van grafische experimentele rapporten.
  4. Installeer het kalibreren, en gplots pakketten door 'pakketten', 'install packages', en het selecteren van de dienstige pakketten.
  5. Klik op 'file' en dan 'change directory' commando, en gebruik de Explorer-venster naar de map die overeenkomt met de LC_Pro analyse uitvoer te selecteren.
  6. Klik op het script-venster en vervolgens de 'run all' commando om het script uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een aangepaste algoritme, LC_Pro, werd ontwikkeld en geïmplementeerd om geautomatiseerde analyse van Ca 2 + uitvoeren dynamiek op confocale afbeelding sequenties. Zoals weergegeven in figuur 1, het algoritme gebruikt sequentiële procesmodules A) detecteren en volgen plaatsen dynamische Ca2 + wijzigen hierboven statistisch (p <0.01) ruis, B) definiëren gebieden van belang (ROI) automatisch actieve plaats centra en C) bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten ROI specifieke gebeurtenis parameters bepalen. Een grafisch overzicht van het algoritme wordt weergegeven middels computer gegenereerde Gaussische pulsen van bekende intensiteit en plaats (figuur 2). Signaalpulsen (figuren 2A en B) werden omgezet naar binair met de z-score voor een standaard-normale verdeling, en best-fit ellipsen werden toegewezen aan pixel loci bovenstaande signaal drempel (figuur 2C). Een ellips sorteer-algoritme werd gebruikt om bepalingne optimale ROI plaatsing (figuur 2D). ROI gemiddelde intensiteit versus tijd werd vervolgens gemeten en signaalparameters van amplitude, duur en ruimtelijke spreiding werd berekend (figuur 2E). Deze analyse benadering werd toegepast om cellulaire Ca2 + dynamiek beoordelen intact vasculair endotheel. Specifiek werd confocale beeldvorming uitgevoerd in geopende varkens kransslagaders zoals beschreven in figuur 3, en het algoritme offline gebruikt om verschillende Ca2 + parameters kwantificeren. Voor deze experimenten werden continu opnamen voor en na toevoeging van de endotheliale stimulus, substance P (SP, 100 pM) en LC_Pro analyse werd vervolgens uitgevoerd. Voor het schalen signaal binnen elke ROI, werden basislijnen afgeleid als lineaire regressies van ROI intensiteit in de experimentele tijdsverloop (figuur 4). Gemiddelde intensiteit van het signaal waarden werden berekend voor elke ROI (Figuur 4A), en waarden boven het gemiddelde waren trunc ated het gemiddelde en een lineaire regressie uitgevoerd om signaal basislijn (Figuur 4B) benaderen. Tenslotte werden ruw intensiteitswaarden gedeeld door de waarde van de regressielijn voor waarden om verandering omgeslagen basislijn (Figuur 4C). Figuur 5 toont een representatief experiment, waaronder afbeeldingen van Ca2 +-afhankelijke fluorescentie in het endotheel (figuur 5A), accumuleren binaire maskers totaal Ca2 + gedetecteerd binnen het bemonsterde gebied (figuur 5B) en opnamen gemiddelde fluorescentie bij elke ROI (figuur 5C) voor en na SP behandeling. Daaropvolgende parameter analyse werd uitgevoerd met R software. Resulterende histogrammen tonen het versterkend effect van SP op evenement amplitude, duur en ruimtelijke spreiding (Figuur 6).

560/51560fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. Signaal stroomdiagrammen van algoritme processen (dit cijfer is verkregen met toestemming van Francis et al..) 24. Het algoritme werd georganiseerd in drie secties: Beeldbewerking, event processing en regio van belang (ROI) verwerking. Afbeelding sequenties zijn inbreng in de stroom-keten, en event statistieken worden gegenereerd als uiteindelijke uitvoer. De beeldverwerking (A) subroutine van het algoritme zet de ingang beeldsequentie in een lijst van best-fit ellipsen door drempelwaarden, met behulp van de z-score voor een standaard normale verdeling en ImageJ analyse van deeltjes. Event processing (B) is een sorteer subroutine gebruikt om optimale ROI positie te bepalen door het organiseren van ellips locaties in event "sites" door de tijd. Na gemiddelde intensiteit metingen worden verricht op elk ROI, zijn statistische parameters voor elk evenement en de site berekend door de ROI verwerking subroutine (C </ Strong>) om de uiteindelijke output te genereren. BKGD, achtergrond; AVG, gemiddeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Demonstratie van geautomatiseerde ROI acquisitie en signaal detectie met behulp van een door de computer gegenereerde Gaussische puls (dit cijfer werd aangepast met toestemming van Francis et al..) 24. Een computer-gegenereerde puls (A) is ingebed in willekeurige ruis. De grijsschaal beeld sequentie werd gefiltreerd om vaste achtergrond pixelwaarden (B) te verwijderen en omgezet in binaire middels drempel pixelintensiteitswaarden P <0,05 berekend door de standaard score (C). ImageJ analyse van deeltjes algorithms werden vervolgens toegepast op de afbeelding sequentie best-fit ellipsen binnen elk frame toewijzen aan pixel loci. Een nieuw algoritme werd gebruikt voor het groeperen ellipsen in discrete tijd "events" en bepaal de optimale positie voor elk ROI gebaseerd op de gemiddelde ellips (D). Een ROI van de gebruiker bepaalde straal wordt dan geplaatst op elke positie (gestippelde cirkel). Gemiddelde intensiteitswaarden binnen een ROI berekend voor elk frame en geschaald met behulp van een lineaire basislijn benadering. Piekamplitude is geïdentificeerd als lokale maxima boven P <0,05, zoals gedefinieerd door de standaard score voor een bijbehorende ROI tracing (E). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Porci ne coronaire dissectie protocol. Ongeveer 0,5 diameter mm x 8 mm lengte takken van de linker voorste dalende kransslagader (1 image, gestippelde cirkel) werden uitgesneden uit de omliggende myocard. Vaartuig segmenten werden ontdaan van omliggende adventitia weefsel en snijd in de lengte met een klein schaartje (2e afbeelding). Vervolgens werden de vaten geopend vlak tot een PDMS blok met behulp van fijne wolfraam draden (3 image) opgespeld. Gemonteerde segmenten schip werden geladen met Fluo-4 Ca 2 +-indicator kleurstof, gewassen, en vervolgens geplaatst in een dekglaasje bodem beeldvorming kamer. Beelden werden verzameld op een vergroting van 20x (488 ex., 510 em.) Op 8,0 frames per seconde met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

0/51560fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 4. ROI gemiddelde intensiteit basislijn benadering. Na gemiddelde intensiteit tegen tijd metingen (getrokken lijnen) voor elke ROI, worden de onbewerkte intensiteitswaarden geschaald F/F0 met de volgende minimum benaderingsmethode. De gemiddelde signaalintensiteit (stippellijn) in de controleperiode wordt berekend door de gebruiker gedefinieerde controlegroep en intervalwaarden (A). De tijdafhankelijke signaalintensiteit curve wordt vervolgens afgekapt boven het gemiddelde bestuurintensiteit de gemiddelde bestuurintensiteit activiteit filteren van basislijn benadering, en een lineaire regressie uitgevoerd op de resulterende curve (stippellijnen) (B). Ten slotte worden de rauwe intensiteit waarden geschaald naar de berekende lineaire basislijn (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.


Figuur 5. Representatieve resultaten van LC_Pro analyse van de basale als de gestimuleerde Ca 2 + dynamiek. Time lapse beelden van een afbeelding invoeren sequentie van een basale interval (A, linker paneel), gevolgd door een substantie-P gestimuleerde sampling interval (A, rechter paneel ) zijn weergegeven in grijstinten. Time lapse beeld sequenties van beste pasvorm ellipsen voor basale als de gestimuleerde intervallen (B) werden gemaakt door LC_pro. Tenslotte tijdsafhankelijke intensiteit geschaald krommen van elkaar automatisch gepositioneerd gebied van belang (ROI) getoond (C).

Figuur 6
Figuur 6. Histogramsvan parameter uitkeringen uit een representatief experiment (Figuur 4). Histogrammen van parameters van piek amplitude (F/F0), duur ½ max (s) en maximale ruimtelijke spreiding (um 2) voor zowel de controle (linker kolom) en Substantie-P gestimuleerde (rechterkant) gebeurtenissen uit een representatief experiment waren weergegeven met behulp van R grafisch verwerken van de output van LC_pro. Met name Substance P stimulatie breidde het aantal evenementen, en veroorzaakte een aanzienlijke verschuiving naar rechts in de mediane amplitude en duur van Mann-Whitney U-test (p <0,01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Decoderen van complexe Ca 2 +-signalen op cellulair en meercellige niveau strenge experimentele en analytische benaderingen vereisen. Hier wordt een aanpak beschreven waarin tijdsopgeloste beeld confocale sequenties van Ca2 +-afhankelijke fluorescentie worden onderworpen aan een geautomatiseerde analyse die statistisch relevante Ca2 + signalen in intacte cellulaire domeinen In het specifieke geval gepresenteerd identificeert en kwantificeert, een slagader segment geïsoleerd van varken hart, gespeld opende aan het endotheel, geladen met de Ca 2 +-indicator Fluo-04:00, onderworpen aan confocale beeldvorming bloot te leggen, en geëvalueerd met de aangepaste algoritme LC_Pro. Dit algoritme is bedoeld om 1) detecteren en spoor plaatsen dynamische Ca2 + wijzigen hierboven statistisch (p <0.01) ruis, 2) definiëren gebieden van belang (ROI) automatisch actieve plaats centra, en 3) analyse gemiddelde fluorescentie-intensiteiten ROI specifieke gebeurtenis parameters bepalen. De aanpakoverwint belangrijkste beperkingen van biologische signalering onderzoek door het verminderen van gebruikersfouten en bias, offline analyse tijd sterk verminderen, en het verstrekken van een volledige index van signalen over een veld om representatieve profielen of patronen te onderscheiden. Output van LC_Pro wordt verder verwerkt door R scripts, het verstrekken van volledige parameter rapporten voor individuele experimenten, met inbegrip van hoge kwaliteit grafische output.

Verschillende stappen zijn belangrijk voor een goede uitvoering van de beschreven techniek. Het weefsel dissectie procedure (stap 1.1.1) moet zorgvuldig worden uitgevoerd om erosie of beschadiging van de endotheliale cellaag voorkomen. Daarnaast moet imago sequenties in het juiste formaat (stap 2.1) zijn voor de geautomatiseerde regio van belang algoritme te kunnen werken. Bijvoorbeeld, als er schaal behorende bij het dossier gebieden plaats wordt verkeerd geplaatst volgens de beeldpuntplaatsen in plaats van de schaal eenheidsposities. Ook kiezen van een geschikte reGion van belang diameter is van cruciaal belang te kunnen uitvoeren van geautomatiseerde analyse van de tl-activiteit binnen een sequentie van beelden. Een te kleine waarde diameter kan leiden tot redundante metingen, terwijl een te grote diameter leidt tot uitsluiting van subtiele signalen.

Potentiële valkuilen van deze techniek voornamelijk betrekking op de gevoeligheid van de automatische analyse verschuivingen opgenomen beeldsequenties xy en verzadiging en / of blekende signaal, wat kan leiden tot vals positieve en vals negatieve resultaten. Dimensionale drifts of verschuivingen kunnen direct worden aangepakt door het gebruik van de stack registratie software en nauwkeurige aanduiding van intervallen waar verstoringen worden geïntroduceerd. Grijswaarden en parameters diameter ROI kan ook worden geoptimaliseerd voor een bepaalde voorbereiding vooraf verzameling gegevens om ruwe data sets te standaardiseren.

Omdat het dient als een standaardbenadering voor dynamische fluorescentiesignaal de analyse beschreven here is geschikt voor diverse toepassingen lichaam. In het vaatstelsel, wordt deze methode wordt gebruikt om karakteristieke fysiologische en pathofysiologische signaal modaliteiten in meerdere vaatbedden onder basale definiëren en gestimuleerd voorwaarden 25,26. Het wordt ook toegepast in de automatische volgen van Ca2 + golven. Uiteindelijk zal een dergelijke wereldwijde geautomatiseerde analyse een cruciale spil in het ontcijferen van ruimte en tijd complexe bio-signalen en bij het vaststellen van nieuwe cel-en multi-cell modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 en MOP-93676.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12, (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5, (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31, (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49, (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5, (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113, (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44, (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451, (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127, (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63, (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34, (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90, (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76, (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293, (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303, (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20, (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19, (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, (2), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics