في الكشف الموضعي للخلايا CD4 T Autoreactive في الدماغ والقلب عن طريق التوافق النسيجي الرئيسية الدرجة الثانية مجمع Dextramers

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

وقد وصفت البروتوكول للكشف عن خلايا CD4 T الذاتية التفاعل في الدماغ والقلب عن طريق تلطيخ المباشر مع كبرى التوافق النسيجي المعقدة الدرجة الثانية dextramers في هذا التقرير. لتحليل شامل، وابتكر أيضا طريقة يمكن الاعتماد عليها لتعداد ترددات خلايا CD4 + T مستضد محددة في الموقع.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

استخدام مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الدرجة الثانية tetramers للكشف عن خلايا CD4 T مستضد محددة قد يشكل تحديا 1-7. لتعزيز حساسية الكشف عن MHC الدرجة الثانية tetramers، أنشأت فريق البحث tetramers الجيل المقبل، المعين "dextramers" 8. Dextramers يحتوي العمود الفقرى ديكستران التي يتم مترافق متعددة الأنصاف-streptavidin fluorophore، بحيث يمكن تركيبها العديد من الببتيد المربوطة، مونومرات MHC البيروكسيديز إلى واحد جزيء ديكستران 9. وبالتالي، يمكن المجاميع الكبيرة من dextramers MHC التي تحتوي على العديد من المجمعات MHC-الببتيد التفاعل مع عدة مستقبلات الخلايا التائية (TCRS).

هذه المجموعة تم إنشاؤها مؤخرا dextramers لمختلف المستضدات الذاتية وأثبتت أن حساسية الكشف عن dextramers كان ما يقرب من خمسة أضعاف أكثر من tetramers 8. تشمل النظم التجريبية التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE) التي يسببها مع بروتين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي) 139-151 في الفئران SJL؛ EAE التي يسببها مع بروتين سكري المايلين دبقية قليلة التغصن (موج) 35-55 في C57BL / 6 الفئران؛ والتهاب عضلة القلب المناعة الذاتية التجريبية (EAM) التي يسببها مع ميوسين الثقيلة القلب سلسلة α (Myhc) 334-352 في الفئران A / J. وتوضح هذه الدراسة استخدام حزب العمال التقدمي 139-151 - 334-352 وMyhc dextramers للكشف عن خلايا CD4 T مستضد محددة في الموقع مع خصوصية من خلال تطوير بروتوكول تلطيخ المباشر، وبالتالي القضاء على الحاجة لتضخيم الإشارات من استخدام الأجسام المضادة fluorophore، و نهج استخداما مع استخدام tetramers. بالإضافة إلى ذلك، كما تم وضع طريقة شاملة لتقييم الأنسجة تعداد موثوق ترددات CD4 T خلايا مستضد محددة في الموقع 10. الكشف عن خلايا T مستضد محددة في الموقع يسمح ترسيم الأحداث الناجمة عن المنبهات الأنتيجين محددة من تلك التي تسببها تفعيل المارة. وبالمثل، فإن تقنية في الوضع الطبيعي يقوم بتقديم أيضافرص وفاق لتتبع حركية تسلل الخلايا التائية مستضد محددة في الأجهزة المستهدفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق:

وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها جامعة نبراسكا لنكولن، لينكولن، NE.

1. تحريض EAE

  1. للحث على EAE، وإعداد الببتيد / مساند فرويند الكامل (CFA) مستحلب كما هو موضح في 11 مع إجراء التعديلات التالية: الخطوة 1.1: إعداد حزب العمال التقدمي 139-151 بتركيز 1 ملغ / مل في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) الخطوة 1.4: استخدام 200 ميكرولتر من CFA مستحلب تحتوي على 100 ​​ميكروغرام من حزب العمال التقدمي 139-151 لكل حيوان الخطوة 1.4.1: لتحصين الحيوانات عشر، وإعداد 2 مل من مستحلب عن طريق خلط 1 مل من حزب العمال التقدمي 139-151 (1 ملغ / مل في 1X . PBS) وحجم مساو من CFA الخطوة 1.5: ضخ 200 ميكرولتر من مستحلب في جرعات الانقسام تحت الجلد في المنطقتين الأربية (~ 75 ميكرولتر لكل منهما) والمنطقة القصية (~ 50 ميكرولتر) من العمر خمسة إلى ستة أسابيع الاناثلو الفئران SJL / J. الخطوات 1.7 و 1.8 غير قابلة للتطبيق لتحريض EAE.

2. التهديف السريرية من الفئران EAE وحصاد المخ

  1. مراقبة الحيوانات لظهور علامات سريرية، ويسجل مرض شدة يوميا من يوم 9 postimmunization على النحو التالي: 0 - صحية؛ 1 - يعرج الذيل أو الخلفيتين ضعف أطرافهم ولكن ليس على حد سواء؛ 2 - يعرج الذيل والخلفيتين ضعف أطرافهم؛ 3 - الشلل الجزئي من أطرافه الخلفية؛ 4 - الشلل التام من الأطراف الخلفية؛ 5 - المحتضرة أو الميتة 12.
  2. الموت ببطء الفئران عندما تصل درجة العصبية من 3 أو 4 باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2. إلى الموت ببطء الفئران، قبل ملء الغرفة الأولى مع القتل الرحيم CO 2 عن طريق تحويل منظم من خزان CO 2 لا تتجاوز 6 رطل ويسمح الحيوانات على البقاء داخل غرفة لحوالي 5 دقائق لتحقيق الاختناق كاملة. نقع الحيوانات الموت الرحيم في 70٪ كحول. على الفور، ووضع الحيوانات على وسادة ماصة وباستخدام زوج من معقمة لالفطر الابيض ومقص فضح القلوب من خلال قطع التجويف الصدري. ثقب الأذين الأيمن ويروي عن طريق حقن 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X الباردة إلى البطينين الأيسر من القلوب.
  3. حفر الجمجمة قنصا الجمجمة بطريقة دائرية باستخدام زوج من مقص منحني، وبعناية، والوجه عظام الجمجمة مع ملقط. حصاد الدماغ عن طريق فظة تشريح وباستخدام مشرط نظيفة، منفصل عن المخ المخيخ. وضع المخ في أنبوب يحتوي الباردة برنامج تلفزيوني 1X وترك الأنبوب على الجليد حتى المعالجة.

3. في الموقع تلون أقسام الدماغي مع MHC من الدرجة الثانية (IA ق) / حزب العمال التقدمي 139-151 Dextramers

  1. إعداد 4٪ PBS مخزنة منخفضة ذوبان الاغاروز، تذوب عن طريق التسخين عند 50 درجة مئوية، وترك الأمر في 40 ° C حمام الماء حتى الاستخدام.
  2. وضع المخ في قالب قاعدة المتاح العميق الأنسجة كاسيت أبقى على الجليد، وتصب المنصهر (40 ° C) الاغاروز. على الفور، اضغط بلطف المخمع ملقط لغمر الأنسجة. ترك الكاسيت على الجليد لمدة 15-20 دقيقة حتى هو ترسيخ كاملة.
  3. ملء حوض الاستحمام مع vibratome المبردة برنامج تلفزيوني 1X. ملء الفضاء حول vibratome حمام مع مكعبات الثلج للحفاظ على درجة حرارة PBS بين 0 و 2 ° C. إصلاح شفرة حلاقة نظيفة في vibratome وتعيين زاوية نصل إلى 15 درجة.
  4. وضع الأنسجة في vibratome. تقليم الاغاروز الزائدة من جميع الجوانب من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من وفضح قليلا من السطح البطني للمخ.
    1. تشويه vibratome كتلة الأنسجة مع الغراء عظمى ونقل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز على سطح صقها عن طريق وضع السطح البطني المكشوفة من المخ خلال الغراء لباجتزاء عرضية. لا تحريك الأنسجة، وبمجرد أن يتم تعيين أكثر من كتلة الأنسجة.
    2. وضع كتلة vibratome التي تحتوي على الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز على الجليد، والسماح للالغراء لتجف لمدة 15 دقيقة.
  5. في غضون ذلك، وضع شام الأنسجةBERS واحد لكل بئر من 24 لوحة جيدا. ملء الآبار التي تحتوي على غرف الأنسجة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X الباردة، وترك لوحة على الجليد.
    1. إعداد غرف الأنسجة عن طريق ربط شبكة النايلون رقيقة إلى نهاية قطع من ماصة 25 مل البولي بروبلين باستخدام الغراء عظمى؛ بعد تقليم شبكة الزائدة حول ماصة، وقطع ماصة إلى طول 1 سم من شبكة.
  6. خفض شفرة vibratome إلى مستوى السطح العلوي من الأنسجة؛ تعيين سرعة vibratome إلى 0.22 ملم / ثانية وبدء باجتزاء مع حركة إلى الأمام لجعل 200 ميكرون أبواب سميكة. نقل القسم الدماغي واحدة لكل جيدا باستخدام فرشاة الألوان المائية لينة في غرف الأنسجة وضعت داخل الآبار من 24 لوحة جيدا. الحفاظ على لوحة على الجليد حتى باجتزاء اكتمال لمنع تدهور الأنسجة. ملاحظة: اتبع الخطوات التالية للحصول على في المجموع، ثلاثة أقسام تقرن من ثلاث مناطق مختلفة من الدماغ الظهرية إلى السطح البطني (الشكل 2). مقطع واحد منيتم تعيين كل زوج (في مجموع الأجزاء الثلاثة) وضعت في ثلاث دوائر الأنسجة الفردية لتلطيخ مع dextramers محددة (IA ق / حزب العمال التقدمي 139-151) ومكافحة CD4. وبالمثل، يتم تعيين مجموعة أخرى من ثلاثة أقسام التي يتم وضعها في ثلاث دوائر فردية الأنسجة لتلطيخ مع dextramers التحكم (IA ق / TMEV 70-86) ومكافحة CD4.
  7. نقل ثلاثة غرف الأنسجة التي تحتوي على أقسام مخصصة لتلطيخ مع dextramers محددة في ثلاثة آبار في 24 لوحة جيدا مع غرفة واحدة لكل بئر فيها، 300 ميكرولتر من مزيج يحتوي على allophycocyanin (APC)، مترافق حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers (2.5 ميكروغرام / مل)، ومكافحة CD4-فيكوإيريترين (PE؛ تم إضافة 5 ميكروغرام / مل) في عرقلة الحل (برنامج تلفزيوني 1X مع 2٪ مصل الماعز العادي) سابقا. تغطية الآبار مع غطاء.
  8. وبالمثل، ونقل ثلاثة غرف الأنسجة التي تحتوي على أقسام مخصصة لتلطيخ مع dextramers التحكم في ثلاثة آبار في 24 لوحة جيدا مع غرفة واحدة في أنناليرة لبنانية الذي، تم إضافة 300 ميكرولتر من مزيج يحتوي على TMEV APC مترافق 70-86 dextramers (2.5 ميكروغرام / مل)، ومكافحة CD4-PE (5 ميكروغرام / مل) في عرقلة الحل سابقا. تغطية الآبار مع غطاء. ملاحظة: يرجى الرجوع إلى Massilamany آخرون، 8 لإعداد dextramers، وجزيئات ديكستران لإعداد وتقديم dextramers تفضلت Immudex، كوبنهاغن، الدنمارك.
  9. تسمية الآبار، والتفاف لوحة بورق الألمنيوم ووضع لوحة على منصة هزاز المقرر أن تناوب لطيف ل1.5 ساعة في الظلام في RT.
  10. بعد فترة الحضانة، وغسل أقسام الأنسجة على منصة هزاز، عن طريق تحويل غرف الأنسجة إلى الطازجة التي تحتوي على بئر 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X الباردة، وتجنب المراوغة محتويات بئر واحدة في الأخرى. تكرار الغسيل ثلاث مرات، والسماح لا يقل عن 10 دقيقة لكل غسل. تأكد من أن أقسام الأنسجة لا تحصل المجففة لأنها يمكن أن التمسك جانبي الغرفة.
  11. إصلاح الأجزاء عن طريق نقل الأنسجة شامBERS في بئر جديدة في 24 لوحة جيدا تحتوي على 1ml من تصفيتها بارافورمالدهيد 4٪ PBS مخزنة (الرقم الهيدروجيني 7.4) على منصة هزاز لمدة 2 ساعة مع تناوب لطيف.
  12. تكرار الغسيل ثلاث مرات كما هو موضح في الخطوة 3.10.
  13. وضع المقاطع الملون وثابتة على شريحة مجهرية نظيفة باستخدام فرشاة الألوان المائية لينة. مسح المياه الزائدة دون لمس الباب، وجبل المقطع باستخدام تصاعد المتوسط. تغطية مع ساترة المجهرية وتسمح الشرائح لتجف في RT O / N في غرفة مظلمة.
  14. تخزين الشرائح في صندوق تخزين الشريحة الضوء واقية من عند 4 درجات مئوية.

4. تحريض زير الشئون الخارجية وجمع القلوب

  1. حث وزير الشؤون الخارجية كما هو موضح في إشارة 11.
  2. الموت ببطء الفئران في يوم 21 postimmunization باستخدام غرفة نظيفة مزودة CO 2 اسطوانة غاز، ونقع الحيوانات في الكحول 70٪. على الفور، ووضع الحيوانات على وسادة ماصة وباستخدام زوج من ملقط ومقص كشف القلبق من خلال قطع التجويف الصدري. ثقب الأذين الأيمن ويروي عن طريق حقن 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X الباردة إلى البطينين الأيسر من القلوب. جمع قلوب ومكان في أنابيب تحتوي الباردة برنامج تلفزيوني 1X.

5. في الموقع تلون أقسام القلب مع MHC من الدرجة الثانية (IA ك) / 334-352 Myhc Dextramers

  1. إعداد 4٪ PBS مخزنة منخفضة ذوبان الاغاروز، تذوب عن طريق التسخين عند 50 درجة مئوية، وترك الأمر في 40   ° C حمام الماء حتى الاستخدام.
  2. وضع القلب في قالب قاعدة المتاح العميق الأنسجة كاسيت أبقى على الجليد، وتصب المنصهر 40 ° C الاغاروز حتى يتم المغمورة الأنسجة تماما كما هو موضح في الخطوة 3.2.
  3. اتبع الخطوة 3.3.
  4. تقليم الاغاروز الزائدة من جميع الجوانب من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من وفضح قليلا من قاعدة القلب. تشويه vibratome كتلة الأنسجة مع الغراء عظمى ونقل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز على سطح صقها عن طريق وضع السطح المعرض للالقلب على الغراء. لا تحريك الأنسجة، وبمجرد أن يتم تعيين أكثر من كتلة الأنسجة.
    1. وضع كتلة vibratome التي تحتوي على الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز على الجليد، والسماح للالغراء لتجف لمدة 15 دقيقة.
  5. اتبع الخطوات من 3.5 و 3.6.
  6. نقل أقسام القلب باستخدام فرشاة الألوان المائية لينة في غرف الأنسجة وضعت داخل الآبار من 24 لوحة جيدا. الحفاظ على لوحة على الجليد حتى باجتزاء اكتمال لمنع تدهور الأنسجة. ملاحظة: اتبع هذه الخطوات للحصول على ما مجموعه ثمانية أقسام تقرن من قمة إلى قاعدة القلب (الشكل 2). وضع جميع المقاطع في غرف الأنسجة، وتخصيص ما يصل إلى 3 أقسام في الغرفة. يتم تعيين مقطع واحد من كل زوج (في المجموع ثمانية أقسام) لتلطيخ مع dextramers محددة (IA ك / Myhc 334-352) ومكافحة CD4. وبالمثل، يتم تعيين مجموعة أخرى من ثمانية أقسام لتلطيخ مع dextramers التحكم (IA ك / ريبونوكلياز 43-56) ومكافحة CD4.
  7. نقلثلاث غرف الأنسجة التي تحتوي على أقسام مخصصة لتلطيخ مع dextramers محددة في ثلاثة آبار في 24 لوحة جيدا مع غرفة واحدة لكل بئر فيها، 300 ميكرولتر من مزيج يحتوي على APC مترافق Myhc 334-352 dextramers (2.5 ميكروغرام / مل) و وأضيف مكافحة CD4-PE (5 ميكروغرام / مل) في عرقلة الحل سابقا. تغطية الآبار مع غطاء.
    1. وبالمثل، ونقل ثلاثة غرف الأنسجة التي تحتوي على أقسام مخصصة لتلطيخ مع dextramers التحكم في ثلاثة آبار في 24 لوحة جيدا مع غرفة واحدة لكل بئر فيها، 300 ميكرولتر من مزيج يحتوي على ريبونوكلياز APC مترافق 43-56 dextramers (2.5 ميكروغرام وأضاف / مل)، ومكافحة CD4-PE (5 ميكروغرام / مل) في عرقلة الحل سابقا. تغطية الآبار مع غطاء.
  8. تسمية الآبار، والتفاف لوحة بورق الألمنيوم ووضع لوحة على منصة هزاز المقرر أن تناوب لطيف ل1.5 ساعة في الظلام في RT.
  9. اتبع الخطوات 3،10-3،11
  10. تكرار غسل عبتيالجليد كما هو موضح في الخطوة 3.10.
  11. وضع الملون والثابتة أقسام (تصل إلى ثلاثة أقسام / الشريحة) على شريحة مجهرية نظيفة باستخدام فرشاة الألوان المائية لينة. مسح المياه الزائدة دون لمس أقسام، وتحميل المقاطع باستخدام تصاعد المتوسط. تغطية مع ساترة المجهرية وتسمح الشرائح لتجف في RT O / N في غرفة مظلمة.
  12. تخزين الشرائح في صندوق تخزين الشريحة الضوء على واقية من 4 ° C.

6. تحليل Dextramer + (DEXT +) CD4 + T الخلايا بواسطة الليزر الضوئي متحد البؤر المجهر (LSCM) (المشتركة لكلا الدماغ والقلب أقسام)

  1. استخدام نيكون A1-90i الكسوف متحد البؤر المجهر نظام لمسح روتينية واقتناء الصور. لبدء اضغط مفتوحة، والبرمجيات شيكل عناصر AR (الإصدار 4.13).
    1. اختيار "TRITC" و "Cy5" قنوات من لوحة. موجات الإثارة / الانبعاثات على التوالي لTRITC وCy5 القنوات، 561.5 نيوتن متر / 553-618 نانومتر و 640.7 نانومتر / 663-738 نانومتر تظهر بشكل افتراضي.
    2. تعيين pseudocolors "الأخضر" و "الأحمر" لTRITC (CD4-PE) وCy5 (dextramer-APC) قنوات، على التوالي.
    3. وضع الشريحة لدراستها على المرحلة المجهرية والتركيز يدويا تحت التكبير 100X. تعيين "HV" إلى 110 والإزاحة إلى "0". انقر على "التركيز" وضبط "الجهد" لتحسين الليزر.
    4. انقر على "التركيز"؛ مسح قسم من أعلى إلى أسفل، وتعيين مستوى 'Z' لاقتناء الصورة. انقر فوق "سلسلة CH" والحصول على صورة بالتتابع. تحديد DEXT + خلايا CD4 + T التي تظهر الخلايا منقط الصفراء بأنها تقوم على التعاون توطين الإشارات المتولدة من كل من الأحمر (dextramers) والأخضر (CD4) القنوات.
  2. استخدام أوليمبوس FV500-BX60 المجهر متحد البؤر لالتعداد الكمي سهلة للخلايا + CD4 + T DEXT. لبدءانقر فوق فتح، والبرمجيات FLUOVIEW (الإصدار 4.3).
    1. حدد الأصباغ "CY3" و "Cy5" من القائمة المنسدلة، وانقر على "تطبيق" لتحميل الليزر منها. ملاحظة: موجات الإثارة / الانبعاثات لCY3 (543 نانومتر / pseudocolored "الخضراء"؛ CD4-PE)؛ القنوات وCy5 (dextramer-APC 633 نانومتر / pseudocolored "الحمراء").
    2. وضع الشريحة لدراستها على الشريحة المجهرية، والتركيز يدويا تحت التكبير المنخفض (4X أو 10X). انقر على "التركيز" في حين أن الليزر CY3 في وضع التشغيل، والتركيز التركيز التهابات.
    3. تغيير الهدف إلى 100X التكبير. تعيين حجم الملف إلى "512/512" من القائمة المنسدلة. انقر على "التركيز" وضبط القيم ل "PMT"، "الربح" و "الأوفست" المعلمات لتحسين أشعة الليزر بشكل منفصل عن CY3 وCy5.
    4. انقر على زر "Z المرحلة" ثم انقر فوق "فوكوس" في حين أن كلا الليزر على. مجموعةسمك "Z مرحلة" بالضغط على "حتى" والسهام "أسفل". تعيين "Z" الفاصل الزمني إلى 2 ميكرون.
    5. انقر على زر "إيقاف"، واختيار "Seq123". ثم، انقر على زر "XYZ" والبدء في الحصول على "Z" سلسلة صور للمنطقة المختارة ضمن التركيز التهابات. حفظ "Z صور مسلسل" كملفات افي. لحفظ ملفات الصور، حدد الصورة من "Z الصورة مسلسل" ثم قم بحفظ كتنسيق "شجار".
  3. دراسة ثلاثة أقسام تقرن من المخ حيث كانت ملطخة مجموعة واحدة من ثلاثة أقسام مع IA ق / حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers/anti-CD4 ومجموعة أخرى من ثلاثة أقسام مع IA ق / 70-86 TMEV dextramers/anti-CD4 لأداء التحليل الكمي.
    1. وبالمثل، وتحليل ثمانية أقسام لإقران القلب، والتي، كانت ملطخة مجموعة واحدة من ثمانية أقسام مع IA ك / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 وحد ذاتها أخرىر من ثمانية أقسام مع ريبونوكلياز 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. فحص 10 إلى 15 البؤر الالتهابية في القسم في المخ، وفي كل التركيز، واكتساب مجموعة من 15 إلى 25 صور المسلسل بالتتابع.
    1. فحص ما مجموعه 20 البؤر الالتهابية من كل ثمانية أقسام من القلب ومن كل التركيز الحصول على 10 إلى 15 صور المسلسل بالتتابع. تتخذ 'Z' صور المسلسل عن طريق مسح الشرائح في الحركة الأفقية العمودية يصل الأفقي العمودي أسفل 'بحيث يتم تجنب تكرار سلسلة' Z 'في نفس التركيز.
    2. مرة واحدة يتم التقاطها 'Z' صور المسلسل، وتسمية الملفات عن طريق تحديد أرقام الشرائح، اسم من الأقسام، وعدد من 'Z' صور المسلسل اتخاذها.
      1. استخدام البرمجيات 'يماغيج' عد خلايا CD4 + T + DEXT فيما يتعلق العدد الكلي للخلايا CD4 + T. حدد "نوع العداد 'في' يماغيج، والتحقق من و# 8216؛ تظهر جميع "وبدء العد بالضغط وسط كل خلية ويستمر العد في مختلف 'Z' صور المسلسل باستخدام السهام الجانب. بعد فرز جميع خلايا CD4 T، واختيار نوع آخر من العداد والعد CD4 + + DEXT خلايا تي. انقر فوق علامة التبويب النتائج للحصول على العدد الكلي للخلايا عدها مع اثنين من عدادات مختلفة.
      2. للحصول على العدد الإجمالي، إضافة عدد من الخلايا في جميع 'Z' صور المسلسل تمثل جميع أقسام الدماغية ثلاثة أو جميع أقسام القلب الثمانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا التقرير، والكشف الموقعي من المستضد محددة، وخلايا CD4 T autoreactive بواسطة تلطيخ المباشر مع الطبقة MHC II dextramers في يوصف. وقد استمدت أقسام الدماغي قطع طازجة من الفئران EAE وملطخة زجاجات تحتوي على حزب العمال التقدمي 139-151 (محددة) أو TMEV 70-86 (مراقبة) dextramers ومكافحة CD4. لوحات قمة في الشكل 1 يبين تحليل LSCM الأقسام الدماغي costained مع حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers (الحمراء) وCD4 الأضداد (الأخضر)، حيث ظهرت الخلايا المزدوج إيجابية الأصفر. كان مثل هذه الميزة غائبة في أقسام ملطخة TMEV 70-86 (مراقبة) dextramers (لوحات أسفل). أظهرت costained (DEXT + CD4 +) الخلايا النقاط منقط حول محيط. تشارك التحليل الكمي من الخلايا T حزب العمال التقدمي محددة في الأقسام الدماغي الخطوات التالية (الشكل 2): 1) أدلى أقسام ثلاثة أزواج، وكانت ملطخة مقطع واحد من كل زوج على حدة مع المضادة للCD4 وحزب العمال التقدمي 139-151 dextramers. وبالمثل، كانت ملطخة مجموعة أخرى من ثلاثة أقسام مع dextramers مكافحة CD4 والتحكم (TMEV 70-86). 2) من قسم معين، وتم تحديد البؤر الالتهابية (10 إلى 15) على أساس مكافحة CD4 تلطيخ. 3) واتخذت مجموعة من 'Z' صور المسلسل (15-25) من كل بالتتابع التركيز من أعلى إلى أسفل مع فاصل من 2 ميكرون بين كل منها. في الجوهر، وقد تم تحليل 10 إلى 15 مجموعات مماثلة من 'Z' صور المسلسل يمثل عدد متساو من البؤر الالتهابية في كل قسم. 4) في الصور الفردية، CD4 + الخلايا (الأخضر)، والخلايا إيجابية لكلا dextramers (الحمراء) وCD4 (الخضراء) والتي ظهرت وتعداد الخلايا منقط الأصفر وعن طريق وضع علامة منهم على حدة باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر، يماغيج، وأخيرا، تم الحصول على المجموع الكلي لكل قسم وذلك بإضافة عدد الخلايا عدها في جميع 'Z' صور المسلسل. بسبب أن الخلايا وتميزت، وإمكانية سرد الخلايا في صور متعددة التي هيتم القضاء على التداخل. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق من تعداد موثوقة + الخلايا DEXT نسبة إلى العدد الكلي للخلايا CD4 معربا.

وتم تمديد هذه دراسة أخرى للتدليل على استخدام الكواشف للكشف عن الخلايا dextramer تي توعية مستضد في الموقع في EAM يسببها مع Myhc 334-352 في الفئران A / J، والذي هو أيضا بوساطة الخلايا T المرض 13،14. تم الحصول على ثمانية أقسام القلب المقترنة، كل 200 ميكرومتر سميكة، وزير الشئون الخارجية من الفئران (الشكل 2). من كل زوج، كانت ملطخة مقطع واحد (مع ما مجموعه 8 أقسام) مع Myhc 334-352 dextramers ومكافحة CD4، في حين كانت ملطخة مجموعة أخرى من المقاطع (8 في المجموع) مع ريبونوكلياز 43-56 dextramers (السيطرة) ومكافحة -CD4. تم الحصول على عشرين مجموعات من 'Z' صور المسلسل في المقابل الى ان العديد من بؤر التهابات تمثل جميع أقسام ثمانية بالتسلسل على النحو الوارد أعلاه (الشكل 2). أساسا، مجموعة معينة من المسلسل ايم 'Z'وتألفت أعمارهم بين 10 إلى 15 فرد واحد يمثل التركيز التهابات واحد. وأظهر تحليل هذه الصور بواسطة LSCM وجود خلايا إيجابية لMyhc 334-352 dextramers (الحمراء)، وCD4 (الخضراء) وتوقعات، والخلايا ملزمة مع كل dextramers وظهرت الخلايا CD4 منقط الأصفر و(الشكل 3، لوحات أعلى) . كان لتلوين الخلفية dextramers السيطرة ضئيلة (الشكل 3، والألواح أسفل). تم تحديد مجموع أعداد خلايا + CD4 + T DEXT والعدد الكلي للخلايا CD4 + T لكل قسم وتعول من جميع أقسام وأضيفت معا للتوصل إلى العدد الإجمالي لكل مجموعة فرعية (خلايا + CD4 + T DEXT؛ CD4 + الخلايا التائية).

الشكل 1
الشكل 1. الكشف عن خلايا حزب العمال التقدمي محددة CD4 T من قبل في الموقع تلطيخ مع حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers. كان المستحث EAE في الفئران SJL بتحصين الحيوانات مع حزب العمال التقدمي 139-151 في CFA. في الإنهاء، وجزءا لا يتجزأ من المخ التي تم جمعها من الفئران EAE في 4٪ الاغاروز، وقدمت المقاطع باستخدام vibratome. بعد تلطيخ مع الكوكتيلات التي تحتوي إما حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers/anti-CD4 أو TMEV 70-86 dextramers (السيطرة) / المضادة للCD4 وتحديد مع 4٪ بارافورمالدهيد مخزنة PBS، تم غسلها أقسام وشنت للفحص من قبل LSCM. لوحات أعلى: قسمين منفصلين ملطخة حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers/anti-CD4. لوحات القاع: قسمين منفصلين ملطخة TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. غادر الفريق: CD4 والأخضر؛ لوحة الأوسط: dextramers والأحمر؛ اللوحة اليمنى: دمج (الأسهم، DEXT + CD4 + الخلايا التائية). التكبير الأصلي 1،000 X (المعتمد:. Massilamany وآخرون 2014 تلطيخ المباشر مع الميجور التوافق النسيجي الدرجة الثانية Dextramers مجمع رخص الكشف عن مستضد محددة، Autoreactive CD4 T الخليويق في الموقع بلوس وان 9 (1):. e87519) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
مصنوعة أقسام الشكل 2. نهج ل quantitate الخلايا DEXT + في العقول والقلوب. المقترنة من المخ أو القلب رفعه الأذن كما هو مبين (لوحة 1). تم تعيين مقطع واحد من كل زوج المقابلة لأجهزة أشارت لتلطيخ مع dextramers محددة (المخ، حزب العمال التقدمي 139-151 dextramers؛ القلب، Myhc 334-352 dextramers)، ومجموعة أخرى من أقسام للdextramers التحكم (المخ، TMEV 70 - 86؛ القلب، ريبونوكلياز 43-56). بعد تحديد والمتصاعدة، تم فحص المقاطع لتحديد بؤر التهابات استنادا تلطيخ مع CD4 بواسطة LSCM (ماج الأصليnification، 40X) (لوحة 2). تعرض كل التركيز التهابات كما تصور في ثلاثية الأبعاد (3D) عرض (لوحة 3) لمجموعة من 'Z' صور المسلسل بالتتابع (لوحة 4). في جميع الصور، احصي الخلايا إيجابية لكلا dextramers محددة أو السيطرة وCD4، أو CD4 وحدها باستخدام برنامج "يماغيج '(المعتمد:. Massilamany وآخرون 2014 تلطيخ المباشر مع الميجور التوافق النسيجي الدرجة الثانية Dextramers مجمع رخص الكشف عن مستضد محددة، خلايا CD4 T Autoreactive في الموقع بلوس وان 9 (1):. e87519) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الكشف عن CD4 T خلايا القلب الميوسين محددة من قبل في الموقع + CD4 + (المعتمد:. Massilamany وآخرون 2014 تلطيخ المباشر مع الميجور التوافق النسيجي الدرجة الثانية Dextramers مجمع رخص الكشف عن مستضد محددة، خلايا CD4 T Autoreactive في الموقع بلوس وان 9 (1): e87519). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على عكس الطبقة MHC أنا tetramers، يستمر استخدام MHC الدرجة الثانية tetramers للتطبيقات الروتينية لتكون صعبة، خصوصا أن تعداد الترددات السلائف من الاسعار المنخفضة للتقارب خلايا CD4 T autoreactive، ويرجع ذلك في جزء منه إلى التبعية تفعيلها 6،15-17. مؤخرا، تم التحايل على هذه المشكلة من خلال خلق الجيل القادم من tetramers، ودعا "dextramers،" السماح لنا للكشف عن خلايا CD4 T مستضد محددة لعدد من autoantigens، مثل حزب العمال التقدمي 139-151، MOG 35-55 وMyhc 334 - 352 8. في هذا التقرير، لأول مرة، فقد ثبت فائدة MHC الدرجة الثانية dextramers لكشف وتحديد الخلايا CD4 T الذاتية التفاعل في الموقع باستخدام أقسام الدماغ من الفئران EAE، وأقسام القلب من الفئران زير الشئون الخارجية. على أساس رد الفعل، dextramers توفر ميزة تتطلب كمية صغيرة من المجمعات MHC / الببتيد. في هذا البروتوكول، ويتطلب كل رد فعل فقط 0.75 ميكروغرام من مونومرات MHC / الببتيد. بالإضافة إلى ذلك، ستاining مع dextramers هو رد فعل من خطوة واحدة، حيث يتم coincubated dextramers مع المضادة للCD4، والإجراء بأكمله، من الأنسجة باجتزاء لتلطيخ، ويمكن أن تنتهي في أقل من يوم واحد. في المقابل، فإن البروتوكولات نشرت لتلطيخ الموقع مع tetramers التقليدية تشمل عادة في إجراءات التضخيم التي يتم فيها تضخيم الإشارات الفلورسنت باستخدام الأجسام المضادة الثانوية للfluorophores. ونتيجة لذلك، قد تلطيخ الاجراءات يستغرق ما يصل إلى ثلاثة أيام لاستكمال 18-20.

وعلاوة على ذلك، فإن استخدام dextramers في أقسام الدماغي يسمح الكشف عن خلايا T مستضد محددة في عمق أقسام الأنسجة، حتى تصل إلى 50 ميكرون. لوحظ أنه تم العثور حزب العمال التقدمي 139-151 DEXT + CD4 + الخلايا لتكون موجودة على حد سواء perivascularly وأيضا ضمن لحمة. وعلاوة على ذلك، فإن شدة الإشارات المتولدة من Myhc 334-352 dextramers منخفضة في أقسام القلب بالمقارنة مع dextramers حزب العمال التقدمي 139-151 في الدماغ ثانيةستعقد (الشكل 1)، ومثل هذا الاختلاف قد تعكس الخصائص الفريدة لكل جهاز. واحدة من هذه المتغير هو المحتوى الدهني التي هي موجودة في كميات عالية في أنسجة المخ بدلا من أنسجة القلب التي تحتوي على الألياف العضلية المخططة أساسا يمكن أن يحتمل تقييد نشر سهولة dextramers في التركيز التهابات. لدعم هذه الفكرة، تم الكشف عن Myhc 334-352 الخلايا DEXT + فقط لعمق لتصل إلى 20 ميكرون في معظم أقسام القلب. بالإضافة إلى ذلك، كانت Myhc 334-352 DEXT + الخلايا الحاضر منتشرة في جميع من خلال عضلة القلب مما يشير إلى طبيعة تنتشر من تتسرب التهابات في آفات التهاب عضل القلب.

عموما، يمكن أن اثنين من العوامل الرئيسية التأثير سلبا على الكشف عن خلايا T مستضد محددة في الموقع من قبل LSCM. أولا، يمكن للإشارات غير كافية المنبعثة من fluorophores يؤدي إلى الحاجة لتضخيم الإشارات باستخدام الأجسام المضادة fluorophore. الثاني، هذا وصمة عار غير المباشرةجي يمكن أن تقوض خصوصية، مثل تلوين الخلفية للمواد التحكم أيضا يمكن أن تزيد بالتناسب 18،19. تم التحايل على هذه القيود من خلال تلطيخ المباشر مع dextramers. وعلى الرغم من الكشف عن خلايا CD4 T وقد تبين بنجاح مع أقسام جديدة، واستخدام الكواشف dextramer في الأنسجة المجمدة يتطلب دراسات إضافية، والتي يمكن أن يكون تحديا كما الإبقاء على الأنسجة النزاهة قد يكون من الصعب بسبب ميل للأنسجة للحصول على تفككت خلال مختلف الخطوات تلطيخ 18،19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية ومؤسسة عضلة القلب للأطفال (SDG2462390204001)، والمعاهد الوطنية للصحة (HL114669). CM هي المستفيدة من منحة ما بعد الدكتوراه الزمالة البحثية التي تمنحها مؤسسة التهاب عضلة القلب، NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73, (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310, (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9, (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219, (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182, (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92, (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166, (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13, (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170, (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165, (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268, (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics