הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

עור של יונקים מכיל מערך מגוון של מבנים - כמו זקיקי שיער וקצות עצבים - שמפגינים דפוסים ייחודיים של ארגון המרחבי. ניתוח עור כמו הר שטוח מנצל את הגיאומטריה 2 ממדית של רקמה זו להפקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעובי מלא של מבני עור.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עור הוא רקמה הטרוגנית מאוד. מבני התוך עורי כוללים זקיקי שיער, שרירי פילי arrector, התמחויות באפידרמיס (כגון צבירי תאי מרקל), בלוטות החלב, עצבים וקצות עצבים, ונימי דם. הסידור המרחבי של מבנים אלה נשלט בחוזקה בקנה מידה מיקרוסקופית - כפי שניתן לראות, למשל, בהסדר המסודר של סוגי תאים בתוך זקיק שערה אחת - ובקנה מידת מאקרוסקופי - כפי שניתן לראות על ידי האוריינטציות כמעט זהות של אלפי שיער זקיקים בתוך אזור מקומי של עור. לדמיין את המבנים האלה בלי חתך העור פיזי אפשרי בגלל הגיאומטריה 2 ממדית של איבר זה. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי עור של עכבר יכול להיות גזור, קבוע, permeabilized, מוכתם, והבהיר כאובייקט שלם שני ממדים, הר שטוח. הפרוטוקול מאפשר להדמיה קלה של מבני עור בשלמותם דרך העובי המלא על שטחים גדולים של עור על ידי optחתך iCal ובנייה מחדש. תמונות של מבנים אלה יכולים גם להיות משולבים עם מידע על מיקום וכיוון יחסי לצירי הגוף.

Introduction

העור הוא אחד האיברים הגדולים ביותר בגוף, עם פונקציות חשובות בsomato-תחושה, בידוד / ויסות חום והגנה חיסונית 1. הבנת הבסיס המולקולרי ותאי של התפתחות עור ותפקוד כבר עניין ארוך שנים בגלל החשיבות הבסיסית של עור כמערכת ביולוגית ואת הרלוונטיות שלה לדרמטולוגיה. עור של יונקים מכיל מגוון של מבנים תאיים, כוללים שכבות מרובדת של קרטינוציטים, רקמת חיבור עורי, מספר סוגים של זקיקי שיער, בלוטות החלב, שרירי פילי arrector, כלי דם, ולפחות תריסר סוגים שונים של הביא (חושיים) ועצב efferent סיבים (איור 1). אזורים שונים בגוף הקשורים לסוגים שונים אופייני של עור. ברוב היונקים, כמעט על פני הגוף כולו מכוסה בעור, כי הוא ארוז בצפיפות עם זקיקי שיער. [בני אדם ועכברושי קרחים מהווים חריגים ההוא דפוס.] השיער חסר ממשטחי כף היד של כפות הידיים ורגליים, אשר קשור גם עם דפוסים מיוחדים אפידרמיס (dermatoglyphs), בלוטות אקסוקרינית, וקצות עצבים תחושתיים. אירועים התאיים ומולקולריים השולטים על הגדילה, התמיינות, וסידור המרחבי של תאים בתוך זקיק השיער הם עניין מיוחד כמו כל מוצגי זקיק, בזעיר אנפין, רבים מהתכונות של organogenesis 2 המרכזיות. תכונות אלה כוללות את קיומם של תאי גזע ונישת תאי גזע, הגירת תא כוריאוגרפיה מדויקת, והרכבה של מבנים תאיים מרכיבי embryologically מובחנים.

מאמר זה מתאר שיטות לביתור, תיקון, תיוג, ועור של עכבר ההדמיה כגיליון דו ממדים שלם, המכונים "הר שלם" או "שטוח הר" הכנה. מאז העור של עכבר הוא דק יחסית, ניתן לתמונה דרך העובי המלא של סקי שטוחn באמצעות מיקרוסקופיה confocal הקונבנציונלית. גישת ההר שטוחה להדמית עור של יונקים היא מבחינה טכנית יתרון משום שהוא עוקף את הצורך בחתך פיזי, ובכך לאפשר מבנים ששוחזרו לחלוטין על ידי חתך אופטי. מאחר שכמעט כולו עור מעובד כאובייקט יחיד, השטוח הר גישה גם מאפשרת ההדמיה של אזורים שונים על פני שטח הגוף תוך שמירת מידע על מיקום וכיוון יחסי לצירי הגוף. לבסוף, מבנים בתוך העור הם בדרך כלל נוכחים בדפוסים שחוזרים על עצמם במרווחים זמן קבועים, ובכך להקל על האוסף של תמונות מנציגים רבים של מבנה נתון. מאפיינים אלה הם מוכרים לneurobiologists שעובד על הרשתית, חלק שני ממדים של מערכת העצבים המרכזית, הנהנית מיתרונות דומים ללימודים של מורפולוגיה עצבית 3.

גישת הר השטוח המתוארת כאן היא של utilit המיוחדy ללימוד מבנים שמפגינים ארגון המרחבי בקנה מידה גדול יחסית בתוך המטוס דו ממדי של העור. דוגמא אחת לארגון המרחבי בקנה מידה גדולה היא הקוטביות מתואמת של זקיקי שיער ומבנים הקשורים לזקיק שיער - צבירי תאי מרקל, שרירי פילי arrector, בלוטות החלב, וקצות עצבים 4. זקיקי שיער הם בכיוון בזווית ביחס למישור של העור, והמרכיב של וקטור הזקיק שנמצאת בתוך המטוס 2 ממדים של העור, בדרך כלל מפגין התמצאות ביחס לצירי הגוף זה בדיוק נקבע לכל עמדה על הגוף. לדוגמא, זקיקי שיער על הנקודה חזרה ממקורי לזנב ושיער על פני השטח הגבי של כף הרגל מצביעים מפרוקסימלי לדיסטלי. הנטייה זקיק שיער נשלטת על ידי איתות קוטביות תא מישוריים (PCP; מכונית גם קוטביות רקמות 5). מערכת איתות זה התגלתה בדרוזופילה שבו קטןסט של גנים PCP ליבה נמצא כדי לשלוט בכיוון של שערות וזיפים cuticular. שלוש orthologues יונקים של גנים PCP ליבה - homolog המסולסל 6 (Fzd6, המכונה גם Fz6), cadherin EGF LAG הקולטן G-הסוג שבע העוקף 1 (Celsr1), וכמו Vang-2 (Vangl2) - ממלא תפקידים מקבילים ביונקים עור, תיאום האוריינטציות של זקיקי שיער עם צירי הגוף. מחקרים על עכברי נוקאאוט Fz6 (Fzd6 tm1Nat, להלן כFz6 - / -) מראה כי הפגם העיקרי בהעדר איתות PCP הוא אקראי או חוסר ארגון ראשוניים של אורינטצית זקיק שיער, ללא השפעה על המבנה הפנימי של הזקיקים 6-8. מערכת שאינו PCP שני פועלת מאוחר יותר כדי לקדם את היישור מקומי של זקיקים בקרבת מקום, מה שמוביל לייצור של דפוסי שיער בקנה מידה גדולה, כגון מערבולות וציציות.

דוגמא שנייה של בקנה מידה גדולהארגון המרחבי בתוך העור נראה במורפולוגיות של סוכות האקסון חושיות. יש עצב סנסורי המעצבב את עור גופי התא שלהם בשורש הגבי הגרעינים ומשולשים. נוירונים אלה לזהות טמפרטורה, כאב, גירוד, וסוגים שונים של עיוותים מכאניות הפוגעים בעור ובשיער 9. הם יכולים להיות מחולקים לתת מבוססים על קוטר האקסון ומהירות הולכה, מבנה קצה עצב מסוף, ואת דפוסי ביטוי של קולטנים, תעלות, ומולקולות אחרות. בגלל הצפיפות הגבוהה של עצבוב בתוך העור, ניתוחים המערבים לדמיין את כל האקסונים (למשל, immunostaining אנטי neurofilament) או אפילו את כל האקסונים של כיתה אחת (כפי שניתן לראות כאשר סוג תא בודד מתאפיין בביטוי של כתב ניאון) בדרך כלל מגלה סופרפוזיציה צפופה של אקסונים שעושה את זה בלתי אפשרי להגדיר את המורפולוגיה של סוכה בודדת. כדי לעקוף בעיה זו, השתמשנו l גנטי מכוון מאוד דלילabeling לייצר דגימות עור גב שבסוכות האקסון מבודדות היטב בודדות הם דמיינו ידי ביטוי של כתב histochemical, phosphatase אלקליין שליה האנושי 10. גישה זו מאפשרת להדמיה חד משמעית של מורפולוגיות סוכת האקסון אדם והגדרה של סוגי נוירון החושית על פי קריטריונים מורפולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. כל החיות מטופלות בהתאם לועדת טיפול בבעלי חיים מוסדי ושימוש אושר (IACUC) פרוטוקול MO11M29 של המוסדות רפואיים ג'ונס הופקינס. התייעץ עם הנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית המקומיות לשיטות שאושרו להמתת חסד. ללבוש כפפות, מעיל מעבדה, ומשקפי מגן בעת ​​טיפול fixatives אלדהיד או ממסים אורגניים.

1. הכנת החומרים

  1. לשפוך צלחות Sylgard
    1. עקוב אחר ההוראות של היצרן, לערבב סוכן הריפוי עם הבסיס, ומערבבים עם מוט פלסטיק.
    2. פיפטה ~ Sylgard נוזל 35 מיליליטר ל10 צלחת תרבות סנטימטר קוטר רקמות. תרבות מנות רקמות עמוקות יותר מאשר מנות חיידקים סטנדרטיות; זה מספק אישור אנכי לסיכות החרקים.
    3. הנח את dishes על משטח אופקי בטמפרטורת חדר למשך הלילה. בועות שנוצרו במהלך הערבוב ייעלמו.
    4. בעקבות פילמור, לאחסן את צלחות Sylgard בטמפרטורת חדר.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות Sylgard בטמפרטורת חדר למשך שנים ושימוש חוזרות מספר פעמים עד שSylgard מתנתק מהצלחת.
  2. פתרונות
    1. תכשיר ונזיל אלכוהול (BBBA). מערבבים בנזואט נזיל 2 כרכים ונזיל אלכוהול בנפח 1. חנות בחושך בבקבוק זכוכית עם פקק זכוכית או עליון טפלון.
      זהירות: משמש BBBA צריכה להיות מטופלים כראוי כפסולת ממס אורגנית. אל תאפשר BBBA ליצור קשר עם פלסטיק.
    2. פוספט שנאגרו מלוח (PBS). להוסיף 4 גרם PFA 80 מיליליטר מים, מוסיף 0.1 מיליליטר 1 N NaOH, מערבב על צלחת חמה ב ~ 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ~ עד PFA נמס לגמרי, ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר 10x PBS ולהביא את הנפח ל100 מיליליטר עם מים.
      זהירות: שאיפת אדי פורמלדהיד / PFA וBBBA צריכה להיותממוזער על ידי שמירה על פתרונות אלה במכולות מכוסות. פורמלדהיד / PFA הוא חומר מסרטן.
    3. שמן האדום O. הכן מלאי 0.5% בisopropanol. מייד לפני השימוש לדלל במים לריכוז סופי של .0.3% האדומים O שמן, ולאחר מכן לסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.

2. Dissection עור, קיבוע, ומסלקת

  1. גב עור לImmunostaining ומלנין הדמיה
    1. לעכברים צעירים מאוד (לדוגמא, עוברים ויום לידה (גורי P) 0-P3), להרדים את העכברים על ידי שאיפת isoflurane. להרדים עכברים מבוגרים על ידי שאיפה isoflurane או על ידי הזרקת קטמין / xylazine אחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. להסיר את השיער עם מכונת גילוח וג'ל להסרת שיער. לעכברים צעירים יותר מP8, ניתן לדלג על שלב זה.
    3. השתמש בסכין גילוח כדי לעשות חתך אופקי מבסיס הזנב לאורך כל אגף, עובר בצד הגבי של הבסיס של כל איבר, שתמשיך לרוחב לאוזניים וסופו של הדברing באף.
    4. לקלף בעדינות את העור מהליך הרקמה הבסיסי מאחורי אל קדמית על ידי לחיצה על העור בין אצבעות בכפפות, כך שזה לא צבט ידי מלקחיים. כשמקלף את העור ברמה של האוזניים, לחתוך ראשון מהאוזניים עם זוג מספריים ולהמשיך במיוחד לאט כמו העור יכול לקרוע במיקום זה.
    5. מנקודה זו ואילך, כוון את העור עם החלק הפנימי כלפי מעלה. הצמד את העור לSylgard עם ~ 20 סיכות חרקים מחולקת באופן שווה סביב בפריפריה; לא יותר מ-למתוח את העור (איור 2). כסה את העור עם 10-20 מיליליטר של PBS.
    6. משם לנתח את השומן הקשורים לעור ורקמות חיבור באמצעות מלקחיים זווית או מעוגלים עם הקצה המחודד של המלקחיים מול אופקי כדי למזער את הסיכון שהמלקחיים יהיו לחדור את העור. Extrude כל בועות אוויר שנלכדו מתחת לעור בעדינות על ידי גלגול המוליך כותנה שקצה מעל פני העור.
      הערה: אם העור הולךכדי לשמש לimmunostaining הר שטוח או היסטוכימיה, להסיר כמה שיותר רקמת החיבור ככל האפשר; אם העור הוא הולך לשמש כדי לחזות זקיקי שיער המבוסס על פיגמנטציה של מלנין, ההסרה של רקמת חיבור פחות שלמה היא משביעת רצון. עור בהריון דורש "ניקוי" מינימאלי של רקמת חיבור חסיד.
    7. תקן את עור הצמיד על ידי הוספת 20 מיליליטר של 4% מוכנים טרי PFA / PBS או 10% שנאגרו פורמלין לכל 10 סנטימטר צלחת Sylgard (אם העור לשמש הדמיה מלנין או phosphatase אלקליין (היסטוכימיה AP)) או 20 מיליליטר של מוכן טרי 2% PFA / PBS (אם העור ישמש לimmunostaining או המהונדס חזותי קראטין (krt) 11 17-GFP), וסובב בעדינות את הלילה בחדר קר. למחרת, לשטוף בPBS ל> 10 דקות.
      הערה: פורמלין הרגיל הוא פורמלדהיד 37%; לכן, "פורמלין 10%" הוא פורמלדהיד .3.7%.
    8. עבור מכתים AP וimmunostaining, ימשיך בסעיף 3. למתארים לעצמי מלניןING, מייבשים את העור באמצעות סדרת אתנול מדורגת (70%, 95%, 100%), יום אחד לכל שלב, עם סיבוב אופקי עדין בטמפרטורת חדר. הסרת רקמות חיבור שיורית.
    9. עם העור ב100% אתנול, להסיר את סיכות חרקים ו, ​​אם תרצה בכך, חתוך את העור במספריים כדי להסיר את 1-2 מ"מ ההיקפי ביותר של עור עם חורי הסיכה.
    10. העבר את העור לצלחת זכוכית בקוטר 10 סנטימטר, למקם את שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית על העור כדי למנוע ממנה מסתלסל, ולהוסיף 20 מיליליטר של BBBA. BBBA מהירות מתקשה רקמות ולכן חשוב לעור להיות שטוח תחת משקליו של שקופיות הזכוכית לפני הוספת BBBA.
    11. במשך כמה השעות הקרובות, הרם את השקופיות את העור למשך מספר שניות כדי לאפשר BBBA לשטוף את העור.
      הערה: יש להשתמש בכפפות בעת עבודה עם BBBA. בהתאם לגיל והמיקום של העור יכולה להיות התכווצות ככל 30% בBBBA.
  2. עור כף רגל לניתוח של שיער הזקיק פאטrning
    הערה: טווח הגילים שנבדקו בדרך כלל הוא P1-P8.
    1. לאחר המתת חסד, לנתק את הרגליים מעל למפרק הקרסול ולעשות חתך ישר אחד על פני שטח הגחון דרך כפות הרגליים.
    2. לקלף בעדינות את העור מהרקמה הבסיסית, שתמשיך בהפרוקסימלי לכיוון הדיסטלי.
    3. חותכים את הספרות כדי לשחרר את העור ולהצמיד אותו לSylgard עם פני השטח הפנימיים פונים כלפי מעלה (איור 2 ג). יש רקמת חיבור מינימאלית על עור כף הרגל.
    4. העור המהונדס Krt17-GFP הוא מוכן הדמיה עכשיו. הדמיה מלנין להמשיך עם קיבעון, התייבשות וסליקת BBBA כפי שתואר בסעיף 2.1.
  3. עור כף רגל המאפשרת הדמית החלב בלוטות
    1. לאחר המתת חסד, להסיר את השיער על ידי שפשוף ג'ל מסיר שיער מעל פני העור עם אצבע ואגודל בכפפה; לחכות ל10 דקות.
      הערה: אין להשתמש במכונת גילוח חשמלי, שיגרום ניזק לעור כף הרגל העדין.
    2. Wאפר לפני השטח של העור במים ברז, לנתח ולהצמיד לעור Sylgard כפי שתואר בסעיף 2.2.
    3. לתקן עם 1% PFA / PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף בPBS.
      הערה: לקבלת הדמיה בלוטות החלב בכפות הרגליים, המתפתחות לאחר השבוע לאחר הלידה הראשונה, הגיל האופטימלי לניתוח עם שמן האדום O הוא P21, כי זה מסמן את נקודת השפל של פיגמנטציה השיער במהלך מחזור השיער הראשון 12, ולכן בלוטות החלב ניתן לראות בקלות רבה יותר. עם עכברים לבקן ניתוח זה יכול להתבצע בכל גיל. כדי להשיג עכברי בקן צאצאי צלב פיגמנט מוטציה לקו המוטציה טירוסינאז כגון c-2J C57BL/6J-Tyr.
  4. הכנת עור זנב לניתוח התפלגות מלנין, אוריינטציה זקיק השיער, וחלב בלוטת יזואליזציה
    1. לאחר המתת חסד, לעשות חתך מעגלי סביב בסיס הזנב, ולאחר מכן חתך אורכי המפעיל את אורכו של הזנב לאורך הפנים גחונה.
    2. <li> לקלף את עור הזנב מתחיל בקצה על ידי תקיפות לתפוס את קצה זנב העצם ו / או רקמות חיבור עם זוג אחד של מלקחיים והעור עם זוג שני של מלקחיים. הצמד את עור הזנב לSylgard.
    3. לניתוח של חלוקת מלנין וכיוון זקיק שיער, לתקן ולעבד את העור כפי שתואר בסעיף 2.1. לניתוח של בלוטות החלב, לחתוך את עור הזנב לסדרה של קטעים ~ 0.5-1 סנטימטר אורך לפני הקיבעון ו דגירה חתיכות העור בPBS / 5 מ"מ EDTA לילה בשעה 37 ° C כדי להחליש את הידבקות הדרמיס-האפידרמיס 13.
    4. בעדינות לקלף את האפידרמיס מדרמיס, להצמיד את האפידרמיס לSylgard (פנימי עם פנים כלפי מעלה), ולתקן אותה בPFA 4% / PBS במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. לשטוף עם PBS, ולהכתים עם שמן האדום O כפי שיתואר להלן.
      הערה: מכונת גילוח חשמלית ו / או ג'ל להסרת שיער ניתן להשתמש בם לפני לנתח עור מבוגר זנב (למשל, P21), אך טיפול זה הוא אופציונלי מאז השיער על הזנב הוא לאצפוף כמו במקומות אחרים בגוף.

3. תגובות מכתים

  1. אדם השליה אלקליין phosphatase (AP) היסטוכימיה לדמיין גנטי שכותרת אקסון Arbors 10,14,15 (3A דמויות, B)
    1. לאחר קיבוע PFA על Sylgard, למקם את העורות קבועים בצלחת זכוכית 10 סנטימטר ולצלול מתחת PBS / 1 מ"מ MgCl 2. בעדינות לסובב את הצלחת באמבט מים ב70 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות להרוס את פעילות phosphatase אנדוגני.
    2. דמיין פעילות כתב AP histochemically עם דגירה 4-48 שעות בטמפרטורת חדר ב0.1 M טריס, pH 9.5, 0.1 M NaCl, 50 מ"מ MgCl 2, 0.34 מיקרוגרם / מיליליטר NBT, ו0.175 BCIP מיקרוגרם / מיליליטר, בדרך כלל באמצעות 10-15 מיליליטר של פתרון מכתים לעור גב p21. לנטר את התגובה מתחת למיקרוסקופ לנתח, נזהר שלא לתת לו להמשיך מעבר לזמן האופטימלי, נשפט על ידי בדיקה ויזואלית של יחסית עוצמת כתמי האקסון לתצהיר NBT לא ספציפי. לעצור את התגובה על ידי שטיפה עם שלושה שינויים של Tween-20% PBS/0.1 במשך שעה 1, מחדש סיכת העורות לSylgard, מייבשים את העור באמצעות סדרת אתנול, ולאחר מכן להעביר את העורות לצלחת 10 סנטימטר עם BBBA.
      הערה: BBBA ממס את משקע NBT לאט. בשעתי המעטות הראשונות בBBBA, רקע קנס של NBT זירז יתמוסס; כתוצאה מכך, פתרון BBBA יהיה להחשיך, והעור יהיה להאיר. שינוי לBBBA הטרי לאחר כמה שעות.
    3. לאחר ההדמיה העור המוכתם-AP, להעביר אותו לאתנול ל> 1 שעות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לאחסן אותו באתנול טרי ב -20 ° C. ניתן לאחסן את עורות צבעוניים AP בדרך זו במשך חודשים רבים ללא איבוד האות.
  2. שמן אדום O מכתים למדמיין החלב בלוטות 4 (איורים 3C-F)
    1. הסר את סיכות חרקים ולהעביר את הרגל קבועה בקלילות או עורות זנב מצלחת Sylgard לבארות של צלחת תרבית רקמת 6 היטב, עםעד שתי דגימות עור בכל טוב. לשטוף עם 60:40 isopropanol: מים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. כתם ב2 מיליליטר 0.3% האדומים O שמן ב60:40 isopropanol: מים (ראה סעיף 1.2) בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
    3. לשטוף עם 60:40 isopropanol: מים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, ואחריו לשטוף במים. לקצץ בזהירות את הקצוות של העור, כוללים חורי הסיכה, עם מספריים עדינים, כך שעל פני השטח של העור יכול להתבצע שטוחים ככל האפשר.
    4. הנח את העור בשקופית עם פני השטח החיצוניים פונים כלפי מעלה, להוסיף כמה טיפות של מים או הרכבה בינונית מימית, לכסות את העור עם coverslip, ולאחר מכן בעדינות תדביק את coverslip לשקופית כדי לשטח את העור עוד יותר.
  3. הר שטוח Immunostaining 4,16,17 (איורים 3G, H)
    1. לחתוך מלבן של עור קבוע PFA (למשל 1 סנטימטר x 0.5 סנטימטר), סימון האוריינטציה שלו עם חתך סימטרי (לדוגמא: קליפ בפינה הימנית הקדמית). בצע את הדגירה ולשטוף את המדרגות עם סיבוב עדין על פלטפורמה אופקית מסתובבת. בבארות של 6 - או צלחת תרבית רקמת 12 היטב, לשטוף מספר פעמים עם PBS להסיר PFA שייר, לשטוף עם ~ 10 שינויים של PBS עם 0.3% טריטון X-100 (PBST 0.3%) מעל 5-8 בשעה טמפרטורת חדר כדי permeabilize העור.
    2. דגירה עם הנוגדן הראשוני בPBST 0.3% עם 5% נסיוב עזים וDMSO 20% במשך חמישה ימים בטמפרטורת חדר. מכסה את הבארות של הצלחת עם נייר שקוף או פלסטיק דבק לחסל הפסדים באידוי.
    3. לשטוף עם 10-15 שינויים של PBST 0.3% מעל 5-8 שעות ודגירה עם נוגדנים משני בPBST 0.3% עם 5% נסיוב עזים וDMSO 20% במשך 3 ימים בטמפרטורת חדר.
    4. לשטוף עם 10-15 שינויים של PBST 0.3% מעל 5-8 שעות.
    5. ליבש ב25%, 50%, ומתנול 75% במשך 5 דקות כל אחד ולאחר מכן מתנול 3x ב100% עבור 20 דקות כל אחד.
    6. ברור בBBBA לילה בטמפרטורת חדר.
      הערה: שטוח הר immunostaining של עור צעיר יותר~ P1 יכול להתבצע כפי שתואר לעיל, אך עם דגירה קצרה יותר ולשטוף פעמים. לדוגמא, עור P1 ניתן immunostained עם דגירה לילה בנוגדן ראשוני ודגירת שעה כמה בנוגדנים משני, ועם התערבות שוטף של רק 2-3 שעות בPBST 0.3%. כפי שצוין לעיל, עורות צעירים הם גם דקים מספיק שהם יכולים להיות הדמיה ללא סליקת BBBA.
  4. חזותי צבירי תאי מרקל עם עצבי פלורסנט מסוף דיי ספיגה (איורים 3I-L)
    AMI-43 (ירוק) וAM4-65 (אדום) הם צבעי ניאון אפשר לתקן, כי להיכנס לתאים באמצעות ערוץ קטיון הלא סלקטיבי 18. בעור המתגורר צבעים אלה נלקחים באופן סלקטיבי ומרוכז בתאי מרקל.
    1. ממיסים 1 מ"ג AM1-43 או AM4-65 ב2 מיליליטר PBS ולאחסן בaliquots ב -80 ° C.
    2. הזרק גורים שזה עתה נולד תת עורי עם 2-10 לצבוע מיקרוגרם למשקל גוף גרם באמצעות מחט G 29.
    3. יום אחד מאוחר יותר, להרדים את העכברים וdisseCT עורות הגבי.
    4. תקן את עורות PFA 4% / PBS ב 4 ° C למשך הלילה, לשטוף עם PBS, ולעגן את העור כפי שתואר בסעיף 3.2.

4. הדמיה וניתוח תמונה

  1. אוריינטציה זקיק שיער הדמיה (איור 4)
    1. השתמש במיקרוסקופ לנתח לגב תמונה, רגל, או עורות זנב, כי הם שקועים בBBBA, שטוח מתחת לשקופית זכוכית, ועדיין בצלחת הזכוכית - גישה זו מצמצמת את זיהום BBBA של המיקרוסקופ.
    2. להאיר את הצלחת מלמטה. כדי למזער את השונות מרחבית בעוצמת אור על פני שדה הראייה, לרומם את צלחת הזכוכית לגובה ~ 10 סנטימטר מעל משטח העבודה הסטנדרטי של מיקרוסקופ לנתח ולמקם את פלסטיק לשדר או צלחת זכוכית מעל מקור האור.
    3. להחזיר את העור לאתנול 100% עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C.
      הערה: השארת העור בBBBA ליותר מיום אחד גורמת לגרגרים המלנין לשבורחלק. ברגע שטופל BBBA העור זה יקשיח ולהישאר שטוח מנקודה זו ואילך. יכולים להיות מקודדים עורות שונים עם סדרה של חריצים בקדמיים שלהם ו / או אחורי מסתיים, כך שהם יכולים להיות לאחסן יחד, כדי לחסוך מקום במקפיא.
  2. ההדמיה וArbors אקסון Tracing (3A דמויות, B)
    1. הנח עור AP מוכתם (סעיף 3.1.3) בין שני לוחות זכוכית מהסוג המשמש לג'לי חלבון קטן. למנוע החדרת בועות אוויר בין הלוחות והעור, ולאחר מכן בזהירות פתיל משם כל BBBA עודף עם מגבת נייר. מניחים את הכריך של צלחת עור צלחת על במה מיקרוסקופ (איור 2 ד).
    2. השתמש בשדה בהיר או תאורת דסק"ש עם מטרת 10X ו2 מיקרומטר או 5 מיקרומטר Z-צעדים. השתמש בבמת XY ממוכנת ללכוד מונטאז' של תמונות XY שהם תפרו יחד כדי ליצור ערכת נתונים אחת תלת ממדית בגוונים אפורים.
      הערה: לסוכת האקסון גדולה אחד, מערך נתונים זה יכול להיותזה גדול כמו 5 GB.
    3. לבצע ידני, אוטומטי, או מעקב חצי אוטומטי של סוכות האקסון עם כל מגוון של חבילות תוכנה.
      הערה: תוכנה כגון Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) היא כלי שיקום עצבי חופשי שפועל בסביבת מחשב וקל יחסית לשלוט 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההדמיה brightfield של flatmounts עור יכולה לשמש לafferents תמונה עורית החושית (איור 3A 10) ודפוסי זקיק שיער המבוסס על פיגמנטציה של מלנין (איור 4). ההדמיה confocal של flatmounts עור ניתן להשתמש כדי להגדיר את הגיאומטריה של (1) צבירי תאי מרקל, דמיינו עם אנטי cytokeratin-6 או עם ספיגת צבע AM (איורים 3I-L), (2) שרירי פילי arrector, דמיינו עם אנטי אקטין שריר חלק (איורים 3G, H), (3) בלוטות החלב, דמיינו עם שמן האדום O (איורים 3C-F), ו (4) זקיקי שיער, דמיינו עם transgene Krt17-GFP או על ידי צביעה עם נוגדנים נגד Krt17 4 (איורים 3E-G, K, L). זה פשוט להבקיע ידני אוריינטציות וסידורים מרחביים של מבנים בתמונות כאלה על ידי הצבת וקטורים של נטייה ידועה על המבנים באמצעות Adobe Photoshop או Illustrator, ולאחר מכן quantifyinגרם אוכלוסיות הווקטור שהתקבלו. בעוד גישה זו די לקנה מידה של כמה מאה וקטורים, זה יהיה משעמם להחריד על 10 - או 100 פי קנה מידה גדולה יותר.

איור 1
איור 1. סכמטי של עור שעיר של יונקים המציגים את המבנים הגדולים. (זכויות יוצרים, תרז וינסלו.)

איור 2
איור 2. עור כף רגל האחורי נתיחת עור וטיפול מדגם.) כלים לנתיחה. ב ') עור גב P5 הוצמד לצלחת Sylgard. C) הגבי P5 הוצמד לצלחת Sylgard. ד') עור גב רכוב בין 2 לוחות הזכוכית ג'ל להדמיה wה-i אובייקטיבית 10X ודסק"ש או תאורת brightfield.

איור 3
איור 3. מבני עור בדירת הר נוף. A, B) סוכה אחת עורית חושית (משמאל) ואת התמונה שלה לאתר (מימין) מעור גב P21 של Brn3a / + CKOAP;. נחשף ה-NFL קואל / + עכבר למינון נמוך טמוקסיפן ביום הריונית 17 תוצאות פרוטוקול זה ברקומבינציה בתיווך Cre של הכתב בחלק קטן מאוד של נוירונים גנגליון השורש הגבי, ולכן חלק קטן של סוכות חושיות עורית מסומנים עם כתב השליה האנושי phosphatase אלקליין (AP). אקסונים שכותרתו הם דמיינו עם היסטוכימיה NBT / BCIP. Brn3a מכונה Pou4f1. C, D) באופן שקול עור זנב מוכתם בשמן האדום O כדי לחזות בלוטות החלב מWT (משמאל) וFz6 - / - עכברים (מימין) ב p21. Fz6 - / - מבנים הם לא מאורגנים. P, הפרוקסימלי; . ד ', דיסטלי עור רגל E, F) הגבי מWT (משמאל) וFz6 - / - (מימין עכברים) שנשאו Krt17-GFP. העור היה שנקטפו ב p21 ומוכתם בשמן האדום O. Fz6 - / - העור של מערבולת שיער במרכזו. P, הפרוקסימלי; . ד ', דיסטלי G, H) עור גב מעכבר WT בזקיקי P21 מראה שיער (דמיינו עם transgene Krt17-GFP וimmunostaining אנטי-GFP; פנל G) ושרירים פילי arrector [דמיינו עם שריר אקטין נגד חלקה (SMA ) Immunostaining; H פנל]. עומק בתוך תמונת Z-מחסנית confocal הוא בקודי צבע. , קדמי; P, אחורי. IL) אשכול מרקל תא (דמיינו עם immunostaining cytokeratin8 או AM11-43 ספיגת צבע) וזקיקה המרכזי שיער (דמיינו בפנלים K ו-L עם Krt17-GFP). תמונות התקבלו מעור גב P1 מגנוטיפים מצויינים. Fz6 - / - אשכול מרקל התא יוצר מעגל סגור, ואילו מקבץ תאי WT מרקל הוא פתוח לכיוון הקדמי. , קדמי; P, אחורי. סולם ברים: A ו-B, 300 מיקרומטר; C ו-D, 500 מיקרומטר; E ו-F, 500 מיקרומטר; G ו-H, 200 מיקרומטר; IL, 50 מיקרומטר. (פנלי A ו-B הם בתמונות מeLife וProc. Natl. אכד. Sci. ארה"ב, ברשות 4,10) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. שיער וזקיקי שיער בעור גב בP1 ו-P7 דמיינו עם פיגמנטציה של מלנין. A, B) עור P1 מWT וFz6 - / -. עכברי C, D) עור P7 מFz6 - / - עכברים. סולם ברים: A ו-B, 500 מיקרומטר; C ו-D, 1 מ"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שליטה בשיטות לנתיחה שתוארו לעיל דורשת רק סבלנות, יד יציבה, וכמה כלים לנתיחה טובים. נתיחת עור הגב היא קלה יחסית, אבל הזנב ועור כף רגל והניתוחים - בעיקר בגילים לאחר לידה מוקדמת - הם יותר מאתגר. בגילים מוקדמים לנשים בהריון (לדוגמא, לפני E15), העור קשה להסיר מבלי לקרוע אותו. נוח, למחקרים רבים של צמיחה ודפוסים של מבני עור בעכברים, האירועים של עניין להתרחש לאחר לידה, כפי שניתן לראות למשל במחקרים של הצמיחה של שרירי פילי arrector 19.

הדמיה עמוקה לתוך העור בתצורת הר שטוחה היא מאתגרת, כי עור הוא רקמה יחסית refractile. אתגר זה הופך להיות יותר כמו העור מתבגר בשל הבידול והעובי מוגבר של שכבות המרכיבות אותה. פתרון חלקי אחד לבעיה זו הוא להפריד את הדרמיס והאפידרמיס ולנתח EpiDermהוא כמבנה נפרד ("mounts כל אפידרמיס"). גישה זו שימושית המאפשרת הדמית זקיקי שיער והמבנים הקשורים בם, במיוחד לעור זנב עכבר. עם זאת, קבלת mounts כל אפידרמיס באיכות גבוהה מעור גב עכבר היא קשה, ככל הנראה עקב (1) הצפיפות הגבוהה של זקיקי שיער שמרחיבים עמוק לתוך הדרמיס ו( 2) הרזון של האפידרמיס interfollicular 13.

מניסיוננו, טיפול BBBA הוא שיטה יעילה ביותר לעיבוד עור שקוף אופטי תוך שמירת אותות immunofluorescent ללא הצורך להפריד בין השכבות באפידרמיס ועורי. בנזיל בנזואט, בו נעשה שימוש כדי לנקות רקמות במשך עשרות שנות 20 וזה נעשה שימוש נרחב כדי לנקות את עוברי צפרדע ודגים. עם זאת, יש BBBA חסרון שזה denatures GFP וחלבונים ניאון אחרים, זה מתמוסס שמן האדום O, וזה יכול לזהם ציוד (למשל, מיקרוסקופים). זה יהיה של interesלא להשוות את טיפול BBBA של עור עם שיטות הבהרה אחרות כגון 21 SeeDB, 22 ClearT, סולם 23, 24 3DISCO, ובהירות 25, שחלקם עולים בקנה אחד עם חלבוני ניאון באופן שיטתי. אם BBBA טופל דגימות הן להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ לנתח, אור / מיקרוסקופ קונבנציונלי ניאון, או מיקרוסקופ confocal, צריכה להיות ממוקמות הדגימות בצלחת זכוכית או בין שני לוחות זכוכית גדולים כדי למזער את זיהום BBBA.

עדיין לא דברנו על ניתוח נתונים בכל פרט, כמו זה הוא יותר ייחודי לשאלה הביולוגית תחת חקירה. עם זאת, כפי שצוין במבוא, נוכחותם של מבנים כמעט זהים רבים כגון זקיקי שיער, צבירי תאי מרקל, וקצוות עצבים, ואת השלמות עם מה שיכול להיות צילמו את המבנים האלה בmounts השטוח מספקת הזדמנות כדי למדוד פרמטרים מבניים או מורפולוגיים בma סטטיסטי קפדניnner, כפי שניתן לראות למשל במחקרים האחרונים של מורפולוגיות האקסון חושיות עורית 10 ושל זקיקי שיער ומבנים הקשורים זקיק בסוג בר ועכברים שעברו מוטציה Fz6 4,8. עם ההתפתחות של כלי ניתוח תמונה מתוחכמים יותר, זה עשוי להיות אפשרי כדי להפוך או חצי אוטומטי חלק מהניתוחים ש, כיום, מבוצעים באופן ידני, ובכך להקל על שימוש רחב יותר של עור שטוח הר הדמיה כשיטה לחוקר את העקרונות שבבסיס ארגון רב תאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. Wiley Blackwell. (2010).
  2. Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
  3. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
  4. Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
  5. Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
  6. Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
  7. Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
  8. Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
  9. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  10. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
  11. Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
  12. Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
  13. Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
  14. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  15. Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
  16. Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
  18. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  19. Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
  20. Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
  21. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  22. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  24. Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  25. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics