माउस त्वचा और बाल कूप patterning और संवेदी एक्जॉन आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अपने आवेदन के फ्लैट माउंट इमेजिंग

Neuroscience

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Summary

ऐसे बालों के रोम और तंत्रिका अंत के रूप में - - स्थानिक संगठन के विशिष्ट पैटर्न है कि प्रदर्शन के स्तनधारी त्वचा संरचनाओं की एक विविध सरणी शामिल हैं. एक फ्लैट माउंट के रूप में त्वचा का विश्लेषण करना त्वचा संरचनाओं का पूर्ण मोटाई उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन करने के लिए इस ऊतक के 2 आयामी ज्यामिति का फायदा उठाते हैं.

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Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

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Abstract

त्वचा की एक अत्यंत विषम ऊतक है. अंतरराज्यीय त्वचीय संरचनाओं बालों के रोम, उठाने वाला जैसे एक एरेक्टर पेशी होती है पिली मांसपेशियों, (जैसे मार्केल सेल समूहों के रूप में) एपिडर्मल विशेषज्ञताओं, वसामय ग्रंथियों, नसों और तंत्रिका अंत, और केशिकाओं शामिल हैं. इन संरचनाओं के स्थानिक व्यवस्था कसकर एक सूक्ष्म स्तर पर नियंत्रित किया जाता है - के रूप में देखा है, उदाहरण के लिए, एक भी बाल कूप के भीतर प्रकार की कोशिकाओं का अर्दली व्यवस्था में - और एक macroscopic पैमाने पर - बाल के हजारों की लगभग समान झुकाव के रूप में देखा त्वचा की एक स्थानीय क्षेत्र के भीतर के रोम. शारीरिक रूप से त्वचा सेक्शनिंग के बिना इन संरचनाओं Visualizing क्योंकि इस अंग की 2 आयामी ज्यामिति के संभव है. इस प्रोटोकॉल में, हम माउस त्वचा, विच्छेदित तय, permeabilized, दाग, और एक अक्षुण्ण दो आयामी वस्तु, एक फ्लैट माउंट के रूप में स्पष्ट किया जा सकता है. प्रोटोकॉल ऑप्ट द्वारा त्वचा के बड़े क्षेत्रों के पूर्ण मोटाई के माध्यम से अपनी संपूर्णता में त्वचा संरचनाओं की आसान दृश्य के लिए अनुमति देता हैराजनैतिक सेक्शनिंग और पुनर्निर्माण. इन संरचनाओं की छवियाँ भी शरीर कुल्हाड़ियों के लिए स्थिति और अभिविन्यास रिश्तेदार के बारे में जानकारी के साथ एकीकृत किया जा सकता है.

Introduction

त्वचा शारीरिक अथवा मानव शरीर संबंधी अर्थ में समास रूप सनसनी, इन्सुलेशन / तापमान, और प्रतिरक्षा रक्षा 1 में महत्वपूर्ण कार्यों के साथ शरीर में सबसे बड़ा अंगों में से एक है. त्वचा विकास और समारोह की आणविक और सेलुलर आधार को समझने क्योंकि एक जैविक प्रणाली और त्वचा विज्ञान के लिए अपनी प्रासंगिकता के रूप में त्वचा के बुनियादी महत्व की लम्बे समय से ब्याज की गई है. स्तनधारी त्वचा keratinocytes के स्तरीकृत परतों, त्वचीय संयोजी ऊतक, बालों के रोम के कई प्रकार, वसामय ग्रंथियों, उठाने वाला जैसे एक एरेक्टर पेशी होती है पिली मांसपेशियों, रक्त वाहिकाओं, और अभिवाही के कम से कम एक दर्जन अलग वर्गों (संवेदी) और अपवाही तंत्रिका सहित बहुकोशिकीय संरचनाओं की एक किस्म शामिल फाइबर (चित्रा 1). शरीर के विभिन्न क्षेत्रों त्वचा की विशेषता से विभिन्न प्रकार के साथ जुड़े रहे हैं. सबसे स्तनधारियों में, लगभग पूरे शरीर की सतह घनी बालों के रोम के साथ पैक किया जाता है कि त्वचा के साथ कवर किया जाता है. [मानव और नग्न तिल चूहों वें करने के लिए अपवाद का गठनपैटर्न है.] बाल भी विशेष एपिडर्मल पैटर्न (dermatoglyphs), बहि: स्त्रावी, और संवेदी तंत्रिका अंत के साथ जुड़े रहे हैं जो हाथ और पैर की हथेली सतहों से लापता है. विकास, भेदभाव, और बाल कूप के भीतर कोशिकाओं के स्थानिक व्यवस्था को नियंत्रित कि सेलुलर और आणविक घटनाओं जीवोत्पत्ति 2 की केंद्रीय सुविधाओं के कई, लघु में, प्रत्येक कूप प्रदर्शन के रूप में विशेष रुचि के हैं. इन सुविधाओं स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व और एक स्टेम सेल आला, ठीक नृत्य सेल प्रवास और embryologically अलग घटकों से बहुकोशिकीय संरचनाओं की विधानसभा में शामिल हैं.

यह लेख विदारक के लिए विधियों का वर्णन, फिक्सिंग, लेबलिंग, और एक अक्षुण्ण दो आयामी पत्र के रूप में इमेजिंग माउस त्वचा, एक "पूरे माउंट" या "फ्लैट माउंट" तैयारी के रूप में भेजा. माउस त्वचा अपेक्षाकृत पतली है, यह चपटा स्की का पूरा मोटाई के माध्यम से छवि के लिए संभव हैn पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग. यह इस प्रकार संरचनाओं ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा पूरी तरह से खंगाला जा करने की इजाजत दी, शारीरिक सेक्शनिंग के लिए की जरूरत को नजरअंदाज क्योंकि स्तनधारी त्वचा इमेजिंग के लिए फ्लैट माउंट दृष्टिकोण तकनीकी रूप से लाभप्रद है. लगभग पूरे त्वचा एक ही वस्तु के रूप में संसाधित किया जाता है, फ्लैट शरीर कुल्हाड़ियों के लिए स्थिति और अभिविन्यास रिश्तेदार के बारे में जानकारी के संरक्षण, जबकि दृष्टिकोण भी शरीर की सतह के कई क्षेत्रों की इमेजिंग की सुविधा माउंट. अंत में, त्वचा के भीतर संरचनाओं आम तौर पर इस प्रकार एक दिया संरचना के कई प्रतिनिधियों से छवियों का संग्रह की सुविधा, नियमित अंतराल पर दोहराया जाता है कि पैटर्न में मौजूद हैं. इन विशेषताओं के रेटिना, neuronal आकारिकी 3 की पढ़ाई के लिए अनुरूप लाभ प्राप्त है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक दो आयामी भाग पर काम करने वाले neurobiologists के लिए परिचित हैं.

यहाँ वर्णित फ्लैट माउंट दृष्टिकोण विशेष utilit की हैत्वचा की दो आयामी विमान के भीतर एक अपेक्षाकृत बड़े पैमाने पर स्थानिक संगठन है कि प्रदर्शन संरचनाओं के अध्ययन के लिए वाई. मार्केल सेल समूहों, उठाने वाला जैसे एक एरेक्टर पेशी होती है पिली मांसपेशियों, वसामय ग्रंथियों, और तंत्रिका अंत 4 - बड़े पैमाने पर स्थानिक संगठन का एक उदाहरण बालों के रोम और बाल कूप जुड़े संरचनाओं के समन्वित ध्रुवता है. बालों के रोम त्वचा के विमान के संबंध में, और त्वचा की 2 आयामी विमान के भीतर निहित है कि कूप वेक्टर के घटक के साथ एक कोण पर केंद्रित कर रहे हैं आम तौर पर प्रत्येक के लिए ठीक निर्धारित है कि शरीर कुल्हाड़ियों के संबंध में एक अभिविन्यास दर्शाती शरीर पर स्थिति. उदाहरण के लिए, विजय - स्तम्भ से वापस बिंदु पर बालों के रोम दुम को और पैर की पृष्ठीय सतह पर बाल बाहर करने के लिए समीपस्थ से इशारा करते हैं. बाल कूप अभिविन्यास तलीय सेल polarity संकेतन द्वारा नियंत्रित किया जाता है (पीसीपी, यह भी कहा जाता है ऊतक ध्रुवता 5). यह संकेत प्रणाली ड्रोसोफिला में खोज की थी, जहां एक छोटे सेकोर पीसीपी जीनों के सेट चर्म संबंधी बाल और बाल के उन्मुखीकरण को नियंत्रित करने के लिए पाया गया था. EGF सात पारित जी प्रकार रिसेप्टर 1 (Celsr1), और Vang की तरह 2 (Vangl2) अंतराल cadherin Frizzled Homolog 6 (भी FZ6 के रूप में भेजा Fzd6,), - - कोर पीसीपी जीनों में से तीन स्तनधारी orthologues स्तनधारी में अनुरूप भूमिका निभाते त्वचा, शरीर कुल्हाड़ियों से बालों के रोम के झुकाव समन्वय. पीसीपी संकेत के अभाव में प्राथमिक दोष के रोम की आंतरिक संरचना पर कोई प्रभाव के साथ, बाल कूप अभिविन्यास का एक प्रारंभिक randomization या गड़बड़ी बताते हैं कि FZ6 पीटा चूहों (- / - इसके बाद FZ6 के रूप में भेजा Fzd6 tm1Nat,) का अध्ययन 6-8. एक दूसरा गैर पीसीपी प्रणाली ऐसी whorls और Tufts के रूप में बड़े पैमाने पर बाल पैटर्न का उत्पादन होता है, जो आसपास के रोम के स्थानीय संरेखण को बढ़ावा देने के लिए बाद में काम करता है.

बड़े पैमाने का एक दूसरा उदाहरणत्वचा के भीतर स्थानिक संगठन संवेदी अक्षतंतु arbors की morphologies में देखा जाता है. त्वचा अंदर आना कि संवेदी न्यूरॉन्स पृष्ठीय रूट और त्रिपृष्ठी ganglia में अपने सेल शरीर है. इन न्यूरॉन्स तापमान, दर्द, खुजली, और त्वचा और बालों 9 पर impinging यांत्रिक विकृतियों के विभिन्न प्रकारों का पता लगाने. वे अक्षतंतु व्यास और चालन वेग, टर्मिनल तंत्रिका समाप्त संरचना, और रिसेप्टर्स, चैनलों, और अन्य अणुओं की अभिव्यक्ति के पैटर्न पर आधारित उपप्रकारों में विभाजित किया जा सकता है. क्योंकि त्वचा के भीतर स्फूर्तिदान के उच्च घनत्व की, कि (एक एकल कोशिका प्रकार एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है जब देखा है) सब axons (जैसे, विरोधी neurofilament immunostaining) या एक एकल वर्ग के भी सभी axons visualizing शामिल विश्लेषण करती है आम तौर पर यह असंभव एक व्यक्ति कुंज की आकृति विज्ञान को परिभाषित करने के लिए करता है कि axons की एक घने superposition पता चलता है. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम अत्यंत विरल आनुवंशिक रूप से निर्देशित एल का इस्तेमाल किया हैabeling व्यक्ति को अच्छी तरह से पृथक अक्षतंतु arbors एक histochemical संवाददाता, मानव अपरा alkaline फॉस्फेट 10 की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं, जिसमें पृष्ठीय त्वचा के नमूनों का निर्माण करने के लिए. यह दृष्टिकोण व्यक्ति अक्षतंतु कुंज morphologies का स्पष्ट दृश्य और शब्द के भागों मानदंडों के आधार पर somatosensory न्यूरॉन प्रकार की एक परिभाषा की अनुमति देता है.

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Protocol

इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार में प्रदर्शन किया गया था. पशुओं के सभी अनुमोदित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति जॉन्स हॉपकिन्स मेडिकल संस्थानों के (IACUC) प्रोटोकॉल MO11M29 के अनुसार संभाल रहे थे. इच्छामृत्यु की मंजूरी दे दी है तरीकों के लिए अपने स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों से परामर्श करें. एल्डिहाइड fixatives या कार्बनिक विलायकों जब संभाल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा पहनें.

माल की 1. तैयारी

  1. Sylgard प्लेट्स डालने का कार्य
    1. , निर्माता के निर्देशों का पालन आधार के साथ इलाज एजेंट मिश्रण है, और एक प्लास्टिक की छड़ी के साथ हलचल.
    2. पिपेट ~ 35 मिलीलीटर तरल Sylgard 10 सेमी व्यास टिशू कल्चर पकवान प्रति. टिशू कल्चर व्यंजन मानक बैक्टीरियल व्यंजन से भी गहरा कर रहे हैं; इस कीट पिन के लिए खड़ी की मंजूरी प्रदान करता है.
    3. Di रखेंरात भर कमरे के तापमान पर एक क्षैतिज सतह पर वह. मिश्रण के दौरान गठन बुलबुले गायब हो जाएगा.
    4. Polymerization के बाद, कमरे के तापमान पर Sylgard प्लेटों की दुकान.
      नोट: Sylgard थाली से detaches तक Sylgard प्लेटें कई बार साल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया और फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. समाधान
    1. लोबान Benzoate और लोबान शराब (BBBA). 2 संस्करणों बेंजाइल बेंजोएट और 1 मात्रा बेंजाइल अल्कोहल का मिश्रण. एक गिलास डाट या Teflon शीर्ष के साथ एक कांच की बोतल में अंधेरे में स्टोर.
      चेतावनी: BBBA प्रयुक्त उचित विलायक कार्बनिक अपशिष्ट के रूप में नियंत्रित किया जाना चाहिए. BBBA प्लास्टिक से संपर्क करने की अनुमति न दें.
    2. फास्फेट खारा (पीबीएस) buffered. 80 मिलीलीटर पानी के लिए 4 जी पीएफए ​​जोड़ें, 70 डिग्री सेल्सियस ~ 5 मिनट के लिए पीएफए ​​पूरी तरह भंग है जब तक ~ पर एक गर्म थाली पर हलचल, 0.1 एमएल 1 एन NaOH जोड़ने, और फिर 10 मिलीलीटर 10x पीबीएस जोड़ने और 100 मात्रा लाओ पानी के साथ एमएल.
      चेतावनी: formaldehyde / पीएफए ​​और BBBA वाष्प की साँस लेना होना चाहिएकवर कंटेनर में इन समाधान रखने के द्वारा कम. Formaldehyde / पीएफए ​​एक कैसरजन.
    3. तेल लाल ओ isopropanol में एक 0.5% शेयर तैयार करें. तुरंत उपयोग से पहले 0.3% तेल लाल ओ की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पानी के साथ पतला, और फिर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.

2. त्वचा विच्छेदन, निर्धारण, और क्लियरिंग

  1. Immunostaining और मेलेनिन इमेजिंग के लिए त्वचा पृष्ठीय
    1. बहुत युवा चूहों (जैसे, भ्रूण और प्रसव के बाद दिन (पी) 0 पी 3 पिल्ले) के लिए, isoflurane साँस लेना द्वारा चूहों euthanize. Isoflurane साँस लेना द्वारा या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद ketamine / xylazine इंजेक्शन द्वारा बड़े चूहों euthanize.
    2. एक बिजली के रेजर और बालों को हटाने की जेल के साथ बाल निकालें. P8 से अधिक युवा चूहों के लिए, इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है.
    3. कान और अंत करने के लिए पार्श्व आगे बढ़ने से, प्रत्येक अंग के आधार के पृष्ठीय पक्ष पर गुजर, प्रत्येक दिशा साथ पूंछ के आधार से एक क्षैतिज कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करेंनाक पर आईएनजी.
    4. धीरे यह संदंश द्वारा pinched नहीं है कि इतनी दस्ताने उंगलियों के बीच त्वचा धारण करके पूर्वकाल को पीछे से अंतर्निहित ऊतक कार्यवाही से त्वचा छील. कान के स्तर पर त्वचा छीलने, जब पहली कैंची की एक जोड़ी के साथ कान काट और त्वचा इस स्थान पर फाड़ कर सकते हैं के रूप में विशेष रूप से धीरे धीरे आगे बढ़ना.
    5. इस बिंदु से आगे, ऊपर का सामना करना पड़ अंदर से त्वचा पूरबी. ~ 20 कीट पिन समान रूप से परिधि के आसपास स्थान दिया गया है साथ Sylgard को त्वचा पिन; त्वचा (चित्रा 2B) पर खिंचाव नहीं है. पीबीएस के 10-20 मिलीलीटर के साथ त्वचा को कवर.
    6. संदंश त्वचा घुसना होगा कि जोखिम को कम करने के लिए क्षैतिज रूप से सामना करना पड़ रहा संदंश के अंत बताया साथ angled या घुमावदार संदंश का उपयोग त्वचा से जुड़े वसा और संयोजी ऊतक दूर काटना. धीरे त्वचा की सतह पर एक कपास इत्तला दे दी applicator रोलिंग द्वारा त्वचा के नीचे फंस गया है कि किसी भी हवाई बुलबुले बाहर निकालना.
      नोट: त्वचा जा रहा हैफ्लैट माउंट immunostaining या ऊतकरसायनविज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, संभव के रूप में संयोजी ऊतक की बहुत दूर; त्वचा मेलेनिन pigmentation के आधार पर बालों के रोम कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, संयोजी ऊतक की कम पूरी तरह हटाने संतोषजनक है. जन्म के पूर्व त्वचा पक्षपाती संयोजी ऊतक की न्यूनतम "सफाई" की आवश्यकता है.
    7. 10 सेमी Sylgard प्रति प्लेट 20 हौसले से तैयार 4% पीएफए ​​/ पीबीएस के मिलीलीटर या 10% बफर formalin जोड़कर टिकी त्वचा को ठीक करें या हौसले से तैयार की 20 मिलीलीटर (त्वचा मेलेनिन इमेजिंग या alkaline फॉस्फेट (एपी) ऊतकरसायनविज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा अगर) 2% पीएफए ​​/ पीबीएस (त्वचा immunostaining या visualizing ट्रांसजेनिक केरातिन (Krt) 17-GFP 11 के लिए इस्तेमाल किया जाएगा अगर), और धीरे से एक ठंडे कमरे में रात भर बारी बारी से. अगले दिन,> 10 मिनट के लिए पीबीएस में धो लो.
      ध्यान दें: मानक formalin 37% formaldehyde है; इसलिए, "10% formalin" 3.7% formaldehyde है.
    8. एपी धुंधला और immunostaining के लिए, धारा 3 में जारी है. मेलेनिन imag के लिएआईएनजी, कमरे के तापमान पर कोमल क्षैतिज रोटेशन के साथ एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से त्वचा (70%, 95%, 100%), हर कदम के लिए एक दिन, निर्जलीकरण. अवशिष्ट संयोजी ऊतक निकालें.
    9. 100% इथेनॉल में त्वचा के साथ, कीट पिन हटाने और, अगर वांछित, पिन छेद के साथ त्वचा की सबसे परिधीय 1-2 मिमी दूर करने के लिए कैंची के साथ त्वचा ट्रिम.
    10. , एक 10 सेमी व्यास कांच डिश के लिए त्वचा स्थानांतरण कर्लिंग से इसे रोकने के लिए त्वचा पर दो गिलास खुर्दबीन स्लाइड जगह है, और BBBA की 20 मिलीलीटर जोड़ें. त्वचा BBBA जोड़ने से पहले गिलास स्लाइड के भार के नीचे चपटी हो करने के लिए यह महत्वपूर्ण है ताकि BBBA तेजी से ऊतक और मज़बूत बनाता है.
    11. अगले कई घंटे से अधिक, BBBA त्वचा पर धोने के लिए अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए त्वचा से दूर स्लाइड उठा.
      नोट: BBBA साथ काम करते समय दस्ताने पहनें. त्वचा की उम्र और स्थान के आधार पर BBBA में जितना 30% सिकुड़न हो सकता है.
  2. बाल कूप Patte के विश्लेषण के लिए फुट त्वचाrning
    नोट: आम तौर पर जांच की उम्र की सीमा P1-P8 है.
    1. इच्छामृत्यु के बाद, पैर टखने संयुक्त ऊपर काट दिया और पैरों के तलवों के माध्यम से उदर सतह के साथ एक भी सीधे काट कर.
    2. धीरे बाहर का दिशा के लिए एक समीपस्थ में आगे बढ़ने, अंतर्निहित ऊतक से त्वचा छील.
    3. त्वचा जारी है और अंदर की सतह (चित्रा -2) का सामना करना पड़ के साथ Sylgard को पिन करने के लिए अंक काट दिया. पैर की त्वचा पर कम से कम संयोजी ऊतक है.
    4. ट्रांसजेनिक Krt17-GFP त्वचा अब इमेजिंग के लिए तैयार है. खंड 2.1 में वर्णित के रूप में मेलेनिन इमेजिंग के लिए निर्धारण, निर्जलीकरण और BBBA समाशोधन के साथ आगे बढ़ना.
  3. Visualizing वसामय ग्रंथियों के लिए फुट त्वचा
    1. इच्छामृत्यु के बाद, एक दस्ताने उंगली और अंगूठे के साथ त्वचा की सतह पर बाल पदच्युत जेल रगड़ से बाल हटाने; 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
      नोट: नाजुक पैर की त्वचा को नुकसान होगा, जो एक बिजली के रेजर का इस्तेमाल न करें.
    2. डब्ल्यूनल के पानी के साथ त्वचा की सतह राख काटना और खंड 2.2 में वर्णित के रूप में Sylgard को त्वचा पिन.
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1% पीएफए ​​/ पीबीएस के साथ ठीक है और फिर पीबीएस में धो लो.
      नोट: यह पहला बाल चक्र 12 के दौरान बाल रंजकता के नादिर के निशान, और इसलिए वसामय ग्रंथियों क्योंकि पहले प्रसव के बाद सप्ताह के बाद विकसित जो पैर, पर वसामय ग्रंथियों दृश्यमान करने के लिए, तेल लाल ओ के साथ विश्लेषण के लिए इष्टतम उम्र, P21 है और अधिक आसानी से देखा जा सकता है. सूरजमुखी मनुष्य चूहों के साथ इस विश्लेषण किसी भी उम्र में किया जा सकता है. ऐसे C57BL/6J-Tyr सी 2j के रूप में एक tyrosinase उत्परिवर्ती लाइन के लिए सूरजमुखी मनुष्य संतान पार pigmented उत्परिवर्ती चूहों प्राप्त करें.
  4. मेलेनिन वितरण का विश्लेषण, बाल कूप अभिविन्यास, और चिकना ग्रंथि दृश्य के लिए टेल त्वचा तैयारी
    1. इच्छामृत्यु के बाद, पूंछ के आधार पर चारों ओर एक परिपत्र कटौती, और फिर अपने उदर चेहरा साथ पूंछ की लंबाई चलाता है कि एक अनुदैर्ध्य भट्ठा बनाते हैं.
    2. <ली> मजबूती से पूंछ हड्डी और / या एक संदंश की जोड़ी और संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ त्वचा के साथ संयोजी ऊतक की नोक लोभी द्वारा नोक पर शुरू पूंछ त्वचा छील. Sylgard पूंछ त्वचा पिन.
    3. मेलेनिन वितरण और बाल कूप उन्मुखीकरण के विश्लेषण के लिए, तय करने और खंड 2.1 में वर्णित के रूप में त्वचा की प्रक्रिया. वसामय ग्रंथियों के विश्लेषण के लिए, क्षेत्रों की एक श्रृंखला में पूंछ त्वचा में कटौती ~ 0.5-1 पूर्व निर्धारण करने के लिए लंबाई में सेमी और dermis-एपिडर्मिस आसंजन 13 को कमजोर करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पीबीएस / 5 मिमी EDTA में त्वचा टुकड़े सेते हैं.
    4. धीरे, डर्मिस से एपिडर्मिस छील Sylgard (भीतरी चेहरा) को एपिडर्मिस पिन, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में यह तय कर लो. पीबीएस के साथ धो लें, और नीचे वर्णित के रूप में तेल लाल ओ के साथ दाग.
      नोट: एक बिजली के रेजर और / या बालों को हटाने जेल से पहले पुराने पूंछ त्वचा (जैसे, P21) विदारक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन पूंछ पर बाल नहीं है क्योंकि इस उपचार वैकल्पिक हैशरीर पर कहीं और के रूप में के रूप में घने.

3. धुंधला प्रतिक्रियाओं

  1. मानव अपरा alkaline फॉस्फेट (एपी) ऊतकरसायनविज्ञान कल्पना को एक्जॉन Arbors 10,14,15 आनुवांशिक रूप से लेबल (आंकड़े 3 ए, बी)
    1. Sylgard पर पीएफए ​​निर्धारण के बाद, एक 10 सेमी गिलास पकवान में तय की खाल जगह और पीबीएस / 1 मिमी 2 MgCl के तहत डूब. धीरे अंतर्जात फॉस्फेट गतिविधि को नष्ट करने के लिए 90 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पकवान बारी बारी से.
    2. आम तौर पर 10-15 का उपयोग 0.1 एम Tris, पीएच 9.5, 0.1 एम NaCl, 50 मिमी 2 MgCl, 0.34 माइक्रोग्राम / एमएल एनबीटी, और 0.175 ग्राम / एमएल BCIP में कमरे के तापमान पर एक 4-48 घंटे ऊष्मायन, साथ histochemically एपी रिपोर्टर गतिविधि कल्पना P21 पृष्ठीय त्वचा प्रति धुंधला समाधान के मिलीलीटर. अविशिष्ट एनबीटी बयान को अक्षतंतु धुंधला तीव्रता रिश्तेदार के दृश्य निरीक्षण से न्याय के रूप में यह इष्टतम समय से परे आगे बढ़ने के लिए नहीं जाने ख्याल रख रही है, विदारक खुर्दबीन के नीचे प्रतिक्रिया मॉनिटर. तीन 1 घंटा के पाठ्यक्रम पर PBS/0.1% बीच 20 का परिवर्तन, Sylgard करने के लिए फिर से पिन खाल, एक इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से खाल निर्जलीकरण, और फिर से एक 10 सेमी पकवान खाल हस्तांतरण के साथ कपड़े धोने की प्रतिक्रिया बंद करो BBBA.
      नोट: BBBA धीरे धीरे एनबीटी वेग घुल. BBBA में पहले कुछ घंटों के दौरान उपजी एनबीटी का जुर्माना पृष्ठभूमि को भंग करेंगे; नतीजतन, BBBA समाधान काला कर देगा, और त्वचा हल्का होगा. कुछ घंटों के बाद ताजा BBBA को बदलें.
    3. एपी से सना हुआ त्वचा इमेजिंग के बाद, कमरे के तापमान पर> 1 घंटा के लिए इथेनॉल को हस्तांतरण और तब -20 डिग्री सेल्सियस पर ताजा इथेनॉल में स्टोर एपी से सना हुआ खाल संकेत का कोई नुकसान के साथ कई महीनों के लिए इस तरह से संग्रहित किया जा सकता है.
  2. तेल लाल ओ धुंधला वसामय ग्रंथियों 4 (आंकड़े -3 सी एफ) कल्पना करने के लिए
    1. कीट पिन निकालें और के साथ, 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर थाली के कुओं को Sylgard थाली से हल्के से तय पैर या पूंछ खाल हस्तांतरणअच्छी तरह से प्रति दो त्वचा के नमूनों पर निर्भर है. 60:40 isopropanol से धो लें: पानी कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए.
    2. पानी (खंड 1.2 देखें) 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर: 60:40 isopropanol में 2 मिलीलीटर 0.3% तेल लाल ओ में दाग.
    3. 60:40 isopropanol से धो लें: पानी एक पानी से धो द्वारा पीछा कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए. त्वचा की सतह के रूप में संभव के रूप में फ्लैट बनाया जा सकता है इसलिए सावधानी से ठीक कैंची के साथ पिन छेद सहित त्वचा के किनारों, दूर ट्रिम.
    4. , एक पानी की कुछ बूँदें या जलीय बढ़ते मध्यम जोड़ने एक coverslip के साथ त्वचा को कवर किया है, और फिर धीरे से आगे त्वचा समतल करने के लिए स्लाइड करने के लिए coverslip टेप, बाहरी सतह का सामना करना पड़ के साथ एक स्लाइड पर त्वचा रखें.
  3. फ्लैट माउंट Immunostaining 4,16,17 (आंकड़े 3 जी, एच)
    1. एक असममित कटौती (जैसे पूर्वकाल सही कोने क्लिप) के साथ अपनी अभिविन्यास अंकन, पीएफए ​​तय त्वचा (जैसे 1 सेमी x 0.5 सेमी) की एक आयत में कटौती. ऊष्मायन और प्रदर्शनएक घूर्णन क्षैतिज मंच पर कोमल रोटेशन के साथ कदम से धो लो. एक 6 के कुओं में - या 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट, अवशिष्ट पीएफए ​​दूर करने के लिए पीबीएस के साथ कई बार धोने, पर मानव संसाधन 5-8 से अधिक 0.3% ट्राइटन X-100 (0.3% PBST) के साथ पीबीएस की ~ 10 परिवर्तन से धो लें त्वचा permeabilize करने के लिए कमरे के तापमान.
    2. कमरे के तापमान पर पांच दिनों के लिए 5% बकरी सीरम और 20% DMSO के साथ 0.3% PBST में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. स्पष्ट टेप या बाष्पीकरणीय घाटे को खत्म करने के लिए चिपकने वाला प्लास्टिक के साथ थाली के कुओं को कवर किया.
    3. 5-8 घंटे से अधिक 0.3% PBST की 10-15 परिवर्तन के साथ धोएं और कमरे के तापमान पर 3 दिनों के लिए 5% बकरी सीरम और 20% DMSO के साथ 0.3% PBST में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
    4. 5-8 घंटे से अधिक 0.3% PBST की 10-15 परिवर्तन के साथ धोएं.
    5. 5 मिनट 20 मिनट प्रत्येक के लिए प्रत्येक और फिर 3x 100 में% मेथनॉल के लिए 25%, 50%, और 75% मेथनॉल में निर्जलीकरण.
    6. रात भर कमरे के तापमान पर BBBA में साफ.
      नोट: फ्लैट की तुलना में छोटी त्वचा के immunostaining माउंट~ P1 के रूप में ऊपर वर्णित है, लेकिन कम ऊष्मायन के साथ प्रदर्शन किया और बार धोने जा सकता है. उदाहरण के लिए, P1 त्वचा प्राथमिक एंटीबॉडी में एक रात ऊष्मायन और माध्यमिक एंटीबॉडी में एक कई घंटे ऊष्मायन के साथ immunostained, और 0.3% PBST में केवल 2-3 घंटे के washes के बीच के साथ किया जा सकता है. ऊपर बताया गया है, युवा खाल भी वे BBBA समाशोधन के बिना imaged किया जा सकता है कि पर्याप्त रूप से पतले होते हैं.
  4. फ्लोरिसेंट तंत्रिका टर्मिनल डाई तेज के साथ मार्केल सेल समूहों Visualizing (3I-एल के आंकड़े)
    एमी -43 (हरा) और AM4-65 (लाल) गैर चयनात्मक कटियन चैनल 18 के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश कि फिक्स फ्लोरोसेंट रंगों हैं. रहने वाले त्वचा में इन रंगों चुनिंदा लिया जाता है और मार्केल कोशिकाओं में ध्यान केंद्रित किया.
    1. सेल्सियस -80 पर aliquots में 1 मिलीग्राम AM1-43 या AM4-65 2 मिलीलीटर पीबीएस में और दुकान भंग
    2. एक 29 जी सुई का उपयोग ग्राम शरीर के वजन के प्रति 2-10 ग्राम डाई के साथ subcutaneously नवजात पिल्ले इंजेक्षन.
    3. एक दिन बाद, चूहों और disse euthanizeपृष्ठीय खाल सीटी.
    4. , 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में खाल फिक्स पीबीएस के साथ धोने, और धारा 3.2 में वर्णित के रूप में त्वचा माउंट.

4. इमेजिंग और छवि विश्लेषण

  1. इमेजिंग बाल कूप अभिविन्यास (चित्रा 4)
    1. , BBBA में डूबे हुए एक गिलास स्लाइड के नीचे चपटा, और अभी भी कांच डिश में कर रहे हैं कि छवि पृष्ठीय, पैर, या पूंछ खाल के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें - इस दृष्टिकोण माइक्रोस्कोप की BBBA संदूषण को कम करता है.
    2. नीचे से पकवान रोशन. , देखने के क्षेत्र भर में रोशनी की तीव्रता में स्थानिक विभिन्नता को कम से कम 10 सेमी विदारक माइक्रोस्कोप के मानक काम कर सतह से ऊपर ~ ऊंचाई तक गिलास पकवान तरक्की और प्रकाश स्रोत पर एक diffusing प्लास्टिक या कांच की थाली रखने के लिए.
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए 100% इथेनॉल के लिए त्वचा पर लौटें
      नोट: अधिक से अधिक एक दिन के लिए BBBA में त्वचा जा मेलेनिन कणिकाओं को तोड़ने के लिए कारण बनता है एकभाग. त्वचा BBBA इलाज हो जाने के बाद यह कड़ा और आगे उस जगह से फ्लैट रहेगा. वे फ्रीजर में अंतरिक्ष को बचाने के लिए, एक साथ स्टोर किया जा सकता है, ताकि अलग खाल, उनके पूर्वकाल और / या पीछे समाप्त होता है पर notches के एक श्रृंखला के साथ कोडित किया जा सकता है.
  2. इमेजिंग और ट्रेसिंग एक्जॉन Arbors (आंकड़े 3 ए, बी)
    1. छोटे प्रोटीन जैल के लिए इस्तेमाल किया प्रकार के दो गिलास प्लेट के बीच एपी दाग ​​त्वचा (धारा 3.1.3) रखें. प्लेटें और त्वचा के बीच हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें, और फिर ध्यान से एक कागज तौलिया के साथ किसी भी अतिरिक्त BBBA दूर बाती. एक खुर्दबीन मंच (चित्रा 2 डी) पर थाली त्वचा प्लेट की सैंडविच रखें.
    2. एक 10X उद्देश्य और 2 माइक्रोन या 5 माइक्रोन z-कदम के साथ उज्ज्वल क्षेत्र या डीआईसी रोशनी का उपयोग करें. एक भी तीन आयामी ग्रे पैमाने पर डेटा सेट बनाने के लिए एक साथ सिले हैं कि XY छवियों का एक असेंबल कब्जा करने के लिए एक यंत्रीकृत XY मंच का प्रयोग करें.
      नोट: एक ही बड़ा अक्षतंतु कुंज के लिए, यह डेटा सेट एक हो सकता है5 जीबी के रूप में बड़ा है.
    3. मैनुअल, स्वचालित, या सॉफ्टवेयर संकुल की एक किस्म से किसी के साथ अक्षतंतु arbors की अर्द्ध स्वचालित ट्रेसिंग कार्य करें.
      नोट: इस तरह के Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) के रूप में सॉफ्टवेयर एक पीसी वातावरण में चलाता है और 10 मास्टर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है कि एक मुक्त neuronal पुनर्निर्माण उपकरण है.

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Representative Results

त्वचा flatmounts की brightfield इमेजिंग मेलेनिन pigmentation (चित्रा 4) के आधार पर छवि त्वचीय संवेदी afferents (चित्रा 3A 10) और बाल कूप पैटर्न के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. त्वचा flatmounts के confocal इमेजिंग विरोधी cytokeratin-6 के साथ या के साथ विरोधी visualized AM डाई तेज (3I-एल आंकड़े), (2) उठाने वाला जैसे एक एरेक्टर पेशी होती है पिली मांसपेशियों, साथ कल्पना (1) मार्केल सेल समूहों, की ज्यामिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चिकनी पेशी actin (आंकड़े 3 जी, एच), (3) तेल लाल हे (आंकड़े -3 सी एफ), और एक Krt17-GFP transgene साथ या विरोधी Krt17 एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा कल्पना (4) बालों के रोम, साथ कल्पना वसामय ग्रंथियों, 4 (आंकड़े 3E जी, कश्मीर, एल). यह मैन्युअल रूप से Adobe Photoshop या Illustrator का उपयोग कर ढांचे पर ज्ञात अभिविन्यास वैक्टर रखने, और फिर quantifyin द्वारा इस तरह के चित्र में संरचनाओं का झुकाव और स्थानिक व्यवस्था स्कोर करने के लिए सरल हैजी परिणामस्वरूप वेक्टर आबादी. इस दृष्टिकोण कई सौ वैक्टर के पैमाने के लिए suffices है, यह एक 10 पर बेहद कठिन होगा - या बड़े पैमाने पर 100 गुना.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रमुख संरचनाओं दिखा स्तनधारी बालों वाली त्वचा के योजनाबद्ध. (कॉपीराइट, Terese लांस.)

चित्रा 2
चित्रा 2. एक Sylgard थाली. डी) के लिए टिकी एक Sylgard प्लेट पर टिकी त्वचा विच्छेदन और नमूना हैंडलिंग. ए) विच्छेदन उपकरण. बी) ए पी -5 पृष्ठीय त्वचा. सी) ए पी -5 पृष्ठीय हिंद पैर त्वचा इमेजिंग के लिए 2 गिलास जेल प्लेटों के बीच घुड़सवार एक पृष्ठीय त्वचा डब्ल्यूएक 10X उद्देश्य और डीआईसी या brightfield रोशनी रबर.

चित्रा 3
फ्लैट में चित्रा 3. त्वचा संरचनाओं देखा माउंट. ए, बी) एक एकल त्वचीय संवेदी कुंज (बाएं) और एक Brn3a CKOAP / + की एक P21 पृष्ठीय त्वचा से अपनी पता लगाया छवि (दाएं);. एनएफएल CreER / + माउस गर्भावधि दिन 17 पर tamoxifen कम खुराक के संपर्क में इस प्रोटोकॉल परिणाम पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की एक बहुत छोटा सा अंश में रिपोर्टर है, और इसलिए त्वचीय संवेदी arbors का एक छोटा सा अंश मानव अपरा alkaline फॉस्फेट (एपी) संवाददाता के साथ चिह्नित कर रहे हैं की Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन में. लेबल axons एनबीटी / BCIP ऊतकरसायनविज्ञान साथ कल्पना कर रहे हैं. Brn3a यों से वसामय ग्रंथियों कल्पना करने के लिए तेल लाल ओ के साथ दाग तेल त्वचा Pou4f1. सी, डी) के रूप में जाना जाता हैगुम्मट (बाएं) और FZ6 - / - P21 पर (सही) चूहों. FZ6 - / - संरचनाओं बेतरतीब हैं. पी, समीपस्थ; . गुम्मट (बाएं) और FZ6 से विकास, बाहर का ई, एफ) पृष्ठीय पैर त्वचा - / - Krt17-GFP ले जाने (दाएं) चूहों. त्वचा P21 पर काटा और तेल लाल ओ FZ6 साथ सना हुआ था - / - त्वचा इसके केंद्र में एक बाल वोर्ल है. पी, समीपस्थ; [विरोधी चिकनी पेशी actin (SMA के साथ कल्पना पैनल जी) और उठाने वाला जैसे एक एरेक्टर पेशी होती है पिली मांसपेशियों;. P21 दिखा एक Krt17-GFP transgene और विरोधी GFP immunostaining के साथ कल्पना बालों के रोम (कम से एक WT माउस से विकास, बाहर का जी, एच) पृष्ठीय त्वचा ) immunostaining; पैनल एच]. Confocal Z-ढेर छवि के भीतर गहराई रंग कोडित है. ए, पूर्वकाल; पी, पीछे. आईएल cytokeratin8 immunostaining या AM11-43 डाई तेज के साथ कल्पना) एक मार्केल सेल क्लस्टर () और Krt17 जी के साथ पैनल कश्मीर और एल में कल्पना की अपनी केंद्रीय बाल कूप (एफ पी). छवियाँ संकेत जीनोटाइप से P1 पृष्ठीय त्वचा से प्राप्त किया गया. FZ6 - / - WT मार्केल सेल क्लस्टर पूर्वकाल की ओर खुला है जबकि मार्केल सेल क्लस्टर, एक बंद चक्र रूपों. ए, पूर्वकाल; पी, पीछे. स्केल सलाखों: ए और बी, 300 माइक्रोन; सी और डी, 500 माइक्रोन; ई और एफ, 500 माइक्रोन; जी और एच, 200 मीटर; आईएल, 50 माइक्रोन. (पैनलों ए और बी eLife और प्रोक से reproduced हैं. Natl. Acad. विज्ञान. अमरीका, अनुमति 4,10) के साथ इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. बाल और P1 और P7 पर पृष्ठीय त्वचा में बालों के रोम मेलेनिन pigmentation के साथ कल्पना. WT और FZ6 से ए, बी) P1 त्वचा - / - चूहों एम> - / -. FZ6 से चूहों सी, डी) P7 त्वचा. स्केल सलाखों: ए और बी, 500 माइक्रोन; सी और डी, 1 मिमी.

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Discussion

ऊपर वर्णित विच्छेदन तरीकों की महारत ही धैर्य, एक स्थिर हाथ, और कुछ अच्छा विच्छेदन उपकरणों की आवश्यकता है. पृष्ठीय त्वचा विच्छेदन अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन पूंछ और पैर त्वचा dissections - विशेष रूप से जल्दी प्रसव के बाद उम्र में - अधिक चुनौती दे रहे हैं. (E15 से पहले जैसे,) जल्दी जन्म के पूर्व उम्र में, त्वचा इसे फाड़ के बिना दूर करने के लिए मुश्किल है. सुविधाजनक, विकास और चूहों में त्वचा संरचनाओं के patterning के कई अध्ययनों के लिए, ब्याज की घटनाओं उठाने वाला जैसे एक एरेक्टर पेशी होती है पिली मांसपेशियों 19 के विकास के अध्ययन में उदाहरण के लिए के रूप में देखा, postnatally होते हैं.

त्वचा एक अपेक्षाकृत refractile ऊतक है क्योंकि गहरे एक फ्लैट माउंट विन्यास में त्वचा में इमेजिंग चुनौती दे रहा है. त्वचा की वजह से भेदभाव और उसके घटक परतों की वृद्धि की मोटाई के रूप में परिपक्व इस चुनौती अधिक से अधिक हो जाता है. इस समस्या का एक आंशिक समाधान dermis और epidermis अलग और Epiderm का विश्लेषण करने के लिए हैएक अलग संरचना ("एपिडर्मल पूरे mounts") के रूप में है. यह दृष्टिकोण विशेष रूप से माउस पूंछ त्वचा के लिए, बालों के रोम और उनके संबद्ध संरचनाओं दृश्यमान करने के लिए उपयोगी है. हालांकि, माउस पृष्ठीय त्वचा से उच्च गुणवत्ता वाले एपिडर्मल पूरे mounts प्राप्त संभवतः कारण गहरी dermis में विस्तार है कि बालों के रोम के (1) उच्च घनत्व और interfollicular एपिडर्मिस 13 (2) के पतलेपन को, मुश्किल है.

हमारे अनुभव में, BBBA उपचार एपिडर्मल और त्वचीय परतों को अलग करने की आवश्यकता के बिना Immunofluorescent संकेतों जबकि संरक्षण ऑप्टिकली पारदर्शी त्वचा प्रतिपादन के लिए एक बेहद कारगर तरीका है. लोबान-बेंजोएट दशकों 20 के लिए ऊतकों खाली करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और यह व्यापक रूप से मेंढक और मछली भ्रूण खाली करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, BBBA यह GFP और अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन denatures कि नुकसान है, यह तेल लाल ओ घुल, और यह उपकरण (जैसे, सूक्ष्मदर्शी) दूषित कर सकते हैं. यह interes का होगायोजनाबद्ध तरीके से ऐसे SeeDB 21, ClearT 22, स्केल 23, 3DISCO 24, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संगत कर रहे हैं जिनमें से कुछ की स्पष्टता 25, के रूप में अन्य स्पष्टीकरण के तरीकों के साथ त्वचा की BBBA इलाज तुलना करने के लिए टी. BBBA नमूने, एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged किया जा करने के लिए एक पारंपरिक प्रकाश / फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, या एक confocal खुर्दबीन हैं इलाज किया, तो नमूने BBBA प्रदूषण को कम करने के लिए एक गिलास पकवान में या दो बड़े गिलास प्लेट के बीच में रखा जाना चाहिए.

इस जांच के तहत जैविक प्रश्न को अधिक विशेष स्वभाव का है, जैसा कि हम किसी भी विस्तार में डेटा विश्लेषण पर चर्चा नहीं की है. परिचय में उल्लेख किया लेकिन, जैसा कि इन संरचनाओं फ्लैट Mounts में imaged किया जा सकता है जिसके साथ इस तरह के बालों के रोम, मार्केल सेल समूहों, और तंत्रिका अंत, और पूर्णता के रूप में कई लगभग समान संरचनाओं की उपस्थिति संरचनात्मक या शब्द के भागों मापदंडों को मापने के लिए एक अवसर प्रदान करता है एक सांख्यिकीय कठोर एमए मेंnner, त्वचीय संवेदी अक्षतंतु morphologies 10 के और बालों के रोम और जंगली प्रकार और FZ6 उत्परिवर्ती चूहों 4,8 में कूप जुड़े संरचनाओं के हाल ही के अध्ययन में उदाहरण के लिए के रूप में देखा. अधिक परिष्कृत छवि विश्लेषण उपकरणों के विकास के साथ, यह वर्तमान में है, जिससे त्वचा के व्यापक उपयोग की सुविधा, मैन्युअल रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं कि विश्लेषण से कुछ को स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित करने के लिए संभव हो सकता है फ्लैट सिद्धांतों की जांच के लिए एक विधि के रूप में इमेजिंग माउंट बहुकोशिकीय संगठन.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

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References

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