Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

Immunology and Infection

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Summary

Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

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Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

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Abstract

Il timo è un organo vitale per lo sviluppo dei linfociti T. Di cellule stromali del timo, le cellule epiteliali timiche (TEC) sono particolarmente cruciali in più stadi di sviluppo delle cellule T: l'impegno delle cellule T, selezione positiva e selezione negativa. Tuttavia, la funzione del TEC nel timo rimane completamente compresa. Nell'articolo, mettiamo a disposizione un metodo per isolare sottoinsiemi TEC da topo fresco timo utilizzando una combinazione di perturbazione meccanica e digestione enzimatica. Il metodo permette di cellule stromali timiche e timociti per essere efficacemente rilasciato dalla cellula-cellula e connessioni cellula-matrice e per formare una cella singola sospensione. Usando le cellule isolate, citometria a flusso multiparametrica può essere applicato alla identificazione e caratterizzazione di TEC e cellule dendritiche. Perché TEC sono una rara popolazione di cellule nel timo, anche noi descriviamo un modo efficace per arricchire e purificare TEC mediante deplezione timociti, il tipo cellulare più abbondante nel timo. Folloala l'arricchimento, cell sorting tempo può essere ridotto in modo che la perdita di vitalità cellulare può essere minimizzato durante la purificazione della TEC. Cellule purificate sono adatti per varie analisi a valle come Real Time-PCR, Western blot e profilo di espressione genica. Il protocollo promuoverà la ricerca della funzione TCE e così come lo sviluppo di ricostituzione in vitro di cellule T.

Introduction

All'inizio lo sviluppo delle cellule T, midollo osseo di cellule staminali ematopoietiche derivate da progenitori multipotenti sono reclutati alla corteccia del timo, sottoposto impegno a T lignaggio e diventare precursori delle cellule T 1. Nella corteccia, precursori delle cellule T CD4 e CD8 doppio negativi (DN) timociti espandersi e differenziarsi in immaturo CD4 e CD8 doppio positivi (DP) timociti, formando una grande piscina di progenitori ai ricettori cellulari altamente variabile T 1. Solo una select sottoinsieme MHC-ristretto di cellule DP diventerà singolo positivi (SP) timociti CD4 o CD8, migrare verso il midollo del timo, e differenziarsi in cellule funzionalmente competenti T maturi, un evento che si riferisce alla selezione come positivo 2 6. Al contrario, cloni di timociti auto-reattivi sottoposti a selezione negativa e vengono rimossi tramite apoptosi, convertito in cellule T regolatorie per l'auto-tolleranza, o deviato verso linfociti intraepiteliali per scopi che non sono ancora chiare 3,7-10.

Nel timo, cellule stromali del timo formano un microambiente unico che fornisce segnali per questi diversi destini di sviluppo delle cellule T 5,11,12. Cellule stromali del timo sono composti da cellule epiteliali timiche (TEC) - tra cui TEC corticali (CTEC) e TEC midollari (mTECs), cellule dendritiche, macrofagi, fibroblasti, cellule endoteliali, periciti derivati ​​dalla cresta neurale e di altre cellule mesenchimali 13-15. Tra questi, TEC sono cruciali nelle varie fasi di sviluppo delle cellule T 1,2,16,17. Tuttavia, la mancanza di un modo affidabile per isolare TEC ha impedito una comprensione globale delle loro funzioni 16. In particolare, CTEC, che formano una rete tridimensionale progenitori nella corteccia circostante, sono essenziali per la selezione positiva 13,18,19, per ragioni che non sono ancora chiare. Studi precedenti fornito indizi utili a capire l'eterogeneità e il ruolo di TEC, per lo più basandosi su strumenti morfologici e istologici 13 12,20. Un modo affidabile e riproducibile per isolare TEC è fondamentale per raggiungere la caratterizzazione imparziale di sottoinsiemi TEC, valutazione quantitativa e qualitativa delle funzioni TEC, e chiarimento dei meccanismi come CTEC supportano la selezione positiva.

A causa della rarità della TEC in timo e le interazioni strette formano nell'organo intatto, l'isolamento di TEC è stato impegnativo. Il protocollo qui descritto è basato sulle scoperte precedenti, attualmente reagenti disponibili, le tecniche e la conoscenza della struttura del timo e della composizione stromale. Quasi due decenni fa, sono stati segnalati diverse procedure di disaggregare i tessuti timo 21-27, in cui i diversi enzimi sono stati usati durante la digestione, tra cui tripsina, Collagenase e dispasi. Grigio et al. comparano questi enzimi nella loro precedure 28, e ha registrato un miglioramento method una digestione più fasi di cocktail di enzimi 29 che si sono resi ampiamente utilizzato 20,30. Tuttavia, questo metodo richiede un lungo tempo di preparazione e mineralizzazione complessi e risultati in variabile finale numero di cellule e proporzioni di TEC anche nella stessa coorte murino 29,30. Diversi anni fa, Liberase grado di ricerca enzima, contenenti altamente purificato Collagenase e proteasi neutra cominciò ad essere utilizzato nel tessuto del timo dissociazione 30. Qui, descriviamo un protocollo basato digestione Liberase, con procedure di separazione meccanica ottimizzate, che produce un elevato numero di TEC vitali dai tessuti del mouse timo. .

Per arricchire cellule stromali dissociate, studi precedenti hanno utilizzato sia gradienti di densità o di separazione tallone magnetica 21,29. Tuttavia, entrambi i metodi causano grave perdita di alcune popolazioni di cellule stromali del timo, in particolare la popolazione di CTEC 29. Eliminazione citotossici e tecniche di panning 12,31. Dopo il confronto di queste tecniche, abbiamo stabilito il protocollo panning attuale per l'arricchimento della TEC. La condizione delicata durante la procedura di arricchimento porta a meno morte cellulare e imparziale e maggiore recupero TEC.

La sospensione di cellule isolate timo descritto nella Sezione 3 può essere applicato direttamente alle analisi citofluorimetrica per l'identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi TEC e cellule dendritiche. Sezione 4 descrive un modo semplice e utile per identificare sottoinsiemi TEC utilizzando il flusso multiparametrica citometro. Per gli esperimenti che cercano di ottenere CTEC purificate o mTECs, TEC arricchimento e cell sorting procedure può essere trovato nella sezione 5 e 6.

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Protocol

In questo studio, adulto - sono stati utilizzati (6 8 settimane) femmina C57Bl / 6 topi. I topi sono stati acquistati dal National Cancer Institute e mantenuti in particolari condizioni di libero patogeni. L'Università del Minnesota Istituzionale Cura e uso Comitato degli animali (IACUC) ha approvato tutti sperimentazione animale.

1 Preparazione degli strumenti e tamponi

  1. Preparare la soluzione enzimatica (media RPMI1640 con il 0,05% [w / v] di Liberase TH e 100 U / ml di DNasi I), tampone ricchi di albumina (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -free] con 0,5% di siero bovino albumina e 2 mM acido Etilendiammina tetraacetico [EDTA]), tampone di FACS (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -free] siero fetale bovino 1% contenente [FBS] e il 0,02% NaN 3), FACS ordinamento tampone (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + -free] contenente il 2% FBS), e media RP10 (media RPMI-1640 fornito con 10% FBS).
  2. Preparare 10 piatti panning. Preparare la soluzione di rivestimento 40 ml (0,01 mg / ml Gavena contro Rat-IgG in 0.1 M NaHCO3 Buffer), e aggiungere 4 ml di soluzione di rivestimento in ciascuna 100 x 15 mm piastra, turbolenza e incubare a 4 ° CO / N. Eliminare la soluzione di anticorpi e lavare la piastra con 5 ml di PBS 1x per 2 volte, agitare vigorosamente tra risciacqui. Conservare le piastre preparate a 4 ° C.

2 Raccolta di Timo Tissue

  1. Euthanize del mouse in una camera di CO 2. Mettere l'animale sulla schiena su una stuoia di dissezione, appuntare i piedi sul tappetino e bagnare la pelliccia a spruzzo con il 70% di etanolo.
  2. Eseguire un'incisione mediana attraverso la pelle, partendo da sopra l'apertura uretrale dritto fino alla mascella inferiore con le forbici ed estendere l'incisione verso il basso per le ginocchia su entrambi i lati. L'incisione sembra un testa in giù "Y". Tirare la pelle flaccida indietro sui lati, e il pin al tappeto dissezione.
  3. Forare la membrana dalla xifoide, tagliare le costole su entrambi i lati fino a circa la clavicola, quindi sollevare le costole conpinza e il pin al tappeto dissezione. Il timo è appena sotto le costole, e si presenta come due lobi bianchi sottili sovrapposti cuore (Figura 1). Tessuto connettivo che circonda Scollegare il timo, tirare delicatamente e rimuovere la coppia di lobi del timo con pinze dentellate curve. Lobi Luogo timo in una piastra da 6 pozzetti contenenti 5 ml di RPMI-1640.

3 Preparazione di cellule stromali timica

  1. Tagliare qualsiasi tessuto adiposo e connettivo circostante e trasferire i lobi del timo ad un nuovo pozzo della piastra 6 pozzetti contenenti 5 ml di fresco preparano soluzione enzimatica. Fare piccole incisioni nei lobi del timo con le forbici sottili, e incubare la piastra a 37 ° C per 20 min.
  2. Pipettare delicatamente digerire il tessuto del timo su e giù 2 - 3 volte con 5 ml pipetta per la dissociazione dei tessuti. Raccogliere il surnatante in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di tampone ricchi di albumina freddo per neutralizzare gli enzimi. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio. Aggiungere 2.5soluzione enzimatica ml al tessuto rimanente e incubare la piastra a 37 ° C per 15 min.
  3. Eseguire agitazione meccanica con una siringa da 3 ml e ago da 18 G per rompere gli aggregati. Pool surnatante nel tubo di raccolta. Aggiungere 2,5 ml della soluzione enzimatica al tessuto rimanente e incubare la piastra a 37 ° C per 15 min.
  4. Ripetere agitazione meccanica con una siringa da 3 ml e un ago da 25 G, e incubare la piastra supplementare di 5 - 10 min.
  5. Dopo aver completato la digestione, piscina il surnatante nel tubo di raccolta. Centrifugare la provetta di prelievo a 400 xg, a 4 ° C per 8 minuti per raccogliere le cellule. Aspirare il liquido e sospendere le cellule pellet in 10 ml di tampone ricchi di albumina e filtrare il campione attraverso maglie di mm 100. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi eseguire il flusso cytometic analisi (sezione 4) o TEC arricchimento (sezione 5).

4 Identificazione delle TEC da Citometria a flusso

  • Preparare le cellule ad una concentrazione finale di 4 x 10 6 cellule per 100 microlitri di buffer di FACS per la colorazione in una piastra di prova ben a fondo rotondo da 96 e tenere la piastra su ghiaccio. Aggiungere 20 microlitri soluzione di blocco Fc (anti-CD16 / CD32 anticorpo a 10 mg / ml in tampone per FACS) alle cellule e incubare le cellule per 10 minuti in ghiaccio. Gira la piastra a 400 xg, a 4 ° C per 3 min. Eliminare il liquido dai pozzi muovendo la faccia piastra giù in un lavandino.
  • Sospendere le cellule pellet in 100 ml di cocktail di anticorpi (anti-CD45, -EpCAM, classe -MHC II, e -Ly51 anticorpi, e la UEA-1 lectina marcato con fluorocromi diversi a produttori raccomandati o testato concentrazioni ottimali di ciascun anticorpo in tampone FACS ), e incubare le cellule in ghiaccio per 20 minuti al buio. Per compensazione, macchiare 1 x 10 6 cellule con ogni singolo fluorocromo.
  • Aggiungere 100 ml di tampone FACS a ciascun bene e far girare la piastra a 400 xg, a 4 ° C per 3 min. Ripetere una fase di lavaggiotempo, e poi risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer FACS. Trasferire le cellule di un fondo rotondo tubo FACS 12 x 15 mm riempita con 300 ml FACS buffer. Acquisire campioni sul citofluorimetro e analizzare i dati utilizzando il software di analisi FACS. Strategia di gating TEC è mostrato nella Figura 2.
  • 5. Arricchimento della TEC da Panoramica

    1. Centrifugare le cellule del timo (preparati nella Sezione 3) a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. Aspirare il liquido e sospendere le cellule pellet nel tampone FACS ordinamento ad una concentrazione di 2 x 10 8 cellule per ml in una provetta conica da 15 ml o 50 ml. Aggiungere anticorpo anti-CD90.2 (clone H12-30) (o anti-CD45) ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml di sospensione cellulare e incubare le cellule delicatamente su un agitatore rotante a 4 ° C per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare con un 5 - 10 volte il volume di RP10 medie e centrifugare la provetta a 400 xg, a 4 ° C per 5 min.
    2. Aspirare il liquido e risospendere le cellule in pelletMezzo RP10 ad una concentrazione di 1 x 10 7 per ml. Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare per ogni piastra rivestita panning (preparata al punto 1.3), turbolenza e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Agitare vigorosamente; trasferire il surnatante in una provetta conica. Sciacquare la piastra due volte utilizzando medie RP10 e piscina surnatanti nel tubo di raccolta.
    3. Centrifugare la provetta di raccolta a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. Aspirare il liquido e risospendere le cellule pellet in 5 ml di mezzo RP10. Aggiungere la sospensione cellulare di una nuova piastra panning, agitare ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule lavare il piatto e piscina in un tubo conico. Una volta TEC sono arricchiti, centrifugare le cellule a 400 xg, a 4 ° C per 5 minuti e sospendere le cellule in 5 ml FACS buffer di smistamento.

    6. Purificazione di TEC di classificare cellulare

    1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare sospensione cellulare ad una concentrazione di 4 x 10 7 cellule in tampone FACS ordinamento. Aggiungi anticorpi desCribed nella Sezione 4.4 nella soluzione di cellule e incubare le cellule delicatamente su un agitatore rotante a 4 ° C per 30 min. Dopo la colorazione, lavare e sospendere le cellule ad una concentrazione di 10 x 10 6 cellule per ml di tampone FACS ordinamento.
    2. Ordina sottoinsiemi TEC attraverso un ugello 100 micron utilizzando la fluorescenza attivato l'ordinamento delle cellule. Cella ordine sono raccolti in 30% (v / v) di FBS in RPMI-1640). Una volta che l'ordinamento delle cellule è fatto, le cellule centrifugare a 400 xg, a 4 ° C per 5 minuti e prepararsi per l'analisi a valle.

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    Representative Results

    Usando questo protocollo, un organo del timo è stato rimosso da un topo adulto (sezione 2) e una sospensione di cellule del timo è stata preparata come descritto nella Sezione 3 La sospensione cellulare ottenuta consisteva di timociti, cellule stromali ematopoietiche derivate da cellule stromali e non-ematopoietiche. CD45 è una ematopoietiche pan-marcatore espresso su entrambi i timociti e cellule stromali ematopoietiche come i macrofagi e le cellule dendritiche. Al contrario, TEC non sono di origine emopoietica e non esprimono CD45 15. Colorazione delle cellule e l'analisi di citometria di flusso sono state eseguite come descritto nella sezione 4.

    Due tipi di sottoinsiemi TEC, CTEC e mTECs, provengono da un comune bi-TEC potente precursore 15. Sia CTEC e mTECs esprimono la molecola EpCAM sulla loro superficie 28. Così TEC può essere gated secondo EpCAM-positivi e CD45-negative mediante citometria di flusso (Figura 2A). CTEC e mTECs possono essere distinte da due reagenti: il Ly51anticorpo che riconosce glutamil aminopeptidasi espressa da CTEC, e la lectina Ulex Europaeus agglutinina-1 (UEA-1) 28, che si lega ad MTEC (Figura 2B). Sia mTECs e CTEC esprimono molecole MHC di classe II sulla loro superficie (Figura 2C e 2D). mTECs può essere ulteriormente classificati in MTEC a bassa e alta MTEC a seconda del livello di molecole MHC II (Figura 2D). Il numero medio di TCE per timo è circa 9 x 10 5. Nei confronti diretti, abbiamo recuperato circa 8 volte più TEC utilizzando questo Liberase protocollo basato enzima rispetto ad un protocollo multi-step con collagenasi / dispasi 29 (Figura 3).

    Al fine di ridurre i tempi di smistamento e aumentare la vitalità delle cellule stromali recuperate, abbiamo sviluppato un metodo di panning per esaurire timociti perché la sospensione di cellule del timo è costituito da oltre il 95% timociti. Le cellule sono state incubate con unti-CD90 anticorpo e catturato da piastre pretrattata. Rispetto a che in tutta la cellule del timo preparate (pre-arricchito), la percentuale di TEC è stato aumentato da meno dello 0,5% a oltre il 15% in cellule post-arricchiti (Figura 4A e 4B). Panoramica con anti-CD45 può essere utilizzato anche se, per esempio, non c'è bisogno di recuperare le cellule dendritiche pure. In questo caso, TEC arricchimento aumenta a circa il 80% (dati non mostrati). Dopo l'arricchimento delle cellule stromali da panning, le proporzioni di sottoinsiemi TEC non è stata alterata (Figura 4C e 4D), suggerendo che uno sottoinsieme o l'altro non è selettivo persi durante il panning. Rispetto al campione di pre-arricchimento, il tasso di recupero del TEC era circa l'85% (Figura 4E).

    Figura 1
    Figura 1 Il timo del mouse During dissezione. Il timo è situato sopra il cuore nel torace superiore anteriore. Dopo il taglio e sollevare le costole, i due lobi bianchi del timo sono esposti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 2
    Figura 2 Identificazione di CTEC e MTEC con l'analisi dei dati citometria a flusso. Campioni di cellule Stained timo sono stati analizzati mediante citometria a flusso. Sono mostrati i profili FACS Rappresentante. I numeri indicano la percentuale di ogni popolazione. (A) di cellule vive, un cancello di eventi CD45-negative e EpCAM-positivi rappresenta cellule TEC. (B) Entro il cancello TEC, due popolazioni sono separate per livello di Ly51 e UEA- 1. CTEC hanno elevatoer espressione di Ly51; mTECs hanno più alto livello di UEA-1. molecole (C) MHC II sono altamente espressi su CTEC. (D) mTECs compone di MHC II sub-popolazioni bassa elevata e MHC II, che sono indicati separatamente come MTEC alta e MTEC basso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3 Un protocollo basato liberase permesso rendimenti più elevati di cellule di timo che utilizzare un / protocollo dispasi multi-step collagenasi. Cellule del timo sono stati preparati utilizzando un multi-step collagenasi / protocollo dispasi pubblicato in precedenza o questo protocollo basato liberase-. I due gruppi di campioni sono stati analizzati mediante citometria di flusso. (A) </ Sono mostrati i profili strong> FACS Rappresentante. I numeri indicano le percentuali di cellule TEC in ogni gruppo. (B) il numero di cellule totali di TEC per topo timo sono riportati nel grafico a barre. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n> 3). A due code, prova T non appaiati è stata eseguita utilizzando il software Prism. P <0,0001. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4 Arricchimento del TEC con il metodo di panning. Profili FACS di cellule stromali del timo pre e post-arricchiti sono mostrati. Cellule del timo pronti sono state colorate con anticorpo anti-CD90. Timociti CD90-positivo compongono oltre il 95% delle cellule del timo. Durante la procedura di arricchimento TEC, timociti sono CapturEd e impoverito sulla piastra panning pre-rivestito, quindi TEC sono arricchiti nel surnatante. (A) e (B), cancelli TEC sono mostrati. I numeri indicano la percentuale di TEC tra totali cellule vive nella popolazione di partenza (pre-arricchimento) o dopo arricchimento (post-arricchimento). (C) e (D), le cellule all'interno CTEC e MTEC porte sono mostrati. I numeri mostrano le percentuali delle CTEC e MTEC nelle popolazioni TEC da ciascun gruppo. Numeri (E) delle cellule di CTEC e mTECs per il mouse del timo sono riportati nel grafico. I dati sono rappresentativi di 5 esperimenti. "Pre" sta per campione di pre-arricchimento; "Post" sta per il campione post-arricchimento; piccole linee orizzontali indicano la media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Nel protocollo, punti critici sono la preparazione di cellule stromali del timo (sezione 3) e l'arricchimento di TEC (sezione 4). Si raccomanda vivamente che la soluzione enzimatica fresca viene preparata ogni volta e il tessuto viene trattato il più presto possibile. Per thymi studiata, ottimizzando il volume della soluzione enzimatica è richiesta a seconda del numero di thymi. Se eventuali residui di tessuto viene lasciato dopo l'elaborazione, aggiungendo più soluzione enzimatica e l'estensione del tempo di incubazione potrebbe aumentare la resa delle cellule. Durante l'arricchimento di TEC, completando la raccolta del surnatante e ripetendo il risciacquo piatto descritto nella sezione 5.3 si riduce la perdita di cellule.

    Nel 1980, Wekerle et al. prima segnalato un tipo di TEC - "timici cellule nutrici" (TNC) 33, che sono grandi cellule epiteliali corticali che avvolgono completamente molte cellule linfoidi vitali all'interno di vescicole intracellulari. Nel 1982, Kyewski e Kaplan descritti vari isolamento condmabili che influenzano il rendimento delle TNC 34. Recentemente, Takahama e colleghi hanno rivisitato l'isolamento e le caratteristiche dei TNC. Essi identificarono tali cellule sulla base di colorazione preferenziale per CD45 solo dopo permeabilizzazione della membrana 35. Sono descritti anche "rotto" TNC nella loro preparazione, che consisteva in una CTEC e molteplici timociti legate. Tale rotto TNC era positivo per CD45 extracellulare e per il marcatore β5t CTEC e comprendeva il 70% del totale CTEC nella loro preparazione. Infatti, abbiamo anche osservato una popolazione cellulare simile, che era CD45 alta EpCAM + e + Ly51 nel nostro sospensione di cellule del timo preparato, anche se composto meno del 40% del totale CTEC con la nostra procedura di isolamento. Questi rotto TNC vengono rimossi dai protocolli TEC di arricchimento, come la nostra, che utilizzano deplezione sia con CD90 o CD45. Così, una sfida futura sarà quella di ridurre al minimo la perdita di questa popolazione.

    Rispettoalla multi-step procedura di digestione esistente 29, il protocollo digestione Liberase consente una resa cella significativamente maggiore di TEC (Figura 3). Altri gruppi hanno riportato i loro nuovi metodi per l'isolamento delle cellule stromali del timo, modificando il metodo di Gray 30,36, anche se la resa cellulare non è risultata significativamente aumentata. Recentemente, Chidgey e colleghi hanno riportato indipendentemente un protocollo TEC utilizzando Liberase digestione e hanno anche ottenuto il rilascio effettivo del TEC 37. Tuttavia, il primo passo rilascio thymocyte del loro protocollo ha il potenziale per eliminare circa 1,6 x 10 4 TEC da ogni timo 29, la maggior parte dei quali sono CTEC. A causa della densità del gradiente di arricchimento causando la perdita di cellule stromali più piccole, un CD45-microbead deplezione basato AutoMACS è comunemente usato per l'arricchimento di TEC prima FACS purificazione 29,36,37. Rispetto al l'arricchimento basato AutoMACS utilizzando protocolli CD45-microbead deplezione 29, lepanning arricchimento ottenuti tassi di recupero più elevati di TEC. Nel complesso, il protocollo presentato qui aggrega una serie di vantaggi precedentemente riportati. Sottoinsiemi TEC purificati con questo protocollo (Sezione 6) sono stati utilizzati con successo per ulteriori analisi, come ad esempio Real Time-PCR e Western blot 12.

    Questo protocollo è adatto per l'isolamento e lo studio di altre cellule stromali del timo, come le cellule dendritiche anche. Noi crediamo che robusto isolamento di cellule stromali del timo, in particolare TEC, accelererà la comprensione di come le funzioni del timo per lo sviluppo delle cellule T e raggiungere in vitro costituzione delle cellule T. Inoltre, la caratterizzazione di queste cellule ha un grande valore pratico per la comunità medica, dal momento che un problema comune con il recupero da terapie (come quelli utilizzati nei trapianti e il trattamento del cancro), è scarsa la ricostituzione delle cellule epiteliali del timo che porta a immunodeficienza.

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    Disclosures

    Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health di Grant R01 AI088209 (a KAH). Ringraziamo anche l'Università del Minnesota Citometria a flusso di risorse.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

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