Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en effektiv metode for isolering, identifisering, og rensing av mus thymisk epitelceller (TECS). Protokollen kan benyttes for studier av thymus-funksjon for normal T-celle utviklingen, thymus dysfunksjon, og T-celle rekonstituering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Thymus er et viktig organ for T-lymfocytter utvikling. Av thymus stromale celler, thymus epitelceller (TECS) er spesielt viktig på flere stadier av T celle utvikling: T celle engasjement, positiv utvelgelse og negativ seleksjon. Men forblir funksjonen TECS i thymus ufullstendig forstått. I artikkelen gir vi en metode for å isolere TEC undergrupper fra friske mus thymus ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk avbrudd og enzymatisk fordøyelse. Fremgangsmåten gjør det mulig for thymus stromale celler og thymocytter effektivt skal frigjøres fra celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-forbindelser, og for å danne en enkelt-cellesuspensjon. Ved hjelp av de isolerte celler, kan multiparameter flowcytometri anvendes til identifisering og karakterisering av TECS og dendrittiske celler. Fordi TECS er en sjelden cellepopulasjon i thymus, vi også beskrive en effektiv måte å berike og rense TECS ved tappe thymocytter, den mest tallrike celletype i thymus. Follovinge anrikning, cellesortering Tiden kan bli redusert, slik at tap av cellelevedyktighet kan minimeres ved rensing av TECS. Purified celler er egnet for ulike nedstrøms analyser som Real Time-PCR, Western blot og genuttrykk profilering. Protokollen vil fremme forskning av TEC-funksjon og så vel som utvikling av in vitro T-celle rekonstituering.

Introduction

Tidlig i T celle utvikling, er beinmargsstamcelle-avledet multipotente stamceller rekruttert til cortex i thymus, gjennomgå satsing på T avstamning og bli T-celle forløpere en. I cortex, T-celle forløper CD4 og CD8 double negative (DN) thymocytter utvide og differensieres til umoden CD4 og CD8 dobbel positive (DP) thymocytter, danner en stor pool av stamfedre med svært variabel T celle reseptorer en. Bare en velger MHC-begrenset undergruppe av DP-celler blir CD4-eller CD8-positive enkelt (SP) thymocytter, migrere til medulla av thymus, og differensiere i kompetente funksjonelt modne T-celler, en hendelse som er referert til som positiv utvelgelse 2- 6. I kontrast, kloner av auto-reaktivt thymocytter gjennomgå negativ seleksjon og fjernes via apoptose, konvertert til regulatoriske T-celler for selv toleranse, eller viderekoblet til intraepitelial lymfocytter til formål som er ennå ikke klart 3,7-10.

I thymus, thymus stromale cellene danner et unikt mikromiljøet signaler tilbake til disse ulike T celle utvikling skjebner 5,11,12. Thymisk stromale celler er sammensatt av thymus epitelceller (TECS) - inkludert cortical TECS (cTECs) og marg TECS (mTECs), dendrittiske celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neural crest-avledet pericytes og andre mesenchymalceller 13-15. Blant disse TECS er avgjørende på de ulike stadier av T celle utvikling 1,2,16,17. Imidlertid har mangelen på en robust måte å isolere TECS hemmet en omfattende forståelse av deres funksjoner 16. Spesielt cTECs, som danner et tredimensjonalt nettverk som omgir progenitorer i cortex, er essensielle for positiv utvelgelse 13,18,19 av grunner som ennå ikke er klar. Tidligere studier gitt ledetråder som er heterogen og rolle TECS, for det meste avhengig av morfologiske og histologiske verktøy 13 12,20. En robust og reproduserbar måte å isolere TECS er grunnleggende for å oppnå objektiv karakterisering av TEC undergrupper, kvantitativ og kvalitativ vurdering av TEC funksjoner, og avklaring av mekanismene hvordan cTECs støtte positiv utvelgelse.

På grunn av lav TECS i thymus og stramme interaksjoner de danner i intakt organ, har isolering av TECS vært utfordrende. Protokollen er beskrevet her er basert på tidligere funn, for tiden tilgjengelig reagenser, teknikker og kunnskap om thymus struktur og stromal sammensetning. Nesten to tiår siden, ble flere prosedyrer rapportert å disaggregert thymus vev 21-27, der ulike enzymer ble brukt under fordøyelsen, inkludert Trypsin, Kollagenase og dispase. Gray et al. sammenlignet disse enzymer i deres precedure 28, og rapporterte en forbedret method med en flere-trinns fordøyelsen av enzym cocktails 29 som ble mye brukt 20,30. Imidlertid innebærer denne metoden en lang forberedelsestid og komplekse fordøyelsen trinn og resultater i variabel endelige celle tall og andeler av TECS selv i samme murine kohort 29,30. For flere år siden, Liberase forskning grade enzym, som inneholder høyt renset Kollagenase og nøytral protease begynte å bli brukt i thymus vev dissosiasjon 30.. Her beskriver vi en Liberase fordøyelsen-basert protokoll, med optimaliserte mekaniske separasjonsprosedyrer, som gir et høyt antall av levedyktige TECS fra mus thymus vev. .

Å berike dissosiert stromale celler, har tidligere studier brukes enten tetthetsgradienter eller magnetiske kuler separasjon 21,29. Men begge metodene forårsake alvorlig mistet av visse populasjoner av thymus stromale celler, særlig befolkningen i cTECs 29. Cytotoksiske eliminasjon og panorering teknikker 12,31. Etter sammenligning av disse teknikkene, etablerte vi dagens panorering protokoll for anriking av TECS. Den milde tilstand under berikelse prosedyren fører til mindre celledød og saklig og økt TEC utvinning.

Det isolerte thymus cellesuspensjon som er beskrevet i avsnitt 3 kan direkte brukes til å flowcytometrisk analyse for identifikasjon og karakterisering av TEC-undergrupper og dendrittiske celler. § 4 beskriver en enkel og nyttig måte å identifisere TEC undergrupper ved hjelp av multiparameter flowcytometer. For eksperimenter som søker å oppnå renset cTECs eller mTECs, TEC berikelse og celle sortering prosedyrer finnes i kapittel 5 og 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne studien, voksen - ble (6 8 uker) kvinnelige C57BL / 6 mus brukes. Mus ble kjøpt fra National Cancer Institute og vedlikeholdt under spesifikke patogen frie forhold. The University of Minnesota Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) godkjent all dyreforsøk.

1. Utarbeidelse av instrumenter og buffere

  1. Forbered enzymløsning (RPMI1640 medium med 0,05% [w / v] over Liberase TH og 100 U / ml DNase I), albumin-rike buffer (1X PBS [2 + Ca / Mg 2 +-fri] med 0,5% bovint serum albumin og 2 mM etylendiamin-tetraeddiksyre [EDTA]), FACS-buffer (1X PBS [2 + Ca / Mg 2 +-fri] inneholdende 1% føtalt bovint serum [FBS] og 0,02% NaN 3), FACS sortering buffer (1X PBS [Ca2 + / Mg 2 +-fri] inneholdende 2% FBS), og RP10 medium (RPMI-1640 medium som følger med 10% FBS).
  2. Forbered 10 panorering plater. Forbered 40 ml beleggsløsning (0,01 mg / ml Goat anti-rotte-IgG i 0,1 M NaHCO3 buffer), og tilsett 4 ml av beleggsløsningen inn i hver 100 x 15 mm plate, virvel og inkuber ved 4 ° CO / N. Hell av antistoff løsning og skyll platen med 5 ml 1x PBS for 2 ganger, virvle kraftig mellom skyllinger. Oppbevar preparerte plater ved 4 ° C.

2. Harvest of Thymus Tissue

  1. Avlive mus i en CO 2 kammer. Sett dyret på ryggen på en disseksjon matte, pin føttene på matten og våt pels ved sprøyting med 70% etanol.
  2. Lag et midtlinje innsnitt gjennom huden, med start fra over uretral åpning rett opp til den nedre kjeve med saks, og forlenger innsnitt nedover til knærne på begge sider. Snittet ser ut som en opp-ned "Y". Trekk den løse huden tilbake på sidene, og feste den til disseksjon matten.
  3. Punktere membranen fra xiphoid, kuttet ribbeina på hver side opp til ca krageben, løft opp ribber medpinsett og feste det til disseksjon matten. Thymus er like under ribbeina, og ser ut som to tynne hvite lapper liggende hjertet (figur 1). Koble bindevev rundt thymus, trekk forsiktig og fjern par thymus lapper med buede taggete tang. Sted thymus lapper til en 6 brønn plate som inneholder 5 ml RPMI-1640.

3. Utarbeidelse av thymisk stromale celler

  1. Trim noen omgivende fett og bindevev og overfører thymus fliker til en ny brønn på 6-brønners plate inneholdende 5 ml ferskt forberede enzymløsning. Lag små snitt i thymus fliker med fin saks, og inkuber platen ved 37 ° C i 20 min.
  2. Forsiktig pipette fordøye thymus vev opp og ned 2-3 ganger med 5 ml pipette for vev dissosiasjon. Samle supernatant fraksjon i et 50 ml rør inneholdende 10 ml kald albumin-rike buffer for å nøytralisere enzymer. Hold samling rør på is. Legg 2.5ml enzymoppløsning til den gjenværende vev og Inkuber platen ved 37 ° C i 15 min.
  3. Utfør skånsom mekanisk omrøring med en 3 ml sprøyte og 18 G nål for å bryte opp aggregater. Pool supernatanten inn i oppsamlingsrøret. Legg 2,5 ml enzymoppløsning til den gjenværende vev og Inkuber platen ved 37 ° C i 15 min.
  4. Gjenta forsiktig mekanisk omrøring med en 3 ml sprøyte og en 25 G nål, og inkuber platen ytterligere 5 - 10 min.
  5. Etter fullstendig nedbrytning, basseng supernatanten inn i oppsamlingsrøret. Sentrifuger oppsamlingsrøret ved 400 x g, 4 ° C i 8 minutter for å samle cellene. Aspirer væsken og suspendere de pelleterte celler i 10 ml albumin-rike buffer og filtrere prøven gjennom 100 mm mesh. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Deretter utføre flyt cytometic analyse (§ 4) eller TECS berikelse (§ 5).

4. Identifisering av TECS ved flowcytometri

  • Forbered cellene til en sluttkonsentrasjon på 4 x 10 6 celler pr 100 ul i FACS-buffer for farging i en 96-brønners rundbunnet testplaten og holde platen på is. Tilsett 20 mL Fc blokk-løsning (anti-CD16 / CD32-antistoff ved 10 pg / ml i FACS-buffer) til cellene, og cellene inkuberes i 10 min på is. Spinn plate ved 400 x g, 4 ° C i 3 min. Kast væske fra brønner ved å dra platen ansiktet ned i en vask.
  • Suspendere de pelleterte cellene i 100 mL antistoff cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC klasse II, og -Ly51 antistoffer, og UEA-en lektin merket med forskjellige fluorokromer på produsenten anbefalte eller testet optimale konsentrasjoner av hver antistoff i FACS buffer ), og inkuberes cellene på is i 20 min i mørket. For kompensering, flekke 1 x 10 6 celler med hver enkelt fluorokrom.
  • Tilsett 100 ul FACS-buffer til hver brønn og spinne plate ved 400 x g, 4 ° C i 3 min. Gjenta vasketrinn éngang, og deretter resuspender cellene i 100 pl FACS buffer. Overfør cellene til en 12 x 15 mm rundbunnet FACS rør fylt med 300 pl FACS buffer. Erverve prøver på flowcytometer og analysere data ved hjelp av FACS analyse programvare. TEC gating strategi er vist i figur 2.
  • 5. Enrichment av TECS ved å panorere

    1. Spinn ned thymusceller (utarbeidet i § 3) ved 400 xg, 4 ° C i 5 min. Aspirer væsken og suspendere de pelleterte celler i FACS sortering buffer ved en konsentrasjon på 2 x 10 8 celler per ml i en 15 ml eller 50 ml konisk rør. Legg anti-CD90.2-antistoff (Klon 30-H12) (eller anti-CD45) ved en endelig konsentrasjon på 2,5 ug / ml av cellesuspensjonen og inkuberes cellene forsiktig på en roterende blander ved 4 ° C i 30 min. Etter inkubering vaskes med en 5 - 10x volum på RP10 medium og sentrifuger røret ved 400 x g, 4 ° C i 5 min.
    2. Aspirer væsken og resuspender de pelleterte celler iRP10 medium ved en konsentrasjon på 1 x 10 7 pr ml. Tilsett 5 ml cellesuspensjon til hver belagt vasking plate (fremstilt i trinn 1.3), virvel og inkuberes i 30 min ved RT. Virvle kraftig; overføre supernatantene til et konisk rør. Vask platen to ganger med medium og RP10 basseng supernatantene inn i oppsamlingsrøret.
    3. Sentrifuger oppsamlingsrøret ved 400 x g, 4 ° C i 5 min. Aspirer væsken og resuspender pelleterte cellene i 5 ml RP10 medium. Legg til cellesuspensjonen til en ny plate panorering, virvle og inkuber i 30 min ved RT. Samle cellene skyller platen og samle dem inn i et konisk rør. Når TECS anrikes, spinne ned cellene ved 400 x g, 4 ° C i 5 minutter og suspendere celler i 5 ml FACS sortering buffer.

    6. Rensing av TECS av Cell Sorting

    1. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og forberede cellesuspensjon med en konsentrasjon på 4 x 10 7 celler i FACS sortering buffer. Legg antistoffer desrives i avsnitt 4.4 i celle-løsning og inkuberes cellene forsiktig på en roterende blander ved 4 ° C i 30 min. Etter farging, vaske og suspendere cellene til en konsentrasjon på 10 x 10. 6 celler pr ml FACS sortering buffer.
    2. Sorter TEC undergrupper gjennom en 100 mikrometer dyse med fluoresens aktivert cellesortering. Sortert celle er samlet i 30% (v / v) FBS i RPMI-1640). Når cellesortering er gjort, sentrifuger cellene ved 400 x g, 4 ° C i 5 min og forberede for genetisk analyse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved hjelp av denne fremgangsmåte ble en thymus organ fjernet fra en voksen mus (del 2) og en thymisk cellesuspensjon ble fremstilt som beskrevet i del 3. Den oppnådde cellesuspensjon besto av thymocytter, hematopoetiske-avledet stromale celler og ikke-hematopoietiske stromale celler. CD45 er et hematopoietisk pan-markør uttrykt på begge thymocytter og hematopoetiske stromale celler slik som makrofager og dendrittiske celler. I kontrast, TECS er ikke av blodkreft opprinnelse og ikke uttrykker CD45 15. Cellefarging og flowcytometrisk analyse ble utført som beskrevet i § 4.

    To typer TEC undergrupper, cTECs og mTECs, stammer fra et felles bi-potent TEC forløper 15. Begge cTECs og mTECs uttrykke EpCAM molekyl på overflaten deres 28. Således TECS kan gated ifølge EpCAM-positive og CD45-negative ved flowcytometri (figur 2A). cTECs og mTECs kan være preget av to reagenser: den Ly51antistoff som gjenkjenner glutamyl aminopeptidase uttrykt av CTEC, og lektin Ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1) 28 som binder seg til Mtec (figur 2B). Begge mTECs og cTECs uttrykker MHC klasse II-molekyler på deres overflate (figur 2C og 2D). mTECs kan videre deles inn i MTEC lav og høy MTEC avhengig av nivået av MHC II-molekyler (figur 2D). Gjennomsnittlig antall TEC per thymus er ca 9 x 10 5. I direkte sammenligninger, vi gjenvunnet ca 8 ganger mer TECS bruke denne Liberase enzymet basert protokoll i forhold til en flertrinns-protokollen med collagenase / dispase 29 (figur 3).

    For å redusere sortering tid og øke levedyktigheten av gjenvunne stromale celler, har vi utviklet en panorering metode for å utarme thymocytter fordi thymus cellesuspensjonen består av over 95% thymocytter. Celler ble inkubert med enTI-CD90 antistoff og fanget av precoated plater. Sammenlignet med den i hele preparerte thymusceller (pre-beriket), ble andelen av TECS øket fra mindre enn 0,5% til over 15% i post-anriket celler (figur 4A og 4B). Panning med anti-CD45 kan også brukes hvis, for eksempel, gjør man ikke trenger å gjenopprette dendrittiske celler i tillegg. I dette tilfellet, TEC berikelse øker til omtrent 80% (data ikke vist). Etter stromal celle berikelse ved å panorere, ble proporsjonene TEC undergrupper ikke endret (Figur 4C og 4D), noe som tyder på at en undergruppe eller den andre ikke er selektivt tapt under panorering. Sammenlignet med den pre-berikelse prøven, var at utvinningen av TECS omtrent 85% (figur 4E).

    Figur 1
    Figur 1. Musen thymus During disseksjon. Thymus er plassert over hjertet i fremre overlegen thorax. Etter å kutte og løfte ribbeina, de to hvite fliker av thymus er utsatt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2. Identifikasjon av CTEC og Mtec med flowcytometrisk analyse av data. Stained thymus celleprøver ble analysert ved hjelp av flowcytometri. Representative FACS profiler blir vist. Tallene angir prosentandelen av hver populasjon. (A) av levende celler, en gate av CD45-negative og EpCAM-positive hendelser representerer TEC celler. (B) Innenfor TEC gate, er to populasjoner atskilt med nivået av Ly51 og UEA- 1. cTECs har høyeh uttrykk for Ly51; mTECs har høyere nivå av UEA-1. (C) II MHC-molekyler er sterkt uttrykt på cTECs. (D) mTECs består av MHC II høye og MHC II lave underpopulasjoner, som er separat referert til som MTEC høyt og lavt MTEC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3. En liberase-basert protokoll tillates høyere celleutbytte fra thymus enn å bruke en flertrinns kollagenase / dispase protokoll. Thymus-celler ble fremstilt ved bruk av en tidligere publisert flere trinn kollagenase / dispase protokollen eller denne liberase-basert protokoll. De to grupper av prøver ble analysert ved strømningscytometri. (A) </ Strong> Representative FACS profiler blir vist. Tallene angir prosenter av TEC celler i hver gruppe. (B) Totalt antall celler av TEC per muse thymus er vist i søylediagram. Feilfelt angir standardavvik (n> 3). En to-tailed, uparet t-test ble utført ved hjelp av programvare Prism. P <0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4. Enrichment av TECS ved panorering metoden. FACS profiler av pre-og post-beriket thymisk stromale celler er vist. Preparerte thymusceller ble farget med anti-CD90 antistoff. CD90-positive thymocytter komponere over 95% av thymusceller. Under TEC berikelse prosedyre, thymocytter er Captured og utarmet på pre-coated panorering plate, er således TECS anriket i supernatanten. (A) og (B), er TEC-porter vist. Tallene viser den andelen av TECS blant samlede levende celler i utgangspopulasjonen (Pre-anrikning) eller etter anrikning (Post-anrikning.) (C) og (D), blir cellene innen CTEC og MTEC porter vist. Tallene viser prosenter av CTEC og Mtec i TEC populasjoner fra hver gruppe. (E) Cell antall cTECs og mTECs per mus thymus er vist i grafen. Dataene er representative for 5 forsøk. "Pre" står for pre-berikelse prøven; "Post" står for post-berikelse prøven; små horisontale linjer viser gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I protokollen, kritiske trinn er utarbeidelse av thymus stromale celler (§ 3) og berikelse av TECS (§ 4). Det anbefales sterkt at frisk enzymløsning fremstilles hver gang, og vevet blir behandlet så snart som mulig. For sammenslåtte Thymi, er å optimalisere mengden av enzym-oppløsningen som kreves avhengig av antall Thymi. Hvis en vevet rester som er igjen etter behandlingen, kan legge mer enzymløsning og forlengelse av inkubasjonstiden øke celleutbytte. Ved anrikning av TECS, full samling av supernatanten og å gjenta plate skylle beskrevet i avsnitt 5.3 vil redusere celletap.

    I 1980 Wekerle et al. først rapportert en type TECS - "thymus sykepleier celler" (transnasjonale selskaper) 33, som er store kortikale epitelceller som helt omslutter mange levedyktige lymfoide celler i intracellulære vesikler. I 1982 Kyewski og Kaplan beskrevet ulike isolasjon dirigentitions som påvirker utbyttet av transnasjonale selskaper 34. Nylig, Takahama og kolleger revisited isolasjon og karakteristikker av transnasjonale selskaper. De identifiserte slike celler på grunnlag av fortrinnsrett farging for CD45 bare etter membran permeabilization 35. De beskrev også "ødelagt" TNC i deres forberedelser, som besto av en CTEC og flere innbundne thymocytter. Slike brutt TNC var positive for ekstracellulære CD45 og for CTEC markør β5t og består 70% av total cTECs i deres forberedelser. Faktisk har vi også observert en tilsvarende cellepopulasjon, som var CD45 + og høy EpCAM Ly51 + i vårt forberedt thymus cellesuspensjon, men omfattet mindre enn 40% av de totale cTECs med vår isolasjonsmetoden. Disse ødelagt TNC blir fjernet fra TEC berikelse protokoller, som vårt, som utnytter uttømming med enten CD90 eller CD45. Således, vil et fremtidig utfordring være å minimalisere tapet av denne populasjonen.

    Sammenlignettil den eksisterende flertrinns oppslutningsprosedyre 29, gjør det mulig for Liberase fordøyelse protokoll et betydelig høyere utbytte av celle TECS (figur 3). Andre grupper har også rapportert sine nye metoder for thymisk stromal celleisolasjon ved å endre Gray metode 30,36, selv om cellen utbytte ikke ble betydelig økt. Nylig, Chidgey og kolleger uavhengig rapportert en TEC protokollen med Liberase fordøyelsen og de ​​også fått effektiv utgivelsen av TECS 37. Imidlertid har den første thymocyte utgivelsen trinn i sin protokoll potensial til å forkaste ca 1,6 x 10 4 TECS fra hver thymus 29, hvorav de fleste er cTECs. Grunnet tettshetsgradient berikelse forårsake tap av mindre stromale celler, er en autoMACS-basert CD45-microbead uttømming populært brukt for anriking av TECS før FACS rensing 29,36,37. Sammenlignet med autoMACS-baserte berikelse ved hjelp av CD45-microbead uttømming protokoller 29, depanorering berikelse oppnådd høyere utvinningsgraden av TECS. Totalt sett protokollen presenteres her samler en rekke tidligere rapporterte fordeler. TEC undergrupper renset med denne protokollen (§ 6) har blitt brukt for videre analyse, slik som Real Time-PCR og Western blot analyse 12.

    Denne protokollen er også egnet for isolering og studier av andre thymiske stromale celler, slik som dendritiske celler. Vi tror at robust isolering av thymus stromale celler, spesielt TECS, vil akselerere forståelse av hvordan thymus funksjoner for T celle utvikling og oppnå in vitro T celle grunnlov. Videre har karakterisering av disse cellene stor praktisk verdi for det medisinske samfunnet, siden et vanlig problem med utvinning fra behandling (slik som de som brukes ved transplantasjon og kreftbehandling) er dårlig rekonstituering av epitelcellene i thymus fører til immunsvikt.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (til KAH). Vi takker også University of Minnesota flowcytometrisystemer Resource.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics