Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Le thymus est un organe vital pour le développement des lymphocytes T. Des cellules stromales thymiques, les cellules épithéliales thymiques (CET) sont particulièrement cruciales à plusieurs étapes du développement des cellules T: l'engagement des cellules T, de sélection positive et négative sélection. Toutefois, la fonction de refroidissement thermoélectriques dans le thymus reste incomplètement comprise. Dans cet article, nous proposons une méthode pour isoler des sous-ensembles TEC de thymus de souris frais en utilisant une combinaison de rupture mécanique et la digestion enzymatique. Le procédé permet aux cellules thymocytes et stromales thymiques être efficacement libérés à partir de la cellule-cellule et des connexions de la matrice extracellulaire et de cellules pour former une suspension de cellules isolées. Utilisation de cellules isolées, de cytométrie de flux à paramètres multiples peut être appliqué à l'identification et la caractérisation des TEC et des cellules dendritiques. Parce que les TEC sont une population de cellules rares dans le thymus, nous décrivons également un moyen efficace d'enrichir et de purifier les TEC en appauvrissant thymocytes, type cellulaire le plus abondant dans le thymus. Follol'aile enrichissement, le temps de tri de cellule peut être réduite de sorte que la perte de la viabilité des cellules peut être réduite au minimum au cours de la purification de TEC. Cellules purifiées sont adaptés à diverses analyses en aval comme PCR en temps réel, Western blot et profil d'expression génique. Le protocole de promouvoir la recherche de la fonction TEC et ainsi que le développement de la reconstitution in vitro des lymphocytes T.

Introduction

Au début du développement de cellules T, de la moelle osseuse souches hématopoïétiques progénitrices multipotentes dérivées de cellules sont recrutés dans le cortex du thymus, subir engagement à T lignée et de devenir des précurseurs de cellules T 1. Dans le cortex, précurseurs des lymphocytes T CD4 et CD8 à double négatifs (DN) thymocytes se dilatent et se différencient en immatures CD4 et CD8 positif double (DP) thymocytes, la formation d'une grande piscine avec des progéniteurs très variable T récepteurs cellulaires 1. Seul un sous-ensemble de sélection restreinte au CMH de cellules DP deviendra unique positifs (SP) thymocytes CD4 ou CD8, migrer vers la moelle du thymus, et se différencier en cellules T matures fonctionnellement compétentes, un événement qui est visé à la sélection positive 2 6. En revanche, les clones de thymocytes auto-réactifs sont soumis à une sélection négative et sont évacués par l'apoptose, convertis en cellules T régulatrices pour l'auto-tolérance, ou dérivé de lymphocytes intra-épithéliaux à des fins qui ne sont pas encore clairement 3,7-10.

Dans le thymus, les cellules stromales thymiques forment un microenvironnement unique, pour fournir des signaux destin 5,11,12 ces différents de développement des cellules T. Les cellules stromales thymiques sont composés de cellules épithéliales thymiques (CET) - y compris TEC corticales (CTEC) et TEC médullaires (mTECs), les cellules dendritiques, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les péricytes de la crête neurale et d'autres cellules mésenchymateuses 13-15. Parmi ceux-ci, les TEC sont essentiels aux différents stades de développement des cellules T 1,2,16,17. Cependant, l'absence d'un moyen efficace d'isoler TEC a entravé une compréhension globale de leurs fonctions 16. En particulier, CTEC, qui forment un réseau tridimensionnel progéniteurs dans le cortex environnant, sont essentiels pour la sélection positive 13,18,19 pour des raisons qui ne sont pas encore claires. Des études antérieures fournies indices quant à l'hétérogénéité et le rôle des TEC, la plupart s'appuyant sur ​​des outils morphologiques et histologiques 13 12,20. Une façon robuste et reproductible pour isoler TEC est fondamentale pour atteindre la caractérisation objective de sous-ensembles de TEC, une évaluation quantitative et qualitative des fonctions de TEC, et la clarification des mécanismes comment CTEC soutenir la sélection positive.

En raison de la rareté des TEC dans le thymus et les interactions serrés qu'ils forment dans l'organe intact, l'isolement des TEC a été difficile. Le protocole décrit ici est basé sur les découvertes précédentes, actuellement réactifs disponibles, les techniques et les connaissances de la structure du thymus et de la composition du stroma. Il ya près de deux décennies, plusieurs procédures ont été signalés à désagréger les tissus du thymus 21-27, dans lequel les différentes enzymes ont été utilisés lors de la digestion, y compris la trypsine, la collagénase et Dispase. Gray et al. rapport ces enzymes dans leur precedure 28, et fait état ​​d'une amélioration de la méthamphétamineod, avec une digestion multi-étape de cocktails d'enzymes 29 qui sont devenus largement utilisé 20,30. Cependant, cette méthode implique un temps de préparation longs et complexes étapes de digestion et entraîne dernière variable du nombre de cellules et les proportions des TEC, même dans la même cohorte de souris 29,30. Il ya plusieurs années, Libérase enzyme de qualité de la recherche, hautement purifié contenant la collagénase et la protéase neutre commencé à être utilisé dans le tissu du thymus dissociation 30. Ici, nous décrivons un protocole à base de Libérase digestion, avec des procédés de séparation mécanique optimisés, qui donne un grand nombre de dispositifs de refroidissement thermoélectriques viables à partir de tissus de thymus de souris. .

Pour enrichir les cellules stromales dissociés, des études antérieures ont utilisé soit des gradients de densité ou séparation magnétique de perles 21,29. Cependant, les deux méthodes provoquent de graves perdu de certaines populations de cellules stromales thymiques, en particulier la population de CTEC 29. Élimination cytotoxique et techniques panoramique 12,31. Après comparaison de ces techniques, nous avons établi le protocole de panoramique actuel pour l'enrichissement des TEC. La condition douce au cours de la procédure d'enrichissement conduit à moins de la mort cellulaire et impartiale et une récupération accrue de TEC.

La suspension de cellules de thymus isolé décrit dans la section 3 peut être directement appliquée à l'analyse par cytométrie de débit pour l'identification et la caractérisation des sous-populations de cellules dendritiques et TEC. La section 4 décrit une méthode simple et utile pour identifier des sous-TEC à l'aide de flux multiparamétrique cytomètre. Pour les expériences qui cherchent à obtenir CTEC purifiés ou mTECs, l'enrichissement de TEC et procédures de tri cellulaire peut être trouvé dans la section 5 et 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dans cette étude, des adultes (6-8 semaines) femelles C57BL / 6 ont été utilisés. Les souris ont été achetées auprès du National Cancer Institute et maintenues dans des conditions libres d'agents pathogènes spécifiques. L'Université de Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel Minnesota (IACUC) a approuvé toute expérimentation animale.

1 Préparation des instruments et tampons

  1. Préparer la solution d'enzyme (milieu RPMI 1640 avec 0,05% [p / v] de Libérase TH et 100 U / ml de DNase I), un tampon d'albumine riche (1X PBS [Ca2 + / Mg2 + exempt] avec 0,5% de sérum bovin l'albumine et 2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]), un tampon FACS (PBS 1X [Ca2 + / Mg2 + exempt] contenant du sérum bovin fœtal à 1% [FBS] et 0,02% de NaN3), tampon de tri FACS (PBS 1X [Ca2 + / Mg2 + exempt] contenant 2% de FBS) et RP10 milieu (milieu RPMI-1640 fourni avec 10% de FBS).
  2. Préparer 10 plaques panoramiques. Préparer la solution de revêtement de 40 ml (0,01 mg / ml de Gavoine anti-IgG de rat dans 0,1 M de tampon NaHCO 3), et ajouter 4 ml d'une solution de revêtement dans chaque plaque de 100 x 15 mm, tourbillon et incuber à 4 ° CO / N. Verser la solution d'anticorps et rincer la plaque en utilisant 5 ml de PBS 1x pour 2 fois, agiter vigoureusement entre les rinçages. Conserver les boîtes préparées à 4 ° C.

2. récolte de Thymus tissus

  1. Euthanasier souris dans une chambre de CO 2. Mettre l'animal sur son dos sur un tapis de dissection, épinglez les pieds sur le tapis et mouiller la fourrure par pulvérisation d'éthanol à 70%.
  2. Faire une incision sur la ligne médiane à travers la peau, à partir d'au-dessus de l'ouverture de l'urètre vers le haut de la mâchoire inférieure avec des ciseaux et s'étendent vers le bas à l'incision du genou des deux côtés. L'incision ressemble à une tête en bas "Y". Tirez la peau lâche en arrière sur les côtés, et la broche à la natte de dissection.
  3. Percer la membrane de la pointe du sternum, couper les côtes de chaque côté jusqu'à environ la clavicule, puis soulevez les côtespince et la broche à la natte de dissection. Le thymus est juste sous les côtes, et ressemble à deux lobes blancs minces recouvrant le coeur (Figure 1). Débranchez le tissu conjonctif qui entoure le thymus, tirez doucement et retirer la paire de lobes du thymus avec des pinces dentelées courbes. Lieu lobes du thymus dans une plaque à 6 puits contenant 5 ml de RPMI-1640.

3 Préparation des cellules stromales thymiques

  1. Coupez tout le tissu adipeux et conjonctif environnant et transférer les lobes du thymus à un nouveau puits de la plaque de 6 puits contenant 5 ml fraîchement préparer la solution d'enzyme. Faire de petites incisions dans les lobes du thymus avec des ciseaux fins, et incuber la plaque à 37 ° C pendant 20 min.
  2. Pipette doucement digérer thymus jusqu'à tissulaire et bas 2 - 3 fois avec 5 ml pipette pour la dissociation des tissus. Recueillir la fraction surnageant dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de tampon d'albumine riche froide pour neutraliser les enzymes. Garder le tube de collecte sur la glace. Ajouter 2,5ml de solution d'enzyme dans le tissu restant et incuber la plaque à 37 ° C pendant 15 min.
  3. Effectuer une agitation mécanique douce avec une seringue de 3 ml et une aiguille 18 G de briser les agrégats. Piscine surnageant dans le tube de collecte. Ajouter 2,5 ml de solution enzymatique au tissu restant et incuber la plaque à 37 ° C pendant 15 min.
  4. Répétez agitation mécanique douce avec une seringue de 3 ml et une aiguille G 25, et incuber la plaque supplémentaire de 5 - 10 min.
  5. Après digestion complète, en commun le surnageant dans le tube de collecte. Centrifuger le tube de collecte à 400 xg, 4 ° C pendant 8 min pour recueillir les cellules. Aspirer le liquide et suspendre le culot cellulaire dans 10 ml de tampon d'albumine riche et filtrer l'échantillon à 100 mm maille. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Puis effectuer l'analyse des flux cytometic (section 4) ou à l'enrichissement TEC (section 5).

4 Identification des TEC par cytométrie en flux

  • Préparer les cellules à une concentration finale de 4 x 10 6 cellules par 100 pi de tampon pour FACS pour la coloration dans une plaque de puits d'essai à fond rond de 96 et de maintenir la plaque sur de la glace. Ajouter 20 ul de solution de bloc Fc (anti-CD16 / CD32 anticorps à 10 pg / ml dans du tampon FACS) aux cellules et on incube les cellules pendant 10 min sur de la glace. Faire tourner la plaque à 400 x g, 4 ° C pendant 3 min. Jeter le liquide des puits en tapotant la surface de la plaque vers le bas dans un évier.
  • Suspendre le culot cellulaire dans 100 pi de cocktail d'anticorps (anti-CD45, -EpCAM, classe -MHC II, et -Ly51 anticorps, et l'UEA-1 lectine marquées avec des fluorochromes à recommandé par le fabricant ou testé des concentrations optimales de chaque anticorps dans un tampon FACS ), et incuber les cellules sur de la glace pendant 20 min dans l'obscurité. Pour la compensation, tacher 1 x 10 6 cellules avec chaque fluorochrome.
  • Ajouter 100 ul de tampon FACS à chaque puits et faire tourner la plaque à 400 x g, 4 ° C pendant 3 min. Répétez la seule étape de lavagetemps, puis remettre en suspension les cellules dans du tampon FACS 100 ul. Transférer les cellules dans un tube à fond rond de FACS 12 x 15 mm remplie avec 300 pi de tampon FACS. Acquérir des échantillons sur cytomètre en flux et analyser les données en utilisant un logiciel d'analyse FACS. TEC stratégie de déclenchement est représentée sur la Figure 2.
  • 5. enrichissement des TEC par Panoramique

    1. Isoler les cellules du thymus (préparés à la section 3) à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min. Aspirer le liquide et en suspension les culots cellulaires dans du tampon de tri FACS à une concentration de 2 x 10 8 cellules par ml dans un tube conique de 15 ml ou 50 ml. Ajouter l'anticorps anti-CD90.2 (clone H12-30) (ou anti-CD45) à une concentration finale de 2,5 pg / ml de suspension de cellules et incuber les cellules doucement sur un agitateur rotatif à 4 ° C pendant 30 min. Après l'incubation, laver avec un 5 - le volume 10x de milieu RP10 et centrifuger le tube à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min.
    2. Aspirer le liquide et remettre en suspension le culot cellulaire dansmilieu RP10 à une concentration de 1 x 10 7 par ml. Ajouter 5 ml de suspension de cellules à chaque plaque revêtue de panoramique (préparé à l'étape 1.3), tourbillon et incuber pendant 30 min à température ambiante. Agiter vigoureusement; transférer les surnageants dans un tube conique. Rincer la plaque deux fois en utilisant un milieu de RP10 et mettre en commun les surnageants dans le tube de collecte.
    3. Centrifuger le tube de prélèvement à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min. Aspirer le liquide et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de RP10. Ajouter la suspension cellulaire à une nouvelle plaque panoramique, agiter et incuber pendant 30 min à température ambiante. Recueillir les cellules rincer la plaque et mettre en commun les dans un tube conique. Une fois que les TEC sont enrichis, centrifuger les cellules à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min et suspendre les cellules dans 5 ml FACS tampon de tri.

    6 Purification des TEC par Tri cellulaire

    1. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et préparer la suspension de cellules à une concentration de 4 x 10 7 cellules dans du tampon de tri FACS. Ajouter des anticorpsdécrite à l 'article 4.4 en solution de cellules et incuber les cellules doucement sur un agitateur rotatif à 4 ° C pendant 30 min. Après la coloration, les cellules laver et suspendre à une concentration de 10 x 10 6 cellules par ml de tampon de tri FACS.
    2. Trier les sous-ensembles TEC à travers une buse 100 uM en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé. Cellules triées sont collectées dans 30% (v / v) de FBS dans du RPMI-1640). Une fois que le tri de cellules, des cellules se fait de centrifugation à 400 xg, 4 ° C pendant 5 minutes et la préparation pour l'analyse en aval.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    En utilisant ce protocole, un organe thymus a été enlevée d'une souris adulte (section 2) et une suspension de cellules du thymus a été préparé comme décrit à la section 3 La suspension cellulaire obtenue est composée de thymocytes, les cellules stromales hématopoïétiques dérivés et les cellules stromales non-hématopoïétiques. CD45 est un marqueur pan-hématopoïétique exprimé sur les thymocytes et les cellules stromales hématopoïétiques telles que les macrophages et les cellules dendritiques. En revanche, les TEC sont pas d'origine hématopoïétique et n'expriment pas CD45 15. Coloration des cellules et cytométrie de flux ont été réalisées comme décrit à la section 4.

    Deux types de sous-ensembles de TEC, CTEC et mTECs, proviennent d'un TEC précurseur bi-puissant commune 15. Les deux CTEC et mTECs expriment la molécule d'EpCAM sur leur surface 28. Ainsi TEC peut être clôturé selon EpCAM-positif et négatif CD45 par cytométrie de flux (figure 2A). CTEC mTECs et peuvent être distingués par deux réactifs: la Ly51anticorps qui reconnaît glutamyl aminopeptidase exprimée par Ctec, et la lectine Ulex europaeus agglutinine-1 (UEA-1) 28 qui se lie à mTEC (figure 2B). Les deux mTECs et CTEC expriment des molécules CMH de classe II à leur surface (figure 2C et 2D). mTECs peut être en outre classés dans la mTEC haut-bas et mTEC en fonction du niveau des molécules du CMH-II (figure 2D). Le nombre moyen de TEC par le thymus est d'environ 9 x 10 5. Dans les comparaisons directes, nous avons récupéré environ 8 fois plus de TEC en utilisant ce protocole à base d'enzymes Libérase par rapport à un protocole en plusieurs étapes avec de la collagénase / dispase 29 (Figure 3).

    Afin de diminuer le temps de tri et d'accroître la viabilité des cellules stromales récupérés, nous avons développé une méthode d'exploration sur épuiser thymocytes parce que la suspension de cellules du thymus est composé de plus de 95% des thymocytes. Les cellules ont été incubées avec unanticorps et capturé par des plaques pré-revêtues ti-CD90. Par rapport à celle de l'ensemble des cellules de thymus préparées (pré-enrichi), la proportion des TEC a été augmentée de moins de 0,5% à plus de 15% dans des cellules post-enrichi (Figure 4A et 4B). Panoramique avec anti-CD45 peut également être utilisé si, par exemple, on n'a pas besoin de récupérer les cellules dendritiques ainsi. Dans ce cas, TEC enrichissement augmente à environ 80% (données non présentées). Après enrichissement de cellules stromales de panning, les proportions des sous-ensembles de TEC n'ont pas été modifiées (Figure 4C et 4D), ce qui suggère que l'un ou l'autre sous-ensemble ne sont pas perdues sélectivement pendant le panoramique. Par rapport à l'échantillon de pré-enrichissement, le taux de récupération des TEC était d'environ 85% (figure 4E).

    Figure 1
    La figure 1 de thymus de souris during dissection. Le thymus est situé au-dessus du cœur dans le thorax supérieur antérieur. Après la coupe et la levée des côtes, les deux lobes blancs du thymus sont exposés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2: Identification des CTEC et mTEC à l'analyse de données de cytométrie en flux. Échantillons de cellules du thymus Stained ont été analysés par cytométrie en flux. Profils FACS représentatifs sont présentés. Les chiffres indiquent le pourcentage de chaque population. (A) de cellules vivantes, un portail d'actualités CD45 négatif et EpCAM-positifs représente cellules TEC. (B) Dans la grille de TEC, deux populations sont séparées par niveau de Ly51 et UEA- 1. CTEC ont une grandeexpression er de Ly51; mTECs ont plus haut niveau de l'UEA-1. molécules (C) du CMH II sont fortement exprimés sur CTEC. (D) mTECs se compose des sous-populations à faible potentiel et CMH II du CMH II, qui sont séparément appelés mTEC haute et mTEC faible. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 Un protocole basé sur libérase permis des rendements plus élevés de cellules de thymus que d'utiliser une multi-étape collagénase / dispase protocole. Cellules du thymus ont été préparés en utilisant un multi-étape collagénase / dispase protocole déjà publié ou ce protocole basé libérase. Les deux groupes d'échantillons ont été analysés par cytométrie de flux (A). </ Strong> profils FACS représentatifs sont présentés. Les chiffres indiquent les pourcentages de cellules TEC dans chaque groupe. (B) Le nombre total de cellules de TEC par le thymus de la souris sont présentés dans le graphique à barres. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n> 3). A, test T non apparié bilatéral a été effectuée à l'aide du logiciel Prism. P <0,0001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 enrichissement des TEC par la méthode de balayage panoramique. Les profils FACS de cellules stromales thymiques pré et post-enrichi sont présentés. Des cellules de thymus préparées ont été colorées avec un anticorps anti-CD90. thymocytes CD90-positif comprend plus de 95% des cellules du thymus. Au cours de la procédure d'enrichissement de TEC, les thymocytes sont captured et appauvri sur la plaque panoramique pré-enduit, ainsi TEC sont enrichis dans le surnageant. (A) et (B), portes de TEC sont présentés. Les chiffres montrent que la proportion des TEC entre cellules vivantes totaux dans la population (pré-enrichissement) à partir ou après enrichissement (post-enrichissement). (C) et (D), les cellules à l'intérieur de la technologie cTEC et MTEC portes sont présentés. Les chiffres indiquent les pourcentages de CTEC et mTEC dans les populations de TEC de chaque groupe. Numéros (E) de cellules de CTEC et mTECs par le thymus de la souris sont indiquées dans le graphique. Les données sont représentatives de 5 expériences. "Pre" est pour l'échantillon de pré-enrichissement; «Post» signifie échantillon post-enrichissement; petites lignes horizontales indiquent la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Dans le protocole, les étapes critiques sont la préparation de cellules stromales thymiques (section 3) et l'enrichissement des TEC (section 4). Il est fortement recommandé que la solution de l'enzyme fraîche est préparée à chaque fois et le tissu est traité dès que possible. Pour thymus commun, l'optimisation du volume de solution d'enzyme est nécessaire, selon le nombre de thymus. Si un résidu de tissu est laissé après le traitement, en ajoutant davantage de solution d'enzyme et l'extension du temps d'incubation peut augmenter le rendement de la cellule. Au cours de l'enrichissement des TEC, fin de la collecte du surnageant et répéter le rinçage de la plaque décrite à la section 5.3 diminue la perte de cellules.

    En 1980, Wekerle et al. d'abord rapporté un type de TEC - «cellules nourricières thymiques" (STN) 33, qui sont de grandes cellules épithéliales corticales qui enveloppent complètement de nombreuses cellules lymphoïdes viables dans des vésicules intracellulaires. En 1982, Kyewski et Kaplan décrit divers cond d'isolementitions qui influent sur ​​le rendement des sociétés transnationales 34. Récemment, Takahama et collègues revisité l'isolement et les caractéristiques des sociétés transnationales. Ils ont identifié ces cellules sur la base de la coloration pour CD45 préférentiel uniquement après perméabilisation membranaire 35. Ils ont également décrit «cassé» TNC dans leur préparation, qui consistait en une CTEC et plusieurs thymocytes liés. Cette cassé TNC étaient positifs pour extracellulaire CD45 et le marqueur β5t CTEC et comprend 70% de CTEC totales dans leur préparation. En effet, nous avons également observé une population de cellules semblables, ce qui était élevé CD45 + EpCAM et Ly51 + dans la suspension de cellules préparée de thymus, bien que constitué à moins de 40% du total des CTEC avec notre procédure d'isolement. Ces cassé TNC sont retirés de protocoles d'enrichissement de TEC, comme la nôtre, qui utilisent l'épuisement soit avec CD90 ou CD45. Ainsi, un défi pour l'avenir sera de minimiser la perte de cette population.

    Comparéde la procédure multi-étape de digestion 29 existant, le protocole de digestion Libérase permet un rendement significativement plus élevé de cellules de TEC (figure 3). D'autres groupes ont également rapporté des nouveaux procédés pour l'isolement des cellules stromales thymiques en modifiant le procédé de Gray 30,36, bien que le rendement de la cellule n'a pas été augmentée de façon significative. Récemment, Chidgey et ses collègues ont rapporté indépendamment un protocole de TEC à l'aide Libérase digestion et ils ont également obtenu une libération efficace des TEC 37. Cependant, la première étape de libération des thymocytes de leur protocole a le potentiel de se défaire d'environ 1,6 x 10 4 à partir de chaque TEC 29 thymus, dont la plupart sont CTEC. En raison de l'enrichissement gradient de densité causant une perte de cellules stromales petites, une déplétion CD45-microbilles à base de AutoMACS est communément utilisé pour l'enrichissement de TEC avant purification 29,36,37 FACS. Par rapport à l'enrichissement à base de AutoMACS en utilisant des protocoles CD45-microbille épuisement 29, lespanoramique enrichissement obtenus des taux de récupération plus élevés de TEC. Dans l'ensemble, le protocole présenté ici regroupe un certain nombre d'avantages signalés précédemment. Sous-ensembles TEC purifiés avec ce protocole (article 6) ont été utilisés avec succès pour une analyse plus approfondie, comme PCR en temps réel et l'analyse Western blot 12.

    Ce protocole est également approprié pour l'isolement et l'étude d'autres cellules stromales thymiques, telles que les cellules dendritiques. Nous croyons que l'isolement de cellules stromales robuste thymiques, en particulier TEC, permettra d'accélérer la compréhension du fonctionnement du thymus pour le développement des cellules T et la réalisation dans la constitution de cellules T in vitro. De plus, la caractérisation de ces cellules a une grande valeur pratique pour la communauté médicale, car un problème courant avec les thérapies de récupération (telles que celles utilisées dans la transplantation et le traitement du cancer) est mauvaise reconstitution de cellules épithéliales dans le thymus conduisant à l'immunodéficience.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

    Acknowledgments

    Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé Grant R01 AI088209 (à KAH). Nous remercions également l'Université du Minnesota cytométrie en flux de ressources.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics