संवर्धन

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

एलिगेंस आमतौर पर ठोस अगर प्लेट पर हो या तरल संस्कृतियों में ई. के साथ वरीयता प्राप्त है कोलाई. विषाक्तता और पोषक तत्वों की पढ़ाई confounding से बैक्टीरियल byproducts रोकने के लिए, हम बहाव के अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए कीड़े की एक बड़ी संख्या बढ़ने और सिंक्रनाइज़ करने के लिए, एक axenic तरल मध्यम, CeHR का उपयोग किया.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Samuel, T. K., Sinclair, J. W., Pinter, K. L., Hamza, I. Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment. J. Vis. Exp. (90), e51796, doi:10.3791/51796 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

इस प्रोटोकॉल में, हम आवश्यक सामग्री मौजूद है, और संशोधित सी बनाने के लिए प्रक्रिया. ई legans आदी होना और प्रजनन मीडिया (mCeHR). इसके अतिरिक्त, सी. उजागर और acclimatizing के लिए कदम ई. पर हो एलिगेंस तरल मीडिया axenic को कोली वर्णित हैं. Axenic सी. उपयोग है कि अंत में, बहाव के प्रयोगों एलिगेंस इस प्रक्रिया के लाभों को वर्णन. सी. विश्लेषण और निर्धारित करने की क्षमता एलिगेंस पोषक तत्वों की आवश्यकता बदलती हीम सांद्रता के साथ axenic तरल मीडिया में एन 2 जंगली प्रकार के कीड़े से बढ़ से यह साफ किया गया था. यह प्रक्रिया कीड़ा वृद्धि और विकास के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए या, दवा उपचार के जहर के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अन्य पोषक तत्वों के साथ दोहराया जा सकता है. जंगली प्रकार के कीड़े के विकास पर विभिन्न हीम सांद्रता का प्रभाव गुणात्मक सूक्ष्म अवलोकन के माध्यम से और टी quantitating द्वारा निर्धारित किया गया हैप्रत्येक हीम एकाग्रता में वृद्धि हुई है कि कीड़े की वह संख्या. इसके अलावा, विभिन्न पोषक सांद्रता का असर ब्याज के पोषक तत्वों में परिवर्तन का जवाब है कि फ्लोरोसेंट सेंसर व्यक्त कि कीड़े के उपयोग के द्वारा assayed किया जा सकता है. इसके अलावा, कीड़े की एक बड़ी संख्या में आसानी से microparticle बमबारी का उपयोग ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस की पीढ़ी के लिए तैयार किए गए.

Introduction

मिट्टी निमेटोड, Caenorhabditis एलिगेंस, विष विज्ञान को आनुवंशिकी से कई अध्ययनों में इस्तेमाल एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. अपने 1 मिमी आकार, चार दिन, खेती की आसानी के तेजी से पीढ़ी समय, और बड़ी संतान संख्या का एक परिणाम के रूप में, इन नेमाटोड आनुवंशिक और औषधीय स्क्रीन 1, 2 की एक संख्या में उपयोग किया गया है. शोधकर्ताओं हड्डीवाला प्रणाली में संरक्षित अणुओं और रास्ते की पहचान करने के लिए इस कीड़ा का लाभ ले. ये रास्ते कोशिका मृत्यु का संकेत है, उम्र बढ़ने और चयापचय के रास्ते, और तंत्रिका तंत्र 3-6 शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, सी. की पारदर्शिता एलिगेंस सीधे जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और प्रोटीन स्थानीयकरण का विश्लेषण करने की कल्पना की जा सकती है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन पत्रकारों, का उपयोग ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.

कई अध्ययनों में इस निमेटोड निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम) प्लेट का उपयोग कर एक ठोस अगर आधारित सतह पर या एल में सुसंस्कृत हैiquid संस्कृतियों एक खाद्य स्रोत 7,8 के रूप में ई. कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त. ये जीवाणु खाद्य स्रोतों द्वारा उत्पादों परिणामों की व्याख्या को प्रभावित करने वाले जीवाणु से हस्तक्षेप साथ जैव रासायनिक और विष विज्ञान के अध्ययन उलझाना कर सकते हैं. सी. इन जटिल प्रभाव से बचने के लिए एलिगेंस एक खाद्य स्रोत के रूप में बैक्टीरिया से रहित है कि एक axenic तरल मीडिया में संवर्धित किया जा सकता है. इस मीडिया का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक कई मानक सी. के लिए अत्यधिक सिंक्रनाइज़ कीड़े के लाखों सुसंस्कृत सी. में विभिन्न विनियमित जीन की माइक्रोएरे विश्लेषण सहित एलिगेंस प्रोटोकॉल एलिगेंस अलग हीम सांद्रता के संपर्क में है, और जीन बमबारी का उपयोग ट्रांसजेनिक कीड़े का उत्पादन. यह मीडिया रासायनिक परिभाषित और डॉ. एरिक क्लेग 9 द्वारा तैयार एक मूल नुस्खा से संशोधित किया गया है. इस mCeHR मीडिया का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक हीम homeostasis में शामिल जीनों की पहचान की है, 10 (एचआरजी ओं) के रूप में हीम उत्तरदायी जीनों को भेजा, जो होगाई. के साथ वरीयता प्राप्त एन जी एम अगर प्लेटों का उपयोग, जो नियमित रूप से विकास की स्थिति में संभव नहीं किया गया है कोलाई.

इस प्रोटोकॉल में हम सी. शुरू करने और बनाए रखने के लिए प्रक्रिया का वर्णन ई. पर हो एलिगेंस कोली axenic mCeHR करने और ट्रांसजेनिक सी. के उत्पादन के लिए कीड़े की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए इस विधि का उपयोग microparticle बमबारी का उपयोग एलिगेंस लाइनों. सी. के पोषण की आवश्यकता का निर्धारण करने के लिए axenic मीडिया का उपयोग करने की उपयोगिता बताते हैं कि हम भी उपस्थित पढ़ाई एलिगेंस एक उदाहरण के रूप में हीम का उपयोग कर. इन अध्ययनों mCeHR मीडिया का उपयोग सी. की एक बड़ी संख्या का तेजी से विकास के लिए अनुमति देता है कि दिखाने कीड़ा शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एलिगेंस.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. कीड़ा उपभेदों

  1. सी. प्राप्त एलिगेंस Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) से ब्रिस्टल N2 उपभेदों wildtype और एन जी एम प्लेटों पर उन्हें बनाए रखने ई. के साथ वरीयता प्राप्त कोलाई तनाव OP50 7. नोट: ट्रांसजेनिक कीड़ा IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) के पहले 11 में वर्णित के रूप में उपयोग उत्पन्न किया गया उपभेदों. IQ6011 इसी लेखक से अनुरोध किया जा सकता है.

संशोधित सी. के 2. तैयारी एलिगेंस बस्ती और प्रजनन मध्यम (mCeHR)

12 से नीचे के रूप में वर्णित mCeHR तरल मीडिया तैयार करें. इस axenic तरल मीडिया कीड़े कोई अतिरिक्त खाद्य स्रोतों के बिना विकसित करने के लिए अनुमति देता है. इस तरह के एक लामिना का प्रवाह हुड के रूप में सख्ती से बाँझ शर्तों का उपयोग axenic तरल मीडिया और axenic कीड़े के सभी जोड़तोड़ बाहर ले.

  1. एक किराने की दुकान से अल्ट्रा वसा रहित दूध प्राप्त करते हैं. प्रशीतित समर्थक का प्रयोगवाहिनी और नहीं कमरे के तापमान उत्पाद. MCeHR मध्यम, लकीर में प्लेटें अगर ब्रेन हार्ट आसव (भी) पर दूध का उपयोग करें और बाँझपन के लिए जाँच करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन के लिए सेते करने से पहले. -80 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब और दुकान के लिए दूध स्थानांतरण
  2. निम्नलिखित घटकों में से प्रत्येक को तैयार है और आदेश और mCeHR का 1 एल तैयार करने के लिए दी गई मात्रा (तालिका 1 ए) में गठबंधन: 2 मिमी कोलीन व्दिअम्लज साइट्रेट की 10 मिलीलीटर, विटामिन और वृद्धि कारक मिश्रण के 10 एमएल (तालिका 1 बी में नुस्खा देखें), 2.4 मिमी Myo-inositol की 10 मिलीलीटर, 10 मिलीलीटर की 2 मिमी hemin क्लोराइड, विआयनीकृत पानी की 250 मिलीलीटर. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर यूनिट के माध्यम से सक्शन और फिल्टर लागू करें.
  3. न्यूक्लिक एसिड मिश्रण की 20 मिलीलीटर (तालिका -1 सी में नुस्खा), खनिज मिश्रण की 100 मिलीलीटर (तालिका -1 डी में नुस्खा), 170 मिलीग्राम / एमएल lactalbumin hydrolyzate की 20 मिलीलीटर, आवश्यक अमीनो एसिड के 20 मिलीलीटर, गैर आवश्यक अमीनो के 10 एमएल जोड़ें एसिड, 450 मिमी के.एच. 2 पीओ 4 की 20 मिलीलीटर,1.45 एम डी ग्लूकोज, 1 एम HEPES के 10 एमएल, सोडियम नमक, 250 एमएल विआयनीकृत पानी की 50 मिलीलीटर.
  4. घटकों बाँझ फिल्टर करने के लिए चूषण लागू करें. फिल्टर निकालें और 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें. मीडिया के पीएच लगभग 6-6.5 है कि सुनिश्चित करें. नोट: यह समाधान के लिए एक साल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  5. उपयोग से पहले mCeHR मध्यम करने के लिए 20% (v / v) अल्ट्रा जैविक स्किम दूध जोड़ें. दूध खोलने और aliquoting जब (एक लामिना का प्रवाह हुड में उदाहरण के लिए) राजनीति बाँझ तकनीक का प्रयोग करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया की दुकान

3. सी. तैयार करें axenic mCeHR तरल माध्यम में संस्कृति के लिए एलिगेंस

  1. कई गर्भवती कीड़े और OP50 ई. की एक न्यूनतम राशि जब तक वहाँ दस 60 मिमी एन जी एम प्लेटों पर कीड़े हो जाना प्लेटों पर कोलाई.
  2. M9 बफर (तालिका 1F में नुस्खा) के 5 एमएल के साथ rinsing द्वारा प्रत्येक थाली से कीड़े निकालें, और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में गठबंधन.
  3. एस के लिए कीड़े की अनुमति देंettle 5 से 10 मिनट के लिए खड़े करने के लिए ट्यूब को छोड़ कर फिर ध्यान ई. युक्त सतह पर तैरनेवाला हटायें कोलाई.
  4. दोहराएँ प्रक्रिया जारी रखने से पहले संभव के रूप में अवशिष्ट बैक्टीरिया के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए 3.2 और 3.3 2x दोहराएँ.
  5. , तीन की एक बहु है कि एक मात्रा में 0.1 एन NaCl में कीड़े Resuspend उदाहरण के लिए 1.5 मिलीग्राम, 3 मिलीग्राम या 6 मिलीग्राम जिसमें व्यक्तिगत कीड़े ट्यूब में देखा जा सकता है.
  6. 5 एन NaOH और 5% सोडियम हाइपोक्लोराइट कीड़ा निलंबन के लिए एक 01:02:06 के अनुपात में (ब्लीच) समाधान जोड़कर कीड़े ब्लीच. उदाहरण के लिए, 1 मिलीलीटर 5 एन NaOH: 2 मिलीलीटर 5% सोडियम hypochlorite: कीड़ा निलंबन के 6 मिलीग्राम. कीड़ा निलंबन को जोड़ने से पहले NaOH और ब्लीच मिलाएं.
  7. भंवर समाधान सख्ती गर्भवती कीड़े भंग कर रहे हैं और जब तक केवल अंडे निलंबन (के बारे में 5 से 10 मिनट) के भीतर दिखाई दे रहे हैं. एक 10X उद्देश्य से एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रक्रिया की निगरानी.
  8. कीड़े पूरी तरह भंग हो जाने के बाद, तुरंत गोलीअंडे 45 सेकंड के लिए 800 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 800 XG पर गोली centrifuging द्वारा बाँझ पानी की 10 मिलीलीटर के साथ दो बार गोली कुल्ला
  9. विरंजन के बाद, 100 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक mCeHR मीडिया के 10 एमएल युक्त एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी अंडा गोली हस्तांतरण. बाँझ तकनीक का उपयोग कर इस प्रक्रिया से बाहर ले. अगर वांछित, axenic तरल संस्कृतियों में जीवाणु वृद्धि को रोकने के लिए, 250 ग्राम / एमएल नैलीडिक्सिक एसिड सहित, अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ने.
  10. लगभग 70 rpm पर एक मिलाते इनक्यूबेटर पर 20 डिग्री सेल्सियस पर तरल संस्कृतियों सेते हैं.
  11. विकास के चरण में है और विकास की दर को ध्यान दें दैनिक कीड़े की जाँच करें.
    नोट: कीड़े शुरू में धीरे धीरे बढ़ने और गर्भवती बनने के लिए 7 से 10 दिन की आवश्यकता होगी. कीड़े तरल माध्यम के लिए acclimatize लेकिन, जैसा कि पीढ़ी समय wildtype (एन 2) कीड़े के लिए लगभग 4 दिनों तक कम हो जाएगा.
  12. कीड़े एच.डी. के बादएक शंक्वाकार ट्यूब कीड़ा संस्कृति हस्तांतरण और एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 XG पर कीड़े गोली, तरल मीडिया में गर्भवती चरण के लिए loped.
  13. सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे 0.1 एम NaCl के एक बराबर मात्रा में कीड़ा गोली resuspend. उदाहरण के लिए, mCeHR के 10 मिलीलीटर में सुसंस्कृत कीड़े के लिए 0.1 एम NaCl के 10 एमएल का उपयोग करें. कीड़े बर्फ पर 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें.
  14. कदम 3.5-3.8 में ऊपर वर्णित के रूप में विरंजन प्रक्रिया से बाहर ले, और कीड़े axenic तरल मीडिया में एक दूसरी पीढ़ी के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. यदि आवश्यक हो, बैक्टीरियल विकास को बाधित करने के लिए फिर से एंटीबायोटिक जोड़ें.
  15. फिर एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या का उत्पादन करने के लिए, कदम 3.5-3.8 में वर्णित के रूप में तो फिर ब्लीच, कदम 3.12 और 3.13 में वर्णित के रूप में फिर 0.1 एम NaCl में कीड़े गोली और resuspend कीड़े गर्भवती बनने के लिए अनुमति देते हैं. अब से एंटीबायोटिक दवाओं के बिना तरल मीडिया में एल 1 लार्वा कीड़े आगे बढ़ें.

तरल से 4. तुल्यकालन कीड़ेसंस्कृति

  1. गोली और कदम 3.12 और 3.13 में ऊपर वर्णित के रूप में 0.1 एम NaCl में कीड़े resuspend. कदम 3.5-3.8 में ऊपर वर्णित के रूप में ब्लीच.
  2. M9 बफर के 10 एमएल में अंडे गोली Resuspend और लार्वा घूर्णन एक मंच प्रकार के बरतन पर 20 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन हैच करने की अनुमति. नोट: अंडे एल 1 लार्वा में हैच जाएगा, लेकिन आगे का विकास नहीं होगा, एल 1 चरण में कीड़े तुल्यकालन.
  3. बनाए रखने और उपसंस्कृति कीड़े, 5 मिनट के लिए 800 XG पर गोली एल 1 लार्वा, तो 10 mCeHR की मिलीलीटर और एक 25 सेमी 2 फ्लास्क को हस्तांतरण में लार्वा resuspend. कीड़े घूर्णन एक मंच पर 20 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने की अनुमति. कीड़े के लिए पर्याप्त पोषण सुनिश्चित करने के लिए 3,000 कीड़े / एमएल / 2 सेमी की एक अधिकतम घनत्व को बनाए रखने.
    नोट: इस चरण में, एंटीबायोटिक दवाओं प्रक्रियाओं एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाता है जब axenic की स्थिति बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं हैं. कीड़े विकास पर नजर रखने के लिए दैनिक जाँच की जानी चाहिए.

5. मुफ्तaxenic मध्यम संस्कृतियों के लिए zing और विगलन कीड़े

  1. Axenic अतुल्यकालिक कीड़ा संस्कृतियों या तरल नाइट्रोजन में लयबद्ध एल 1 लार्वा रुक. 5 मिनट के लिए 800 XG पर गोली कीड़े तो प्रत्येक शीशी के लिए 0.5 मिलीलीटर का उपयोग एस बफर में (6.45 मिमी KHPO 4, 43.55 मिमी KHPO 4, 146.25 मिमी NaCl) resuspend. प्रत्येक शीशी 30% v / वी ग्लिसरॉल के साथ एस बफर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और तरल एन 2 में लंबी अवधि के भंडारण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस तक कीड़े हस्तांतरण. प्रत्येक शीशी में प्रति मिलीलीटर लगभग 1 एक्स 10 6 कीड़े रुक.
  2. लगभग सभी बर्फ से पिघल रहा है जब तक लगभग 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों incubating द्वारा कीड़े पिघलना. एक लामिना का प्रवाह हुड में, mCeHR युक्त एक बाँझ फ्लास्क कीड़े हस्तांतरण और 20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें जगह

6. MCeHR में विकास और प्रजनन पर Hemin एकाग्रता के प्रभाव को निर्धारित

  1. सी. के पोषक निर्भर विकास परख करने axenic mCeHR मीडिया का प्रयोग करें एलिगेंस. प्रभाव ओ निर्धारित करने के लिएकीड़ा वृद्धि और विकास पर च hemin एकाग्रता, axenic N2 कीड़े या हित के अन्य उपभेदों सिंक्रनाइज़ उपयोग करें. धारा 4 में ऊपर वर्णित के रूप में एल 1 लार्वा सिंक्रनाइज़.
  2. अगले दिन, गोली और सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा गिनती और axenic मीडिया की μl प्रति 1 कीड़ा को पतला पर. 0.3 एम एनएच 4 OH में 10 मिमी hemin क्लोराइड बनाओ और केंद्रित एचसीएल का उपयोग पीएच 8 को समायोजित करें.
  3. 24 अच्छी तरह से थाली को mCeHR मीडिया के 800 μl जोड़ें. मीडिया के 100 μl में हर अच्छी तरह से 100 कीड़े जोड़ें. 0 माइक्रोन से, 1.5 माइक्रोन तीन प्रतियों में 1,000 माइक्रोन से लेकर सांद्रता में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए hemin क्लोराइड जोड़ें. सभी कुओं 0.3 एम एनएच 4 OH का एक ही एकाग्रता होते हैं सुनिश्चित करें. धीरे 100 एल 1 लार्वा अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए pipetting से पहले कीड़े resuspended.
  4. दैनिक कीड़े की जांच करने और प्रत्येक कुएं में प्रत्येक एकाग्रता में वृद्धि को ध्यान दें. ऊष्मायन के 9 दिन बाद कीड़े की संख्या की गणना और प्रत्येक हीम को इसी कीड़े / एमएल की संख्या साजिशएकाग्रता (चित्रा 1).

Heme सेंसर कीड़े पर Hemin एकाग्रता की 7. प्रभाव

  1. 4 युक्त mCeHR में लयबद्ध एल 1 हीम सेंसर कीड़े (Phrg-1 :: GFP) सेते माइक्रोन, 8 माइक्रोन, 10 माइक्रोन और 20 माइक्रोन hemin.
  2. प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी, 48 घंटे बाद ऊष्मायन (चित्रा 2) का उपयोग कर छवि कीड़े.

8. ट्रांसजेनिक सी. उत्पन्न करने के लिए mCeHR उपयोग एलिगेंस Microparticle बमबारी का प्रयोग

नोट: चित्रा 3 13 में उल्लिखित है सृजन और UNC-119 (ed3) mCeHR में बड़े कीड़े का उपयोग microparticle बमबारी से बाहर ले जाने के लिए प्रक्रिया.

  1. इल्ली तैयारी
    1. एक 175 सेमी 2 फ्लास्क एक सप्ताह पूर्व बमबारी करने में mCeHR मीडिया के 90 मिलीलीटर में लगभग 1 एक्स 10 6 अतुल्यकालिक UNC-119 (ed3) कीड़े हस्तांतरण. कीड़े 20 डिग्री सेल्सियस ओ में विकसित करने की अनुमतिना 70 आरपीएम (चित्रा 3-1) ~ में मंच मिलाते हुए.
      नोट: एक सप्ताह बाद, कीड़ा घनत्व कई वयस्क गर्भवती कीड़े के साथ काफी अधिक होना चाहिए. लगभग 3 x 10 7 कीड़े microparticle बमबारी के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    2. सर्द JM109 ई. कोली बर्फ पर 10 सेमी एन जी एम प्लेटों वरीयता प्राप्त.
    3. दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को axenic कीड़े हस्तांतरण और 2 मिनट के लिए 800 XG पर कीड़े अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और M9 बफर (चित्रा 3-2) के 50 एमएल में प्रत्येक ट्यूब में कीड़े resuspend.
    4. वयस्क कीड़े बर्फ पर 10 से 15 मिनट के लिए गंभीरता से गोली करने की अनुमति दें.
      नोट: 2 मिलीलीटर गोली अब> 90% वयस्क कीड़े को शामिल करना चाहिए. इस 2 मिलीलीटर गोली लगभग 5 x 10 6 कीड़े है और एक microparticle बमबारी के लिए पर्याप्त है चाहिए.
    5. कोट ठंडा JM109 की पूरी सतह कीड़े के 2 मिलीग्राम गोली के साथ एन जी एम प्लेट वरीयता प्राप्त. पूरी तरह से अवशोषित हो तरल तो थाली छोड़ अनुमति दें(चित्रा 3-3) आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर 30 मिनट के लिए.
  2. सोने के कणों की तैयारी
    1. एक siliconized microcentrifuge ट्यूब में सोने के कणों की 30 मिलीग्राम वजन. 1 मिलीलीटर 70% इथेनॉल जोड़ें और 5 मिनट के लिए ट्यूब भंवर.
    2. ट्यूब सोने के कणों गोली 10 सेकंड के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र, फिर 15 मिनट के लिए बैठने की अनुमति. ध्यान से सोने के कणों को ट्यूब के सामने की ओर करने के लिए टिप छू द्वारा एक विंदुक टिप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    3. 1 मिनट के लिए बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर, भंवर के साथ सोने के कणों को धो लें और संक्षेप में 10 सेकंड के लिए 6000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. तो बाँझ 50% ग्लिसरॉल के 0.5 मिलीलीटर में सोने के कणों resuspend, दो बार धोने कदम दोहराएँ.
      नोट: सोने के कणों के अंतिम एकाग्रता 60 मिलीग्राम / मिलीलीटर होगी और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है
  3. डीएनए सोने के कण मिश्रण तैयार
    1. 10 और के साथ वांछित प्लास्मिड डीएनए के 10 ग्राम जुडा# 956; एक siliconized 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में UNC-119 बचाव प्लाज्मिड के जी. डि पानी के 50 μl और अच्छी तरह से resuspended सोने के कण समाधान 1 मिनट के लिए तो भंवर के 100 μl जोड़ें.
    2. 2.5 एम 2 CaCl की 150 μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए फिर से समाधान भंवर. इस समाधान के लिए, 3 से 5 मिनट के लिए 0.1 एम spermidine और भंवर के 60 μl जोड़ें.
    3. पल्स 10 सेकंड के लिए 6000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला निकालें और 70% इथेनॉल के 300 μl जोड़ें. भंवर अच्छी तरह से 1 मिनट के लिए, 6000 XG पर पल्स अपकेंद्रित्र, 100% इथेनॉल के 170 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend हटा दें. सख्ती 5 से 10 मिनट तो अपकेंद्रित्र नाड़ी और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए समाधान भंवर.
  4. बमबारी (चित्रा 3-3)
    नोट: इस प्रोटोकॉल सामग्री / उपकरण की तालिका में निर्दिष्ट कण वितरण प्रणाली के साथ किया जाता है. उपलब्ध कण वितरण साधन के लिए निर्देशों का पालन करें.
      <ली> एक 15 सेमी की थाली में टिशू पेपर के एक पत्रक रखें. चिमटी का प्रयोग, व्यक्तिगत रूप से 100% इथेनॉल में सात macrocarriers डुबकी और सुखाने के लिए ऊतक पर उन्हें करना.
    1. अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के साथ biolistic कक्ष, macrocarrier धारक, और लक्ष्य थाली साफ. स्वच्छ और प्रत्येक बमबारी प्रक्रिया से पहले रोक स्क्रीन आटोक्लेव.
    2. बैठने उपकरण का उपयोग धारक में चिमटी और प्रेस का उपयोग धारक में macrocarrriers लोड करें.
    3. समान रूप से प्रत्येक macrocarrier के केंद्र में डीएनए लेपित सोने के कणों के 20 μl फैल गया और फिर समाधान पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
    4. इथेनॉल के साथ दबाव विभक्त के दो हिस्सों को साफ और इथेनॉल साफ टूटना डिस्क के साथ इकट्ठा. बमबारी के चेंबर में इकट्ठे दबाव विभक्त और टूटना डिस्क भाड़ में.
    5. Macrocarrier धारक के साथ एक autoclaved रोक स्क्रीन इकट्ठा और धातु आवश्यक शेल्फ और जगह में ताला पर उपकरण जगह है.
    6. इकट्ठे MACR डालेंocarrier दबाव विभक्त नीचे आवंटित स्लॉट में biolistic चेंबर में तंत्र और दबाव विभक्त के साथ पंक्ति में.
    7. लक्ष्य प्लेट शेल्फ पर कीड़े के साथ खुला एन जी एम थाली टेप और चैम्बर के दरवाजे को बंद करें.
    8. , कीड़े बौछार टूटना डिस्क को तोड़ने की जरूरत है कि करने के लिए दबाव को समायोजित करने के लिए. , पारा दबाव के 28 इंच के लिए वैक्यूम चालू करें डिस्क टूटना तब तक आग बटन दबाएँ.
    9. निर्वात छोड़ दें और तंत्र से एन जी एम प्लेट हटा दें. थाली से कीड़े धो लें और JM109 ई. के साथ वरीयता प्राप्त बीस 10 सेमी एन जी एम प्लेटों में फिर से विभाजित कोली (चित्रा 3-4).
    10. कीड़े 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 से 14 दिनों के लिए आगे बढ़ने और प्लेटों को भूखा करने की अनुमति दें. UNC-119 दोष से बचाया कीड़े सामान्य आंदोलन होगा और इस समय पहचाना जा सकता है. इन स्वतंत्र ट्रांसजेनिक लाइनों (Figur का प्रतिनिधित्व के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए अलग प्लेटों से कम से कम 10 "wildtype" कीड़े उठाओई 3-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सी. संवर्धन ई. द्वारा उत्पादित माध्यमिक चयापचयों से हस्तक्षेप के बिना, कीड़े के लिए आवश्यक हैं कि पोषक तत्वों के निर्धारण में axenic तरल माध्यम एड्स में एलिगेंस कोलाई. Wildtype N2 कीड़े तीन पीढ़ियों के भीतर mCeHR मीडिया को जलवायु के अनुकूल बनाना और एन जी एम बैक्टीरियल प्लेटों पर बड़े कीड़े के लिए तुलनीय वृद्धि दिखा. दरअसल, इन कीड़े OP50 बैक्टीरिया पर बड़े कीड़े के लिए 3.5 दिनों की तुलना में 4 दिनों के भीतर गर्भवती हो जाते हैं.

MCeHR का उपयोग करने का एक फायदा ये कीड़े 14 का सही पोषक तत्वों की आवश्यकता है कि जांच के अध्ययन में देखा गया था. चित्रा में 1 कीड़े mCeHR में 1 मिमी तक, हीम की बढ़ती मात्रा के साथ पूरक बड़े हो रहे थे. इन कीड़ों की टिप्पणियों कीड़े L4 लार्वा चरण के लिए विकासशील लेकिन mCeHR में नौ दिनों के बाद गर्भवती चरण के लिए प्रगति करने में असमर्थ के साथ, 4 माइक्रोन से नीचे हीम सांद्रता में वृद्धि में एक अलग देरी दिखाया. 10 माइक्रोन और 20 की सांद्रता में56, एम हीम कीड़े 4 दिनों में गर्भवती चरण के लिए विकसित और संतान की बड़ी संख्या का उत्पादन. कीड़े 20 माइक्रोन हीम युक्त mCeHR में बड़े हो रहे थे जब संतान की अधिकतम संख्या में देखा गया था. कीड़े 100 माइक्रोन और 500 माइक्रोन हीम पर संतान के विकास और उत्पादन जारी रखा. हालांकि, लार्वा संतान की संख्या में काफी 20 माइक्रोन हीम के इष्टतम हीम एकाग्रता में बड़े कीड़े की तुलना में गिरावट आई है. 800 माइक्रोन पर या ऊपर हीम सांद्रता इन हीम सांद्रता कीड़े को विषाक्त थे जो संकेत दिया कि L3 लार्वा चरण, पर अवरुद्ध, बीमार कीड़े में हुई.

इष्टतम हीम एकाग्रता और सी. पर हीम अभाव और हीम विषाक्तता के प्रभाव को निर्धारित करने के अलावा एलिगेंस विकास, हीम संवाददाता उपभेदों परोक्ष रूप से एक छोटे एकाग्रता सीमा के भीतर कृमि के हीम स्थिति का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. IQ6011 कीड़ा एक हीम उत्तरदायी ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता व्यक्त करता है कि एक ट्रांसजेनिक कीड़ा है, पी एचआरजी -1 चित्रा 2 के रूप में देखा यह प्रतिक्रिया, हीम परिपूर्ण परिस्थितियों में उलट है. GFP अभिव्यक्ति 20 माइक्रोन हीम में दमित है और हीम एकाग्रता के रूप में बढ़ जाती है की कमी हुई है. हीम एकाग्रता में वृद्धिशील परिवर्तन बढ़ाने mCeHR मीडिया में जीन प्रतिक्रिया और अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है.

ध्यान से कीड़ा के लिए प्रदान की पोषक सांद्रता नियंत्रण करने में सक्षम होने के अलावा, mCeHR axenic मीडिया सिंक्रनाइज़ कीड़े की एक बड़ी संख्या के कुशल विकास के लिए अनुमति देता है. यह सुविधा microparticle बमबारी (चित्रा 3) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कम से कम एक एकीकृत लाइन इस प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है हर microparticle बमबारी (तालिका 2) से विकसित किया गया है.


चित्रा 1. सी. एलिगेंस हीम विकास की अवस्था. कीड़े 9 दिनों के लिए mCeHR में 1,000 माइक्रोन 0 माइक्रोन से हीम सांद्रता की एक सीमा में बड़े हो रहे थे. प्रत्येक एकाग्रता में कीड़े की संख्या की गिनती और साजिश रची गई थी. 1.5 माइक्रोन हीम सांद्रता कीड़े L4 और आगे विकसित करने में असमर्थ थे. 800 माइक्रोन हीम में कीड़े एल 2-L3 चरणों में छोटे क़द और हीम विषाक्तता के प्रभाव दिखाया गया.

चित्रा 2
MCeHR में अलग हीम सांद्रता हीम सेंसर की चित्रा 2. रिस्पांस (Phrg-1 :: GFP) के तनाव. सिंक्रनाइज़ ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस व्यक्त एचआरजी -1 :: GFP mCeHR 4 के साथ पूरक मीडिया, 8, 10, या 48 घंटे के लिए 20 माइक्रोन हीम में बड़े हो रहे थे. छवियाँ एक Zeiss LSM 710 confoca के साथ ले जाया गयाएल माइक्रोस्कोप. स्केल बार 100 मीटर है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. सी. में microparticle बमबारी के योजनाबद्ध एलिगेंस mCeHR में उगाई UNC-119 कीड़े का उपयोग कर. (1) लगभग 3 x 10 7 UNC-119 (ed3) कीड़े 90 मिलीलीटर mCeHR मीडिया में बड़े हो रहे हैं. (2) Gravids 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी गई थी. (3) लगभग 5 x 10 6 गर्भवती कीड़े की एक 2 मिलीलीटर गोली एक गैरवरीय एन जी एम थाली पर समान रूप से फैल गया था. कीड़े सोने के कणों को complexed UNC-119 बचाव प्लाज्मिड के 12 ब्याज की प्लाज्मिड के माइक्रोग्राम और 6 ग्राम के साथ बमबारी कर रहे थे. (4) टीवह कीड़े ई. के साथ वरीयता प्राप्त बीस 10 सेमी प्लेटों पर विभाजित किया गया बमबारी कोलाई तनाव JM109. (5) 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह ऊष्मायन के बाद, जंगली प्रकार के कीड़े के साथ प्लेट transgene अभिव्यक्ति ताकत और अलगाव दरों के विश्लेषण के लिए चयन किया गया था.

"एर> तालिका -1 डीIGN: केन्द्र "> टेबल 1E
टेबल 1A
CeHR, 1 एल
बाँझ तकनीक और एक 1 एल (0.22 मीटर) वैक्यूम फिल्टर यूनिट का प्रयोग, वर्णित क्रम में स्टॉक समाधान और पानी की निम्न मात्रा में फिल्टर.
Choline व्दिअम्लज साइट्रेट 10 मिलीलीटर
विटामिन और वृद्धि कारक मिश्रण 10 मिलीलीटर
Myo-Inositol 10 मिलीलीटर
Hemin क्लोराइड 10 मिलीलीटर
विआयनीकृत पानी 250 मिलीलीटर
न्यूक्लिक एसिड मिश्रण 20 मिलीलीटर
खनिज मिश्रण 100 मिलीलीटर
Lactalbumin hydrolyzate 20 मिलीलीटर
आवश्यक अमीनो एसिड मिक्स 20 मिलीलीटर
गैर आवश्यक अमीनो एसिड मिश्रण 10 मिलीलीटर
के.एच. 2 पीओ 4 20 मिलीलीटर
डी ग्लुकोज 50 मिलीलीटर
HEPES, सोडियम नमक 10 मिलीलीटर
विआयनीकृत पानी 250 मिलीलीटर
वॉल्यूम में इस बिंदु पर 800 मिलीलीटर हो जाएगा
जोड़ तो वैक्यूम से फिल्टर यूनिट निकालें:
कोलेस्ट्रॉल 1 मिलीलीटर
अल्ट्रा क्रीम दूध स्किम 200 मिलीलीटर
टेबल 1B
विटामिन और वृद्धि कारक मिश्रण, 100 मिलीलीटर
समाधान 1: पानी को जोड़ने की 60 मिलीलीटर के लिए:
N-acetyl-α-D-glucosamine 0.15 जी
डीएल alanine 0.15 जी
Nicotinamide 0.075 ग्राम
डी pantethine 0.0375 जी
डीएल pantothenic एसिड, Hemi कैल्शियम नमक 0.075 ग्राम
फोलिक एसिड 0.075 ग्राम
Pyridoxamine 2HCl 0.0375 जी
Pyridoxine एचसीएल 0.075 ग्राम
पीला रंग mononucleotide, सोडियम नमक 0.075 ग्राम
Thiamine हाइड्रोक्लोराइड 0.075 ग्राम
2 समाधान: 5 मिलीलीटर 1 एन KOH में निम्नलिखित रसायन तैयार:
पी aminobenzoic एसिड 0.075 ग्राम
डी बायोटिन 0.0375 जी
Cyanocobalamin (बी 12) 0.0375 जी
Folinic एसिड, कैल्शियम नमक 0.0375 जी
विटामिन बी कम्पलैक्स का एक घटक 0.075 ग्राम
Pyridoxal 5-फॉस्फेट 0.0375 जी
समाधान 3: 0.0375 जी (±) α-L-lipoic एसिड, 1 मिलीलीटर इथेनॉल में ऑक्सीकरण फार्म:
समाधान 1, 2, और 3 का मिश्रण है और 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर या -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots फ्रीज
यह जल्दी से किया जाता है तो इस मिश्रण के लिए शेयरों की छोटी मात्रा में करें.
टेबल 1C
न्यूक्लिक एसिड मिश्रण, 100 मिलीलीटर
पानी को जोड़ने की 60 मिलीलीटर के लिए:
Adenosine 5 '-मोनोफास्फेट, सोडियम नमक 1.74 जी
Cytidine 5 'फॉस्फेट 1.84 जी
ग्वानोसिन 2 '- और 3' मोनोफास्फेट 1.82 जी
या
ग्वानोसिन 5 'फॉस्फेट 2.04 जी
Uridine 5 'फॉस्फेट, disodium नमक 1.84 जी
थाइमिन (पिछले जोड़) 0.63 जी
4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 100 मिलीलीटर और दुकान का हल लाओ या -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots फ्रीज
यह जल्दी से किया जाता है तो इस मिश्रण के लिए शेयरों की छोटी मात्रा में करें.
खनिज मिश्रण, 1 एल
2 MgCl • 6 2 हे 4.1 जी
सोडियम साइट्रेट 2.9 जी
पोटेशियम साइट्रेट monohydrate 4.9 जी
CuCl 2 • 2H 2 हे 0.07 जी
2 MnCl • 4H 2 हे 0.2 जी
ZnCl 2 0.1 जी
फे (एनएच 4) 2 (एसओ 4) 2 • 6 2 हे 0.6 जी
2 CaCl • 2H 2 हे (हमेशा पिछले जोड़) 0.2 जी
यह जल्दी से किया जाता है तो इस मिश्रण के लिए शेयरों की छोटी मात्रा में करें.
अन्य अवयव
के.एच. 2 पीओ 4 450 मिमी
Choline डि एसिड साइट्रेट 2 मिमी
Myo-Inositol 2.4 मिमी
डी ग्लुकोज 1.45 एम
Hemin क्लोराइड 0.1 एन NaOH पीएच 8.0 में 2 मिमी
HEPES, सोडियम नमक 1 एम स्टॉक समाधान
कोलेस्ट्रॉल इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर
Lactalbumin एंजाइमी hydrolyzate 170 मिलीग्राम / मिलीलीटर
टेबल 1F
M9 बफर, 1 एल
के.एच. 2 पीओ 4 3 जी
ना 2 4 HPO 6 ग्राम
NaCl 5 ग्राम
एच 2 हे 1 एल
आटोक्लेव 30 मिनट
1 एम 4 MgSO (बाँझ) 1 मिलीलीटर

तालिका 1. व्यंजनों mCeHR और mCeHR के घटकों के लिए.

बमबारी जंगली प्रकार बचाव के साथ लाइनों बचाव / transgene के साथ लाइनों स्थिर लाइनों
1 2 2 1
8 5 0
3 4 4 2
4 5 2 1
5 5 3 1
औसत 4.8 3.2 1

तालिका 2. Averaट्रांसजेनिक सी. के जीई संख्या एलिगेंस microparticle बमबारी का उपयोग कर उत्पन्न.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम तेजी से सी के लिए अनुमति देता है एक संशोधित axenic तरल मीडिया mCeHR पेश कीड़े की एक बड़ी संख्या के उत्पादन के साथ एलिगेंस पीढ़ी. कीड़े ई. contaminating के बिना हो रहे हैं यह मीडिया के कई फायदे पता चलता है कोलाई बैक्टीरिया या byproducts और पोषण और विषाक्तता अध्ययन में शोषण किया जा सकता है. ई. का उपयोग कोली या इस तरह के अध्ययन में अन्य बैक्टीरिया कई कमियां हैं. उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया की वृद्धि को विभिन्न परिस्थितियों में बदल सकते हैं और बैक्टीरिया के परिणाम की व्याख्या confounding, assayed किया जा रहा है कि अणुओं metabolize सकता है. इसलिए, इन अध्ययनों प्रदर्शन करने के लिए एक परिभाषित माध्यम के विकास अत्यधिक लाभप्रद है.

हालांकि सी. एलिगेंस पिछले अध्ययनों 15, सी. में बड़े कीड़े में तरल मीडिया में बड़ा हो गया है एलिगेंस रखरखाव मध्यम (CEMM) हम obse क्या विपरीत पीढ़ी बार 16 में एक अलग देरी, दिखानेmCeHR माध्यम में RVE. हमारा मुख्य लक्ष्य सी. फायदा उठाने के लिए था हीम और धातु चयापचय पर विशेष जोर देने के साथ पोषक होमियोस्टेसिस अध्ययन करने के लिए एलिगेंस. इसे ध्यान में रखते, mCeHR और हमारे समूह द्वारा उत्पन्न संशोधनों इस लक्ष्य को पूरा करने और सीधे कीड़ा में हीम homeostasis को बनाए रखने और अंततः हड्डीवाला मॉडल प्रणाली 17, 18 में के लिए आवश्यक जीन की एक संख्या की पहचान करने के लिए प्रेरित किया है. पुनर्निर्मित mCeHR 1 मीडिया भी Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila, और सी सहित अन्य निमेटोड प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता remanei. इसके अलावा कम धातु योगों mCeHR -2 और mCeHR -3 भारी धातु विषाक्तता और आवश्यकताओं 12 की जांच के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.

पिछले अभ्यस्त करने के लिए, एन 2 कीड़े mCeHR मीडिया में लगभग 7 से 10 दिन की एक लंबी पीढ़ी समय दिखा रहे हैं. कीड़े subcultured कर रहे हैं, इस पीढ़ी समय OP5 पर बड़े कीड़े के समान 4 दिन, करने के लिए कम हो जाती है0 बैक्टीरिया. हालांकि, पीढ़ी समय अनुग्राह्यतापूर्वक क्योंकि खिला, आंदोलन, या विशिष्ट पोषण आवश्यकताओं में दोष की, कुछ उत्परिवर्ती कीड़े के लिए लंबे समय तक हो सकता है.

Axenic तरल मीडिया का उपयोग करते समय यह दुराराध्य बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाता है कि महत्वपूर्ण है. आमतौर पर, एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कम से कम है और कीड़े मध्यम करने के लिए acclimatize और अवशिष्ट बैक्टीरिया का सफाया कर रहे हैं के रूप में अंत में समाप्त कर दिया. एंटीबायोटिक्स शुरू में यह कीड़ा संस्कृतियों डूब कर सकते हैं कि अवशिष्ट बैक्टीरिया की वृद्धि को रोकता है के रूप में स्थापित जब संस्कृतियों axenic हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं. विरंजन के लगातार दो राउंड के बाद, एंटीबायोटिक दवाओं केवल मास्क एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में इन तकनीकों का प्रयोग. Axenically कीड़े उगाने के लिए आवश्यक हैं कि गरीब सड़न रोकनेवाला तकनीक, लेखकों axenically कीड़े विकसित करने के लिए सक्षम किया गया है कि एंटीबायोटिक दवाओं के लगातार उपयोग के रूप में संस्कृतियों से छोड़े गए हैं संदूषण के बिना. मेड के साथ ही, उचित भंडारणआइए और घटकों कीड़ा रखरखाव और विकास के लिए आवश्यक है. कीड़े विकास की दर के लिए जाँच की और आवश्यक पोषक तत्व समाप्त हो रहे हैं के रूप में Dauer गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो भीड़ को रोकने के लिए subcultured किया जाना चाहिए. इस कीड़े का घनत्व 3,000 कीड़े / एमएल / 2 सेमी से अधिक नहीं है कि यह सुनिश्चित करने से रोका जा सकता है. सी. बढ़ती करने के लिए नए हैं कि शोधकर्ताओं ने एलिगेंस axenically दैनिक कीड़े की जाँच और साप्ताहिक कीड़े की गणना के द्वारा इस लक्ष्य को हासिल कर सकते हैं.

एलिगेंस शोधकर्ताओं जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं कि fluorescently टैग मार्करों व्यक्त ट्रांसजेनिक कीड़े उत्पन्न करके अपने पारदर्शी गुणों का लाभ ले. ट्रांसजेनिक्स इंजेक्शन 19 का उपयोग कर उत्पन्न साथ extrachromosomal सरणियों और ऊंचा जीन अभिव्यक्ति के मुद्दों से बचा कि कम प्रतिलिपि integrants की पीढ़ी के लिए अनुमति दी उपयोग biolistic बमबारी का उल्लेख किया. का उपयोग करते हुए पैदा करने ट्रांसजेनिक्स के पहले, एक कमीसी. के microparticle बमबारी एलिगेंस प्रक्रिया 20 के लिए आवश्यक UNC-119 (ed3) कीड़े की एक बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए अंडे की थाली तैयार करने के लिए आवश्यकता थी. प्रत्येक परिवर्तन की जरूरत कीड़े की संख्या के लिए 20 अंडे प्लेटों की आवश्यकता है. Axenic mCeHR तरल संस्कृति का प्रयोग अधिक कुशल विकास और बाद में बमबारी के लिए अधिक कीड़े की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, बमबारी UNC-119 (ed3) कीड़े 21 का उपयोग कर से बचने के लिए दवा चयन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हितों का संघर्ष कर रहे हैं की घोषणा.

Acknowledgments

इस काम HealthGrants DK85035 और DK074797 (एच) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MgCl2•6H2O Sigma M-2393
Sodium citrate Sigma S-4641
Potassium citrate monohydrate Sigma P-1722
CuCl2•2H2O Fisher C455-500
MnCl2•4H2O Fisher M87-100
ZnCl2 Sigma Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O Sigma F-1018
CaCl2•2H2O Fisher C70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt Sigma A-1752
Cytidine 5 -phosphate Sigma C-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphate Sigma G-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium salt Sigma U-6375
Thymine Sigma T0376
N-Acetylglucosamine Sigma A3286
DL-Alanine Fisher S25648 
p-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878
Biotin Sigma B-4639
Cyanocobalamine (B-12) Sigma V-2876
Folinate (Ca) Sigma F-7878
Niacin Sigma N-0761
Niacinamide Sigma N-3376
Pantetheine Sigma P-2125
Pantothenate (Ca) Sigma P-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) ACRCS 21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphate Sigma P-3657
Pyridoxamine 2HCl Sigma P-9158
Pyridoxine HCl Sigma P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na) Sigma R-7774
Thiamine HCl Sigma T-1270
DL-6,8-Thioctic Acid Sigma T-1395
KH2PO4 Sigma P-5379
Choline di-acid citrate Sigma C-2004
myo-Inositol Sigma I-5125
D-Glucose Sigma G-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma L-9010
Brain Heart Infusion BD 211065
Hemin chloride Frontier Scientific H651-9
HEPES, sodium salt Sigma H-3784
Cholesterol J.T. Baker F676-05
MEM Non-Essential Amino Acids Invitrogen 11140-076
MEM Amino Acids Solution Invitrogen 11130-051
Nalidixic acid sodium salt Sigma N4382
Tetracycline Hydrochloride MP Biomedicals 2194542
Biolistic Delivery System BioRad 165-2257
Gold particles (Au Powder)   Ferro Electronic Material Systems 6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μm BioRad  165-2263

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  2. Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
  3. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
  4. Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
  5. Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
  6. Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
  7. Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. 1-11 (2006).
  8. Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
  9. Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. (2002).
  10. Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
  11. Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
  12. Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. (2007).
  13. Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. 1-10 (2013).
  14. Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
  15. Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
  16. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
  17. White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
  18. Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
  19. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  20. Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
  21. Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics