Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Bioengineering
 

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Obom, K. M., Cummings, P. J., Ciafardoni, J. A., Hashimura, Y., Giroux, D. Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System. J. Vis. Exp. (92), e52008, doi:10.3791/52008 (2014).

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Abstract

Introduction

Zellen, die in Suspension wachsen, Zellen, die als Zuschlagstoffe zu wachsen, und die Zellen, die mit einem Substrat verankert wachsen: Säugerzelllinien können in eine von drei Kategorien auf der Basis ihrer Wachstumseigenschaften klassifiziert werden. Obwohl die Luft-Rad-Bioreaktor, in diesem Video gezeigt, in der Lage, alle drei Arten von Zellen wachsen, wird dieses Video Verwendung des Bioreaktors zur Verankerung abhängigen Zellen auf Mikroträgern wachsen zu demonstrieren. Wobei die Zellen selbst sind das Produkt - verankerungsabhängigen Säugetierzellen können zum Zwecke der Herstellung von mehr Zellen gezüchtet werden. Beispielsweise menschlichem Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen werden zur Zeit mit dem Zweck der Ernte der Zellen und deren Injektion in die erkrankte Gewebe kultiviert. Der pneumatische Bioreaktor in diesem Video gezeigt hat für die Herstellung solcher mesenchymaler Stammzellen für diese Anwendung als geeignet erwiesen (Serra et al., Persönliche Mitteilung, 2013).

Anchorage dependent Säugetierzellen werden in der Regel gewachsen kleinen Maßstab in 2D Kulturgefäße wie Zellkulturplatten, Zellkulturflaschen oder Rollerflaschen, wo sie auf eine speziell behandelte Oberfläche 1 Wachstum zu halten. Wenn mehrere Zellen erwünscht sind, können die Platten oder Flaschen durch Verwendung von mehr oder größere Gefäße erweitert werden. Aber für kostengünstigere Kultivierung großer Mengen von verankerungsabhängigen Zellen, wodurch die Oberfläche für die Zellanheftung kann mit kleinen festen Kügelchen genannte Mikroträgern durchgeführt werden. In Abhängigkeit von den Bindungsmerkmalen der Zelle gibt verschiedene Arten von Mikroträger im Handel erhältlich, wie Dextran, ein Peptid oder Kollagen beschichtet ist. Mikroträger haben eine große Oberfläche im Verhältnis zum Volumen bietet eine größere Fläche für das Zellwachstum; und die Mikroträger in Suspension unter Rühren, das die Zellen zu hohen Dichten in Bioreaktorsystemen 2 kultiviert werden können beibehalten werden. Derzeit sind die Arten von bioreactors wo adhärenten Zellen auf Mikroträgern gewachsen sind Spinnerflaschen und Rührkessel-Systeme, die axiale Laufräder verwenden, um Aussetzung der Zelle resistenten Mikrounternehmen zu erhalten.

Mehrere Faktoren sind wichtig für die erfolgreiche Kultivierung von Zellen, einschließlich der Sauerstoffspannung, Scherspannung, Oberflächenmatrix und Nährstoff-und Metabolit-Konzentrationen. Die Verwendung von Bioreaktoren ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Wachstumsbedingungen und der Potential signifikant niedrigeren Produktionskosten 1. Es gibt verschiedene Designs Bioreaktor für in-vitro-Zellkultivierung einschließlich gerührten Suspension, rotierenden Wandgefäß, Hohlfaser-, Beutel-Bioreaktor auf einer Wippe Plattform und Wirbelschichtsysteme 3. Viele dieser Systeme präsentieren einzigartige Probleme für die Zellkultivierung und skalieren -up, wie hohe Kosten, Nährstoff Konzentrationsgradienten, hydrodynamische Scher, Zellaggregation und Schwierigkeiten bei der Probennahme, Überwachung und Steuerung cell Scale-up.

Verschiedene adhärenten Zelllinien sind in der Herstellung von Viren, entweder bei der Herstellung von viralen Impfstoffen oder zur Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie-Anwendungen verwendet. In diesem Video mit dem einmaligen Gebrauch pneumatische (Luft-Rad) Bioreaktorsystem, zeigen wir die Kultur der Menschenlungenkarzinomzellen (A549) Zellen auf Mikroträgern für die Produktion eines onkolytischen Adenoviren. Der pneumatische Bioreaktor Design verwendet eine vertikale Bewegung Rad, das durch den Auftrieb des Gases in dem Boden des Bioreaktors gespült angetrieben wird. Diese sanfte Methode begrenzt Rühren hydrodynamische Scherkräfte, aber immer noch gewährleistet eine optimale Medium und Zell Mischen von 4. Im Vergleich zum Rührkessel, hat die pneumatische Reaktor geringer Wandschubspannung auch bei hoher Lautstärke Air-Rad-Bioreaktorsystemen (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Rührkesselreaktoren, wird die vertikale Laufrad dieser einmaligen Gebrauch Reaktor durch einen Strom von Gasblasen innerhalb gedrehtDas Schiff, das für die schonende und gleichmäßige Durchmischung Medium (Abbildung 2) ermöglicht.

Protocol

1. Login

  1. Schalten Sie den Bioreaktor. Klicken Sie irgendwo auf die Login-Seite zu öffnen. Wählen Sie Benutzernamen und Passwort eingeben und auf "Login".

2. Kalibrierung

  1. Kalibrieren pH-Sensor (2-Punkt vor dem Autoklavieren).
  2. Untersuchen pH-Sensor und bestätigen Sensorspitze mit Elektrolytlösung gefüllt. Bereiten Sie zwei Becher mit pH-Eichlösungen (Elektrolyt) pH 4 und pH 7 und verfügen eine Waschflasche mit destilliertem Wasser.
  3. Verbinden Sie das Kabel mit dem pH-Wert pH-Sensor. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" auf der Schnittstelle Hallo und klicken Sie auf "Kalibrieren". Geben Sie Puffertemperatur im Temp-Feld Kalibrierungslösung.
  4. Zeigen pH-Sensor in Puffer 1 (pH 4) und geben Sie in das Feld Wert "Null". Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die auf den Button "kalibrieren 1". Spülen Sie den pH-Sensor mit destilliertem Wasser.
  5. Sensor in Puffer 2 (pH 7). Geben Sie Puffer2-Wert im Feld "span". Warten Sie, Graphen zu stabilisieren und klicken Sie auf Kalibrieren 2-Taste.
  6. Klicken Sie auf "Speichern" klicken Sie dann auf "Schließen".
  7. Kalibrieren Sie den gelösten Sauerstoff (DO)-Sensor.
  8. Sicherstellen, dass die DO-Sensor hat, indem er auf das System für mehrere Stunden verbunden polarisiert worden. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" auf der Schnittstelle Hallo, und klicken Sie kalibrieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "DO A".
  9. Trennen Sie die DO-Sensor und geben Sie 0 in das Feld "Null". Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die klicken Sie auf "Kalibrieren 1"-Taste.
  10. Schließen Sie den Sauerstoffsensor und geben Sie 100 in das Feld "Span". Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die klicken Sie auf "Kalibrieren 2"-Taste.
  11. Klicken Sie auf "Speichern" klicken Sie dann auf "Schließen".

3. Autoklav und installieren Sensoren und Reagenzienbehälter

  1. Nach der Kalibrierung Ort Sensoren und Thermalbrunnen in autoLlave Beutel und Autoklaven für 30 min bei 121 ° C, 15 psi.
  2. Desinfizieren Autoklaven Beutel mit 70% Isopropylalkohol (IPA) und Transfer Beutel zu biologischen Sicherheitsschrank (BSC). Entfernen Sie die äußeren Umhüllungen von Gefäß.
  3. Desinfizieren Innenverpackung mit 70% IPA und Transportbehälter für die biologische Sicherheitswerkbank (BSC). Entfernen Innenverpackung und das Schiff zu inspizieren und Schläuche für Schäden während des Transports Schaden ein.
  4. Installieren Sie den pH-Wert und Sauerstoffsensoren in den beiden vorderen Ports. Installieren Sie den Thermalbrunnen auf der linken hinteren Port. Öffnen Sie die Sensorkappe.
  5. Führen Sie den Sensor durch den Sensor-Port. Fädeln Sie den Sensor fest in den Anschluss.
  6. Transportbehälter von BSC.
  7. Hängen Sie die DO und pH-Sensor-Kabel außerhalb des Gefäßes Hülse und überprüfen, dass nichts in der Hülse. Schieben Sie den Behälter in der Hülse, mit den Füßen zuerst.
  8. Sorgfältig passen die Temperaturfühler in den Behälter Thermalbrunnen. Sicherzustellen, dass der Boden des Behälters liegt, an den Heizungen.
  9. Entfernender Schlauch setzt aus ihren Taschen. Spiel Farbcodierung auf den Schlauch an die entsprechenden Anschlüsse und Pumpen auf dem Bioreaktor-Steuereinheit.
  10. Installieren Sie die Hauptgasleitung durch Drücken der Stecker in die Gassteckdose. Installieren Sie die Mikrogasleitung durch Verdrehen der Stecker im Uhrzeigersinn in die Gassteckdose. Installieren Sie den Abluftfilter Schlauch:
  11. Öffnen Sie die Filter Ofen. Sichere den Abluftfilter auf dem U-Kanal, so das Schlauch geht durch die beiden Haken an den Filter und aus dem Ofen.
  12. Installieren Sie den Schlauch durch Kondensator Tasche in der Schlauchaufnahme. Schließen Sie die Tür.
  13. Route zusätzlich Linien A und B, beide Medienleitungen, und die Ernte Linie hinter dem DO-Sensor und auf der Bank neben dem Bioreaktor-Steuereinheit.
  14. Schließen Sie die Kabel an die DO und pH-Sensoren.

4. Zugabe von Medium und Micro-Träger

  1. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" und klicken Sie auf "Systemsteuerung Pumpen" auf der Computer-Schnittstelle.
  2. Bilden eine Sterile Verbindung zwischen einem unbenutzten Medium zusätzlich Linie (1 Orange-Band) und dem Medium Flasche / Beutel Quelle durch Schweißen der Rohrleitungen oder Armaturen mit Luer.
  3. Klicken Sie auf den Schieberegler, um auf der Medienpumpe einzuschalten. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medien wenden Pumpe aus nach Zugabe gewünschte Menge des Mediums.
  4. Platzieren Mikrokügelchen in Ca 2 +, Mg 2 + freiem PBS für 3 h bei RT.
  5. Waschperlen mehrmals mit Ca 2 +, Mg 2 + freiem PBS.
  6. Autoklav für 15 Minuten bei 115 ° C, 15 psi.
    HINWEIS: In 3 g / l (Trockengewicht) in diesem Experiment.
  7. Pumpe in Mikroträgern, die hydratisiert, gewaschen und in den Reaktor in der gleichen Weise wurde das Medium im Schritt 4.1 zugegeben wurden autoklaviert.

5. Die Gleichgewichtseinstellung und Ein-Punkt-Kalibrierung DO

  1. Stellen Sie die Regler auf Auto und geben Sie die gewünschten Sollwerte. Hier verwenden Agitation Set Point (SP) = 15 min, Temperatur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Warten Sie auf die parameter ins Gleichgewicht.
  2. Sensor bestätigen ist vollständig polarisiert. Bestätigen DO Barwert hat sich stabilisiert.
  3. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" und klicken Sie auf "Kalibrieren". Klicken Sie auf "DO A", klicken Sie auf "One Point".
  4. Geben Sie "100" in das Feld "Span". Klicken Sie auf "Kalibrieren 1", klicken auf "Speichern" und klicken Sie auf "Schließen":

6. Starten eines Run

  1. Navigieren Sie zur Registerkarte Aktionen. Klicken Sie auf "Batch". Verwenden des On-Screen-Tastatur oder eine externe Tastatur an eine Batch-Namen eingeben 16 Zeichen oder weniger.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Tastatur auf dem Bildschirm "Hide". Klicken Sie auf "Start Batch" bestätigen Sie mit "Start" in der Überlagerung.

7. Impfen mit Zellen

  1. Bilden eine sterile Verbindung zwischen einem unbenutzten Medium zusätzlich Linie (1 Orange Band) und die Zelle Flasche / Beutel Quelle durch Schweißender Schlauch oder mit Hilfe der Luer Armaturen.
  2. Installieren der Silikonabschnitt des Schlauchs in der Medienpumpe, so dass der Pfeil in Richtung der Rohrleitung zwischen der Pumpe und dem Behälter.
  3. Überprüfen Schlauchklemme ist offen und seine verzweigte Schlauchklemme geschlossen ist. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medienpumpe einzuschalten, und klicken Sie auf "Aus" nach der Zugabe von Zellen.
  4. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" und klicken Sie auf "Systemsteuerung Pumpen".

8. Probenahme

  1. Nach Impfen und so oft wie gewünscht, um die Kultur zu überwachen, zeichnen Sie eine Probe aus der Kultur, in der folgenden Weise:
  2. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" und klicken Sie auf "Probe nehmen". Legen Sie die Sampling-Schlauch in der Probenahmepumpe und nach den Anweisungen auf dem Bildschirm manipulieren die Sampling-Hahn.
  3. Führen Sie mindestens eine tägliche mikroskopische Beobachtung und Zellzahl an diesen Proben.
  4. Wenn die Zellen die gewünschte Dichte in diesem C erreichtase 1,2 x 10 6 Zellen / ml, infizieren die Zellen durch die Zugabe eines Virus-Inokulum.
  5. Aseptisch das Inokulum in den 20-ml-Spritze, und verbinden Sie die Spritze mit einem der Ersatz zusätzlich Ports auf den Reaktor. Einführung des Inokulums in den Reaktor durch Druck auf den Spritzenkolben.
  6. Weiter Probenahme und der Analyse der Kultur für die Adenovirus intrazellulären Partikelkonzentration.

Representative Results

In Abbildung 3 sind die Parameter für die Auslösung der Bioreaktorlauf gezeigt. Diese Abbildung zeigt den Bildschirm vor der Einstellung der Parameter Temperatur, Sauerstoffgehalt, pH-Wert und Agitation. Nachdem die Parameter festgelegt sind, werden die Laufparameter kontinuierlich überwacht und Einstellungen vorgenommen, um die erforderlichen Bedingungen aufrecht zu erhalten. Die Software erzeugt einen kontinuierlichen Anzeige, die für die einfache Identifizierung von Problemen ermöglicht. In diesem Experiment wurde unter Verwendung von 2,5 l DMEM mit 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-Schaum-C, 2 mM L-Glutamin und 3 g / l Mikroträger wird das System stabilisiert, so dass die Prozent Sauerstoff beträgt 50%, die Temperatur 37 ° C, und der pH-Wert beträgt 7,2. Der Reaktor wird mit A549-Zellen bei einer Konzentration von 7 x 10 4 Zellen / ml (oder 10 Zellen / Mikroträger) inokuliert. Die für diese Ausführung gewählten Parameter führte bei der Mehrzahl der Zellen innerhalb von 2 h (4) haften, um die Mikroträger. Nach 12 Stunden sind die Zellen Dämonentrier Zeichen der Abflachung und Ausbreitung auf der Mikroträgeroberfläche (5). Um 24 h, haben Mikroträger eine relativ gleichmäßige Verteilung der Zellen, ohne Mikro-Träger ohne Zellen und ohne große Klumpen von Zellen auf den Mikroträgern (Abbildung 6). Der Anteil der Mikroträger Kolonisierung durch A549-Zellen 75% bis 24 h und anschließend 90% (Figur 7). Die Zellen weiterhin exponentiell zu ca. 1 Million Zellen / ml nach 48 Stunden (Figur 8) wachsen. Nach Infektion mit einer Dosis von onkolytische Adenovirus (2 x 10 8 Virionen / ml) bei 50 Stunden, erhöht sich die Dichte auf 1,2 Millionen Zellen / ml und begann dann zu verringern, wie die lytische Infektion fortgeschritten ist. Es war ~ 10.000-fach Verstärkung des viralen Impfstoff.

In vorherigen Experimenten haben wir festgestellt, dass die Überwachung und Anpassung Gasstrom ist für die Maximierung des Zellwachstums (unveröffentlichte Daten). Schnell wachsende Zellen können das System mit Sauerstoff abzureichern die DO-Ebene zu Null abgesenkt. Während die Zellen weiter zu wachsen, war es bei einer viel langsameren Geschwindigkeit. Es ist wichtig, Überwachung und Anpassung der Sauerstofffluss, um die Zell Anforderungen während der logarithmischen Wachstumsphase zu erfüllen. Jeder Lauf kann für ein optimales Wachstum durch den Vergleich der pH-Wert, DO und Temperatur mit täglichen Zellzahlen analysiert werden.

Figur 1
Abbildung 1. Fluiddynamik des Pneumatik-Bioreaktorsystem (PBS), verglichen mit einem Rührkessel-Bioreaktor Messung der Wandscherkräfte an verschiedenen Reaktorvolumen.

Figur 2
Abbildung 2. Pneumatische Air-Rad-Reaktor Laufrad.

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Abbildung 3. Pneumatische Luft Rad Software Screenshot von Parametern, den Bioreaktor Lauf zu initiieren.

Figur 4
Abbildung 4. Micro-Träger Besiedlung mit A549-Zellen 2 h nach der Inokulation. (Durchschnittliche Mikroträger Durchmesser ~ 180 um.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Figur 5. 12 Stunden nach der Initiation der Kultur werden die Zellen A549 Anbringen Abflachung und Verteilen auf den Mikroträgern.5highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Micro-Träger mit den Zellen nach 24 h in Kultur beschichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Prozentualer Anteil der Mikroträger Kolonisierung durch A549-Zellen nach der Inokulation.

Figur 8
Abbildung 8. Die Anzahl der lebensfähigen A549-Zellen in Kultur vor und nach Infektion mit adenoviruns. Beachten Sie, dass die Virusinfektion Schritt erfolgte bei 50 Stunden.

Discussion

Diese Einweg-Bioreaktor-System ist relativ einfach zu bedienen und bietet Echtzeit-Analysen für Reaktor Überwachung und Analyse. Es ist sehr gut für Säugetier und Insektenzellkultur mit Zelldichten erreicht über 30 Millionen Zellen / ml geeignet. Außer in diesem Bericht beschriebenen 11 A549-Zellen, haben wir SF-9 Insektenzellen im Bioreaktor als auch gewachsen. Die schonende Durchmischung durch den pneumatischen Luft Rad vorgesehen reduziert Zellschäden. Mehrere Schritte sind entscheidend bei der Einrichtung dieses Reaktors. Zuerst richtige Kalibrierung des pH und Sauerstoffsensoren ist für eine optimale Kontrolle der Kultur und für die Zugabe von Reagenzien, um den pH oder die Sauerstoff in dem System anzupassen. Zweitens muss das Reagenz und Saatgut Flaschen gefüllt werden, und die Luer-Anhänge in einer sterilen Umgebung, wie einem BSC. Sobald die Reagenzien sind aus der sterilen Umgebung bewegt wird, müssen die Anschlüsse an den Bioreaktor Zuleitungen mit Sorgfalt vorgenommen werden, um mikrobielle Kontamination zu vermeiden.

Der Einweg-Bioreaktorsystem pneumatische hat das Potenzial, viele der Forschung und klinische Anwendungen in den Bereichen von Biotherapeutika, Impfstoffe zu treffen, Stammzellen, und personalisierte Medizin 4. Darüber hinaus ist die Flexibilität dieses Systems ermöglicht Batch, Fed-Batch-, Perfusions-und Transfektion bezogen Bioreaktor Anwendungen 5. Schließlich haben Einweg-Bioreaktorsystemen der potenTiAl auf die Bedürfnisse von großen industriellen Produktion gerecht zu werden und um Leitlinien und Empfehlungen der nationalen und internationalen Aufsichtsbehörden 6-10 einzuhalten.

Disclosures

Autoren D. Giroux und Y. Hashimura sind Mitarbeiter von PBS Biotech, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet wird, erzeugt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 3  PBS
Single Use Assembly PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549) ATCC CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers GE 3781
Antifoam C Sigma A8011

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References

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