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मीका की तैयारी उच्च संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए लिपिड bilayers समर्थित

Bioengineering

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Summary

हम उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए अभ्रक समर्थित लिपिड bilayers तैयारी का एक तरीका मौजूद है. मीका एक परमाणु पैमाने पर पारदर्शी और फ्लैट है, लेकिन शायद ही कभी क्योंकि कठिनाइयों से निपटने की इमेजिंग में इस्तेमाल किया; हमारी तैयारी अभ्रक चादर का भी बयान में यह परिणाम है, और bilayer तैयारी में प्रयुक्त सामग्री कम कर देता है.

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Matysik, A., Kraut, R. S. Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (88), e52054, doi:10.3791/52054 (2014).

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Abstract

समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) व्यापक रूप से झिल्ली गुण (चरण जुदाई, क्लस्टरिंग, गतिशीलता) और ऐसी दवाओं या पेप्टाइड्स के रूप में अन्य यौगिकों, के साथ अपनी बातचीत के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि SLB विशेषताओं का इस्तेमाल किया समर्थन पर निर्भर करती है.

SLB इमेजिंग और माप के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक एक अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, FCS और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) कर रहे हैं. AFM एक बेहद सपाट सतह (आमतौर पर अभ्रक) की आवश्यकता है, जबकि सबसे अधिक ऑप्टिकल इमेजिंग अध्ययन, एक गिलास समर्थन पर बाहर किया जाता है क्योंकि इन सामग्रियों के प्रभारी और चिकनाई गुण जोरदार प्रसार को प्रभावित के बाद से, इन तकनीकों से परिणाम, सीधे तुलना नहीं की जा सकती है. दुर्भाग्य से, कांच स्लाइड को काटने और अभ्रक के पतले स्लाइस gluing के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता के उच्च स्तर SLB तैयारी के लिए अभ्रक का नियमित प्रयोग करने के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है. इस चुनाव की विधि, इस तरह तैयार अभ्रक होगा हालांकिसतहों अक्सर विशेष रूप से छोटे काम दूरी, उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेंस के साथ, असमान (लहराती) और छवि के लिए मुश्किल खत्म किया जा रहा. यहाँ हम लिपिड पुटिका बयान और SLB तैयारी के लिए पतली, फ्लैट अभ्रक सतहों की तैयारी के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं. इसके अतिरिक्त, हमारे कस्टम बनाया चैम्बर SLB गठन के लिए vesicles के केवल बहुत छोटी मात्रा की आवश्यकता है. AFM पढ़ाई में इस्तेमाल उन लोगों को सीधे तुलना कर रहे हैं कि उच्च गुणवत्ता लिपिड bilayer सतहों, कुशल सरल और सस्ती उत्पादन में समग्र प्रक्रिया का परिणाम है.

Introduction

वर्तमान प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य भी परमाणु शक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है जो ऑप्टिकल कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) या confocal माइक्रोस्कोपी, का उपयोग अभ्रक समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अभ्रक सतहों की तैयारी के लिए एक विधि को दिखाने के लिए है माइक्रोस्कोपी (AFM).

SLBs लिपिड क्लस्टरिंग, चरण जुदाई, पेप्टाइड्स, प्रोटीन या अन्य यौगिकों 1-5 से bilayer घटकों या उनकी बातचीत की गतिशीलता के कई अध्ययनों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल हैं. विभिन्न substrates SLB गठन अध्ययन 4,6-8 की प्रकृति पर निर्भर करता है (यानी कांच, अभ्रक, सिलिकॉन डाइऑक्साइड, पॉलिमर) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ठेठ झिल्ली पढ़ाई ऐसी TIRFM और AFM के रूप में माइक्रोस्कोपी आधारित इमेजिंग तकनीक, पर भरोसा करते हैं. कांच पारदर्शी है क्योंकि इस प्रकार, TIRFM इमेजिंग के लिए एक कांच की सतह एक विशिष्ट स्थान है. कांच की तैयारी अपेक्षाकृत आसान है, और परिणामों की गुणवत्ता में मुख्य रूप से हैपूर्व लिपिड vesicles के बयान को सफाई पूरी तरह से सतह से निर्धारित होता. इसकी उच्च अक्षीय संकल्प की वजह से AFM अभ्रक सतहों की आवश्यकता है. मीका सही बेसल दरार के पास से, एक सिलिकेट खनिज है. इस प्रकार, हौसले से cleaved अभ्रक भी उप नैनोमीटर पैमाने पर 9 झिल्ली ऊंचाई मतभेदों के अवलोकन की अनुमति, atomically फ्लैट है.

ऐसे प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस), ट्रैकिंग एक अणु (श्रीमती), और photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली जैसे तरीकों का उपयोग प्रसार पढ़ाई कि लिपिड झिल्ली गतिशीलता वे जमा कर रहे हैं पर जो सतह के प्रकार, जिससे कांच पर भारी निर्भर करती है, लेकिन पता चला और अभ्रक व्यापक रूप से अलग परिणाम 10,11 दे सकते हैं. इन मतभेदों झिल्ली जांच के प्रसार गुणांक, लेकिन यह भी अलग दरों के साथ diffusing कणों की अलग आबादी का पता लगाने, और संभवतः विभिन्न राज्यों के बीच स्विच करने के लिए न केवल शामिल हैं.

इस प्रकार,एक ही सतह (इस मामले अभ्रक में) का उपयोग किया जाता है जब तक कि TIRFM और AFM तकनीक का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के प्रत्यक्ष तुलना, अक्सर समस्याग्रस्त है. TIRFM और AFM bilayer इमेजिंग एक ही अभ्रक सतह 12,13 पर आयोजित किया गया, जहां कुछ अध्ययन कर रहे हैं हालांकि, अभ्रक शायद ही कभी क्योंकि ज्यादातर समस्याओं से निपटने के, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग किया जाता है. मीका तैयारी तो ऑप्टिकल चिपकने वाला 12 का उपयोग coverslip से चिपके हैं जो पतली पत्रक, में हाथ से काटने की आवश्यकता है. इस विधि हालांकि संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्राप्त सतहों उन्हें मुश्किल कम काम दूरी, उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेंस के साथ उपयोग करने के लिए कर रही है, अक्सर लहराती और मोटी हैं.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार मीका सतहों बहुत पतले होते हैं (170 माइक्रोन की coverslip मोटाई सहित ~ 220 माइक्रोन,) और अत्यंत फ्लैट, सफल उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है जो "तरंगमयता", परहेज. उन्होंने इसका इस्तेमाल किया जा सकता हैTIRFM या confocal सेटअप के लिए. इसके अलावा, एक ही नमूने AFM को हस्तांतरित किया जा सकता है, और यहां तक ​​कि TIRFM / confocal और AFM के साथ एक साथ imaged. इन दो तकनीकों का मेल bilayer झिल्ली संरचना के साथ 14 प्रसार व्यवहार का सीधा संबंध अनुमति देता है. अभ्रक सतहों हौसले से चिपके रहते हैं, क्योंकि वे साफ कर रहे हैं और (कांच सफाई प्रोटोकॉल आमतौर पर इस तरह पिरान्हा समाधान, सल्फ्यूरिक एसिड, सोडियम पोटेशियम / हाइड्रॉक्साइड के रूप में रसायन शामिल हैं) समय लेने, खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, और संभावित खतरनाक सफाई प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है. भी प्रोटोकॉल में वर्णित एक छोटे से कक्ष के बढ़ते, कम से कम 50 μl के लिए प्रभावी bilayer गठन के लिए आवश्यक vesicles की मात्रा कम कर देता है. अंत में, सतह विधानसभा की पूरी प्रक्रिया में समय लगता पारंपरिक अभ्रक दरार और gluing रूप में करता है, (तैयारी कम से कम 30 मिनट लगते हैं), और मैनुअल कौशल के एक उच्च डिग्री की आवश्यकता नहीं है नहीं है.

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Protocol

1. मीका और स्लाइड तैयार

  1. जगह नंबर 1 साढ़े (0.17 मिमी) धुंधला रैक में coverslips.
  2. 60 डिग्री सेल्सियस पर 2% डिटर्जेंट में 30 मिनट के लिए Sonicate
  3. विआयनीकृत जल के साथ 20 बार धोएं.
  4. संदंश का उपयोग स्लाइड्स निकालें और संपीड़ित हवा या नाइट्रोजन का उपयोग कर शुष्क झटका.
  5. अभ्रक चादर कैंची या रेजर ब्लेड का उपयोग कर 10 x 10 मिमी वर्ग टुकड़ों में काटें.
  6. धार का उपयोग 2-3 पतली पत्रक में प्रत्येक अभ्रक टुकड़ा काट.
    नोट: इस कदम तेज ब्लेड का उपयोग आवश्यक है.

2. मीका विधानसभा और बढ़ते चैंबर

  1. इथेनॉल के साथ स्वच्छ सूक्ष्म गिलास स्लाइड.
  2. ऑप्टिकल चिपकने का उपयोग कांच स्लाइड करने के लिए कदम 1.6 में कटौती अभ्रक की गोंद पत्रक. कम चिपचिपापन चिपकने वाला बेहतर बूंद फैला है और अभ्रक गोंद की सलाह दी है.
  3. , यूवी दीपक के नीचे 10 मिनट का इलाज.
    नोट: चिपकने वाला 380nm के लिए 350 की रेंज में अधिकतम अवशोषण और requ सिफारिश की ऊर्जा के साथ पराबैंगनी प्रकाश से ठीक हो जाता हैपूरा इलाज के लिए iRed 4.5 जम्मू / 2 सेमी है. हालांकि, विभिन्न प्रकाश स्रोतों (चिपकने वाला आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की सामग्री देखें) इस चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. स्कॉच टेप के साथ पहले कुछ परतों को हटाने के द्वारा एक साफ अभ्रक सतह बेनकाब.
  5. अभ्रक सतह पर ऑप्टिकल चिपकने के छोटे से ड्रॉप (~ 20 माइक्रोन) रखें.
    नोट: इस चरण में, कम autofluorescence स्तर के साथ उच्च चिपचिपापन चिपकने की सलाह दी है. हमारा अनुभव कम (2.2 कदम) और उच्च चिपचिपापन चिपकने के संयोजन का उपयोग अभ्रक बंटवारे का काफी प्रभाव को (कदम 2.7) बढ़ जाती है कि पता चला है.
  6. धीरे हवा के बुलबुले से बचने, चिपकने के ड्रॉप पर ताजा साफ coverslip जगह, 1 मिनट के लिए व्यवस्थित करते हैं.
  7. , यूवी दीपक के नीचे 10 मिनट का इलाज.
    नोट: इस कदम के बाद, कांच स्लाइड, अभ्रक और coverslip के सैंडविच (कुछ हफ्तों तक) समय की एक अपेक्षाकृत लंबी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है. अभ्रक सतह ताजा है बनाना, सिर्फ वास्तविक SLB तैयारी से पहले अगले चरण पर जाएँ.
    नोट: चिपकने वाला 380nm के लिए 350 की रेंज में अधिकतम अवशोषण और पूरा इलाज के लिए आवश्यक सिफारिश की ऊर्जा के साथ पराबैंगनी प्रकाश से ठीक हो जाता है 4.5J/cm 2 है. हालांकि, विभिन्न प्रकाश स्रोतों (चिपकने वाला आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की सामग्री देखें) इस चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. वीडियो में दिखाया गया है एक exacto चाकू का प्रयोग, धीरे पक्ष गिलास स्लाइड से coverslip उतरना. ज्यादातर मामलों में, अभ्रक की एक पतली और फ्लैट परत coverslip से जुड़ी रहेगी. (2.4 कदम से दोहराने) reused किया जा सकता मीका गिलास स्लाइड से जुड़ी.
  9. अभ्रक परत अभी भी coverslip से चिपके है और 2.8 कदम में बंटवारे के दौरान पूरी तरह से हटाया नहीं गया था कि बनाना, नग्न आंखों से या एक विदारक खुर्दबीन के नीचे की सतह की गुणवत्ता की जाँच करें. एक संदंश के साथ एक छोटी सी खरोंच बनाना या सुई विदारक अभ्रक से एक detectably अलग निरंतरता है जो चिपकने के बीच अंतर करने में मदद मिलेगी.
  10. एक 1.5 एमएल शीशी टोपी से रबड़ की मुहर निकालें और ऑप्टिकल का उपयोग कर सतह को उल्टा टोपी गोंदचिपकने वाला या नेल पॉलिश, और यूवी दीपक के साथ इलाज, या हवा क्रमश: 10 मिनट से सूखे.
    नोट: नमूना AFM इमेजिंग के साथ एक साथ ऑप्टिकल (TIRFM या confocal) के लिए तैयार किया जाता है, तो एक 1.5 एमएल शीशी टोपी खुर्दबीन मंच पर AFM सिर माउंट करने के लिए बहुत छोटा हो सकता है. उस मामले में, टोपी AFM सिर बढ़ते के लिए उपयुक्त एक बड़ा व्यास के साथ किसी भी प्लास्टिक O-अंगूठी, द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. प्रयोग अभ्रक सतह को नुकसान पहुँचाए बिना टोपी को हटाने की आवश्यकता है जब मामले में, सिलिकॉन तेल के बजाय गोंद या नेल पॉलिश का इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. समर्थित लिपिड bilayer (SLB) संरचना

  1. सतह के साथ कक्ष में हौसले से तैयार liposome समाधान रखें. SLB गठन के लिए आवश्यक न्यूनतम मात्रा ~ 30 μl है.
    नोट: liposome और SLB गठन पर अधिक जानकारी के लिए, ऐसे में इस तरह के बैग एट अल के रूप में के रूप में प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख, 2014 15..
  2. वांछित प्रोटोकॉल का उपयोग SLB गठन के साथ आगे बढ़ें. ऊष्मायन के दौरानइमेजिंग, चैम्बर एक गर्मी ब्लॉक या उनके पिघलने के तापमान ऊपर प्रयोग किया जा रहा है लिपिड रखने के लिए आवश्यक तापमान बनाए रखने के लिए गर्म खुर्दबीन मंच में रखा जा सकता है.

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Representative Results

SLBs में फ्लोरोसेंट लिपिड जांच के प्रसार व्यवहार सब्सट्रेट के आधार पर अलग है. श्रीमती तकनीक के साथ संयुक्त TIRFM कण आंदोलनों दृश्यमान करने और उनके प्रसार गुणांक निकालने के लिए एक मूल्यवान विधि है. एक DOPC कांच और अभ्रक पर समर्थित (1,2-dioleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine) bilayer में diffusing एक sphingomyelin-ATTO647N जांच का एक अणु संकेतों जुड़ी एनिमेटेड आंकड़ा पर दिखाए जाते हैं. अभ्रक सतह यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया था. ऑप्टिकल aberrations का अनुमान है, आधा अधिकतम (FWHM) पर पूरी चौड़ाई मापा और 16,17 प्लगइन मोजाइक 2D पीएसएफ साइज ImageJ का उपयोग 20 बात फैल समारोह (पीएसएफ) के औसत से किया गया था. कांच और अभ्रक के लिए मापा FWHM क्रमशः 441nm और 464nm (चित्रा 1) के थे. कांच और अभ्रक पर इमेजिंग के बीच संकल्प में 22nm अंतर महत्वपूर्ण नहीं है. दोनों ही मामलों में, हर एक फ्लोरोसेंट अणु की पीएसएफ केन्द्रक loca किया जा सकता हैलगातार फ्रेम में lized, और मोजाइक कण ट्रैकर ImageJ 16,17 प्लगइन के साथ समय के साथ कण trajectories में जुड़े. 2 दोनों सतहों पर समर्थित bilayer भर diffusing कणों का नमूना trajectories पता चलता है. कांच और अभ्रक पर समर्थित DOPC झिल्ली में diffusing फ्लोरोसेंट जांच का मतलब वर्ग विस्थापन (एमएसडीएस) चित्रा 3 पर साजिश रची गई थी. दो आबादी मॉडल तेज और धीमी प्रसार गुणांक निकालने के लिए किया गया था कई आबादी के साथ साथ मौजूदगी के कारण, विधि के अनुसार वर्णित Schutz (चित्रा 4, चित्रा 5) 18. प्रसार गुणांक और उनके भिन्न TrackArt सॉफ्टवेयर 19 का उपयोग कर निकाला गया और तालिका 1 में संक्षेप हैं.

तेज और धीमी: इस उदाहरण से परिणाम diffusing जांच के दो अलग राज्यों के अस्तित्व को साबित. तेजी से जनसंख्या का प्रसार गुणांक लगभग 1 है0.5 गुना अधिक अभ्रक पर कांच पर से. हालांकि धीमी घटक, अभ्रक पर केवल ~ 1/10 तेजी से जनसंख्या का एक विकास की तुलना में (<0.01 माइक्रोन 2 / सेक) कांच पर लगभग स्थिर है.

चित्रा 1
चित्रा 1. जवाब पीएसएफ आकार. ग्लास (काला ठोस लाइन) और अभ्रक (लाल धराशायी लाइन) पर मापा 20 स्थानों के लिए औसत पीएसएफ तीव्रता प्रोफाइल. कांच और अभ्रक के लिए सामान्यीकृत तीव्रता का आधा अधिकतम (FWHM) पर पूरी चौड़ाई क्रमश: 441 एनएम और 464 एनएम होने का अनुमान था. 22nm फर्क इन दो सतहों के बीच इमेजिंग संकल्प में कोई महत्वपूर्ण गिरावट नहीं है कि इंगित करता है. पीएसएफ तीव्रता प्रोफाइल मोजाइक पीएसएफ 2 डी उपकरण ImageJ प्लगइन 16,17 का उपयोग कर मापा गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 2. नमूना trajectories. ग्लास (ए) और अभ्रक (बी) पर समर्थित एक DOPC लिपिड bilayer में diffusing एस.एम. ATTO647N का नमूना trajectories. कांच समर्थित bilayer में, जांच अक्सर कभी कभी तेजी से diffusing राज्य के लिए स्विचन, सतह पर स्थिर है. अभ्रक समर्थित bilayer पर diffusing जांच, इसके विपरीत, शायद ही कभी सतह पर स्थिर रहे. इसके बजाय, वे तेज और धीमी diffusing राज्य के बीच स्विच करने के लिए करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. वर्ग विस्थापन मतलब. वर्ग विस्थापित मतलब पर diffusing एस.एम. ATTO647N कणों का बयान एक गिलास (■) और अभ्रक (●) DOPC bilayer का समर्थन किया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. संचयी प्रायिकता वितरण. वर्ग विस्थापन का संचयी प्रायिकता वितरण (सीपीडी) फिट बैठता है और ग्लास (ए) पर diffusing एस.एम. ATTO647N कणों की द्वि घातीय (दो आबादी) प्रसार मॉडल के लिए फिट बैठता है और अभ्रक (बी) का समर्थन DOPC bilayers. वितरण और फिट बैठता है केवल पांचवें समय अंतराल (Δ टी = 50 मिसे) के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. गणना और भूखंडों TrackArt 19 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं.दुबला "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
तेजी से (आर 1 2) और धीमी (2 आर 2) diffusing के लिए चित्रा 5. एमएसडी और अंश भूखंडों. एमएसडी भूखंडों आबादी और सीपीडी फिट बैठता से गणना की तेजी से जनसंख्या (एफ 1) के अंश. परिणाम ग्लास (ए) पर diffusing एस.एम. ATTO647N कणों के लिए अलग से भेंट की और अभ्रक (बी) DOPC bilayers समर्थन कर रहे हैं. गणना और भूखंडों TrackArt 19 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

जनसंख्या 1 (उपवास) जनसंख्या 2 (धीमा)
डी 1 (माइक्रोन 2 / सेक) अंश (%) डी 2 (माइक्रोन 2 / सेक) अंश (%)
कांच 1.840 ± 0.031 65.19 ± 0.56 0.006 ± 0.001 34.81 ± 0.56
अभ्रक 53.88 ± 0.26 0.176 ± 0.002 46.12 ± 0.26

प्रसार आँकड़ों की तालिका 1. प्रसार गुणांक. सारांश. धीमी गति से और तेजी से आबादी और उनके भागों के लिए प्रसार गुणांक. गणना एक दो आबादी मॉडल का उपयोग TrackArt सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन किया गया. Trajectories मान्यता प्राप्त है और मोजाइक कण ट्रैकर ImageJ प्लगइन का उपयोग कर से जुड़े थे.

एनिमेटेड चित्रा :. ग्लास (बाएं) और अभ्रक (दाएं) पर समर्थित एक DOPC bilayer में diffusing sphingomyelin-ATTO647N की एकल अणुओं प्रसार Timelapse TIRFM फिल्म. स्केल बार 5 माइक्रोन है.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल लिपिड bilayer बयान और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए चिकनी और पतली अभ्रक सतहों की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन करता है. तकनीक ज्यादातर एक उच्च गुणवत्ता अभ्रक सतह प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है जो ग्लास, अभ्रक, कांच सैंडविच (2.8 कदम), के सावधान disassembly तक सीमित न्यूनतम पुस्तिका कौशल की आवश्यकता है. अभ्रक cleaving बिना ऑप्टिकल चिपकने से अलग करने के लिए यह संभव है क्योंकि हौसले cleaved अभ्रक का निरीक्षण हमेशा ऑप्टिकल चिपकने के क्षेत्रों उजागर, जा, इस बिंदु पर आवश्यक है. यही कारण है कि चिपकने वाला पर बजाय अभ्रक पर bilayer के अवांछित बयान में परिणाम हो सकता है. अभ्रक सतह कुछ अपवादों को छोड़कर हम प्राप्त की समान रूप से उच्च ऑप्टिकल इमेजिंग गुणवत्ता को देखते हुए coverslip सतह के समानांतर साथ वर्णित विधि है का उपयोग कर तैयार; इसलिए हम अतिरिक्त सत्यापन के लिए एक की जरूरत नहीं देखा था.

चैम्बर बढ़ते में अंतिम चरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता. वीडियो ट्यूटोरियल से पता चलता है एकएक कक्ष के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है 1.5 मिलीलीटर कांच की शीशी प्लास्टिक की टोपी, हालांकि यह किसी भी इसी तरह के आकार की वस्तु और वांछित आयामों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, इसके धारक के साथ नमूना AFM सिर में फिट करने के लिए है, जहां एक साथ AFM-TIRFM/confocal इमेजिंग, के लिए उदाहरण . इमेजिंग एक मानक, 35 मिमी धातु सेल कक्ष का उपयोग किया जा रहा है, तो एक कस्टम कक्ष के बढ़ते, छोड़ी जा सकती हैं. इस मामले में हालांकि, एक 25 मिमी दौर कवर कांच का इस्तेमाल किया जाना है, और liposome समाधान का एक बहुत बड़ा मात्रा SLB गठन के लिए आवश्यक होगा.

यहाँ प्रस्तुत परिणामों एक अणु इमेजिंग और ट्रैकिंग आसानी से वर्णित सतह तैयारी के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार, TIRFM इमेजिंग के लिए उत्तरदायी होना काफी पतली अत्यंत फ्लैट अभ्रक सतहों पर किया जा सकता है. एक ही तैयारी इस तरह कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (TIR-एफसीएस) के रूप में उच्च संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सहित अन्य तकनीकों, के लिए लागू किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, SLBs प्रस्तुत करने काared उसी तरह (या भी ठीक उसी नमूने) में विभिन्न तरीकों, जैसे AFM, श्रीमती, एफसीएस, और FRAP का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के प्रत्यक्ष तुलना के लिए एक आवश्यक कसौटी, दोनों प्रयोगात्मक setups में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

लेखक कोई पावती है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bath Sonicator Fisher Scientific FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5 Marienfeld 102222
DOPC Avanti Polar Lipids 850357
Hellmanex III (detergent) Hellma Analytics 320.003
Mica V-1 Grade SPI Suppliers 1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity) Norland Products NOA63
Optical Adhesive (low viscosity) Norland Products NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N AttoTec AD 647N-171
UV lamp Synoptics Ltd. GelVue GVM20 The lamp was set to 100% power

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References

  1. Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
  2. Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
  3. Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
  4. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
  5. Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
  6. Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
  7. Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
  8. Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
  9. Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
  10. Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
  11. Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
  12. Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
  13. Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
  14. Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
  15. Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. (2013).
  16. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
  17. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  18. Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
  19. Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).

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