Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela

Biology

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Summary

O uso de dois métodos para estimar a expressão do gene nos principais apêndices gustativas de Aedes aegypti, identificamos o conjunto de genes putativamente subjacentes às respostas neuronais para compostos amargos e repulsivas, conforme determinado pelo exame eletrofisiológico.

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Sparks, J. T., Dickens, J. C. Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (94), e52088, doi:10.3791/52088 (2014).

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Abstract

Introduction

Compostos como DEET, Picaridin, Citronelal e IR3535 foram mostrados para repelir os mosquitos de forma eficaz, incluindo os importante vetor da doença Aedes aegypti 1,2. Registramos potenciais de ação de neurônios sensoriais associados com sensilla gustativa específica para determinar as células envolvidas com mosquito repelência. Juntamente com a jusante sequenciação de genes expressos nestes tecidos, que pode identificar os genes mais provável que medeiam as respostas destas células, a fim de rastrear novos compostos para melhorar a capacidade de repelência.

RNA-seq é uma ferramenta poderosa, rapidamente se tornando padrão para controlar alterações temporais e espaciais na expressão gênica. Analisa RNA-seq de apêndices quimio insectos e órgãos foram usadas para descobrir receptores moleculares em várias espécies de insectos 3-5, melhorando consideravelmente em pesquisas de genes baseados em PCR convencional pelo gene 6. Insetos representar a classe animal mais diverso, prétando muitas oportunidades para estudar a relação entre os genes e os fenótipos únicos. Tecnologia de RNA-seq pode ser empregue em qualquer tecido de insectos vivos. Da mesma forma, a gravação electrofisiológica de células sensoriais dentro sensilas gustativa uniporous pode ser conseguido de muitas diferentes espécies de insectos. O emparelhamento das duas técnicas, permite que os pesquisadores para reduzir os genes envolvidos no conjunto de um fenótipo chemosensory observado. Diferentes espécies apresentará desafios específicos, mas podem informar a conexão entre genes de receptores de quimio e uma adaptação chemosensory. O tamanho ea morfologia dos chemosensory sensilla é variável e poderá exigir solução de problemas durante a gravação de potenciais de ação para reduzir o ruído e identificar sinais repetíveis. As dissecções de órgãos quimio pode ser trivial ou delicado e demorado, dependendo da morfologia e tamanho do insecto. Recuperação de RNA de alta qualidade pode exigir alguma resolução de problemas, bem como, tais como evitar certos pigmentos durantecoleta de tecido.

Ao demonstrar os efeitos dos compostos repelentes através de ensaios de comportamento é direta e informativa, esta abordagem é demorada e ampla em relação ao mecanismo de ação. Eletrofisiologia juntamente com RNA-seq permite análises mais específicas do que impulsiona comportamentos de esquiva em insetos. Uma vez que o "kit" de discriminação produtos químicos foi identificado em uma espécie de insecto, tentativas mais específicos para melhorar repelentes conhecidos são possíveis. Receptores e proteínas associadas em células sensoriais responsáveis ​​por estes comportamentos podem ser expressas de forma heteróloga para o rastreio química directa. Além disso, modelagem molecular pode prever quais os produtos químicos que induzem respostas fortes de estes receptores 7.

O instantâneo de todos os genes activos num conjunto restrito de tecidos quimio pode também ser útil na identificação de genes semelhantes noutras espécies. Usando homologia de sequência e de expressão de similarities, os investigadores podem formar conjuntos de receptores moleculares mais provável que medeiam respostas aos repelentes que são amplamente eficaz de insectos. Nós apresentamos o seguinte protocolo para auxiliar os pesquisadores na desconstrução vias quimio insetos e persuadir mais se aprofundar no neuroethology de não-modelo e insetos de importância econômica.

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Protocol

1. Cria Ae. adultos aegypti

  1. Ovos eclodem em cerca de ¾ de polegada de água na bandeja rasa. A superlotação irá reduzir o tamanho dos adultos.
  2. Larvas Rear a 25 ° C (12-HL: 12-HD) e se alimentam com comida de peixe chão.
    NOTA: super-alimentação pode reduzir as taxas de sobrevivência.
  3. Remover pupas individualmente por Pasteur pipeta diária e transferir para pratos de plástico (9 cm × 5,5 cm) dentro de pequenos baldes de confinamento, com tampas de malha fina, estabelecendo, assim, 24 grupos etários hr.
  4. Mosquitos adultos alimentar 10% de solução de sacarose por bola de algodão colocado nas paredes de tela de uma habitação gaiola os mosquitos em uma câmara a 27 ° C e 70% de umidade relativa do ar sob o mesmo fotoperíodo como larvas.
  5. Para eletrofisiologia, use 5-10 dias animais velhos. Em geral, os animais maiores irão produzir melhores resultados. Para o isolamento do RNA, usar animais que estão dentro de um único agrupamento idade 24 hr no intervalo de 5-10 dias de idade.

  1. Determinar a concentração adequada de eletrólitos (por exemplo, 1-10 mM) que provoca atividade mínima de neurônios sensoriais selecionadas. NaCl 10 mM ou 1 mM KCl são eletrólitos razoáveis ​​para testar actividade de base ao começar um experimento.
  2. Dissolver cada produto químico experimental em solvente apropriado (se não a água, o uso de etanol ou DMSO) que tem pouco ou nenhum efeito na actividade de pico quando comparadas aos electrólito sozinho. As concentrações finais de etanol a 10% ou 1% de DMSO são concentrações de partida razoáveis.
  3. Selecione adequado (por exemplo quinina por amargo ou sacarose para doces) de controle de produtos químicos que são bem descritos impedimentos alimentação ou estimulantes em insetos.

3. Eletrofisiologia (gravação ponta 8; Figura 1)

  1. Eletrodos de vidro Form puxando mecanicamente capilares de vidro. Otimizar calor e puxar configurações para puxar vidro para formar recordi forma apropriadaeletrodos GN. Quebre cuidadosamente off final do eletrodo de vidro usando uma pinça sob um microscópio de dissecação para criar ponta do eletrodo de abertura que é grande o suficiente para envolver sensillum alvo, mas pequeno o suficiente para evitar o contacto com estruturas vizinhas.
  2. Sob um microscópio, identificar visualmente pela morfologia e posicionar o alvo sensilla / sensillum para garantir a repetibilidade de gravação ponta. Animais da preparação para permitir o acesso livre para sensilla de ângulo de entrada do eletrodo.
  3. Anesthetize insetos adultos frias no congelador a -20 ° C. Evite danos aos neurônios periféricos por exposição excessiva ao frio. Corte tiras estreitas de fita adesiva com lâmina de barbear em lâmina de vidro. Imobilizar todo inseto em uma lâmina de vidro usando tiras estreitas.
  4. Insira um fio de tungstênio quimicamente afiada no tórax dorsal ou olho para servir como o indiferente (terra) eletrodo.
  5. Preencha eletrodo de vidro feita no passo 3.1 com uma solução estimulante de interesse. Usando uma seringa inserido, preencher capIllary de ponta puxado para blunt end. Deitar fora todas as bolhas de ar, segurando fim puxou para baixo. Coloque um fio de prata (chloriding opcional) para o eletrodo de vidro feita no passo 3.1 para servir como gravação e eletrodo estimulante.
  6. Conecte-se eletrodos para um pré-amplificador que é projetado para gravações de contato chemoreceptive sensilla em insetos. Este pré-amplificador (300 Hz-3 kHz filtro de banda) irá reduzir o tempo de estabilização para capturar a atividade neuronal tão perto de estímulo introdução possível. Coletar, armazenar e analisar sinais elétricos usando um microcomputador equipado com software de gravação de pico.
    NOTA: O aterramento da configuração de gravação corretamente pode melhorar drasticamente a relação sinal-ruído.
  7. Estimular sensilas com uma solução de controlo (apenas electrólito) para garantir a funcionalidade. Contagem de pontos a partir de 200 ms após o artefato estímulo para todas as preparações.
  8. Aleatória a fim de produtos químicos de teste para todas as experiências, excepto estudos de dose-resposta,para eliminar o preconceito. Para os estudos de dose-resposta, para expor sensilas concentrações crescentes da substância química experimental. Permitir que um mínimo de 3 min entre as estimulações para garantir a recuperação adequada.
    Nota: Esta exigência pode variar dependendo do inseto e sensilla. O limiar é definido como a concentração para a qual o erro padrão não se sobrepõe com o erro padrão para a concentração mais baixa testada.

4. Isolamento de ARN e Sequenciação (Figura 2)

  1. Prepare os pilões livre de RNAse bem ajustados pelo arrefecimento los em gelo seco antes de tecido disruption.Prepare acompanham pilões livre de RNase que se encaixam tubos de tampa de pressão com força. Manter tubos de coleta fechados a menos que dissecando ativamente para evitar o excesso de condensação.
  2. Usando aspirador filtrada, coloque 30 a 40 mosquitos frio anestesiados (15 seg em freezer -20 ° C) na fase fria e ordenar por sexo. Coloque animais dorsal lado para baixo, segurando asas para não danificar apêndices gustativas.
  3. O uso de dois pares de uma pinça fina, dissecar labella pareado ou tarsos de machos ou fêmeas sob um microscópio de dissecação e limitar a inclusão dos tecidos adjacentes.
    NOTA: 500 labella emparelhado rende aproximadamente 800-1.000 nanogramas de ARNm total. 400 tarsos indivíduo (5 cada) produzem segmentos 1,200-1,800 nanogramas de ARNm total.
  4. Com um par de ofegantes-fórceps, levemente agarrar tromba mosquito apenas proximais para labella expondo estiletes interiores. Usando outro par de recolha-pinça, retire labella e adicionar o tecido para o lado do tubo de coleta de frio.
  5. Com um par de fórceps, levemente agarrar mosquito perna no cruzamento da tíbia e do primeiro segmento tarsal. Usando outro par de fórceps, retire tarsos e adicionar o tecido para o lado do tubo de coleta de frio.
    Nota: Tenha em conta os tipos de células na interface do tecido queria e indesejado. Embora seja importante para limitar a inclusão de tecidos vizinhos, é igualmente importante para não omitir as porções de tecido desejado. A final amostra deve representar fielmente todo o órgão de interesse. Criar um limite preciso com a pinça de apreensão de tal forma que uma pinça de coleta pode precisamente libertar por raspagem ou pegar apenas o tecido desejado.
  6. Periodicamente, girar tubo de coleta brevemente em 0 ° C centrifugar a 9000 xg para manter o tecido no fundo do tubo. Se a umidade se acumula nos tubos de coleta durante a dissecção, adicione 50uL de reagente Trizol fria para cobrir o tecido coletado.
  7. Usando marcador laboratório anti-manchas, identifique claramente um livre de RNase 1,5 ml encaixe tubo de tampa para cada tipo de tecido para a coleção. Usando 1,5 ml suporte de tubos e nitrogênio líquido, congelada em seguida, moer tecido em pó fino (pedaços finos se em Trizol). Repetir uma vez. Levar o volume total de 1 ml de Trizol para ressuspender e tecido triturado por agitação em vórtex.
  8. Adicionar 200 ul de clorofórmio e misture bem. Depois de 5 min à temperatura ambiente, rotação para baixo numa centrífuga a 4 ° C e 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteadicionar fase aquosa directamente numa coluna de filtro de DNA genómico. Girar a 11.000 x g durante 5 min. Adicionar um volume igual de RNase etanol a 70% a fluir-through e misture por pipeta. Transferir líquido a uma coluna de recolha de RNA e continuar a extracção de RNA por as instruções fornecidas.
  9. Quantificar e avaliar a pureza do RNA total em um espectrofotômetro de precisão e prosseguir com qualquer método RNA seqüenciamento padrão.

5. quantitativa de RT-PCR de RNA Sequenciação de validação (Figura 3)

  1. Seleccione tantos genes quanto possível comparar os níveis de expressão de genes relativos ao longo de um intervalo dinâmico, tanto em abundância previsto sequência e função do gene chemosensory presumido.
  2. Pares de criação de iniciadores para cada gene alvo para amplificar um produto de PCR específico 100-180 pares de bases. Excluir amplificação gDNA não específica, garantindo pelo menos um iniciador por conjunto se estende por uma fronteira intron. Como alternativa, use o tratamento DNase para reduzir a contaminação genômica.
  3. Coletartecidos de insecto, tal como descrito na secção anterior. Calcule quanto tecido é obrigada a fornecer RNA suficiente para completar todas as reações qRT-PCR.
    NOTA: triplicado Biológica e reações triplicado técnicos irá proporcionar o máximo de confiança nos resultados.
  4. Calcule quantificação gene relativo como alvo X - (Ct [alvo] -Ct [referência]) para cada gene alvo e médio para cada réplica, tanto biológica quanto técnico. Use gene (s) serviço de limpeza para normalizar valores Ct entre repetições biológicas e para erradicar a escala do eixo Y em comparações de expressão relativa.
  5. Avaliar a semelhança de RNA-seq e conjuntos de dados de qRT-PCR utilizando o, procedimento de bootstrap equivalência com base em regressão 9, aplicada iterativamente, para os dados a partir de cada tecido.
    NOTA: Este procedimento identifica a mais pequena "região de semelhança" que pode ser construído em torno dos dados de RNA-seq e qRT-PCR observado, e permitir a expressão do gene como medido pela relação qRT-PCR para ser considerado estatisticamente equivalente à medição da expressão do gene em relação ao ARN-seq.

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Representative Results

As gravações de traço de potenciais de ação de Ae. sensilas gustativa aegypti (Figura 1) demonstrar a eficácia da estimulação directa com uma gama de produtos químicos. Esta técnica pode ser usada para quantificar respostas a qualquer químico estimulador contando picos de uma determinada amplitude e duração ao longo de um intervalo de tempo razoável (geralmente menos do que 500 ms). Gravações de rastreamento deve ser facilmente reproduzíveis sob um dado conjunto de condições experimentais. Caso contrário, as respostas fisiológicas observadas podem representar fenótipos incomum entre os indivíduos da espécie de teste.

Dados RNA-seq Raw exige filtração e mapeamento preciso, antes de ser apresentado como RPKM arredondada (o número de leituras por mapeados comprimento kilobase de transcrição por milhão lê mapeados) ou FPKM (o número de fragmentos de leitura por comprimento kilobase de transcrição por milhão lê mapeada) Os valores numéricos (Figura 2). A distinção entreestes dois métodos de normalização de RNA-seq foi descrita em dois trabalhos seminais 10,11. Uma vantagem da sequenciação de ARNm total é a capacidade de detectar a expressão de grandes famílias de genes simultaneamente. A apresentação visual de a expressão de muitos genes de uma só vez permite para uma compreensão única do conjunto de ferramentas moleculares para um dado tecido. As comparações entre os sexos, estágios de desenvolvimento ou tipos de tecido pode ser feita rapidamente.

Repetições biológicos para conjuntos de dados de RNA-seq pode ser limitada pelo custo ou dificuldade de recolha de tecido. qRT-PCR oferece a capacidade de validar pequenos subconjuntos de expressão total de gene a um custo menor e exige menos RNA fonte. Lado a comparações de dados secundários (Figura 3A) permitir uma maior confiança nos resultados de RNA-seq, como os dois métodos dependem de diversos produtos químicos para a estimativa da abundância gene. Funções de equivalência estatística (Figura 3B) demonstra os limites de segurança em cada caso.

Figura 1
Figura 1: registros eletrofisiológicos de um sensillum de médio porte no labelo de Ae. aegypti, modificados a partir citou o trabalho 12. Vestígios mostram respostas a NaCl 100 mM, 100 mM de sacarose, 1 quinino mM, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% e 0,8% Citronelal IR3535. Os três picos com diferentes amplitudes ou formas são rotulados, uma b ou c. Estes três pontos corresponder com três subtipos de neurônios sensoriais com diferentes sensibilidades: sal, açúcar e amargo, respectivamente.

Figura 2
Figura 2:. Tabela da expressão do gene receptor gustativo como determinado pela RNA-seq para 8 amostras de tecido, modificado a partir do trabalho citado 13 células individuais relatar valores RPKM paracada anotação gene gustativa, tecidos masculinos (à esquerda) e tecidos femininos (direita). Os valores numéricos são arredondados para o décimo mais próximo. -Mapa de calor intensidade da cor é limitado a mais alta RPKM e o ponto médio é escalado para cada família de genes individualmente. Há apenas uma família de genes mostrado neste caso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Comparação dos dados de qRT-PCR e os dados de RNA-seq, modificados a partir de trabalhos citados 13 (A) Cada gene quimiorecepção do eixo horizontal é representada por duas colunas de dados. A coluna da esquerda representa a expressão relativa, tal como determinado pela RNA-seq; Valores RPKM de genes Chemoreception foram divididos por esse gene de arrumação Aaeg LASP para gerar proporções numéricas neste tecido. O direitocoluna representa a expressão relativa, tal como determinado por qRT-PCR. Em primeiro lugar, em replicado biológica valores Ct para os genes LabelLa foram normalizados utilizando Aaeg LASP como um padrão. Em segundo lugar, replicar valores Ct foram utilizadas para cada gene para calcular os valores de expressão relativa (target E - (Ct [alvo] -Ct [referência])). As barras de erro indicam o desvio padrão de valores de expressão relativa calculados individualmente. (B) ARN-seq qRT-PCR e os conjuntos de dados foram comparados num estudo separado. Os eixos verticais representam abundância gene relativo como demonstram os dados de RNA-seq, com um valor de 1 a ser atribuída a gene housekeeping Aaeg LASP e todos os outros a expressão do gene que está sendo relatado em relação a esse valor. Os eixos horizontais representam abundância relativa gene como previsto por qRT-PCR, com um valor de 1 a ser atribuída a gene housekeeping Aaeg LASP e todos os outros a expressão do gene que está sendo relatado em relação a esse valor. As linhas vermelhas representam equivalência exata. As linhas tracejadas representam limites da 'região de semelhança "para inclinação, calculado pelo algoritmo de equivalência estatística 9. Linhas pretas sólidas representam a regressão por mínimos quadrados de qRT-PCR equivalência a quantificação do RNA-seq para os 12 genes-alvo e gene housekeeping Aaeg LASP, cada uma representada por ponto de dados círculo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O aspecto mais desafiador de potenciais de ação de gravação de sensilla gustativa é decidir quais as respostas são "normais". Quando se emprega única ponta sensillum gustativa gravação pela primeira vez para uma determinada espécie de inseto, o número total e sensibilidade dos neurônios dos receptores gustativos (GRNs) são provavelmente desconhecido. Muitas gravações preliminares são primeiros obrigados a decidir o alcance e as concentrações de produtos químicos para testar. Neste exemplo, que começaram com a observação de que uma única GRN respondeu a baixas concentrações de DEET (Figura 1). Subsequentemente, foi analisada respostas dentro do mesmo sensillum para uma gama de concentrações de produtos químicos que se sabe serem amargo ou aversivas para outros insectos e observou-se uma forma semelhante e amplitude de pico (Figura 1). Estas observações sugerem que um único subtipo GRN responde a estes compostos aversivas. Para comparação, testou-se os compostos conhecidos açucarados para estimular a alimentação num mosquitoes para ver se um pico semelhante ocorreu. Observou-se uma maior pico diferente, neste caso. Da mesma forma, observou-se uma terceira, ponto de tamanho intermediário em resposta à estimulação sal, elevando o total contagem GRN subtipo para três.

Preparações de gravação eletrofisiológicos em insetos são inerentemente variável. Alvo sensilla gustativa são normalmente muito pequeno e deve ser posicionado no ângulo apropriado para acessar com o eletrodo de registro, sem tocar vidro à cutícula. Para estabelecer uma ponte condutora para os neurônios gustativas, o poro terminal do sensillum deve estar aberto para a linfa contido para estabelecer contato direto com o eletrólito do eletrodo de registro. Temos observado bloqueio das aberturas sensilla seja por resíduos estranhos ou excretado e seca o material de dentro do sensillum alvo. Para evitar estes impedimentos, o cuidado deve ser tomado quando a criação e manipulação de insetos para evitar o contato com a sensilla alvo. Além disso em Choocantar, insetos teste saudáveis ​​intactas, fatores biológicos, tais como idade, alimentação estado, acasalamento estado e zeitgeber tempo deve ser considerado no estabelecimento de controles para reduzir a variabilidade nas gravações.

Pode ser difícil obter uma preparação que responde de forma consistente. Muitos ensaios podem ser necessários para melhorar a relação suficiente sinal-ruído para resolver picos individuais. Variações experimentais sobre os preparativos acima mencionados pode levar a melhores resultados. É aconselhável estabelecer uma resposta robusta em seu aparelho de gravação para a sua espécie de teste usando um elicitora spike inseto comum, como a sacarose ou o quinino. Uma vez que um sensillum gustativa está respondendo, essas respostas deve ser reprodutível. O comprimento mínimo de tempo entre estímulos devem ser determinadas experimentalmente examinar a dinâmica de pico sob diferentes restrições temporais. A estimulação excessiva deve ser evitada para preservar GRN saúde e para evitar a degradação da linfa sensillum. No caso thasensibilidade de resposta t diminui rapidamente após a primeira estimulação, um maior número de preparações devem ser obtidos para proporcionar confiança que estas respostas são fisiologicamente típico para as espécies indicadas.

A solubilidade de alguns produtos químicos de teste pode criar dificuldade em fazer os eletrodos estimuladores, como alguns solventes podem afetar a atividade GRN, mesmo em baixas concentrações finais. Essas considerações podem ser resolvidas através de tentativa e erro e com controles apropriados. Qualquer dissolvente utilizado deve ser adicionada ao electrólito de controlo e outras soluções de teste para assegurar a coerência das respostas. Pequenos insetos imobilizatórias, proporcionando assim o acesso directo para direcionar sensilla sem danificar os tecidos frágeis, pode exigir tentativa e erro.

A principal limitação da eletrofisiologia é a separação infeliz de respostas neuronais observados e potenciais respostas comportamentais a jusante. Portanto, é vantajoso para testar as respostas para os produtos químicos que têm been mostrado para provocar respostas comportamentais específicas, a fim de discutir a importância dos resultados em um contexto ecológico. Gravações com ponta para permitir uma detecção precisa da actividade celular, tornando esta técnica ideal para avaliar animais transgénicos ou aqueles que apresentam diferenças fenotípicas em comportamento. Essas gravações também oferecem mais informações sobre respostas neuronais, como a dinâmica temporal e amplitude, do que os sistemas que dependem de repórteres visuais da atividade neuronal. Em alguns casos, as respostas neurais pode ser quantificada com mais facilidade do que os dados comportamentais 12.

Coleta de tecido para o RNA-seq e qRT-PCR é simples, mas exige concentração contínua e atenção à preservação do material genético por meio de armazenamento a frio e evitar o excesso de umidade. RNase atividade pode afetar a qualidade de RNA; portanto tecido só deve entrar em contato superfícies limpas em todo coleta e extração de RNA. Embora a solução de problemas necessária para qRT-PCR is bem documentada, as armadilhas mais prováveis ​​ocorrer no início do processo ao projetar primers e selecionando genes-alvo e de limpeza. Genes que previsivelmente representam pontos uniformemente espaçados ao longo de uma linha de nível de expressão relativa são úteis para comparar ARN-seguintes e os conjuntos de dados de qRT-PCR (Figura 3). Por exemplo, seleccionando genes para qPCR que mostram valores RPKM de 0, 10, 20, 30, etc., respectivamente, oferecem uma ordem previsível de abundância a ser testado.

RNA-seq foi bem-sucedida no destacando humilde expressar genes em nossa pesquisa de tecidos gustativos (Figura 2). A compilação gene confiável para Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) e gene chemoreception prévia identificação 14 fez marcando a expressão do gene relativamente fácil. Para estes fins, insetos com anotações de genes disponíveis e famílias de genes identificados de interesse são sistemas modelo valiosos. Determinação de um limite precisaspara a expressão gênica contra o ruído de fundo é especulativa, mas os métodos de determinação de cortes razoáveis ​​estão disponíveis 15-17. Aqui nós determinamos um nível RPKM de total confiança e de um nível mais baixo de RPKM diminuiu a confiança com base em precedentes 9 pelo qual nós enquadrado nossa discussão dos resultados.

No futuro esperamos dissecar outros tecidos quimio, tanto no mosquito e outros insetos de importância econômica para estender o nosso conhecimento dos genes medeiam inseto repelência. Nós estabelecemos vários genes candidato gustativas que são mais provável que medeiam respostas aos compostos aversivas, comparando seqüências de genes de espécies com dados funcionais disponíveis 13. Estamos gerando linhagens transgênicas de mosquitos ausentes esses genes quimio individuais. Vamos usar gravações de ponta para avaliar o papel desses genes na capacidade do animal para detectar repelentes conhecidos e avaliar respostas comportamentais desses mutantes para repellents. No exemplo que estes genes candidatos não afectam significativamente a repelência, mais resolução podem ser necessários para determinar mais precisamente a expressão do gene ou a presença de proteína numa única célula ou sensillum. Lowly receptores expressos podem ser alvos críticos para a triagem de novos repelentes, junto com co-receptores ubíqua expressas. Infelizmente, a hibridização in situ e a imunolocalização provou extremamente difícil em tecido gustativo inseto 18.

Uma vez que nós estabelecemos que genes medeiam estas respostas e comportamentos fisiológicos, podemos expressar esses genes em sistemas de células que são passíveis de high-throughput screening de repelentes candidatos. Em abordagens que utilizam silico modelação estrutural 07 de maio também ser útil para prever quais os tipos de compostos irá eliciar fortes respostas de receptores específicos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary A-M Systems 628000 Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire A-M Systems 7875 .015" bare
Tungsten wire Alfa Products 369 0.127 mm diameter
Fine forceps Fine Science Tools 11252 #5SF Inox
Refridgerated stage BioQuip Products 1429 Chill Table
Preamplifier Syntech Taste Probe preamplifier
Software for electrophysiology Syntech Autospike software for electrophysiology
TetraMin fish food Tetra Tropical fish food granules fish food ground to fine powder
TRIzol Life Technologies 15596-026 RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74136 includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer Nano Drop Products ND-1000 tabletop spectrometer
R statistics freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) www.r-project.org Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack Evergreen 240-6388-030 Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle Grainger 6HAX6 RNase free
Centrifuge Thermo Scientific 11178160 Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool NCBI n/a

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References

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43, (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106, (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12, (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8, (8), e1002930 (2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52, (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16, (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502, (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122, (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25, (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5, (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100, (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33, (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5, (12), e1000598 (2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132, (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14, (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4, (20), 1-16 (2010).

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