Fysiologiska Inspelningar och RNA sekvensering av de smak bihang till Gula-febern Mosquito

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Med hjälp av två metoder för att uppskatta genuttryck i de stora smak bihang av Aedes aegypti, har vi identifierat den uppsättning av gener förmodat underliggande de neuronala svar på bittra och frånstötande föreningar, som bestäms av elektrofysiologisk undersökning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sparks, J. T., Dickens, J. C. Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (94), e52088, doi:10.3791/52088 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Föreningar som DEET, Picaridin, Citronellal och IR3535 har visat sig effektivt avvärja myggor, inklusive viktiga sjukdomsvektor Aedes aegypti 1,2. Vi spelar in aktionspotentialer från sensoriska neuroner i samband med specifika luktintrycket sensilla att bestämma cellerna involverade med mygga avvisande. Tillsammans med nedströms sekvensering av uttryckta gener i dessa vävnader, kan vi identifiera de gener troligen förmedlar svaren från dessa celler för att screena nya föreningar för förbättrade repellerande kapacitet.

RNA-seq är ett kraftfullt verktyg, snabbt blivit standard för att spåra tid och rum förändringar i genuttryck. RNA-seq analyser av insekts chemosensory bihang och organ har använts för att avslöja molekylära receptorer i flera insektsarter 3-5, kraftigt förbättra den konventionella PCR-baserade sökningar genen genom gen 6. Insekter representerar de mest skiftande djurklass, presenterar många möjligheter att studera sambandet mellan gener och unika fenotyper. RNA-seq teknik kan användas på alla levande insekt vävnad. På samma sätt kan elektrofysiologiska inspelning från sensoriska celler inom uniporous gustatory sensilla uppnås på många olika insektsarter. Parningen av dessa två tekniker ger forskare möjlighet att begränsa de inställda gener inblandade i en observerad chemosensory fenotyp. Olika arter kommer att presentera specifika utmaningar, men kan informera sambandet mellan chemosensory receptorgener och ett chemosensory anpassning. Storleken och morfologi chemosensory sensilla är rörlig och kan kräva omfattande felsökning vid inspelning aktionspotentialer för att minska buller och identifiera repeterbara signaler. Dissektioner av chemosensory organ kan vara trivialt eller känslig och tidskrävande, beroende på morfologi och storlek insekten. Återvinning av hög kvalitet RNA kan kräva viss felsökning också, som att undvika vissa pigment undervävnadssamling.

Medan påvisa effekterna av avvisande föreningar genom beteende prövningar är direkt och informativ, är detta tillvägagångssätt tidskrävande och omfattande med avseende på verkningsmekanism. Elektrofysiologi tillsammans med RNA-seq möjliggör mer specifika analyser av vad som driver undvikandebeteenden hos insekter. När "verktygslåda" för kemisk diskriminering har identifierats i en insektsarter, till mer specifika försök förbättra kända repellenter är möjliga. Receptorer och tillhörande proteiner i sensoriska celler som ansvarar för dessa beteenden kan uttryckas heterologt för direkt kemisk screening. Vidare kan molekylmodellering förutspå vilka kemikalier kommer att framkalla starka reaktioner från dessa receptorer 7.

Den ögonblicksbild av alla aktiva gener i en smal uppsättning chemosensory vävnader kan också vara användbara för att identifiera liknande gener i andra arter. Använda sekvenshomologi och uttryck similarities, kan forskarna bilda uppsättningar av molekylära receptorer troligen förmedlar svar på repellenter som i stort sett effektiv på insekter. Vi presenterar följande protokoll för att hjälpa forskare att dekonstruera insekts chemosensory vägar och förmå fler att gräva i Neuroetologi av icke-modellen och ekonomiskt viktiga insekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Uppfödning Ae. aegypti vuxna

  1. Hatch ägg i ungefär ¾ tum vatten i grunt fack. Överbeläggning kommer att minska storleken av vuxna.
  2. Bakre larver vid 25 ° C (12-hL: 12-HD) och foder med mald fisk mat.
    OBS: övergödning kan minska överlevnad.
  3. Ta puppor individuellt av pasteurpipett dagligen och överföra till plastskålar (9 cm x 5,5 cm) inuti små inneslutnings hinkar med fina mask lock, vilket upprättande 24 tim åldersgrupperingar.
  4. Foder vuxna myggor 10% sackaros lösning genom bomullstuss placeras på skärmväggar i en bur bostäder myggor i en klimatkammare vid 27 ° C och 70% relativ fuktighet under samma fotoperiod som larver.
  5. För elektrofysiologi, använd 5-10 dagar gamla djur. I allmänhet kommer större djur producerar bättre resultat. För RNA-isolering, använder djur som finns inom ett enda 24 tim ålder gruppering i 5-10 dagar gamla intervallet.

  1. Bestäm en lämplig koncentration av elektrolyt (t.ex. 1-10 mM) som framkallar minimal aktivitet från utvalda sensoriska neuroner. 10 mM NaCl eller 1 mM KCl är rimliga elektrolyter att testa baslinjen aktivitet när börjar ett experiment.
  2. Upplös varje experimentell kemikalie i lämpligt lösningsmedel (om inte vatten, använd etanol eller DMSO) som har liten eller ingen effekt på spik aktivitet vid jämförelse till elektrolyt ensam. Slutliga koncentrationer av 10% etanol eller 1% DMSO finns rimliga utgångskoncentrationer.
  3. Välj lämpligt (t.ex. kinin för bitter eller sackaros för söta) kontrollkemikalier som är väl beskrivna matnings avskräckande eller stimulantia i insekter.

3. Elektro (tips inspelning 8; Figur 1)

  1. Form glaselektroder genom mekaniskt dra glaskapillärer. Optimera värme och dra inställningar för att dra glaset för att bilda lämpligt formad recording elektroder. Försiktigt bryta änden av glaselektrod med användning av pincett under ett dissektionsmikroskop för att skapa elektrodspets öppning som är tillräckligt bred för att omsluta mål sensillum, men tillräckligt liten för att undvika kontakt med angränsande strukturer.
  2. Under ett mikroskop, visuellt identifiera genom morfologi och placera målet sensilla / sensillum att säkerställa repeterbarhet tip inspelning. Prep djur för att tillåta fri tillgång till sensilla från vinkel elektrod posten.
  3. Kalla Bedöva vuxna insekter i frysen vid -20 ° C. Undvik skador på perifera nervceller av överexponering för låga temperaturer. Skär smala remsor av tejp med rakblad på glasskiva. Immobilisera hela insekt på en glasskiva med hjälp smala remsor.
  4. Sätt i ett kemiskt vässad volfram tråd i ryggbröstkorgen eller ögon att fungera som den likgiltiga (jord) elektrod.
  5. Fyll glaselektrod i steg 3.1 med en stimulerande lösning av intresse. Med användning av en insatt spruta, påfyllningskåpaIllary från drog änden till trubbiga änden. Häll ut alla luftbubblor, hålla drog änden nedåt. Sätt i ett silvertråd (chloriding tillval) i glaselektrod i steg 3.1 att fungera som inspelning och stimulerande elektrod.
  6. Anslut elektroderna till en förförstärkare som är utformad för inspelningar från kontakt chemoreceptive sensilla i insekter. Denna förförstärkare (300 Hz-3 kHz bandpassfilter) kommer att minska inställningstid att fånga nervaktivitet så nära stimulans introduktion som möjligt. Samla in, lagra och analysera elektriska signaler med hjälp av en mikrodator utrustad med programvara spik inspelning.
    OBS: Jordinspelningsinställningar ordentligt kan drastiskt förbättra signal-till-brus-förhållande.
  7. Stimulera sensilla med en kontrollösning (endast elektrolyt) för att säkerställa funktionaliteten. Räkna spikar som börjar 200 ms efter stimulans artefakt för alla förberedelser.
  8. Slumpmässig ordning av testkemikalier för alla experiment, utom dosresponsstudier,att eliminera förspänning. För dos-responsstudier utsätta sensilla till ökande koncentrationer av den experimentella kemiska. Låt det gå minst 3 min mellan stimuli för att säkerställa tillräcklig återhämtning.
    OBS: Detta krav kan variera beroende på insekter och sensilla. Tröskel definieras som den koncentration som standardfel inte överlappar standardfelet för den lägst testade koncentrationen.

4. RNA Isolering och sekvense (Figur 2)

  1. Förbered tätslutande RNas-fri pestles genom att kyla dem på torris innan vävnad disruption.Prepare medföljande RNas fria pestles som passar snap cap rör ordentligt. Håll uppsamlingsrören stängda såvida aktivt dissekera att undvika överskott kondens.
  2. Använda filtrerad sug, placera 30 till 40 kall sövda myggor (15 sek i -20 ° C frys) på kall scen och sortera efter kön. Placera djur ryggsidan nedåt, gripa vingar för att inte skada smak bihang.
  3. Med hjälp av två par fina pincett, dissekera parade Labella eller tarsi från män eller kvinnor under ett dissekera mikroskop och begränsa införandet av angränsande vävnader.
    OBSERVERA: 500 parade Labella ger ungefär 800-1,000 nanogram av total-mRNA. 400 enskilda tarsi (5 segment vardera) ger 1,200-1,800 nanogram av total mRNA.
  4. Med ett par kippar-tång, lätt förstå mygga snabel bara proximala till Labella exponera inre mandränger. Använda andra paret insamlings-pincett, ta bort Labella och lägga vävnad till sidan av kallprovröret.
  5. Med en pincett, lätt förstå mygga ben vid korsningen av skenbenet och första böjd segmentet. Använda andra pincett, ta bort tarsi och lägga vävnad till sidan av kallprovröret.
    OBS: Ta hänsyn till de celltyper i gränssnittet mellan önskade och oönskade vävnad. Även om det är viktigt att begränsa införandet av grann vävnad, är det lika viktigt att inte utelämna delar av önskade vävnaden. Det finella prov måste noggrant representera hela organet av intresse. Skapa en exakt gräns med grip pincett så att insamlings pincett exakt kan befria genom skrapning eller ta tag endast den önskade vävnaden.
  6. Periodvis, spinn ner provröret kort i 0 ° C centrifugera vid 9000 xg för att hålla vävnader i botten av röret. Om fukt ansamlas i uppsamlingsrören under dissektion, lägga 50ul kall Trizol reagens för att täcka insamlade vävnad.
  7. Använda smutsavvisande lab markör, tydligt märka en RNas-fri 1,5 ml snap lock rör för varje vävnadstyp för indrivning. Använda 1,5 ml rör rack och flytande kväve, frys sedan slipa vävnad till fint pulver (fina bitar om i Trizol). Upprepa en gång. Ta totala volymen av Trizol till 1 ml och slamma markvävnad genom vortex.
  8. Tillsätt 200 ul kloroform och blanda väl. Efter 5 minuter vid rumstemperatur, spinn ner i centrifug vid 4 ° C och 11.000 x g under 15 minuter. Noggrantlägg vattenhaltiga skiktet direkt till ett genomiskt DNA-filterkolonn. Centrifugera ner vid 11000 x g under 5 min. Lägg lika volym RNas-fri 70% etanol för att strömma igenom och blanda genom pipett. Överför vätskan till en RNA uppsamlingskolonn och fortsätta RNA-extraktion per instruktionerna.
  9. Kvantifiera och bedöma renheten av total-RNA på en precisions spektrofotometer och fortsätt med alla vanliga RNA sekvensemetod.

5. Kvantitativ RT-PCR validering av RNA sekvense (Figur 3)

  1. Välj så många gener som möjligt att jämföra relativa genuttryck nivåer över ett dynamiskt område, både i förutspått sekvens överflöd och förmodade chemosensory geners funktion.
  2. Design primerpar för varje målgen att förstärka en specifik 100-180 baspar PCR-produkt. Uteslut ospecifik gDNA förstärkning genom att se åtminstone en primer per set spänner en intron gräns. Alternativt kan du använda DNas behandling för att minska iska föroreningar.
  3. Samlainsekt vävnad såsom beskrivits i föregående avsnitt. Räkna ut hur mycket vävnad som krävs för att ge tillräckligt RNA för att slutföra alla QRT-PCR-reaktioner.
    OBS: Biologisk tre exemplar och tekniska trippel reaktioner kommer att ge maximalt förtroende för resultaten.
  4. Beräkna relativa gen kvantifiering som X mål - (Ct [mål] -Ct [referens]) för varje målgen och medelvärde för varje replikera, både biologiska och tekniska. Använd hushållning gen (er) för att normalisera Ct-värden mellan biologiska replikat och att förankra Y-axeln skala jämförelser av relativa uttrycket.
  5. Bedöm likheten av RNA-seq och QRT-PCR dataset med hjälp av regressionsbaserade, bootstrap likvärdighet förfarande 9, iterativt tillämpas på data från varje vävnad.
    OBS: Denna procedur identifierar minsta "regionen likhet" som kan byggas runt den observerade RNA-punkter och QRT-PCR uppgifter, och låta det relativa genuttryck mätt med qRT-PCR skall anses statistiskt likvärdigt med mätning av relativa genuttryck genom RNA-seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De spår inspelningar av aktionspotentialer från Ae. aegypti smaksensilla (Figur 1) visar effektiviteten av direkt stimulering med en rad kemikalier. Denna teknik kan användas för att kvantifiera svar på någon stimulerande kemikalie genom att räkna spikar av en given amplitud och varaktighet under en rimlig tidsperiod (i allmänhet mindre än 500 ms). Spår inspelningar måste vara lätt reproducerbar inom en given uppsättning experimentella betingelser. Annars kan de observerade fysiologiska reaktioner representerar ovanliga fenotyper bland individer av den art som testas.

Raw RNA-seq data kräver filtrering och noggrann kartläggning innan de presenteras som rundade RPKM (antalet mappade läser per kilolängd avskrift per miljon läsningar mappas) eller FPKM (antalet lästa fragment per kilolängd avskrift per miljon läsningar mappas) numeriska värden (Figur 2). Skillnaden mellandessa två RNA-seq normaliseringsmetoder har beskrivits i två banbrytande verk 10,11. En fördel med den totala mRNA-sekvense är förmågan att detektera uttrycket av stora genfamiljer samtidigt. Den visuella presentationen av expressionen av många gener på en gång möjliggör en unik förståelse för den molekylära verktygsuppsättning för en given vävnad. Jämförelser mellan könen, utvecklingsstadier eller vävnadstyper kan göras snabbt.

Biologiska replikat för RNA-seq datauppsättningar kan begränsas av kostnad eller svårigheten att vävnadssamling. QRT-PCR erbjuder möjligheten att validera små delmängder av totalt genuttryck till mindre kostnad och kräver mindre käll RNA. Sida vid sida jämförelser av uppgifter (Figur 3A) möjliggöra större förtroende för RNA-seq resultat, eftersom de två metoderna förlitar sig på olika kemiska sammansättningar för gen överflöd uppskattning. Statistiska likvärdighet funktioner (Figur 3B) visar gränserna för säkerhet i varje enskilt fall.

Figur 1
Figur 1: Elektro inspelningar från en medelstor sensillum på labellum av Ae. aegypti honor, modifierade från citerat verk 12. Spår visar reaktioner på 100 mM NaCl, 100 mM sackaros, 1 mM kinin, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% citronellal och 0,8% IR3535. De tre spikar med olika amplituder eller former är märkta a, b eller c. Dessa tre spikar motsvarar tre sensoriska neuron subtyper med olika känslighet: salt, socker och bitter, respektive.

Figur 2
Figur 2:. Tabell över smakreceptor genuttryck som bestäms av RNA-seq för 8 vävnadsprover, modifierad från citerade arbetet 13 Individuella celler rapporterar RPKM värden förvarje smak gen annotation, manliga vävnader (till vänster) och kvinnliga vävnader (till höger). Numeriska värden är avrundade till närmaste tiondel. Värme karta färgintensitet är maximerad till högsta RPKM och mittpunkten skalas för varje gen familj för sig. Det finns bara en gen familjen som visas i det här fallet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Jämförelse av QRT-PCR data och RNA-seq uppgifter, modifierade från citerade arbetet 13 (A) Varje chemoreception genen hos den horisontella axeln representeras av två datakolumner. Den vänstra kolumnen representerar relativa uttryck som bestäms av RNA-seq; RPKM värden för chemoreception gener dividerat med den för hushållning gen Aaeg LAsP att generera numeriska proportioner i denna vävnad. Rättkolumn representerar relativ expression såsom bestäms genom QRT-PCR. Först, var den biologiska replikat Ct-värdena för Labella gener normaliserade med användning Aaeg LAsP som en standard. För det andra, replikera Ct-värden för varje gen användes för att beräkna relativa uttrycksvärden (E-målet - (Ct [mål] -Ct [referens])). Felstaplarna indikerar standardavvikelse individuellt beräknade relativa uttrycksvärden. (B) RNA-seq och QRT-PCR dataset jämfördes i en separat analys. De vertikala axlarna representerar relativa gen överflöd vilket framgår av RNA-seq uppgifter, med ett värde av 1 tillskrivs Housekeepinggen Aaeg LAsP och alla andra genuttryck rapporteras relativt till detta värde. De horisontella axlarna representerar relativa gen överflöd som förutspåtts av QRT-PCR, med ett värde av 1 tillskrivs Housekeepinggen Aaeg LAsP och alla andra genuttryck rapporteras relativt till detta värde. Röda linjer representerar exakt likvärdighet. Streckade linjer representerar gränserna för "regionen likhet" för lutning, beräknas av den statistiska likvärdighet algoritmen 9. Fasta svarta linjerna representerar minsta kvadrat regression av QRT-PCR motsvarighet till RNA-seq kvantifiering för de 12 mål gener och Aaeg LAsP Housekeepinggen, varje representeras av cirkeln datapunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest utmanande aspekten av inspelningsaktionspotentialer från luktintrycket sensilla är att besluta vilka svar är "normala". När anställa singel smak sensillum spets inspelning första gången för en viss insektsarter, det totala antalet och känsligheter smakreceptor nervceller (GRNs) är sannolikt okänd. Många preliminära inspelningar först för att avgöra omfattningen och koncentrationerna av kemikalier för att testa. I det här fallet började vi med observationen att en enda GRN besvarade låga koncentrationer av DEET (Figur 1). Därefter undersökte vi svar inom samma sensillum till en rad koncentrationer av kemikalier som är kända att vara bitter eller obehaglig till andra insekter och observerade en liknande spik form och amplitud (Figur 1). Dessa observationer tyder på att en enda GRN subtyp svarar på dessa aversiva föreningar. Som jämförelse, testade vi sockrade föreningar kända för att stimulera utfodring i mosquitoes för att se om en liknande spik inträffat. Vi observerade en annan, större spik i det här fallet. Likaså observerade vi en tredje, medelstora spik som svar på salt stimulering, vilket ökar det totala GRN subtyp räkna till tre.

Elektrofysiologiska inspelning preparat i insekter är till sin natur variabel. Target smaksensilla är oftast mycket små och ska placeras på lämplig vinkel för att komma åt med inspelningen elektroden utan att röra glaset till nagelbanden. Att etablera en ledande bro till smak nervceller, måste anslutnings por av sensillum vara öppen för den inneslutna lymfan att etablera direkt kontakt med inspelningen elektroden s elektrolyt. Vi har observerat blockering av sensilla öppningar antingen genom främmande skräp eller utsöndras och torkat material inifrån målet sensillum. För att undvika dessa hinder, måste man vara försiktig när uppfödning och hantering insekter för att undvika kontakt med målet sensilla. Förutom choosjunger oskadade, friska försöks insekter, biologiska faktorer som ålder, utfodring stat, parning stat och zeitgeber tiden bör beaktas när man fastställer kontroller för att minska variationen i inspelningar.

Det kan vara svårt att få en lyhörd preparat konsekvent. Många studier kan vara nödvändigt för att förbättra signal-brusförhållande nog att lösa enskilda spikar. Experimentella variationer på de nämnda preparaten kan leda till bättre resultat. Det är lämpligt att upprätta en robust svar på din inspelning apparat för dina testarter med hjälp av en gemensam insekt spik elicitor, som sackaros eller kinin. När väl en smak sensillum svarar bör dessa svar vara reproducerbar. Minsta tid mellan stimuli bör bestämmas experimentellt undersöka spik dynamik under olika tidsrestriktioner. Överdriven stimulering bör undvikas för att bevara GRN hälsa och förhindra sensillum lymfa nedbrytning. I fallet that svarskänslighet minskar snabbt efter första stimulering, ett större antal preps måste erhållas för att ge förtroende för att dessa svar är fysiologiskt typiska för given art.

Lösligheten av några testkemikalier kan skapa svårigheter gör stimulerande elektroder, eftersom vissa lösningsmedel kan påverka GRN aktivitet, även vid låga slutkoncentrationer. Dessa överväganden kan åtgärdas genom trial and error och med lämpliga kontroller. Alla lösningsmedel som används bör läggas till kontroll elektrolyten och andra testlösningar för att säkerställa överensstämmelse av svaren. Immobilisera små insekter, vilket ger direkt tillgång till rikta sensilla utan att skada ömtåliga vävnader, kan kräva försök och misstag.

Den största begränsningen för elektrofysiologi är den olyckliga separationen av observerade neuronala svar och eventuella efterföljande beteendemässiga reaktioner. Därför är det fördelaktigt att testa svar på kemikalier som har been visat att framkalla specifika beteendemässiga reaktioner för att diskutera betydelsen av resultaten på ett ekologiskt sammanhang. Tips inspelningar möjliggör mycket exakt upptäckt av cellulär aktivitet, vilket gör denna teknik idealisk för att bedöma transgena djur eller de som visar fenotypiska skillnader i beteende. Dessa inspelningar ger också mer information om neuronala svar, såsom tidsmässiga och amplitud dynamik, än som förlitar sig på visuella reportrar av nervaktivitet. I vissa fall, kan neurala svar kvantifieras lättare än beteende uppgifter 12.

Mjukpapper kollektion för RNA-seq och QRT-PCR är enkel men kräver ständig koncentration och uppmärksamhet att bevara cellmaterial genom kylförvaring och undvikande av fukt. RNas aktivitet kan påverka RNA kvalitet; Därför vävnad får endast kontakta rena ytor i hela samlingen och RNA-extraktion. Även om felsökning krävs för QRT-PCR is väldokumenterade, de mest sannolika fallgropar inträffar tidigt i processen när man utformar primers och välja mål- och hushållning gener. Gener som förutsägbart representerar jämnt fördelade punkter längs en ​​linje av relativ uttrycksnivå är användbara för jämförelse av RNA-punkter och QRT-PCR datauppsättningar (Figur 3). Till exempel, välja gener för qPCR som visar RPKM värden av 0, 10, 20, 30, osv, respektive, erbjuda en förutsägbar ordning överflöd som ska testas.

RNA-seq lyckades att belysa ödmjuk uttrycka gener i vår undersökning av smak vävnader (Figur 2). Den pålitliga gen build för Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) och förhands chemoreception genidentifiering 14 gjorde scoring genuttryck relativt lätt. För dessa ändamål, insekter med tillgängliga gen anteckningar och identifierade genfamiljer av intresse är värdefulla modellsystem. Bestämning av en korrekt tröskelför genuttryck kontra bakgrundsljud är spekulativ, men metoder för att bestämma rimliga cutoffs finns 15-17. Här har vi fastställt en RPKM nivå fullt förtroende och en lägre RPKM nivå minskat förtroende bygger på prejudikat 9 genom vilket vi inramade vår diskussion om resultaten.

I framtiden hoppas vi att dissekera andra chemosensory vävnader i både mygg och andra ekonomiskt viktiga insekter att utöka vår kunskap om de gener som förmedlar insektsavvisande. Vi har etablerat ett flertal kandidatsmak gener som är mest sannolikt medier svar på aversiva föreningar genom att jämföra gensekvenser arter med tillgängliga funktionella data 13. Vi genererar transgena linjer av myggor saknade dessa individuella chemosensory gener. Vi kommer att använda spets inspelningar för att bedöma vilken roll dessa gener på djurets förmåga att upptäcka kända repellenter och bedöma beteendemässiga reaktioner hos dessa mutanter att repEllents. I det fall att dessa kandidatgener inte väsentligen påverkar avvisning kan mer upplösning vara nödvändigt att mer exakt bestämma genexpression eller protein närvaro i en enda sensillum eller cell. Ödmjuk uttryckta receptorer kan vara kritiska mål för screening av nya repellenter, tillsammans med ubiquitously uttryckta co-receptorer. Tyvärr, in situ hybridisering och immunolokalisering har visat otroligt svårt i insekts gustatory vävnaden 18.

När vi har etablerat vilka gener förmedlar dessa fysiologiska reaktioner och beteenden, kan vi uttrycka dessa gener i cellsystem som kan bli föremål för high-throughput screening av kandidat repellenter. I silico metoder som använder strukturmodellering 7 maj också vara användbara i att förutsäga vilka typer av föreningar kommer att framkalla starka reaktioner från specifika receptorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary A-M Systems 628000 Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire A-M Systems 7875 .015" bare
Tungsten wire Alfa Products 369 0.127 mm diameter
Fine forceps Fine Science Tools 11252 #5SF Inox
Refridgerated stage BioQuip Products 1429 Chill Table
Preamplifier Syntech Taste Probe preamplifier
Software for electrophysiology Syntech Autospike software for electrophysiology
TetraMin fish food Tetra Tropical fish food granules fish food ground to fine powder
TRIzol Life Technologies 15596-026 RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74136 includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer Nano Drop Products ND-1000 tabletop spectrometer
R statistics freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) www.r-project.org Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack Evergreen 240-6388-030 Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle Grainger 6HAX6 RNase free
Centrifuge Thermo Scientific 11178160 Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool NCBI n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43, (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106, (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12, (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8, (8), e1002930 (2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52, (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16, (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502, (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122, (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25, (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5, (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100, (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33, (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5, (12), e1000598 (2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132, (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14, (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4, (20), 1-16 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics