Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

Biology
 

Summary

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

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Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

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Abstract

A acessibilidade de high-throughput seqüenciamento revolucionou muitas áreas da biologia. A fim de entender melhor as comunidades microbianas associadas virais e do hospedeiro, um fluxo de trabalho abrangente para a extração de DNA e RNA foi desenvolvido. O fluxo de trabalho ao mesmo tempo gera metagenomes virais e microbianas, assim como metatranscriptomas, a partir de uma única amostra para o sequenciamento de próxima geração. O acoplamento destas abordagens fornece uma visão geral de ambas as características taxonómicas e as funções de comunidade codificado. Os métodos apresentados usar Fibrose Cística (FC) expectoração, um tipo de amostra problemático, porque é extremamente viscosa e contém uma quantidade elevada de mucinas, ADN livre de neutrófilos, e outros contaminantes desconhecidos. Os protocolos descritos aqui direcionar esses problemas e com sucesso recuperar DNA viral e microbiana com a contaminação de DNA humano mínima. Para complementar os estudos Metagenômica, um protocolo metatranscriptomics foi otimizado para recuperar tanto microbianae mRNA host que contém relativamente poucas seqüências de RNA ribossômico (rRNA). Uma visão geral das características dos dados é apresentada para servir de referência para avaliar o sucesso dos métodos. Amostras adicionais CF escarro também foram coletadas para (i) avaliar a consistência dos perfis microbioma em sete dias consecutivos dentro de um único paciente, e (ii) comparar a consistência da abordagem metagenômica para a sequenciação à base de gene 16S RNA ribossomal. Os resultados mostraram que a flutuação diária das perfis microbianas sem perturbação antibiótico foi mínimo e os perfis de taxonomia das bactérias comuns associadas CF eram altamente semelhantes entre as bibliotecas 16S rDNA e metagenomes gerados a partir do DNA -derived lise hipotônica (HL). No entanto, as diferenças entre os perfis taxonómicas 16S rDNA gerado a partir de ADN total e HL-ADN derivado sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem em beneficiar não só a remoção do ADN de origem humana, mas também extracellul-microbiana derivadaDNA ar que podem deturpar os perfis microbianos reais.

Introduction

Comunidades virais e microbianas associadas com o corpo humano têm sido investigados extensivamente na última década, através da aplicação de tecnologias de sequenciamento 1,2. Os resultados conduziram ao reconhecimento dos micróbios importância na saúde humana e da doença. A principal iniciativa partiu do projeto humano microbiome que descreve as bactérias (e alguns archaea) residentes na pele humana, e dentro de cavidades orais, vias respiratórias, trato urogenital e do tracto gastrointestinal 3. Mais estudos microbioma de saudáveis ​​vias respiratórias humanas através de lavado bronco-alveolar (BAL) 4,5 e swabs de nasofaringe 4 demonstraram que o pulmão pode servir como um dispositivo de recolha de amostras ambientais, resulta na colonização microbiana transitória nas vias aéreas. No entanto, o impacto da colonização microbiana em superfícies das vias respiratórias com deficiência pode levar a infecções pulmonares graves e crónicos, tais como as observadas em pacientes de fibrose cística (FC).

t "> CF é uma doença genética letal causada pela mutação no regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) 6. Estas mutações dão origem a proteínas CFTR defeituoso que por sua vez afecta o transporte de iões transepitelial através da superfície apical do epitélio. A doença afecta múltiplos sistemas orgânicos, mas a maioria de mortalidade e morbidade é atribuível à doença pulmonar FC 7. A CF pulmão fornece um ecossistema único para a colonização microbiana. O defeito no transporte de íons provoca muco para acumular-se nas vias aéreas CF, criando microambientes que consistem em aeróbia , microaerofilia, e compartimentos anaeróbios ancorados por uma superfície mucosa rico em nutrientes estática. Esta ambiente facilita a colonização e proliferação de micróbios, incluindo bactérias, vírus, e fungos. aguda e infecções microbianas pulmonares crónicas levam a respostas imunitárias constantes mas ineficaz, resultando em extensa remodelação das vias respiratórias, a perda de capacidade pulmonar, e, finalmente, pulmoinsuficiência pulmonar.

Comunidades bacterianas associadas com a CF de pulmão foram bem descritas por meio de abordagens cultura-dependentes e independentes de cultivo, que incluem usando 16S RNA ribossomal (rRNA) sequenciamento gene 8 e metagenomics espingarda 9,10. A abordagem baseada em rRNA 16S é capaz de caracterizar uma vasta gama de espécies microbianas e capturar grandes mudanças na diversidade comunidade. No entanto, ele é limitado em sua resolução na definição das comunidades (resumidos na Claesson et al. 11, 2010) e as previsões de potenciais metabólicas se limitam a essas funções gerais conhecidos para a taxa identificados. Portanto, 16S rRNA métodos de sequenciação do gene são insuficientes para a precisão analítica taxonômica e funcional necessária das diversas comunidades microbianas presentes nos pulmões de FC. A abordagem metagenômica descrito aqui complementa a abordagem baseada em rRNA 16S, supera suas limitações, e permite uma maneira relativamente eficazpara analisar tanto a taxonomia comunidade microbiana e conteúdo genéticas nos pulmões com FC.

ADN microbiana isolada a partir de amostras associado a animais, muitas vezes contém uma grande quantidade de ADN do hospedeiro. Expectoração ou amostras de tecido de pulmão com FC geralmente contêm uma grande quantidade de ADN libertado pelos neutrófilos humanos na resposta imune, muitas vezes, maior do que 99% do DNA total de 12 - 14. Embora algumas células humanas intactas pode estar presente, a maior parte deste ADN é livre em solução ou adsorvido à superfície de micróbios. Além disso, a presença de tampões de muco viscoso excepcionalmente, detritos celulares e outros contaminantes desconhecidos complicam ainda mais o isolamento de células microbianas. Vários métodos foram testados para empobrecer a estas amostras de ADN humano, incluindo gradientes de Percoll a humano a partir de células microbianas separado 15, o tratamento com DNase I, o brometo de etídio monoazide para degradar selectivamente DNA humano 16, e o kit MolYsis, tudo com sucesso limitado. Até à data, o processo mais eficiente de purificação de ADN microbiano para expectoração de FQ foi uma modificação do processo descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Esta abordagem, aqui conhecido como método de lise hipotónico (HL), utiliza uma combinação de β-mercaptoetanol para a redução de mucina ligações dissulfureto, lise hipotónica de células eucarióticas, e tratamento com DNase I de ADN solúvel 9. Apesar da falta de alternativas ao método HL levantou algumas preocupações devido a (i) possíveis vieses resultantes da lise indesejada de micróbios e (ii) se as flutuações observadas na composição da comunidade 9,10 são um artefato de variações associadas com o processamento da amostra. Para além da geração de metagenomes espingarda, que abordar estes problemas, comparando os perfis de genes de rRNA 16S e o ADN total extraído a partir de DNA microbiano do método HL utilizando o mesmo conjunto de amostras de expectoração recolhidos a partir de um único paciente em sete dias consecutivos.

ent "> Em comparação com as comunidades microbianas, a caracterização das comunidades virais associados com animais é limitado 18,19 As comunidades virais em CF das vias aéreas só foram caracterizadas minimamente 20 -.. 22 O primeiro estudo metagenômico caracterizar o DNA de comunidades virais em CF das vias aéreas mostraram que a maioria dos vírus associados com os pulmões com FC são fagos 20. O potencial metabólico de fago na FQ e indivíduos sem FC foi significativamente diferente. Especificamente, as comunidades de fagos em indivíduos com FC realizada genes reflectora de adaptações hospedeiras bacterianas para a fisiologia de CF das vias aéreas, e virulência 20. metagenomic estudos subsequentes bacterianas do vírus no tecido pulmonar FC demonstrou heterogeneidade espacial distinto de comunidades virais entre as regiões anatômicas 22. Além disso, o tecido pulmonar FC abrigou a diversidade viral menor observado até agora em qualquer ecossistema 22. A maioria dos vírus identificados foram fagoscom o potencial para infectar patógenos CF. No entanto, os vírus eucarióticos como o vírus do herpes, adenovírus e vírus do papiloma humano (HPV) foram também detectadas. Em um caso, onde foram observados quistos no tecido do pulmão durante a dissecção, mais de 99% de um genoma de vírus do papiloma humano foi recuperado, mesmo que o paciente nunca foi diagnosticado com um papiloma ou carcinoma pulmonar. Isso indica que a diversidade viral presente reflete não só a gravidade dos danos nos tecidos, mas também pode expor e explicar uma doença uncharacterized subjacente. Os protocolos descritos aqui fornecer uma maneira simples, mas poderosa para isolar partículas virais (VLPs) a partir de amostras que consistem em grandes quantidades de muco espesso, de acolhimento e células microbianas, DNA livre, bem como restos celulares.

Complementando metagenômica, metatranscriptomics é usado para monitorar a dinâmica na expressão gênica em toda a comunidade microbiana e o anfitrião 9,23. Neste caso, tanto microbiana e host ARNm devem ser preferencialmente seleccionado. Uma vez que os mRNAs não estão poliadenilados bacterianas, um ARNm método suspenso baseado em oligo-dT, não pode ser explorado. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser utilizado em amostras associadas hospedeiras-se as amostras são conhecidas por conter grandes quantidades de ARNm eucariota. Muitas amostras associado a animais, expectoração de FQ, contêm uma elevada densidade de células, para além de grandes quantidades de detritos celulares e nucleases que incluem as RNases. Assim, outro desafio é evitar uma forte degradação do RNA durante metatranscriptome processamento. Na maioria dos casos, o RNA total extraído de expectoração CF é parcialmente degradado, o que limita as aplicações a jusante e utilidade do ARN derivado. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. A eficácia dessas abordagens se limita, contudo, especialmente quando se trabalha com parcialmente degradada rRNA 9,24. Os métodos empregados aqui permitired para a recuperação de RNA total parcialmente degradada adequado para jusante remoção total rRNA eficiente. A comparação directa da eficiência de remoção de rRNA a partir de ARN total parcialmente degradado comparando dois conjuntos diferentes foi ilustrada por Lim et ai. (2012) 9.

No geral, o objetivo deste artigo é o de fornecer um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar metagenomes espingarda virais e microbianas, e um metatranscriptome, a partir de uma única amostra associada ao animal, utilizando amostra de escarro induzido como um exemplo. Fluxo do laboratório molecular deverá incluir as áreas de pré e de pós-amplificação separados para minimizar a contaminação cruzada. Os métodos são facilmente adaptáveis ​​a outros tipos de amostras, tais como o tecido 22, nasofaringe e orofaringe cotonetes 25, a lavagem broncoalveolar (BAL) e de coral (dados não publicados). Cada amostra deve ser processado imediatamente após a coleta, especialmente quando metagenomics microbianas e conheceuatranscriptomics estudos são desejados. Se as amostras foram congeladas, que limita o isolamento de células microbianas intactas para metagenomes microbianos como o congelamento potencialmente romper a integridade da célula. No entanto, o congelamento não exclui metatranscriptomics e isolamento viral, mas a qualidade do ARN e da quantidade de partículas virais recuperados podem ser afectadas pelo processo de congelação-descongelação. É importante notar que a expectoração induzida tem servido como fonte primária de amostras em muitos estudos associados a pacientes adultos e outras doenças pulmonares crônicas 26,27 como BAL pode ser muito invasivo. Em nossos estudos, amostras de escarro foram coletadas com um método de amostragem cuidadosa e consistente, ou seja, na sequência de bochechos e lavagem da cavidade oral, utilizando solução salina estéril para manter a contaminação micróbios orais dentro das amostras de escarro para um mínimo.

Protocol

NOTA: Induzida amostras de escarro foram coletadas de acordo com a Universidade da Califórnia Institutional Review Board (HRPP 081.500) e San Diego State University Institutional Review Board (IRB SDSU # 2121), pelo coordenador da pesquisa, da Universidade da Califórnia, San Diego (UCSD ) clínica de adultos para FC.

1. Coleta e pré-tratamento (amostras de pré-tratamento dentro de 30 minutos após a coleta)

  1. Antes de recolha de amostra, etiqueta quatro tubos de 15 ml como: (i) metagenome virai, (ii) metagenome microbiana, (iii) metatranscriptome, e (iv) expectoração extra. Repita o procedimento para cada amostra. Adicionar 2 ml de esferas de sílica 0,1 milímetros para dentro do tubo rotulado "Metatranscriptome", seguido por 6 ml de tampão de lise de ARN baseada em isotiocianato de guanidina (tampão GITC-lise).
  2. Durante a recolha da amostra, utilizar solução salina estéril (60 ml) como uma lavagem de boca para minimizar a contaminação por micróbios orais. Recolha de amostras de expectoração ao longo de um período de tempo de 30 min após oinalação de 4 ml de solução salina hipertónica 7% através de um nebulizador. Amostras do processo, imediatamente, tal como descrito abaixo.
  3. Dilui-se a amostra a um volume total de 8 ml.
    1. Estimar o volume da amostra pesando copo vazio escarro antes e após a coleta da amostra.
    2. Se o volume da amostra é inferior a 8 ml, adicionar a quantidade apropriada de 0,02 micrometros de filtrado 1x PBS para gerar um volume de amostra total de pelo menos 8 ml.
    3. Imediatamente homogeneizar a amostra com uma seringa de 3 ml até sem aglomerados visíveis permanecer dentro da expectoração
    4. Usando a mesma seringa, elaborar 2 ml de escarro e proceder de imediato para a etapa 1.4.
  4. Preservar RNA total de escarro Amostra
    1. Injectar 2 ml da amostra de expectoração do passo 1.3.4 em o "metatranscriptome" tubo contendo esferas de sílica e tampão GITC-lise.
    2. Fechar a tampa e feche firmemente o tubo com Parafilm para evitar fugas.
    3. Homogeneizar o escarro imediatamente em velocidade média por 10 min. Dependendo do vortexer disponível, colocar o tubo horizontal e prenda com fita adesiva, se necessário.
    4. Manter o tubo a 4 ° C ou numa caixa de gelo e o transporte para o laboratório, se necessário.
  5. Usando a mesma seringa, alíquota de 2 ml de escarro cada um dentro dos tubos rotulados como "metagenome viral" e "metagenome microbial" e transferir a expectoração restante do copo de escarro para o tubo rotulado de "escarro extra".
  6. Armazenar todos os tubos a 4 ° C ou a caixa de gelo e o transporte para o laboratório, se necessário.

2. Gerando Viral metagenoma

  1. Preparação de tampões e soluções
    1. Prepare 50 mM ditiotreitol (DTT) com antecedência e armazenar a 4 ° C. Este é estável durante 2 semanas.
    2. Preparar tampão salino de magnésio (SM) (250 ml): a 1 ​​M de NaCl, 10 mM de MgSO 4, 50 mM Tris-HCl; ajustar o pH para 7,4. Esterilizar por filtração (0,02 mm de tamanho de poro) e armazenar em temperatura ambiente. Prepare enzima ADNase I a 100 U / mL (em água de grau molecular) a partir de pâncreas bovino liofilizado ADNase I de acordo com a actividade definida por unidade Dornase / mg de peso seco.
    3. Preparar tampão 10x ADNase I (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM de CaCl2; ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por filtração (0,02 mm de tamanho de poro) e armazenar em temperatura ambiente.
    4. Prepare a 4% de paraformaldeído.
    5. Prepare 200x Tampão TE: 2 M de Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M de EDTA. Esterilizar por filtração (0,02 mm de tamanho de poro) e armazenar em temperatura ambiente.
    6. Preparar 10 ml de 10% de sódio dodecilsulfato (SDS), utilizando água de grau molecular.
    7. Preparar 50 ml de CTAB / NaCl (10% de CTAB. NaCl 700 mM), utilizando água de grau molecular. Dissolve-se o CTAB durante a noite. Se persistir precipitados, aquecer a solução a 65 ° C. A solução é altamente viscoso à temperatura ambiente.
      NOTA: A filtração utilizando tampões de filtro de 0,02 mm permite a remoção de partículas virais, como dentro da solução, mas nãocontaminação de ácido nucleico livre.
  2. Pré-tratamento da amostra
    1. Preparar a quantidade apropriada de fresco mM ditiotreitol 6,5 (DTT).
    2. Dilui-se o homogenato através da adição de tampão SM de 0,02 micrometros de filtrado para gerar um volume total de 6 ml.
    3. Para ajudar a dissolução do muco, adicionar um volume igual (6 ml) de 6,5 mM de ditiotreitol (DTT) para a amostra, vortex vigorosamente para misturar e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
    4. Vortex a amostra tratada vigorosamente e centrifugação a 10 ° C, 3,056 xg durante 15-20 min.
    5. Recolhe-se o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml.
    6. Repita o passo 2.2.3 e 2.2.5 para a próxima amostra.
    7. Transferência e filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,45 um montado em uma seringa para um novo tubo de 15 ml.
      NOTA: Se o tamancos de filtro, recuperar as amostras da seringa e omitir a etapa de filtração.
    8. Retirar uma subamostra de 100 mL da amostra de 0,45 mm-filtrada, realizar clorofórmio e DNase I tratamento (ver secção 2.3.12-2.3.15) e adicionar um volume igual de paraformaldeído a 4% para fixar a amostra para microscopia de epifluorescência (Figura 2A).
    9. Para uma abordagem partículas virais "pega-tudo" de enriquecimento (ver discussão), vá para o passo 2.3.12 omitir seleção partículas virais com base no gradiente de cloreto de césio ultracentrifugação. No entanto, isto pode resultar na contaminação bacteriana resistente ao clorofórmio e maior quantidade de ADN-hospedeiro no lisado viral.
  3. Partículas virais semelhantes (VLP) Enriquecimento e Purificação
    1. Prepare cloreto de césio indivíduo (CsCl) soluções por dissolução de uma quantidade apropriada de CsCl com tampão SM não filtrada para a densidade desejada (1,7 g / mL, 1,5 g / mL, 1,35 g / ml, e 1,2 g / ml). Filtrar cada solução através de um filtro de 0,02 mm, antes da utilização.
    2. Configurar gradiente de CsCl, como mostrado na Figura 2B.
    3. Carga 1 ml de 1,7 g / ml em cada tubo, a carga de 1 ml de 1,5 g / ml em cada tubo, a carga de 1 ml de 1,35 g/ ml em cada tubo de carga, 1,2 g / ml em cada tubo (opcional), e finalmente carregar 6-8 ml da amostra para o respectivo tubo. Marcar camadas individuais para denotar a localização de cada fracção.
    4. Equilibre cada par de oposição de tubos para dentro de 1 mg.
    5. Encher cuidadosamente cada tubo no balde rodada. Gire todos os baldes, mesmo que estejam vazios. Coloque o balde de spin para o rotor.
    6. Centrifugar a 82.844 xg, a 4 ° C durante 2 horas.
    7. Após a centrifugação, retire cuidadosamente os tubos de o titular, sem perturbar os gradientes de densidade.
    8. Utilizando uma seringa de 3 ml com uma agulha de 18 G, furar o tubo logo abaixo do g / ml de densidade de camada de 1,5 (Figura 2, seta vermelha) e puxar ~ 1,5 ml para dentro da seringa.
    9. Recolher a fracção superior, removendo lentamente a agulha e permitindo que a fracção restante no tubo para gotejar para um novo tubo de 15 ml através do punção. Rotular isso como "resíduos fração superior".
    10. Recolha de 1,5 g / ml fraction (contendo VLP) a partir da seringa, ejectando o conteúdo em dois novos tubos de microcentrífuga.
    11. Repita o passo 2.3.8-2.3.10 para todas as amostras.
    12. Adicionar 0,2 volume de clorofórmio ao concentrado viral, agitar vigorosamente, incubar à TA durante 10 min, a uma velocidade de rotação máxima durante 5 min, e recolher a fase aquosa.
    13. Adicionar tampão 10x ADNase e DNase I (concentração final = 2,5 U / ul) no concentrado viral tratado com clorofórmio, e incubar a 37 ° C durante 1,5-2 h.
    14. Inactivar a actividade de ADNase, a 65 ° C durante 15 min.
    15. Retirar 15 mL da fracção de clorofórmio-viral e tratado com DNase I-para um novo tubo, e adicionar 15 uL de paraformaldeído a 4% para fixar a amostra para microscopia de epifluorescência.
  4. Extração de DNA
    1. Piscina concentrados virais a partir de cada amostra em 50 ml de um tubo Oak Ridge centrífuga de alta velocidade limpo e esterilizado.
    2. Adicionar o seguinte: 200x volume de tampão TE 0,1, 10 ul de 0,5 M de EDTA por ml de samplo, 1 volume de formamida e 10 ul de glicogénio. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Utilizando os novos volumes, adicionar 2 volumes de etanol temperatura ambiente 100%. Misturar bem e incubar a 4 ° C durante pelo menos 30 min.
    4. ADN pelete por centrifugação a 17.226 xg em tubo durante 20 min, a 4 ° C utilizando um rotor SS-34.
    5. Descartar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta serológica. Lava-se a pelete duas vezes com etanol gelado a 70%.
    6. Remover tanto líquido quanto possível e permita que o sedimento ao ar seco à temperatura ambiente durante 15 min.
    7. Ressuspender o sedimento de DNA em 567 ul de 1x tampão de TE (pH 8,0).
      NOTA: Deixe pelo menos 15 min para a ressuspensão completa à temperatura ambiente. Armazenar o DNA ressuspenso durante a noite a 4 ° C até posterior processamento.
    8. Transfira a totalidade do 567 ul de solução de ADN ressuspenso para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de pré-aquecida até 10% SDS e 3 ul de proteinase K (20 _6; g / ml), misture bem e incubar durante 1 hora a 56 ° C. Pré-quente CTAB / NaCl a 65 ° C.
    9. Adicione 100 ml de NaCl 5 M e misture bem. Adicionar 80 ul de solução pré-aquecida de CTAB / NaCl, vórtice, e incubar durante 10 min a 65 ° C.
    10. Adicionar igual volume de clorofórmio, vortex para misturar, e na rotação 16,100 xg durante 5 min.
    11. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Adicionar um volume igual de fenol / clorofórmio, vortex para misturar, e rodam a 16,100 xg por 5 min.
    12. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Adicionar um volume igual de clorofórmio, vortex para misturar, e rodam a 16,100 xg por 5 min.
    13. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Adicionar igual volume de isopropanol à fracção sobrenadante, misturar e incubar à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 30 min.
    14. Sedimentar o ADN, a rotação de 16.100 xg durante 15 min a 4 ° C. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com etanol gelado a 70%. Realizar uma breve centrifugação e remover o etanol remanescente a partir do tubo. Ar secar o sedimento durante 15 minutos.
    15. Ressuspender o sedimento de DNA com 50 ul de tampão de eluição (Tris 5 mM, pH 8,5). Permitir que o pellet para hidratar por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente.
    16. Quantificar o ADN utilizando um ensaio baseado em fluorescência de alta sensibilidade.
  5. A amplificação utilizando phi29 Polimerase (Opcional)
    1. Preparar tampão de recozimento 2x: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM de MgCl 2.
    2. Dilui-se polimerase de ADN de phi29 a 5 U / uL.
    3. Tampão de amostra de pré-mistura, composta por 50 ul de iniciadores aleatórios de hexâmero (100 uM), 125 ul de 2x tampão de emparelhamento, e 25 ul de água. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    4. Tampão de pré-mistura de reacção, constituída por 100 ul de tampão phi29 10x, 40 ul de dNTPs 10 mM e 560 ul de água. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    5. Adicionar 1 mL de DNA molde em tampão de amostra de 4 ul.
    6. Incubar the mistura a 95 ° C durante 3 min e arrefecer em gelo.
    7. Adicionar 14 mL de tampão de reação na mistura a partir de 2.4.4, misture pipetando cima e para baixo.
    8. Adicionar 1 mL de polimerase de ADN de phi29, misturar-se pipetando para cima e para baixo, e incuba-se a 30 ° C durante 18 horas seguido por 65 ° C durante 10 min.
    9. Limpe as reações utilizando colunas de DNA genômico ou fenol / clorofórmio e precipitação de etanol.
  6. Epifluorescência Microscopy (Consulte Haas et al. 2014 28 para a configuração do sistema de filtração)
    NOTA: A seguir ao isolamento e purificação, microscopia de epifluorescência com corantes ácidos nucleicos pode ser utilizada para verificar a presença e pureza de partículas virais em amostras (Figuras 2A e 2C). DNA livre na amostra pode dar azo a fluorescência de fundo. Portanto, a amostra deve ser tratada com ADNase I-antes da fixação e coloração para micrografias.
    1. Preparar a solução de montagem (ácido ascórbico 0,1%, 50% de glicerol). Adicionar 100 uL de ácido ascórbico a 10% a 4,9 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS), homogeneiza-se. Adicionar 5 ml de 100% de glicerol para a mistura, misturar bem e rotular o tubo como "montar".
    2. Filtro de montagem utilizando uma matriz de alumina de 0,02 mm filtro de seringa descartável, alíquota para tubos de microcentrífuga, e armazenar a -20 ° C.
    3. Aliquota de 100 ul de amostra para um tubo de microcentrifugação novo e adicionar um volume igual de paraformaldeído a 4% para fixar as VLPs. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min.
    4. Completar o volume a 1 ml por adição de 800 mL de água de 0,02 mm-filtrada. Adicionar 1 ml de SYBR ouro mancha para dentro do tubo e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Configure o sistema de filtração por ligar a bomba de vácuo entre -9 e -10 psi (-62,1 e -68,9 kPa).
    6. Lave o pedestal com água e coloque um filtro de 0,02 mm matriz de alumina com anel de suporte de polipropileno anular no pedestal filtro.
    7. Inserir uma torre de filtro no topo do pedestal do filtro com o filtro e seguro com uma pinça.
    8. Pipetar os conteúdos do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para a torre de filtro, e permitir que alguns minutos para a amostra a filtrar.
    9. Rótulo e pipeta 10 ml de reagente de montagem em uma lâmina de microscópio.
    10. Deixe o vácuo no durante a remoção da torre de filtro e grampo.
    11. Retire cuidadosamente o filtro do pedestal filtro e seque a parte inferior do filtro com um Kimwipe, em seguida, coloque o filtro diretamente no topo do monte sobre a lâmina de microscópio.
    12. Pipetar mais 10 ul de reagente de montagem para o filtro e colocar uma lamela sobre o filtro.

3. Geração Microbial metagenoma

  1. Preparação de tampões e soluções
    1. Preparar 50 ml de tampão 1x: ADNase NaAc 50 mM, 10 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2; ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por filtração (0,22) e lojaà temperatura ambiente.
    2. Prepare enzima ADNase I a 1000 U / mL (em água de grau molecular) a partir de pâncreas bovino liofilizado ADNase I de acordo com a actividade definida por dornase unidade / mg de peso seco.
    3. Preparar 100 ml de tampão SE: NaCl 75 mM, EDTA 25 mM; ajustar o pH para 7,5. Esterilizar por filtração (0,22) e armazenar em temperatura ambiente.
  2. Pré-tratamento da amostra Antes da Extracção de DNA
    1. Dilui-se o homogenado por adição de 5 volumes de 0,22 um filtrado 1x PBS. Por exemplo, adicione 10 ml de 1x PBS em 2 ml de amostra.
    2. Adicionar β-mercaptoetanol a 2% (v / v), concentração final. Rocha-se a mistura (na capa química) à temperatura ambiente durante 2 h.
    3. Girar a amostra a 10 ° C e 3.056 xg, durante 15 min, e rejeitar o sobrenadante.
    4. Ressuspender o sedimento em 10 ml de água de grau molecular (ou 0,22 mM de água filtrada), e incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Repita os passos 3.2.3 e 3.2.4 uma vez.
    6. Spin a 10 ° C e 3.056 xg, durante 15 min, e rejeitar o sobrenadante.
    7. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão 1x DNase e adicionar 15 ul de ADNase I (1.000 U / ul) por ml de amostra.
    8. Incubar a 37 ° C com repetidas de mistura durante 2 horas.
    9. Inactivar a actividade de ADNase, a 65 ° C durante 15 min.
    10. Girar a 10 ° C e 3.056 xg, durante 15 min, e descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de SE.
    11. Repita o passo 3.2.10.
    12. Girar a 10 ° C e 3.056 xg, durante 15 min, e descartar o sobrenadante.
    13. Ressuspender o sedimento em 2 ml de tampão de SE, e transferir para dois tubos de microcentrífuga.
    14. Agregar as células nos tubos de microcentrífuga. Girar os tubos a 16.100 x g à temperatura ambiente durante 15 min.
    15. Remover o sobrenadante e extrai-se o ADN das células peletizadas usando um kit de extracção de ADN genómico, protocolo de variação de bactérias Gram-positivas.

4. Gerando Metatranscriptome

  1. Amostra Pre-tratamento
    1. Execute lise mecânica de células por espancamento talão em tampão GITC-lise imediatamente após a coleta da amostra e homogeneização. Veja o passo 1.4.
    2. Girar-se a mistura a 4 ° C e 600 xg durante 5 min para sedimentar as esferas de sílica.
    3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.
    4. Adicionar 200 ul de clorofórmio para cada 750 ul de tampão de lise GITC-utilizados, agitar vigorosamente à mão durante 15 segundos, incubar à temperatura ambiente durante 10 min, e centrifugação a 4 ° C e 3056 x g durante 15 min. Durante este 15 min de centrifugação, preparar-se para o passo 4.2.
    5. Após o 15 min rotação (a separação clara das formas de fase fase de interfase-orgânicas aquosas), extrair a fase aquosa (sem interromper a interfase) em novo tubo (s) livre de RNase.
      NOTA: A fase aquosa contém o ARN. Manter os tubos em gelo até que o próximo passo.
  2. Realizar a extracção de ARN total e purificação utilizando kits de purificação de ARN disponíveis comercialmente baseados em colunas ou conventional precipitação de ARN baseada em isopropanol.
    1. Baseada em coluna de sílica ARN Purificação
      1. Medir o volume total da fracção aquosa obtida.
      2. Adicionar volume adequado de tampão de ligação RNA-de provar e misture bem.
      3. Ajuste mistura de se apropriar condição de ligação de acordo com o protocolo do fabricante. Misture bem e fazer uma centrifugação breve.
      4. Carregar a mistura em coluna de a-ARN. Para uma grande amostra de volume, utilize o carregamento múltiplo e carregar cada coluna até 4x. Caso contrário, considere o uso de várias colunas para cada amostra.
      5. Lava-se a coluna apropriadamente de acordo com o protocolo do fabricante.
      6. Elui-se o ARN com, pelo menos, 30 ul de água isenta de RNase. Duplo-eluição irá aumentar ligeiramente o rendimento de ARN. No entanto, isto irá diluir a concentração de ARN.
      7. Medir a concentração de RNA e seguir diretamente para DNase I tratamento. Use o Bioanalyzer para verificar a qualidade do RNA (recomendado).
      8. RNA Precipitation
        1. Adicionar um volume igual de isopropanol (por exemplo, 500 mL de isopropanol em 500 ul de fracção aquosa) e 2 ul de 10 mg / mL de glicogénio livre de ARNase para a amostra.
        2. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 min.
        3. Girar a 12.000 xg e 4 ° C durante 15 min.
        4. Remova cuidadosamente o sobrenadante, adicionar 1 ml de RNase etanol a 75%. Girar-se a mistura a 7500 x g e 4 ° C durante 5 minutos para garantir que o grânulo é intacta.
        5. Retire cuidadosamente o etanol.
        6. Repita os passos 4.2.2.4 e 4.2.2.5 uma vez.
        7. Ar secar o sedimento durante 10 minutos.
        8. Reidratar o sedimento em 50 mL de água livre de RNase, incubar a 55 ° C durante 5 min e prosseguir directamente para tratamento de DNase. Use o Bioanalyzer para verificar a qualidade do RNA (recomendado).
        9. ARN loja em alíquotas a -20 ° C ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

Representative Results

Metagenomes virais

Expectoração de FQ é excepcionalmente viscoso e contém uma elevada quantidade de mucina e ADN livre (Figura 2A); a ultracentrifugação em gradiente de densidade facilita a eliminação de ADN derivadas do hospedeiro (Figura 2B). Os resultados de um estudo anterior 9 mostrando oito viromes gerados a partir do fluxo de trabalho apresentados aqui são resumidos (Tabela 1). Sete amostras (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, e CF5-B; Tabela 1) foram processados ​​como descrito na secção 2. O viromes gerados continha pouco (0,02 % -3,7%) sequências de origem humana, com apenas uma exceção (70%). CF4-A foi omitido o passo de ultracentrifugação em gradiente de densidade (CF4-A) e o virome gerado a partir desta amostra específica continham sequências de origem humana> 97% (Tabela 1). A Figura 2 mostra um exemplo de imagem de microscopia de epifluorescência de um típico CF sputum amostra antes (Figura 2A) e depois (Figura 2C) ultracentrifugação em gradiente de densidade. Partículas virais como o claro (VLPs) foram observadas nas micrografias sem partículas grandes seguintes a separação por gradiente de densidade. Após a extração do DNA VLP, a contaminação bacteriana é frequentemente testados usando a amplificação do gene 16S rDNA antes do sequenciamento do DNA VLP.

Microbianas metagenomes

Sete amostras de escarro aqui apresentados foram coletados a partir de um único paciente CF em sete dias consecutivos. O paciente começou em antibiótico oral (ciprofloxacina e doxiciclina) no dia 3, depois do escarro foi colhido. O volume de cada amostra de expectoração recolhida a partir deste paciente foi de 15 mL ao longo dos 7 dias; por conseguinte, não PBS foi adicionado à amostra. O objetivo deste evento de amostragem foi avaliar os protocolos apresentados neste fluxo de trabalho (i) avaliar a flutuação diária da estrutura da comunidade microbiana, e (ii) comparara estrutura da comunidade microbiana e resolução entre metagenômica e 16S rDNA. Portanto, o ADN total e HL-DNA foram extraídos a partir de cada amostra.

A concentração de ADN-HL de cada amostra de expectoração a seguir à extracção de ADN é apresentada na Tabela 2. O rendimento total de HL-ADN variaram de 210 ng a> 5 ug. Bibliotecas de sequenciação Illumina foram gerados com um material de partida total de 1 ng para cada amostra (Figura 3). As características dos dados Metagenômica são apresentados na Tabela 2. Todas menos uma biblioteca rendeu mais de 1 milhão de sequências e mais do que 85% sequências de alta qualidade foram retidos quando o pré-processamento de dados usando o software PRINSEQ 29. Todos os conjuntos de dados foram pré-processados ​​primeiro a remover duplicatas e sequências de baixa qualidade (pontuação de 25 mínimo de qualidade), seguido por mais de triagem e remoção de sequências de origem humana usando DeconSeq 30. A quantidade de humano-derived contaminação sequência é altamente dependente das propriedades da amostra. Aqui, a quantidade total de sequências derivadas de humanos variou 14-46% (Tabela 2). As sequências foram então anotado previamente processados ​​usando o Metaphlan oleoduto 31, bem como MG-RAST servidor 32.

Além metagenomes, bibliotecas amplicon 16S rDNA foram geradas a partir de ambos o ADN total e HL-DNA através de iniciadores com alvo de aproximadamente 300 pb da região variável da V1-V2 no gene 16S rRNA 33,34. Produtos de PCR de amostras individuais foram normalizados e reunidas para sequenciamento utilizando o Illumina 500 ciclo emparelhado-end sequenciamento realizado na plataforma MiSeq. Emparelhado-end sequências amplicon 16S rDNA foram ordenados por amostra via códigos de barras usando um script python eo emparelhado leituras foram montados utilizando phrap 35,36. Extremidades seqüência montadas foram aparadas até o escore médio de qualidade foi ≥20 usando uma janela de 5 nt. Quimeras potenciais foram on removido usando Uchime 37 contra um subconjunto sem quimera das sequências de referência SILVA 38. Taxanomy foi atribuído à alta qualidade lê com SINA 39 (versão 1.2.11), utilizando os 418.497 sequências bacterianas do banco de dados SILVA 38. Sequências com atribuições idênticas taxonômicos foram agrupados para produzir unidades taxonômicas operacionais (Otus). Este processo gerou 1.655.278 sequências para 16 amostras (tamanho médio: 103.455 seqüências / amostra; mínimo: 72.603; máx: 127.113). A pontuação cobertura Mercadorias mediana, uma medida da plenitude de sequenciamento, foi ≥ 99,9%. O pacote de software Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) foi utilizado para análise e figura geração. Alpha-diversidade (intra-sample) e beta-diversidade (inter-amostra) foram calculados em Explicet no ponto de rarefação de 72.603 seqüências com 100 de bootstrap re-amostragens.

A primeira pergunta direcionada por este estudo era saber se hipotônica preferenti lisealiado seleciona para (ou seja, preferencialmente retém ou lise) determinados grupos de micróbios. Após o primeiro lise hipotónica, as células peletizadas foram ressuspensas subamostrados a partir das duas primeiras amostras (CF1-1A * e * CF1-2A) para comparar com as amostras, após a segunda lise hipotónico (CF1-1and CF1-2). Todas as amostras foram tratadas da mesma forma, isto é, tratou-se com ADNase I antes da extracção do ADN, seguido de extracção de ADN e a tubagem de sequenciação. Como mostrado na Figura 4, os perfis das subamostras microbianos são altamente similares às amostras depois de dois tratamentos de lise hipotónica. Além disso, a segunda lise hipotónica aumenta a fracção de sequências não-humanos por 6-17% dentro dos metagenomes (Tabela 2).

Para testar as diferenças na composição microbiana entre metagenomic- e perfis baseados-rDNA 16S, e por mudanças antes e depois de lise hipotônica que poderiam explicar as diferenças previamente observados entre o nosso garanhãos, entre outros, as bibliotecas de sequenciação de rDNA 16S bacterianas foram gerados a partir de ADN total de ambos o ADN e HL-derivado (Figura 4B). No nível de gênero, os perfis de taxonomia das bactérias comuns associadas à CF, tais como Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella, e Streptococcus foram muito semelhantes entre as bibliotecas 16S rDNA e metagenomes gerados a partir do DNA derivado do HL. No entanto, a detecção Rothia nas bibliotecas 16S rDNA não foi tão abundante como com as bibliotecas metagenomic. Ao comparar os perfis de taxonómicas 16S rDNA gerados a partir de ADN total e HL-ADN derivado, Pseudomonas foi diferencialmente representado no DNA total em comparação com o ADN de partida derivados a partir de HL-Dia 3.

Metatranscriptomas

Tipicamente, o RNA total extraído de expectoração CF é parcialmente degradado e o tamanho varia de 25-4,000 bps (Figuras 5A e et al 2012 9.. A fracção de rRNA dentro dos metatranscriptomas não empobrecido varia 27-83%, e a abundância relativa de rRNA variou entre amostras (Tabela 3; dados extraídos de Lim et al. 9). No entanto, a depleção com kit de Ribo-Zero diminuição da abundância relativa rRNAs de rRNA a 1-5%, com a excepção da amostra CF1-F. A variação na eficácia da remoção de rRNA poderia reflectir a qualidade do RNA extraído, ou diferenças no presente comunidade microbiana e, portanto, a acessibilidade de rRNAs de sondas para hibridação 9. Os electroferogramas de uma bem sucedida (Figura 5B) e vencida procedimento de remoção (Figura 5D) rRNA usando o kit de remoção de Ribo-Zero rRNA diferem, no qual os picos de rRNA são visíveis na remoção vencida.

A gama de tamanho de cDNA Bibliotecas de generated reflecte muitas vezes a gama de tamanho da amostra de RNA de partida. As bibliotecas de cDNA aqui apresentados foram gerados com um kit de amplificação transcriptoma todo (WTA2) no consumo de rRNA seguido por Roche-454 biblioteca sequenciamento preparação 9. O cDNA gerado conter fragmentos que vão desde 50-4,000 bps (Figuras 5E e 5F) e é altamente consistente através de amostras (Lim et al. 2012) 9. A disponibilidade de outros RNA-Seq kits de preparação biblioteca específicos da plataforma fornecem atualmente mais opções alternativas para que se combinam a síntese de cDNA e preparação biblioteca seqüenciamento em óptimas condições. Uma opção recomendada até o momento é o ScriptSeq Kit Ouro completa combinando reagentes remoção rRNA recomendados acima e kit de preparação biblioteca RNA-Seq.

Figura 1
Figura 1: Fluxo de trabalho para a preparaçãoprepara- de amostras associadas ao hospedeiro, como amostra de escarro, para virome, microbioma, e metatranscriptome seqüenciamento.

Figura 2
Figura 2: cloreto de césio gradientes de densidade de ultracentrifugação facilitar a eliminação de ADN extracelular e partículas grandes (A), e para permitir o isolamento ideal das partículas virais, como de expectoração de FQ. Um mililitro de cada gradiente é disposto em camadas em cima uma da outra antes de carregar a amostra pré-tratada (B). Seguindo partículas de isolamento e purificação, microscopia de epifluorescência com corantes ácidos nucleicos, tais como SYBR ouro são usados ​​para verificar a presença e pureza de partículas virais em amostras. Partículas virais semelhantes Clear (C; seta branca) foram observados após a separação por gradiente de densidade da CF amostra de escarro.


Figura 3:. Exemplo de a distribuição do tamanho das bibliotecas Nextera XT gerados a partir de 1 ng de HL-ADN que resultou em microbiomas de expectoração de FQ normalização da biblioteca, agrupamento, e quantidade de carregamento foi feito como descrito no protocolo do fabricante, sem qualquer desvio.

Figura 4
Figura 4: A análise taxonômica das comunidades microbianas em nove amostras coletadas longitudinalmente de paciente um CF (A) perfis microbiano baseado nas bibliotecas metagenomic gerados a partir de DNA baseado no método de lise hipotônica.. A atribuição espécies baseou-se na pré-processamento de dados de pipeline Metaphlan seguinte ao remover duplicatas e sequências de baixa qualidade e homologia sequência humana. A fim de mostrar que dois-reps lise hipotônica não seleciona preferencialmente a grupos específicos de micróbios, subsamples (*) após a primeira lise hipotônica foram incluídos. (B) perfis microbianos baseado na região V1V2 do sequenciamento do gene 16S rRNA do DNA total (T) e método de lise hipotônica DNA baseado (HL). Estes dados não foram previamente publicados.

Figura 5
Figura 5: Exemplos de Agilent Bioanalyzer 2100 electroferogramas de ARN (AD) e de cDNA (EF) gerada para as bibliotecas metatranscriptomic, utilizando o pico de ARN e de alta sensibilidade fichas dsDNA respectivamente. (A) e (C) mostram os exemplos de electroferogramas antes de procedimentos de remoção de rRNA. Os electroferogramas de uma bem-sucedida (B) e vencida procedimento de remoção (D) rRNA usando kit de remoção total rRNA ligeiramente diferente, umat que rRNA picos são visíveis na remoção sem êxito. A gama de tamanhos de ADNc (EF) gerado usando o kit de amplificação de todo o transcriptoma (Sigma-Aldrich) é similar ao intervalo de tamanho do ARN empobrecido-rARN de partida, e altamente consistentes nas duas amostras diferentes. Por favor clique aqui para ler um versão maior desta figura.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Número total de leituras 224859 87.891 106189 93.301 140020 1.558 272552 217438
Preprocessed lê um 109389 73.624 67.070 82.011 68.617 1.137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Número de bases 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
A média de comprimento de leitura 432 453 431 337 428 215 441 439
Seqüências de acolhimento b 240 526 28 79.774 13 797 585 5.859
0,21% 0,71% 0,04% 97,27% 0,02% 70,10% 0,27% 3,70%
Sucessos virais c 7214 23.550 4.070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31,99% 6,07% 0,90% 6,77% 1,93% 3,00% 3,78%
Por atribuir Lê d 103888 60.490 32.780 1935 68.440 311 105612 119551
94,97% 82,16% 48,87% 2,36% 99,74% 27,35% 48,94% 75,46%
um após dados pré-processing por PRINSEQ 29.
b Human lê identificado por DeconSeq 30 mais lê com um melhor hit BLASTn (banco de dados de nucleotídeos NCBI) ao filo Chordata.
c tBLASTx bate contra a base de dados do genoma viral in-house. A percentagem foi calculada usando o número total de pré-processado lê.
d Lê sem BLASTn bater contra a base de dados de nucleotídeos NCBI. A percentagem foi calculada usando o número total de pré-processado lê. Alguns lê sem BLASTn bater contra a base de dados do NCBI nucleótidos foram identificadas como virai ao nível da proteína na análise tBLASTx.

Tabela 1:. Biblioteca características de oito viromes gerados a partir de amostras de expectoração utilizando fluxo de trabalho apresentado Esta tabela é extraída a partir de Lim <em> et al. (2012) 9. Sete amostras (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, e CF5-B) foram processados ​​como descrito na Seção 2 e viromes que continham pouco (0,02% gerado - 3.7 sequências%) de origem humana com uma única excepção (70%). CF4-A foi omitido o passo de ultracentrifugação em gradiente de densidade (CF4-A) e virome gerado que continha as sequências de origem humana> 97%.

Amostra Concentração Rendimento total Nº Total Lê Nº Total Lê (Processado b) As sequências não-humanos
(Ng / mL) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1.300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28,8 2.880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24.1 2.410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33,6 3.360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43.2 4.320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57,8 5.780 1000174 872036 565376
65%
* 1 ml de amostra foi sub-amostrado a partir CF1 -1 E CF1-2 após a primeira etapa de lise hipotônica (Passo 3.1.5) antes do segundo procedimento de lise hipotônica. As células foram centrifugadas como descrito em 3.1.7 e prosseguir através do protocolo restante, sem qualquer modificação.
um Unprocessed Illumina lê de um 2 x 300 pb MiSeq sequenciamento de execução.
b As leituras foram avaliados, aparado, e removidos com base na qualidade e no comprimento tal como descrito na discussão.

Tabela 2:. Características de microbiomas gerados a partir de amostras de expectoração utilizando apresentada fluxo de trabalho A concentração de DNA de cada amostra em 100 ul de tampão de eluição (Tris 5 mM / HCl, pH 8,5) e as características dos dados da sequência são apresentados. Um total de 1 ng foi usada para gerar biblioteca indivíduo usando o kit de preparação de biblioteca Nextera XT.

0 "fo: manter-together.within-page =" always "> Amostra CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Tratamento Nenhum Ribo-Zero Nenhum Ribo-Zero Nenhum Ribo-Zero Nenhum Ribo-Zero Preprocessed lê 2.088 1991 40.876 25.238 19.728 32.737 31.791 36.172 A média de comprimento de leitura 275 245 262 270 233 259 240 267 Total de rRNA lê 1.737 91 29.499 17.267 5.285 291 16.371 1.761 83,20% 4,60% 72,20% 68,40% 26,80% 0,90% 51.50% 4,90% Microbial rRNA 1.414 32 19.978 12.035 23 227 6916 1.076 67,70% 1,60% 48,90% 47,70% 0,10% 0,70% 21,80% 3,00% Eukaryota rRNA 323 59 9.520 5.232 5262 64 9455 683 15,50% 3,00% 23,30% 20,70% 26,70% 0.20% 29,70% 1,90% % RRNA removido * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Não-rRNA lê 351 (16,8%) 1.900 (95,4%) 11,377 (27,8%) 7,971 (31,6%) 14,443 (73,2%) 32.446 (99,1%) 15,420 (48,5%) 34,411 (95,1%) Total de visitas NR 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2.857 (11,3%) 4,938 (25,0%) 10.751 (32,8%) 5,905 (18,6%) 15.766 (43,6%) Eukaryotic 74 407 2.790 2.524 4614 10.227 4.553 8274 Bacteriano 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Por atribuir lê 249 (11,9%) 1.209 (60,7%) 8.050 (19,7%) 5,114 (20,3%) 9,505 (48,2%) 21,695 (66,3%) 9,515 (29,9%) 18,645 (51,5%) * A quantidade de rRNA removido expressa como uma percentagem da quantidade presente na alíquota não empobrecido.

Tabela 3:. Biblioteca características dos metatranscriptomas com e sem depleção de rRNA Os dados são extraídos de Lim et al (2012) 9, que tem comparação adicional de outros kits de remoção de rRNA e o efeito de nebulização ADNc antes da preparação da biblioteca de sequenciação..

Discussion

Metagenomics virais

As partículas virais são concentradas utilizando polietileno glicol (PEG) ou pequenos concentradores de volume. Em alguns casos, pode não ser necessária concentração, mas pré-filtração ou passos de centrifugação de baixa velocidade são usadas para remover as células eucarióticas e microbianas. Os lisados ​​virais será enriquecido e purificado utilizando ultracentrifugação de gradiente de densidade de 9,41 ou filtros de tamanho pequeno (por exemplo, 0,45 mm) para remover as células microbianas e eucarióticas grandes 25. Ultracentrifugação de gradiente de densidade é tipicamente realizada com soluções densos mas inertes, tais como sacarose ou cloreto de césio para isolar e concentrar as partículas virais 41. A separação física é baseada no tamanho e densidade de flutuação de partículas virais. Portanto, a escolha adequada do tamanho de poro do filtro e a rigorosa preparação de gradientes são essenciais para isolar as comunidades virais específicos, como o sucesso da recuperação físicaVLP determina a comunidade isolada 41 (isto é, partículas virais que não passam através do filtro ou queda na densidade de extracção não serão detectados no metagenome). Após o isolamento e concentração viral, pode haver contaminação material genómico não-viral presente na amostra, tanto na forma de ácidos nucleicos livres e microbiana e células eucarióticas. Portanto, é crítico para verificar a pureza de partículas virais em amostras (Figuras 1A e 1B). Um tratamento de clorofórmio é comumente utilizado para lisar as células remanescentes, seguido por tratamento com nuclease para degradar ácidos nucleicos livres antes da extracção do ácido nucleico.

Uma advertência ao fluxo de trabalho apresentados foi a utilização de separação por gradiente de densidade para isolar partículas virais, uma vez que podem excluir partículas virais com invólucro que possam ser muito flutuante para entrar no gradiente de CsCl. Uma alternativa "catch-all" método é omitir a separ gradiente de densidadeção e isolar o DNA da comunidade dos 0,45 mm - filtrados tratados com clorofórmio e ADNase I. Esta abordagem é também apropriado para acomodar pequenos volumes de amostras, tais como aqueles a partir de esfregaços de sangue ou plasma. No entanto, isto pode resultar na contaminação bacteriana resistente ao clorofórmio e maior quantidade de ADN extracelular ADNase I resistente.

Protocolos de seqüenciamento atuais requerem 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para a preparação biblioteca sequenciamento de DNA em que os rendimentos mais elevados proporcionar uma escolha mais ampla de opções de sequenciamento. A concentração de ADN de viromes geradas muitas vezes varia entre o limite inferior de detecção de mais do que 200 ng / mL. A quantidade de ácidos nucleicos virais recuperados podem ser insuficientes para a preparação da biblioteca de sequenciação directa. Em tais casos, a amplificação do ácido nucleico é essencial. Linker amplificação espingarda bibliotecas (LASLs) 2,42,43 e amplificação do genoma inteiro com base em múltiplos de amplificação de deslocamento (MDA) são os doismétodos mais comumente usados ​​para gerar DNA suficiente para sequenciamento. MDA métodos tais como aqueles baseados em phi29 polimerase de ADN são conhecidas por sofrer de viés de amplificação, e pode amplificar ADNcs e preferencialmente de ADN circular, resultando em taxonómico não quantitativo e caracterização funcional 44,45. Foi demonstrado uma versão optimizada do LASLs abordagem para introduzir apenas desvios mínimos, promove uma maior sensibilidade (para pequenas quantidades de material de partida), e é facilmente adaptado para diferentes plataformas de sequenciação 43. No entanto, a abordagem tem muitas etapas, requer equipamento especializado para minimizar a perda de DNA, e é limitado a modelos de dsDNA. No nosso laboratório, esta abordagem foi adaptada com sucesso para amplificar quantidade detectável e indetectável de DNA extraído a partir de lavage- broncoalveolar, e coral- VLP derivadas de água do mar (não publicadas e Hurwitz et ai. 46).

Desenvolver pipelines de análise de dados tem classically sido um dos aspectos mais desafiadores da análise metagenômica viral devido à natureza altamente diversificada e em grande parte desconhecida das comunidades virais. Embora haja um número estimado de 10 8 genótipos virais na biosfera, até à data bases de dados virais atuais contêm ~ 4.000 genomas virais, o que é cerca de 1/100000 dessa diversidade viral total aproximado. Portanto, pesquisas baseadas em similaridade (como BLAST 47) para atribuição taxonômica e funcional em metagenomes virais possuem desafios inerentes. Muitas sequências de deixar de ter semelhanças significativas para genomas no banco de dados e, portanto, são classificados como desconhecido. Apesar de pesquisas baseadas em homologia são as aplicações mais importantes para a atribuição de taxonomia e função para a sequência de dados, abordagens alternativas com base na análise independente do banco de dados foram desenvolvidos 48- 50. Fancello et al. 51 fornecer uma revisão completa de ferramentas computacionais e algoritmos usados ​​em Viral metagenômica.

Microbial Metagenomics

Tipicamente, a quantidade total de DNA extraído a partir de comunidades microbianas tratados com lise hipotónica (HL-DNA) na gama de 20 ng a 5 mg. O rendimento é altamente dependente do estado de saúde do paciente e a quantidade de amostra de expectoração recolhida, o que explica as variações observadas na produção total de células HL-DNA extraído neste estudo (Tabela 2). Os passos críticos para gerar dados de sequência de boa qualidade dependem da qualidade de bibliotecas de sequenciação geradas. A Figura 2 mostra um intervalo de tamanho típico para as bibliotecas de sequenciação geradas a partir de ADN microbiano derivado de expectoração CF utilizando um procedimento de fragmentação de ADN baseada em enzimática. O tamanho óptimo biblioteca é dependente da escolha da plataforma de sequenciação e aplicação, e, por conseguinte, o processo de fragmentação pode ser optimizado, se necessário, através de métodos alternativos, tais como sonicação e a nebulização. Além deos resultados representativos apresentados, o sucesso do método apresentado na expectoração CF recolhidos a partir de vários doentes em vários pontos de tempo é também ilustrado na Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10.

Estudos anteriores 9,10 sugerem que cada paciente abriga um conjunto exclusivo de comunidade microbiana que muda ao longo do tempo, refletindo assim a persistência dos principais jogadores dentro da comunidade enquanto as flutuações são provavelmente devido a perturbações, tais como tratamentos com antibióticos. Se essas flutuações ocorrem diariamente, mesmo sem perturbações externas ou devido ao processo de amostragem e processamento de amostras, ainda está em questão. Com base na metagenômico HL-ADN e análise amplicão ADNr 16S, a amostragem de 7 dias longitudinal mostra que a variação diária de perfis microbianas sem perturbação antibiótico (Dia 1, 2, e 3) foi mínima (Figuras 3A e 3B). Após a introduçãoprodução de antibióticos orais imediatamente após a amostragem Dia 3, mudanças no perfil da comunidade tornou-se evidente no dia 4. Enquanto o antibiótico ciprofloxacina atinge um amplo espectro de bactérias patogénicas conhecidas, tais como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Streptococcus pneumoniae, o tratamento aumentou a abundância relativa de P. aeruginosa, enquanto diminui o Streptococcus spp. e P. melaninogenica. By Day 6, a comunidade recuperou lentamente para a estrutura inicial da comunidade de partida. Os resultados sugerem que as flutuações de perfis microbianos dentro de um único paciente é mais provável devido a perturbações da comunidade nas vias aéreas.

Dada a consistência entre os perfis microbianos de bibliotecas 16S rDNA e metagenomes de DNA HL-derivada, que descartou os preconceitos provenientes dos primers 16S rRNA utilizados neste estudo. Uma possível explicação para as diferenças observadas em toda 16S rDNA taxonômicoperfis al gerados a partir de ADN total e HL-ADN derivado (Figura 3B) pode ser a presença de quantidades elevadas de Pseudomonas spp. ADN extracelular após o tratamento antibiótico. Isto é apoiado pelas descobertas de que estas diferenças foram mais aparentes no dia 7, três dias após o tratamento antibiótico, que tem como alvo Pseudomonas spp. em adição aos outros. A ciprofloxacina é comumente usada como tratamento de primeira linha em pacientes com FC e P. crônica infecção aeruginosa, embora o seu espectro de atividade inclui a maioria dos patógenos associados à FC. Trabalhamos com a hipótese de que o tratamento com antibióticos erradica comunidades sensíveis, incluindo Streptococcus spp. e, portanto, criar um nicho preenchido por P. resistente aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa pode ganhar resistência, através do aumento de suas comunidades de biofilme e DNA extracelular foi mostrado para ser o principal suporte estrutural de sua arquitetura biofilme 52. Mesmo quando tele recuperou a estrutura da comunidade, DNA extracelular pode ter permanecido no CF escarro. Portanto, estes dados sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem apresentados neste fluxo de trabalho potencialmente beneficiar não só na remoção do ADN humano derivada, mas também ADN extracelular microbiana derivada que podem deturpar os perfis microbianas reais.

Metatranscriptomics

A alta qualidade metatranscriptome deve conter relativamente poucas sequências de RNA ribossomal (rRNA) e representam uma amostragem imparcial das transcrições da comunidade (mRNA). Devido à semi-vida curta e limitada quantidade de ARNm, é crítico que o protocolo, como apresentado aqui, reduz o manuseamento da amostra para maximizar o número de transcritos recuperados.

Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. Estes incluem Microb Enrich, Ribo-Zero, e específicas de cada amostra h subtrativoybridizations 53 que são baseados em hibridação de oligonucleótido, e o ARNm-kit APENAS que se baseia na actividade enzimática do RNA alvo contendo uma exonuclease 'monofosfato 5. Além disso, várias abordagens para enriquecimento de mRNA, tais como o MessageAmp Kit II-Bactérias que preferencialmente polyadenylates e amplifica ARN linear também estão disponíveis. Alguns destes métodos (por exemplo, de mRNA-ONLY, Microb E Xpress eo MessageAmp) são usadas simultaneamente para máxima eficiência. No entanto, a eficácia de todas estas abordagens estão limitadas, especialmente quando se trabalha com rRNA parcialmente degradado, como frequentemente observado no ARN total extraído de amostras de FC. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser usado para gerar metatranscriptomas consistindo de ARNm tanto eucarióticas e procarióticas. Além disso, o (A) da cauda poli adicionado às sequências pode reduz a quantidade de dados de sequências úteis. Regiões com trechos homopoliméricas tendem a ter menores escores de qualidade, causing um número significativo de lê para ser filtrados por sequenciação e software de pós-sequenciamento, e a duração média de leitura útil após o corte fora de poli (A) caudas serão significativamente reduzidos em 54.

Lidar com as comunidades microbianas CF complexos e RNA parcialmente degradado (Figuras 4A e 4C), nosso estudo anterior mostrou que o método de captura de hibridização pelo kit Ouro Ribo-Zero foi mais eficaz na remoção tanto rRNA humano e microbiana em comparação com os combinam tratamentos com outros kits 9 (Tabela 3). Os dados resultantes permite a análise simultânea de ambos hospedeiro humano e transcritos microbianas. Dependendo do rendimento e qualidade do RNA, assim como a escolha final da plataforma de sequenciamento, muitos desses processos, incluindo o passo a síntese de cDNA podem ser simplificados, com geração biblioteca seqüenciamento. Por exemplo, o ARN tratado Ribo-Zero pode ser usado para fazer a sequenciação metatranscriptome libraries utilizando o kit RNA-Seq ScriptSeq Biblioteca Preparação.

Análise metagenômica de comunidades associadas a animais fornece uma representação abrangente da entidade funcional global que inclui o acolhimento e de suas comunidades associadas. O fluxo de trabalho aqui apresentado é adaptável a uma variedade de amostras associado a animais complexos, especialmente aqueles que contêm muco espesso, grandes quantidades de resíduos celulares, o DNA extracelular, proteínas e complexos de glicoproteína, bem como células hospedeiras para além do microbiano e viral desejado partículas. Mesmo que as partículas virais e microbianas podem ser perdidos a cada passo, as partículas de isolamento e purificação são essenciais para minimizar a quantidade de ADN do hospedeiro. Enquanto os dados metagenomics fornece potenciais metabólicas das comunidades examinados, metatranscriptomics complementar esta revelando a expressão diferencial de funções codificadas 9. Uma avaliação abrangente dos dados genómica e transcrições rendeu novas insireitos à dinâmica das interações com a comunidade e facilita o desenvolvimento de terapias melhorando 9,10,55.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde (1 R01 GM095384-01) atribuído à Floresta Rohwer. Agradecemos Epicentro, uma empresa Illumina para fornecer acesso antecipado a kits Ribo-Zero Epidemiologia. Agradecemos Mark Hatay para a concepção e produção do suporte de tubos de ultracentrifugação. Agradecemos Andreas Haas e Benjamin Knowles para leituras críticas e discussões sobre o manuscrito, e Lauren Paul para auxiliar o processo de filmagem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

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Comments

5 Comments

  1. Hi, when generating the microbial metagenome: are you sure you are using DNase I at 1,000 U/µl concentration?

    I think it must be 1,000 U/ml instead of 1,000 U/µl

    Thanks in advance,
    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 16, 2015 - 6:42 AM
  2. Hi Galo,

    Yes to your question. We are using extremely high concentration of the DNase I (1000U/µl) to ensure all extracellular DNA are digested while not adding too much volume to the sample. The amount of extracellular DNA in CF sputum is high. If you were to use this protocol for other samples that do not have that much extracellular DNA, you can definitely adjust the amount of DNase I. The high concentration of DNase I can be prepared from the lyophilized DNase I. The catalogue number is in the materials table.

    Please let me know if you have any other questions.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 16, 2015 - 12:53 PM
  3. In that case I think I had to use that high concentrations of DNase since, although I don't work with CF, my samples are sputum too.

    Thank you very much!

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 4:15 AM
  4. Actually I have another question I cannot answer from internet.

    Normally I use DTT in order to liquefy sputum samples. In your paper you use DTT for the viral extraction, but B-mercaptoethanol for the microbial one instead.

    I don't know if it really makes any difference or there is any reason to use one or another in microbial extracion.

    Thanks again,

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 5:47 AM
  5. Hi Galo,

    Many has tried and used DTT. Our group didn't see any differences. However, since we are modifying the protocol described by Breitenstein et al. (1995) and they used B-mercap, we decided to stick to B-mercap.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 17, 2015 - 12:46 PM

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