のライブイメージング
1Biology Department, Wesleyan University

Published 1/12/2015
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Developmental Biology

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Summary

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Hellerman, M. B., Choe, R. H., Johnson, R. I. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (95), e52120, doi:10.3791/52120 (2015).

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Abstract

ショウジョウバエの蛹の開発の固有のプロセスがシフトし、生細胞イメージングの間に追跡する個々の細胞の挙動を困難にする方法で、眼の上皮を歪めることができます。これらのプロセスとしては、網膜回転、細胞増殖と生物の動きを。蛹は、それが困難な単一の焦点面で数個眼以上の焦点の合った画像を取得するために行う、画像化のために準備されるように加え、微妙なバンプとを含む上皮のトポロジにおける不規則性はしばしば導入襞。ワークフローは、ここにショウジョウバエの蛹の眼の開発中に細胞プロセスの容易な分析を可能に救済こ ​​れらの問題を、説明した。適切ステージ蛹を簡単にほとんどの研究室で組み立てることができる撮像リグに配置されているユビキチンDEカドヘリン:GFPGMR-GAL4駆動型UAS-αカテニン:GFPを眼の上皮1のセル境界を視覚化するために使用されている-3。デコンボリューションは、された後複数の焦点面において捕捉蛍光画像に適用し、最大値投影画像は、各時点で生成され、画像編集ソフトウェアを使用して強化される。アラインメントアルゴリズムを迅速に追跡するために、個々の細胞の挙動が容易になり、余分な動きを安定化させるために使用される。

Introduction

化合物ショウジョウバエの眼は、アクセサリ色素細胞4,5のハニカム格子で区切り、その〜750個眼のステレオタイプの配置によって特徴づけられる。ローカル細胞運動、細胞増殖、細胞形状の変化、及びアポ​​トーシスこれらの色素細胞は、イベントの協調組み合わせによってパターニングされる。この上皮のライブ可視化は1つが生理学的に関連し、非摂動3次元コンテキストでこれらのイベントを支える分子機構を研究することができます。

以前のプロトコル6,7とは対照的に、ここで説明する技術は、イメージングプロセスから分離することができない無関係な組織の動きを安定化するための効率的な方法を組み込んでいる。 、成長回転し、画像化の過程でシフト組織-このメソッドは、開発ショウジョウバエの蛹のアイ上皮における細胞の挙動の研究を強化する。加えて、動き安定化技術デここにスクライブ余分な動きが発生した他のコンテキストで細胞を研究するために有用であろう。

アイ固有のドライバGMR-GAL4 1-3の制御下にGFP:GFPなどUAS-αカテニン:シ ​​ョウジョウバエ網膜のフィールドにセル境界を視覚化するために、トランスジェニックハエラインはUBI-DEカドヘリン発現する生成した。 2 GFPタグ付きの膜マーカーの使用は、より低い強度の光でセル境界の視覚化を可能にする。これは、組織の損傷を最小限に抑え、高エネルギー波長に繰り返し暴露に退色増加フレームレート、動画継続を可能にする。 RNAiの導入遺伝子の有効性を高めるために、UAS-DCR-2は、第2フライライン8に組み込まれた。

以前のプロトコルから第三の更新では、簡単にほとんどの実験室で組み立てられた単純なイメージングリグについて説明する。この装置は、特殊なイメージングrを持つ必要性をなくす大学の「機械工場 'または類似のサービスによって生成されたIG。この結像リグ画像他蛹組織9,10に用いられるものと同様である。

ここで提示直接蛹殻形成(時間APF)後〜17から42時間の眼のパターニングに寄与形態形成事象を評価するために使用できる単純な生細胞イメージングプロトコルである。具体的には、このプロトコルは、蛹の開発中に遺伝子発現を改変する結果を決定するために、1つを可能にする。

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Protocol

図3は、実験手順の概要を示しています。

1.組織調製

  1. 目的の遺伝子の改変された表現の結果を判断するには、重複して、次のクロスを設定し、25℃で維持する:UAS-導入遺伝子 (オス)X GMR-GAL4。 UAS-α-CAT:GFP、UBI-DE-CAD:GFP。 + / SM5-TM6b(処女雌)注:コントロール組織のクロスUAS-lacZをを得るためには、GMR-GAL4に雄。 UAS-α-CAT:GFP、UBI-DE-CAD:GFP女性 。 βガラクトシダーゼは、網膜内の細胞の挙動に欠陥を発生しない。
  2. RNAiの導入遺伝子の有効性を強化するために、クロスUAS-RNAiは、GMR-GAL4、UAS-DCR-2に雄。 UAS-α-CAT:GFP、UBI-DE-CAD:GFP。 + / SM5-TM6b処女雌。
    注:異所性DCR-2を発現する網膜における細胞挙動の臨時欠陥が(データは示さない)が観察されている。警戒は、このアプローチを使用している場合をお勧めします。
  3. S1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内の適切な遺伝子型と場所の白の前蛹を選出。蛹はDCR-2を発現する、男性または女性のどちらか蛹を選択した場合:UAS-DCR-2、X染色体上の挿入体の発現が、 ​​男性では強い。蛹は蛹のケースの色素沈着の前に0時間APFで性欲べきである - 男性の生殖腺は、蛹(後部から約3分の1)の側面に大きな透明地球儀として表示されます。
  4. 25℃で清潔なプラス​​チックチップ-BOXに、蛹を含むマイクロ遠心チューブをインキュベートします。先端-ボックスに、蒸留水に浸した組織の10cm 2のピース、蛹場所の乾燥を防ぐために。
    注:チップインボックス内の湿度が高くなりすぎると蛹の場合は、後の工程で解剖することがねっとりと困難になることがある。
  5. 適切な時間インキュベートする。目のパターニングに関連する細胞の挙動を取り込むには、約17時間のAPF、20時間のAPFまたは24時間のAPでイメージング用の蛹を準備F.は、特定の細胞の挙動を最もよく観測された場合にさらなる議論のための代表的な結果を参照してください。
  6. 黒シルガードの解剖皿に新鮮な両面テープの一部を置きます。両面テープ( 図1A)に付着した蛹の頭を持つ位置蛹、背側まで、.Try両面テープに蛹の胸部と腹部領域を接着するためではない。ピンセットで慎重に持ち上げて、蛹の頭部を露出させるために蓋を取り外します。片方の目の周りの領域を露出させるために蛹のケースの側面に沿って裂ける。
  7. 静かに粘着テープから蛹を削除します。蛹が付着したままの場合は、接着力を弱めるために蛹のケースとテープの間の接合部に、少量の蒸留水を適用します。

2.実装

  1. 吸い取り紙から小さな15ミリメートル2フレームを構築し、middlethatで穴を開け、直径5.5ミリメートル( 図1B)がある。蒸留水に浸し、中に配置します顕微鏡スライドの中心。 30ccのシリンジを使用して、吸い取り紙のフレームを取り囲むようにワセリンの均一なリングを絞り出す。ワセリンリングは蛹の幅よりもわずかに高く、リングの直径は、カバースリップの幅よりわずかに小さいことをことを確認してください。
  2. スライド上に直接ワセリンの小さなビーズを追加し、穴に.Carefully石油ゼリービーズ( 図1D)でサポートされて、その側面に、さなぎを手配吸い取り紙( 図1C)に打ち抜い。
  3. ワセリンリングの上にカバースリップを置きに接触眼の神経上皮( 図1D)上記上皮ようにします。穏やかワセリンに対するカバースリップを密封し蛹目領域とカバーガラスとの間の小さな平坦な接触面を生成するための準備を圧縮する。

3.蛍光イメージング

  1. 画像使い蛹準備を蛍光顕微鏡。すべての7分接着結合の領域で、眼の神経上皮の頂端ドメインを介して連続切片をキャプチャします。
    注:A)適切なシリアルのセクションでは、通常、0.2μmのZ-のステップで構成さzスタックあたり4-5である。 b)は、軽度の衝撃や折り目を含む上皮のトポロジーにおける不規則性、組織の大きな領域の焦点の合った画像を取得することが困難なことがあります。画像化しながら、一合焦であると関心領域の一部を見つけることが、隣接領域がピンボケすること。蛹の目とカバーガラスの間に蒸留水の小液滴を含めると、いくつかの急性組織襞ではなく、蛹の眼の形態形成の初期段階の穏やかに不均一なトポロジー特性を排除することができます。これらの例では合焦スライスフィールド全体について取得されるまで、zスタックを拡張することによって、組織をオーバーサンプリングする。 C)連続切片ごとに7分のキャプチャ重要なのReduずに3から4時間のライブイメージングを有効にする必要があります画像品質を損なう可能性GFPの蛍光強度のction。短い時間間隔で画像化の合計時間を減少させることができる。
  2. 3から4時間イメージングを続行します。蛹の成長と血リンパのポンプが網膜との位置を移動させるので、多くの蛍光顕微鏡で提供されていますオートフォーカスと時間関数を使用しないでください警戒再焦点ごとに14-21分を必要としている。 4時間を超えたことイメージングが遅くなったり、目の形態形成を停止することがあります。
  3. バックグラウンドを低減し、連続切片の画像のコントラストを向上させるために適切なデコンボリューションソフトウェアを使用する。各zスタックファイルの場合は、(材料の表を参照)LAS AFソフトウェアで次の手順を実行します。ツールパネルに移動し、3Dデコンボリューションを選択し、[適用]をクリックします。
  4. 各デコンボリューションスタック·ファイルの最大投影(MP)イメージの生成:ツールパネルに移動し、3D投影]を選択し、[適用]をクリックします。
    注:最大投影アルゴリズムは、均一の生成に失敗することがありますオーバーサンプリングされた組織のためのLY焦点画像。焦点外の領域を鮮鋭化するための技術は、ステップ5.2に概説されている。

4.ポスト·イメージング蛹レスキューと表現型の検証

  1. アーティファクトが導入または蛹は、撮影時に傷つけられたかどうかを検討するために、慎重にイメージング·リグから蛹​​を削除します。使用して鉗子は、カバースリップを削除し、食品のきれいなバイアルに蛹を転送する。室温または25℃で保存大人のハエが出現するまで。
  2. 慎重に大人の目の表現型を調べ、元のフライのクロスから出てくる大人のハエの目と比較する。

5.画像処理

  1. 自動画像調整:
    注:ライブショウジョウバエ組織が ​​シフトし、画像化プロセスを通して成長します。したがって、画像の中心は、ショウジョウバエ組織内の同じポイントに対応しないことが連続した時間点で収集した。加えて全体網膜ディスクは、〜21と23時間APFとの間で約30°回転します。個々の細胞の挙動を強調表示して生物成長による注意散漫を低減し、これを手動で実行することができ、各MP image.While、ここで使用される画像編集ソフトウェアを整列するプロセスを促進することができ、組み込みのアルゴリズムた( 材料の表を参照こと)。
    1. スタックにメインメニュー、オープンスクリプトおよびロード]を選択ファイルのファイルタブから。
    2. ロードレイヤーパネルにMPイメージファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。
      注:このオプションを選択した場合、ソフトウェアは、画像データを歪めるアラインメントアルゴリズムを使用してもよい。
    3. すべてのMPファイルはレイヤーペインにロードされた後は、全ての画像が最も早い時点は、層スタックの一番上になるように、時系列順になっていることを確認してください。層が正しい順序になっていない場合、それらが順序付けされるまで、それらをドラッグアンドドロップ正しく。
    4. メインメニューの[編集]タブから自動整列レイヤーを選択します。再配置を選択し、[OK]をクリックします。
    5. 自動位置合わせアルゴリズムは、関連する焦点にフレームを配向させるために失敗した場合は、移動ツールを使用してマイナーな調整を行う。
  2. コンポジットシャープ:
    注:初期MPイメージのピンボケの領域は「トリミング」LAS AFソフトウェアで対応するデコンボリューションスタックによって先鋭化することができます。スタックファイルをトリミングすると、1が手動で最大投影アルゴリズムに供されるzスタックの間隔を制限することができます。
    1. ([プロセス]タブの下)ツールパネルのクロップ機能を探します。手動で彼らが最初に焦点外の領域内にのみ接着ベルトにまたがるように最初と最後のスライスを制限する。この地域のために最適化された新しいスタックファイルを生成するために、[適用]をクリックします。
    2. TIFFファイルとしてローカルに最適化されたスタックと輸出のための新しい最大投影を生成します。
    3. 目で電子画像編集ソフトウェア(材料の表を参照)、スタックに(メインメニューの[ファイル]タブにあります)を開いているスクリプトとロード]を選択ファイル。
    4. ロードレイヤーパネルに特定の時点の初期MPイメージファイルと、ローカルに最適化されたMPファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。
    5. ペイン層内の両方の層を選択して、均一に網膜のフィールドを、合焦得自動的に二つの画像の適切な領域をマスクする(メインメニューの[編集]タブにあります)オートブレンドレイヤーを選択します。 TIFFファイルとしてこの合成画像を保存します。
    6. 繰り返しますが、すべての次善のMP画像について5.2.5を通じて5.2.1繰り返します。
  3. さらに調整:回転、トリミング、ムービーレイヤーのレベルを調整します。
    1. すべてのレイヤー選択した状態で、網膜の背腹軸が揃うように、画像を回転させるように変形ツール(編集>自由変形)を使用しますムービーフレームのy軸に。
    2. 必要であれば、所望のサイズおよび形状に視野を減らすために切り抜きツールを使用。
    3. 細胞膜と細胞体の間のコントラストを強化するために(個々のフレームの)レベル調整を使用してください。
    4. 文体の目的のために、各フレームにおける関心の点を強調するために偽色を紹介し、特定の細胞の挙動を強調する。
  4. アニメーション:映画に画像を変換する:
    1. メインメニューの、Windowsのタブからアニメーションのペインを開きます。アニメーション枠の右上隅にあるメニューからレイヤーからフレームを作成]を選択。
    2. 層は、スタックの底から始まる順番にアニメーション枠に追加されることに注意してください。フレームの順序を逆にするには、最初のフレームをすべて選択して、アニメーション枠メニューからリバースフレームを選択。
    3. フレーム親指の下にドロップダウンメニューを使用して、各フレームのフレーム遅延時間を選択ネイル。
      注:本稿の4映画1フレーム遅延は0.8秒である。
    4. メインメニュー、オープン輸出の[ファイル]タブからとビデオをレンダリングを選択します。ファイルオプションの下QuickTime書き出しを選択し、目的のビデオ形式を選択します。カスタムフレームレート設定レンダリングオプション]で、15のフレームレートを入力して、レンダリングをクリックします。

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Representative Results

蛹の目のライブイメージングは​​、神経上皮のパターニングに貢献する細胞の挙動を観察する成功した戦略である。特定のタンパク質の役割は、容易に眼の開発中のタンパク質レベルを変更する導入遺伝子を発現することによって評価することができる。このGMR-GAL4を行うために形態形成溝の背後に導入遺伝子発現を駆動するために使用される。これは最初の2幼虫齢の間、目のフィールドを確立する以前のイベントを摂動しないという利点を提供しています。さらに、多くのRNAi導入遺伝子は、効率的に(データは図示せず)は、タンパク質のレベルを低下させるかなりの時間を必要とする。したがって、GMR-GAL4ドライバーラインでのRNAi導入遺伝子を駆動することは、しばしば無傷で進めて変態時のアイディスクの第三幼虫齢眼の発達と外転が可能になり、大幅に蛹の眼の形態形成の間に、唯一の後にタンパク質レベルを低減します。幼虫の発育がしかし非常に効率的なRNAi導入遺伝子によって乱されている場合は、十字架をすることができます飛ぶ0時間のAPF、25°Cに転送導入遺伝子発現および蛹を減少させるために18℃に維持する。 RNAiの導入遺伝子発現の有効性に対処するために、転写物またはタンパク質のレベルは、標準的な技術( 例えば 、定量的-PCR、免疫蛍光、免疫ブロット法)を使用して、ステージをマッチさせた蛹に評価されるべきである。

幼虫の開発中に、それぞれの個眼の光受容体のコアは、目のディスク11の前方側に後方から移動する波として採用されている。この発達勾配は蛹の目の中に保持された。確かに、時22.5時間APF、GMR-GAL4、UAS-DCR-2のパターニングで画像化。 UAS-α-CAT:GFP、UBI-DE-CAD:GFP。 + / SM5-TM6b網膜は後部領域( 図2)において著しくより成熟した。これらの網膜の表現型が野生型ハエ菌株のものと同等であった(データは示さず)。伝統的に蛹の目の形態形成が発達時間に応じて記述されている( 例えば時間APF)。しかし、顕著に発達勾配の我々は、以下のイベントに応じて目のパターニングを記述する提案する:

1°ラッピング図2、ムービー1):最初は最大8つの細胞が直接光受容体の束に連絡した。二つのセル - 通常前部と後部の細胞は - 原色(1°S)として募集された。これら1sが急速に安定した接合を形成するために相互に接続する、光受容体の束を囲んだ。未分化interommatidial細胞(IC)は、それぞれ個眼のグループの間で無秩序な方法で横たわっていた。 1°の細胞動員に付随は、アポトーシスは12(ない映画1において注釈)前述のようにICプールの約5%を剪定。

ICのインターカレーション図2、ムービー2):各感光体の束の周りに巻き付けて密封1°Sのような、ローカルCELLの動きはそれぞれ個眼の背側と腹側にグループ化されたICを再編成。 ICは、単一の行に(通常は2)の行に複数のインターカレーション。 ICを移動させる目標位置を自信を持って大きな「細胞性の拡張」の方向突起を観察することによって、野生型組織に予測することができる。 1°細胞の増殖が伴うと思わICインターカレーション13に貢献した。多くのICは、(図示しない)二次電池(2°S)として区別するために移動します。

3°競争図2ムービー3):インターカレーションの後には、3のICは三次(3°)ニッチを占めるように競った。このダイナミックな戦いでは、細胞は頻繁に避難される前に、わずか5から10など分間3°ニッチを占めていた。最終的には単一のセルは、安定した3°ニッチを確立した。

最終的な剪定図2、ムービー4):3 3°Sと6 2°Sそれぞれの個眼の周り:アポトーシス3,15-18の急増を効率的複眼5,14間できちんとした六角形のIC格子を生成するために必要な最小限にICの数を減少させた。前述のように、通常の毛の最も近くに位置するそれらの過剰ICはアポトーシス7により除去した。我々は、ICインターカレーションおよび3°ニッチの確立と細胞死の付随を観察し、これらのイベントの効率化に貢献した過剰の細胞のものと剪定を提案する。 ICが剪定されたように加えて、毛organulesの微妙な再配置は、多くの場合、観察された。

図1
図1:蛹の解剖とイメージング(A)蓋はAの頭部を露出させるために(23時間APFでここに示されている)、ショウジョウバエの蛹から削除されますニマル。点線は両面テープの一部を表す。単純なライブイメージングリグの(B)イラスト(CおよびD)のヘッドで露光され、蛹、石油ゼリービーズ上に載って約35°に配置される。(D)ワセリンビーズの上に位置して蛹の高倍率像。カバースリップと目的の位置が(縮尺で描かれていない)が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:蛹目全体の発展の勾配。 (A)22.5時間のAPFで撮像蛹目のシングルイメージ。 GFPとαCat:接着結合は、DE-CADでラベル付けされたGFP。箱入りの領域は(C)に注釈されている。(B)は、それぞれ24及び41時間後APFでの中期段階と完全にパターン化された個眼、のイラスト。 2個の1°S(青)は、4つの錐体細胞(白​​)の中央のグループ分けを取り囲む。 interommatidial細胞(ライトグレー)のパターニングAPF 41時間が完了した場合:3 3°Sは、代替の頂点とシングル2°の形六角形の各辺を占める。スリーorganules(濃い灰色)各眼を囲む毛。(A)から、目の小領域の(C)注釈。二つの1°細胞(疑似色のライトブルーの例)は、各感光体バンドルを取り囲むように展開します。 ICの(緑、黄、赤と濃い青)単一行にインターカレーション。各代替頂点に3セルは3°ニッチ(オレンジ色)を占めるように(ピンク色で概説)競う。展開これらのイベントを観察するために作品1-4を参照してください。 このFIGURの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいE。

図3
図3:実験手順の概要は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ムービー1 :一次包装 1°の細胞を各ひな鳥眼の周囲の細胞のプールから選択される。 2 1°Sはそれぞれの個眼を包囲して接続すると、接合部は急速に(ピンクライン)を形成するアドヘレン。ストレート1°:1°細胞接合部は拡大し、1°Sは、周囲のICから光受容体の束を絶縁、成長し始める。当初は光受容体は、精巧な接着結合をマーク、明るく密集GFPグロー。形態学的には、GRAを変更二重各頂上4頂端錐体細胞の各セット間にイメージングとX字形接合の平面の下、これらの感光体接合部が明確になる個眼描く。左のオリジナル画像。右側のパネルに導入された疑似カラーリングと注釈。 21時間のAPFから撮像アイ。

ムービー2 :Interommatidial細胞intercalaction interommatidial細胞(IC)はで強調表示、赤、青、黄、2つのセルの距離によって背(上)および腹側(ボトム)眼分離象限を形成し、最初は緑。赤と黄色のICは、56分までに目標1°Sに接触して、(T = 42分から)を、それぞれ腹側と背伸ばす。青と​​緑のICは、同様に反対側の眼を標的とするように拡張する。 「新規」1°:ICの接合部は急速に横方向に展開します。 112分の時点でのICのオリジナルの象限は、GEに完全にインターカレーションがあります細胞の単一の行をnerate。左のオリジナル画像。右側のパネルに導入された疑似カラーリングと注釈。 23時間のAPFから撮像アイ。

映画3 :第三競技別の頂点2または3個の細胞で(ピンク色で概説)は3°ニッチを占めるように競争する。 「プッシュ」に登場する彼らの隣人はさておき、細胞が反対個眼に向かっ達する大規模な拡張を生成する。 3°ニッチ(オレンジ色)を占めることが多いつかの間、細胞撤回または隣人によって位置から押し出されているのいずれかです。この217分の映画の終わりまでに、多くの3度のニッチが確立されます。左のオリジナル画像。右側のパネルに導入された疑似カラーリングと注釈。 23時間のAPFから撮像アイ。

モー競う4:最終剪定毛organules近傍の細胞のアポトーシスによって除去される。例は、紫、赤、黄色と青で強調表示されます。イメージングの過程で、細胞の除去は、IC六角形の各水平アームに沿ってちょうど1 2°を残した。 ICの六角形の対角線両側の過剰細胞の剪定は、この映画の中で撮影していなかった。この遺伝子型に剛毛群の配置における小さな誤差は、多くの場合( 図2Bと比較)を観察した。 3剛毛のうちの2個は、撮像中のコーナーのニッチに操縦:再位置決め隣接するICの除去および運動によって促進されるように思われた。左のオリジナル画像。右側のパネルに導入された疑似カラーリングと注釈。 26時間のAPFから撮像アイ。

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Discussion

野生型開発(上記)の説明は、RNAiパターニングイベントまたは過剰発現遺伝子型の比較のための基礎を形成する。正確に決定する際に生きている組織の発達の比較は、細胞の挙動、目的のタンパク質によって調節される非常に貴重である。さらに、ここでは説明しない、生細胞イメージングは​​1つが、そのパターンの目のイベントに関心のある遺伝子の役割の定性的および/または定量的な説明を行うことができます。ほとんどの色素細胞APF 30-32時間では安定したポジションを獲得したし、アポトーシスは、網膜のフィールドから余分な細胞を剪定している。 1度の微妙拡大に隣接する長方形の2°のセルの幅が減少し、3°の六角形になる。■そしてこの後、唯一の微妙な変化は、色素細胞は、それらの特徴的な形状を採用することとして観察される。顔料及びレンズ材料の次の世代は、おそらく接着結合の成功したイメージングを妨げる。

ヴァルもののライブ蛹目を撮影するときuable戦略は、いくつかの落とし穴が念頭に置かれなければならない。まず、前蛹のケースを除去して取り付け、撮影時の脱水、発熱、および傷害に対して特に脆弱な動物をレンダリングします。このような侮辱は、検査中の遺伝子型に関係しない非定型組織の発生を誘導することにより、データを混乱させることができます。第二に、ここで説明するプロトコルは、カバーガラスは、蛹の頭部上皮と直接接触することが必要です。我々は、眼に対してカバースリップを押すと過剰な圧力が印加されると、網膜の開発がストールすることを観察した。実際、外来機械的な力は、組織構造19,20を含む発生プロセスに影響を与えるために他のシステムに示されている。これらの理由のために、非常に静かに眼に対してカバースリップを配置することが重要である。さらに、画像化さ蛹は、撮像リグから救出と大人として浮上させるべきである:アーティファクトは、撮影時に導入することができます多くの場合、元のクロスから年齢をマッチさせたハエの目でこれらの成人の画像化された目を比較することによって検出すること。さらに、複数の画像化セッションからのデータは、細胞の挙動を確認するために比較されなければならない。最後に、標準的な免疫蛍光ステージ整合した組織中の細胞の配置、大きさと数が同じであるかどうかを決定するために使用されるべきである。

異所性のDCR-2は、しばしば、RNAiの有効性を増強するために使用される。しかし、異所性DCR-2、ICインターカレーションの存在下で、3°ニッチおよびアポトーシスの安定化は、時々 (データは示さず)を破壊した。したがって、DCR-2の発現は、注意して使用する必要があります。

ここで説明するプロトコルは、接着結合にラベルを付け、蛹の目の中に色素細胞の形態形成を評価するため、GFPを利用しています。この戦略は、容易に( 例えば 、感光体の形態形成を評価するために)、他の目的のために変更することができる。二重標識アプローチのために、追加のUA非GFPタグと関心のある他の細胞成分( 例えば秘書小胞、小胞体、核を)ラベルS導入遺伝子は、組み込むことができる。これらの遺伝子の強度および寿命を評価が必要となるしかし:RFP、DsRedのとmCherryをし、例えば、色素細胞のパターニングを捕捉するために必要な長期間蛹眼を撮像するための貧しいラベルであることが証明された(データは示さず)。急速な細胞の挙動( 例えば、分泌)を調査する場合は、ここで説明されたプロトコルを容易に適切な蛍光タンパク質の共焦点顕微鏡検査のために変更することができる。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b  Available on request from authors
Scotch double stick tape 3M 665
Black Sylgard dissection dish Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard Dow Corning SYLG184
Sylgard (Black) Dow Corning SYLG170
Glass petri dish Corning 7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide Fisher Scientific 12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip VWR 48393-172
Forceps  Fine Science Tools 91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper Fisher Scientific 05-713-336
Vaseline Fisher Scientific 19-086-291 Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe Fisher Scientific S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software Leica Microsystems

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References

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