Live-imagerie de la
1Biology Department, Wesleyan University

Published 1/12/2015
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Developmental Biology

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Summary

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Hellerman, M. B., Choe, R. H., Johnson, R. I. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (95), e52120, doi:10.3791/52120 (2015).

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Abstract

Processus inhérents à la nymphose Drosophila peuvent changer et de fausser l'épithélium de l'oeil de manière à rendre le comportement de cellules individuelles difficiles à suivre lors de l'imagerie de cellules vivantes. Ces procédés comprennent: la rotation de la rétine, la croissance cellulaire et le mouvement organismal. En outre, des irrégularités dans la topologie de l'épithélium, y compris bosses subtiles et se replie souvent présentés comme la nymphe est préparé pour l'imagerie, font qu'il est difficile d'acquérir des images de mise au point de plus que quelques ommatidies dans un plan focal unique. Le workflow décrit ici remédie à ces questions, ce qui permet une analyse facile de processus cellulaires au cours du développement des pupes des yeux drosophile. Nymphes appropriée à étages sont disposés dans un appareil de formation d'image qui peut être facilement assemblé dans la plupart des laboratoires Ubiquitin-DE-Cadhérine. GFP et GMR-GAL4 axées sur l UAS-α-caténine: GFP sont utilisés pour visualiser les limites des cellules dans l'épithélium oculaire 1 -3. Après déconvolution estappliqué aux images fluorescentes capturées à plusieurs plans focaux, images maximales de projection sont générés pour chaque point de temps et améliorées en utilisant un logiciel de retouche d'image. Algorithmes d'alignement sont utilisés pour stabiliser rapidement le mouvement superflu, qui rend le comportement de cellules individuelles plus facile à suivre.

Introduction

Le composé de Drosophila yeux est caractérisée par la disposition de ses stéréotypé ~ 750 ommatidia séparés par un treillis en nid d'abeilles de cellules de pigment accessoire 4,5. Ces cellules pigmentaires sont modelés par une combinaison coordonnée d'événements: les mouvements de cellules locales, la croissance cellulaire, les changements dans la forme des cellules et l'apoptose. La visualisation en direct de cet épithélium permet d'étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces événements dans un contexte tridimensionnel physiologiquement pertinente et imperturbable.

Contrairement aux protocoles précédents 6,7, la technique décrite ici comprend un procédé efficace pour la stabilisation de mouvement de tissu étranger qui ne peut pas être désaccouplé du processus d'imagerie. Cette méthode améliore les études de comportement des cellules dans le développement de la drosophile épithélium pupe des yeux - un tissu qui se développe, tourne, et les changements au cours de l'imagerie. En outre, la technique de mouvement de stabilisationdécrit ici sera utile pour l'étude des cellules dans d'autres contextes où le mouvement se produit étrangère.

Pour visualiser les limites des cellules de la rétine dans le domaine de la drosophile, mouche lignes transgéniques ont été générés qui expriment ubi-DE-Cadherin: GFP ainsi que UAS-α-caténine: GFP sous le contrôle du pilote spécifique de l'oeil GMR-GAL4 3.1. L'utilisation de deux marqueurs membranaires GFP étiqueté permet la visualisation des limites des cellules à la lumière d'intensité plus faible. Cela minimise les dommages des tissus et photoblanchiment sur l'exposition répétée à des longueurs d'onde de haute énergie, permettant taux de trame augmenté et la durée du film. Pour améliorer l'efficacité de transgènes ARNi, UAS-DCR-2 a également été incorporé dans une deuxième ligne de mouche 8.

Dans une troisième mise à jour de protocoles précédents, une plate-forme d'imagerie simple qui est facile à assembler dans la plupart des laboratoires est décrite. Cet appareil permet d'éviter l'obligation d'avoir une imagerie spécialisée rig généré par 'la boutique de machine »d'une université ou d'un service similaire. Cette plate-forme d'imagerie est similaire à celle utilisée pour l'image d'autres tissus pupes 9,10.

Présenté ici est un protocole simple d'imagerie des cellules vivantes qui peut être utilisé pour évaluer directement les événements morphogénétiques qui contribuent à la structuration de l'œil de ~ 17 à 42 h après la formation du puparium (h APF). Plus précisément, ce protocole permet de déterminer les conséquences de la modification de l'expression des gènes au cours du développement de chrysalide.

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Protocol

La figure 3 montre un résumé de la procédure expérimentale.

1. Préparation des tissus

  1. Pour déterminer les conséquences de l'expression modifiée d'un gène d'intérêt, mis en place la croix suivante en double exemplaire et de maintenir à 25 ° C: UAS-transgéniques (mâles) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (Les femelles vierges) NOTE: Pour obtenir contrôle croix de tissu UAS-lacZ mâles à GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: femelles GFP. β-galactosidase génère pas de défauts dans le comportement des cellules dans la rétine.
  2. Pour améliorer l'efficacité de transgènes ARNi, croix UAS-ARNi mâles à GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b femelles vierges.
    REMARQUE: défauts occasionnels dans le comportement des cellules dans la rétine exprimant ectopique DCR-2 ont été observées (données non présentées). Vigilance est recommandé si vous utilisez cette approche.
  3. Sélus blanc pré-pupes de génotypes appropriés et dans 1,5 ml microtubes. Si les nymphes exprimer DCR-2, sélectionnez pupes soit mâle ou femelle: expression de SAMU-DCR-2, un insert sur ​​le chromosome X, est plus forte chez les hommes. Pupes devrait être sexué à 0 h APF avant la pigmentation de la coque de nymphose - les gonades mâles sont visibles grands globes translucides sur les côtés latéraux de la pupe (environ un tiers de la partie postérieure).
  4. Incuber microtubes contenant les nymphes, dans une boîte de pointe de plastique propre à 25 ° C. Pour éviter le dessèchement des pupes place un 10 cm 2 morceau de tissu, imbibé d'eau distillée, dans la boîte de pointe.
    REMARQUE: si l'humidité dans la boîte de pointe devient trop élevée, la coque de nymphose peut devenir détrempé et difficile à disséquer dans les étapes ultérieures.
  5. Incuber pendant le temps approprié. Pour capturer les comportements cellulaires associés à modeler l'œil, préparer pupes pour l'imagerie à environ 17 h APF, 20 h ou 24 h APF APF. Voir résultats représentatifs pour la discussion sur le moment où les comportements de cellules spécifiques sont mieux observées.
  6. Placez un morceau de ruban adhésif double face douce sur un plat de dissection Sylgard noir. Placer un côté nymphe, dorsale en place, avec la tête de la pupe adhéré au ruban adhésif double face (figure 1A) .Essayez ne pas adhérer thoraciques et abdominaux régions de la nymphe à l'adhésif double face. Avec des pinces soulevez délicatement et retirer l'opercule pour exposer la tête de chrysalide. Déchirez le long du côté de la coque de nymphose pour exposer la zone autour de l'œil.
  7. Retirez délicatement la nymphe du ruban adhésif. Si la nymphe reste adhérente, appliquer un petit volume d'eau distillée à la jonction entre la coque de nymphose et la bande à affaiblir l'adhérence.

2. Montage

  1. Construire un petit 15 mm 2 trame du papier buvard et percer un trou dans le middlethat est de 5,5 mm de diamètre (figure 1B). Plongez dans l'eau distillée et placer dansle centre d'une lame de microscope. En utilisant une seringue de 30 cc, presser un anneau uniforme de la gelée de pétrole pour entourer le cadre de papier buvard. Assurez-vous que la bague de gelée de pétrole est légèrement supérieure à la largeur de la nymphe et que le diamètre de l'anneau est légèrement inférieure à la largeur d'une lamelle.
  2. Ajouter une petite perle de gelée de pétrole directement sur ​​la diapositive, dans le trou percé dans le papier buvard (figure 1C) .Carefully organiser la pupe, de son côté, soutenu par le cordon de la gelée de pétrole (figure 1D).
  3. Déposer une lamelle couvre-objet au-dessus de la bague de gelée de pétrole afin qu'il entre en contact au-dessus de l'épithélium de la neuro-épithélium oculaire (figure 1D). Comprimer doucement la préparation pour sceller la lamelle contre la gelée de pétrole et de générer une petite surface de contact à plat entre la région des yeux pupe et la lamelle.

3. Fluorescence Imaging

  1. Image de la préparation de chrysalide en utilisant unmicroscope à fluorescence. Chaque 7 min capture des coupes en série par l'intermédiaire du domaine de la neuro-épithélium apical des yeux, dans la région des jonctions adhérentes.
    REMARQUE: a) les articles de série appropriés sont généralement 4-5 par z-pile composé de 0,2 um z-étapes. b) Irrégularités dans la topologie de l'épithélium, y compris des bosses et des plis légers, peuvent rendre difficile d'acquérir des images de mise au point des grandes régions de tissu. Alors que l'imagerie, on peut trouver le cadre d'une zone d'intérêt d'être mise au point, et une région voisine d'être out-of-focus. Y compris une petite goutte d'eau distillée entre l'œil et la pupe lamelle peut éliminer certains plis de tissus aigus mais pas la topologie caractéristique légèrement inégale des premières étapes de la morphogenèse des yeux chrysalide. Dans ces cas-échantillonner le tissu en étendant le z-pile de mise au point jusqu'à ce que les tranches sont acquis pour l'ensemble du domaine. c) Capture coupes en série tous les 7 min devrait permettre live-imagerie pour 3-4 heures sans un redu importantsction de l'intensité de fluorescence de GFP qui peuvent compromettre la qualité de l'image. Courts intervalles de temps peuvent réduire la durée totale de l'imagerie.
  2. Continuer imagerie pour 3-4 heures. Ne utilisez pas de mise au point automatique et la fonction de temps qui est disponible sur de nombreux microscopes à fluorescence, puisque la croissance des pupes et le pompage de l'hémolymphe déplace la position de la rétine et vigilante recentrage est nécessaire tous les 14 à 21 min. NOTE que l'imagerie delà de 4 heures peut ralentir ou bloquer la morphogenèse de l'œil.
  3. Utilisez un logiciel de déconvolution appropriée pour réduire fond et d'améliorer le contraste des images de section de série. Pour chaque fichier z-pile, procédez comme suit dans le logiciel LAS AF (voir tableau des matériaux): Allez dans le panneau Outils, sélectionnez 3D Déconvolution et cliquez sur Appliquer.
  4. Générer une image projection maximale (MP) pour chaque fichier de pile déconvolué: Allez dans le panneau Outils, sélectionnez Projection 3D et cliquez sur Appliquer.
    NOTE: L'algorithme de projection maximale peut échouer à générer un uniformely image focalisée de tissu qui a été échantillonné. Une technique pour l'affûtage des régions hors-focus est décrite dans l'étape 5.2.

4. Post-imagerie nymphe de sauvetage et de vérification phénotype

  1. Pour examiner si des artefacts ont été introduits ou la pupe lésés lors de l'imagerie, retirer délicatement la nymphe de la plate-forme d'imagerie: l'aide de pinces supprimer la lamelle et de transférer la nymphe dans un flacon propre de la nourriture. Entreposer à la température ambiante ou 25 ° C jusqu'à ce que la mouche adulte émerge.
  2. Examiner attentivement le phénotype de l'œil adulte et comparez les yeux de mouches adultes émergents de la croix de mouche d'origine.

5. Traitement d'image

  1. Alignement automatique de l'image:
    NOTE: Le tissu vivant Drosophila se déplacera et se développer tout au long du processus d'imagerie. Par conséquent, les centres d'images recueillies à des moments successifs peuvent ne pas correspondre au même point dans le tissu drosophile. En outre, ledisque entier rétinienne tourne environ 30 ° entre ~ 21 et 23 h APF. Pour mettre en évidence les comportements cellulaires individuels et réduire les distractions causées par la croissance organismal, aligner chaque image.While MP cela peut être effectué manuellement, le logiciel de retouche d'image utilisée ici (voir le tableau des matériaux) a algorithmes intégrés qui peuvent accélérer le processus.
    1. De l'onglet Fichier du menu principal, Scripts ouvertes et sélectionnez Fichiers de charge dans la pile.
    2. Importez les fichiers d'image MP dans le panneau Calques de charge et sélectionnez OK. Assurez-vous que la tentative l'option Source Images à aligner automatiquement ne est pas sélectionnée.
      NOTE: Si cette option est sélectionnée, le logiciel peut utiliser un algorithme d'alignement qui fausse les données d'image.
    3. Une fois tous les fichiers MP ont chargé dans le panneau Calques, assurez-vous que toutes les images sont dans l'ordre chronologique de telle sorte que le point de temps plus tôt est au sommet de la pile de couches. Si les couches ne sont pas dans le bon ordre, faites glisser et déposez-les jusqu'à ce qu'ils soient commandéscorrectement.
    4. Sélectionnez Alignement automatique des calques dans l'onglet Modifier du menu principal. Choisissez Repositionner et cliquez sur OK.
    5. Si l'algorithme Auto-Align ne parvient pas à orienter les cadres à un point focal pertinent, faire des ajustements mineurs à l'aide de l'outil Déplacer.
  2. Affûtage Composite:
    REMARQUE: les régions hors de mise au point d'une image initiale de MP peuvent être affûtées par «culture» de la pile déconvolué correspondant dans le logiciel LAS AF. Rognage d'un fichier de pile permet de restreindre manuellement l'intervalle d'une pile-z qui est soumise à l'algorithme de projection maximum.
    1. Recherchez la fonction de la culture dans le panneau Outils (sous l'onglet Processus). Restreindre manuellement les tranches initiales et finales de telle sorte qu'ils se étendent seulement la courroie d'adhérence dans la région initialement hors-foyer. Cliquez sur Appliquer pour générer un nouveau fichier de pile qui est optimisé pour cette région.
    2. Générer une nouvelle projection maximale de la pile optimisé localement et l'exportation sous forme de fichier TIFF.
    3. En ee logiciel de retouche d'image (voir le tableau des matériaux), des scripts ouverts (située dans l'onglet Fichier du menu principal) et sélectionnez Charger des fichiers dans la pile.
    4. Importez le fichier d'image de député initiale et fichier MP optimisée localement pour un point de temps particulier dans le panneau Calques de charge et sélectionnez OK. Assurez-vous que la tentative l'option Source Images à aligner automatiquement ne est pas sélectionnée.
    5. Sélectionnez les deux couches dans les couches volet puis choisissez Fusion automatique des calques (situé dans l'onglet Modifier du menu principal) pour masquer automatiquement les régions appropriées des deux images, ce qui donne un uniforme de mise au point de la rétine domaine. Enregistrer l'image composite d'un fichier TIFF.
    6. Répétez les étapes 5.2.1 à travers 5.2.5 pour toutes les images MP sous-optimales.
  3. Corrections supplémentaires: rotation, recadrage, et ajustez les niveaux des couches film:
    1. Avec toutes les couches sélectionné, utilisez l'outil Transformation (Edition> Transformation) pour faire pivoter les images de sorte que l'axe dorso-ventrale de la rétine est alignéà l'axe Y du cadre du film.
    2. Si nécessaire, utilisez l'outil Recadrage de réduire le champ de vision d'une taille et la forme souhaitées.
    3. Utilisation ajustement de niveau (de trames individuelles) pour aider à améliorer le contraste entre la membrane cellulaire et le corps de la cellule.
    4. Pour des raisons de style et de souligner les comportements de cellules spécifiques, introduire des fausses couleurs pour souligner les points d'intérêt dans chaque trame.
  4. Animation: convertir les images dans un film:
    1. Ouvrez le volet de l'animation dans l'onglet Windows du menu principal. Sélectionnez faire des cadres à partir de couches dans le menu situé dans le coin supérieur droit de la fenêtre d'animation.
    2. On notera que les couches sont ajoutés à la sous-fenêtre d'animation dans un ordre séquentiel en commençant par le bas de la pile. Pour inverser l'ordre des images, sélectionnez d'abord tous les cadres et sélectionnez Inverser les images dans le menu Animation volet-là.
    3. Sélectionnez un temps de retard de trame pour chaque trame en utilisant le menu déroulant ci-dessous le cadre pouceongle.
      NOTE: Le retard de trame pour Films 1-4 présentée dans cet article est de 0,8 sec.
    4. De l'onglet Fichier du menu principal, ouvert Exporter et sélectionnez Rendu vidéo. Choisissez exportation QuickTime sous Options de fichier et sélectionnez un format vidéo de votre choix. Sous Options de rendu mis Frame Rate Personnalisé, entrez un taux de 15 de trame, et cliquez sur Rendu.

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Representative Results

Live-imagerie de l'oeil pupe est une stratégie efficace pour observer les comportements de cellules qui contribuent à la structuration de la neuroépithélium. Le rôle des protéines spécifiques peut être aisément évaluée par expression de transgènes qui modifient les taux de protéines au cours du développement de l'œil. Pour ce faire, GMR-GAL4 est utilisé pour diriger l'expression du transgène derrière le sillon morphogénétique. Ceci offre l'avantage de ne pas perturber les événements antérieurs qui établissent le domaine de l'oeil pendant les deux premiers stades larvaires. En outre, de nombreux transgènes ARNi exige beaucoup de temps pour réduire efficacement les niveaux de protéines (données maintenant présentées). Ainsi conduite transgènes ARNi avec la ligne de pilote GMR-GAL4 permet souvent troisième stade de développement des larves et des yeux retournement des disques oculaires pendant la métamorphose de procéder indemne et réduit de manière significative les niveaux de protéines que plus tard, au cours de la morphogenèse des yeux chrysalide. Si le développement des larves est cependant perturbée par un transgène ARNi très efficace, peut voler croixêtre maintenue à 18 ° C pour réduire l'expression du transgène et des nymphes transféré à 25 ° C à 0 h CSA. Pour faire face à l'efficacité de l'expression du transgène, la transcription ou protéines niveaux ARNi devrait être appréciée en pupes étape appariés en utilisant des techniques standard (par exemple quantitative-PCR, immunofluorescence, immunotransfert).

Au cours du développement des larves, les noyaux de photorécepteurs de chaque ommatidie sont recrutés comme une onde qui se propage à partir de la partie postérieure de la face antérieure du disque 11 de l'oeil. Ce gradient de développement a été retenue dans l'œil de chrysalide. En effet, quand imagés à 22,5 h APF, structuration de GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b rétines était nettement plus mature dans la région postérieure (Figure 2). Le phénotype de ces rétines était comparable à celle des souches de mouches de type sauvage (données non présentées). Traditionnellement morphogenèse oculaire pupe est décrit selon le temps de développement (par exemple,h APF). Toutefois, en raison du gradient prononcé de développement, nous proposons de décrire un motif oculaire selon l'une des événements suivants:

1 ° emballage (Figure 2 et Movie 1): Initialement jusqu'à huit cellules directement contacté les faisceaux de photorécepteurs. Deux cellules - habituellement dans les cellules antérieures et postérieures - ont été recrutés comme primaires (1 ° S). Ces 1s encerclés rapidement les faisceaux de photorécepteurs, la connexion à l'autre pour former des jonctions stables. Cellules indifférenciées interommatidial (CI) pondent de manière désorganisée entre chaque groupement ommatidial. Concomitant avec le recrutement des cellules 1 °, apoptose taillé environ 5% de la piscine IC comme décrit précédemment (non annotée dans Movie 1) 12.

IC intercalation (Figure 2 et Movie 2): Comme les 1 ° s emballés et scellés sur chaque faisceau de photorécepteur, CE localemouvements ll réorganisés les circuits regroupés aux dorsales et ventrales côtés de chaque ommatidie. Les CI intercalés à partir de plusieurs (généralement deux) lignes dans une seule rangée. La position cible de circuits intégrés mobiles pourrait être prédit avec assurance dans le tissu de type sauvage en observant la projection directionnelle de grandes extensions «cellulaires». La croissance des cellules 1 ° accompagné et a probablement contribué à IC 13 intercalation. De nombreux circuits iront à différencier comme des cellules secondaires (2 ° de s) (non représenté).

3 ° la concurrence (Figure 2 et Movie 3): Après l'intercalation, trois circuits a participé à occuper le (3 °) niche tertiaire. Dans cette bataille dynamique, cellules souvent occupé la niche 3 ° pour aussi peu que 5 à 10 minutes avant d'être déplacées. Finalement, une seule cellule établi une écurie 3 ° niche.

La taille finale (Figure 2 et Movie 4): Une hausse de l'apoptose 3,15-18 réduit le nombre de circuits au minimum requis pour générer efficacement un réseau hexagonal IC soignée dans l'œil composé 5,14: trois 3 ° s 2 et six ° s autour de chaque ommatidie. Comme indiqué précédemment, généralement ces circuits en excès se trouvant la plus proche des poils ont été éliminées par apoptose 7. Nous avons observé la mort cellulaire concomitante avec IC intercalation et 3 ° niche établissement et proposons que la taille des cellules excédentaires contribué à l'efficacité de ces événements. En outre, subtile re-positionnement de organules de poils a été souvent observé que des circuits intégrés ont été élagués.

Figure 1
Figure 1:. Nymphe dissection et imagerie (A) L'opercule est retiré d'une nymphe drosophile (ici à 23 h APF) pour exposer la tête de l'unNimal. La ligne pointillée représente un morceau de ruban adhésif double face. (B) Illustration du gréement simple live-imagerie. (C et D) Avec tête exposée, la pupe est positionné à environ 35 ° reposant sur ​​le cordon de la gelée de pétrole. (D) d'agrandissement d'image supérieur d'une pupe positionné au sommet de la perle de la gelée de pétrole. La position de la lamelle et l'objectif sont illustrés (non dessinée à l'échelle). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Un gradient de développement à travers l'œil de chrysalide. (A) Une seule image d'un oeil pupe imagé à 22,5 h APF. jonctions adhérentes sont étiquetés par DE-Cad: GFP et αCat: GFP. Région encadrée est annoté (C). (B) Illustrations de mi-étape et ommatidies entièrement modelé, à 24 et 41 h respectivement APF. Deux ° s 1 (bleu) encerclent un groupe central de quatre cellules de cône (blanc). De 41 h APF la structuration des cellules interommatidial (lumière gris) est complète: trois 3 ° s occupent sommets suppléants et un 2 ° formes simples de chaque côté de l'hexagone. Trois poils organules (gris foncé) entourent chaque ommatidie. (C) Annotation d'une petite région de l'œil (de A). Deux ° 1 cellules (exemples bleu clair pseudo-couleur) Développer pour encercler chaque faisceau de photorécepteur. CI (vert, jaune, rouge et bleu foncé) se intercalent en lignes simples. A chaque sommet alternatif trois cellules concurrence (décrite dans le rose) d'occuper la niche 3 ° (de couleur orange). Voir Films 1-4 pour observer ces événements qui se déroulent. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Résumé de la procédure expérimentale Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1 :. emballage primaire 1 ° cellules sont choisis dans le pool de cellules entourant chaque ommatidie naissante. Comme deux 1 ° s encerclent chaque ommatidie et se connectent, jonctions adhérentes forment rapidement (lignes roses). Les droites 1 °: 1 ° jonctions cellulaires dilatent et 1 ° s commencent à se développer, faisceaux de photorécepteurs isolant des circuits environnants. Initialement, les photorécepteurs brillent, GFP dense marquage jonctions adhérentes élaborés. Changements morphologiques gratirer doublement ces jonctions photoréceptrices dessous du plan de l'imagerie et les jonctions en forme de X entre chaque série de quatre cellules de cône apical sommet de chaque ommatidie deviendra plus clair. Les images originales sur gauche; pseudo-colorant et annotations introduites dans les panneaux sur la droite. Eye imagée de 21 h APF.

Film 2 :. intercalaction cellulaire Interommatidial Les cellules interommatidial (CI) a souligné en rouge, bleu, jaune et vert d'abord former un quadrant séparer une dorsale (haut) et ventrale (en bas) ommatidie par une distance de deux cellules. Les CI rouges et jaunes se étendent ventrale et dorsale, respectivement (de t = 42 min), la prise de contact avec la cible 1 ° s de 56 min. Les CI bleus et verts se étendent de façon similaire à cibler ommatidie contraire. «Nouvelles» 1 °: jonctions IC développer rapidement latéralement. A 112 minutes, le quadrant initial de CI a entièrement intercalé à generate une seule rangée de cellules. Les images originales sur gauche; pseudo-colorant et annotations introduites dans les panneaux sur la droite. Eye imagée de 23 h APF.

Film 3 :. concurrence tertiaire Au suppléants sommets deux ou trois cellules (décrite dans le rose) en concurrence pour occuper le créneau 3 °. Apparaissant à «pousser» leurs voisins côté, les cellules génèrent de grandes extensions qui atteignent vers ommatidies contraire. Occupant le créneau 3 ° (de couleur orange) est souvent éphémère et cellules soit rétracter ou sont poussés hors de position par leurs voisins. A la fin de ce film de 217 min, de nombreux 3 ° niches apparaissent établies. Les images originales sur gauche; pseudo-colorant et annotations introduites dans les panneaux sur la droite. Eye imagée de 23 h APF.

Mo4 vie. La taille finale des cellules au voisinage de organules de poils sont éliminés par apoptose. Des exemples sont mis en évidence en violet, rouge, jaune et bleu. Au cours de l'imagerie, l'élimination des cellules à gauche juste une 2 ° le long de chaque bras horizontal de l'hexagone IC. L'élagage des cellules excédentaires sur les côtés en diagonale de l'hexagone IC n'a pas été capturé dans ce film. Dans ce génotype erreurs mineures dans la mise en place de groupes de soies ont été souvent observées (comparer avec la figure 2B). Deux des trois groupes de poils manoeuvrés dans des niches d'angle lors de l'imagerie: repositionnement semblait être facilitée par l'élimination et le mouvement de circuits intégrés voisins. Les images originales sur gauche; pseudo-colorant et annotations introduites dans les panneaux sur la droite. Eye imagée de 26 h APF.

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Discussion

La description du développement de type sauvage (ci-dessus) constitue la base pour les comparaisons d'événements de structuration dans ARNi ou des génotypes de surexpression. Les comparaisons de développement direct de tissu sont très précieux pour déterminer précisément quels comportements cellulaires sont réglementés par une protéine d'intérêt. En outre, et non décrit ici, imagerie des cellules vivantes permet de faire une des descriptions qualitatives et / ou quantitatives sur le rôle d'un gène d'intérêt dans les événements qui modèle l'œil. En 30-32 heures APF plupart des cellules pigmentaires ont acquis des positions stables et l'apoptose a élagué les cellules excédentaires du champ de la rétine. Suite à cela, seuls des changements subtils sont observés que les cellules pigmentaires adoptent leurs formes caractéristiques: 3 ° S Devenez hexagonale et, comme une ° s élargir subtilement, la largeur des deux cellules rectangulaires ° voisins diminue. Génération suivante de pigment et matériau de la lentille entrave susceptible imagerie réussie de jonctions adhérentes.

Bien qu'un valuable stratégie, plusieurs pièges doit garder à l'esprit lors de l'imagerie de l'œil pupe en direct. Tout d'abord, enlever la coque de nymphose antérieure rend l'animal particulièrement vulnérables à la déshydratation, une surchauffe, et des blessures lors du montage et de l'imagerie. Insultes tels que ceux-ci peuvent confondre les données en induisant le développement du tissu atypique qui ne est pas pertinent pour le génotype en cours d'examen. Deuxièmement, le protocole décrit ici nécessite qu'une lamelle de verre en contact direct avec la tête épithélium chrysalide. Nous avons observé que le développement de la rétine cale si la pression excessive est appliquée lorsque l'on pousse la lamelle contre l'oeil. En effet exogène forces mécaniques ont été représentés aux autres systèmes pour influencer les processus de développement, y compris l'architecture tissulaire 19,20. Pour ces raisons, il est important de placer très doucement la lamelle contre l'oeil. En outre, les pupes imagé devrait être sauvé de la plate-forme d'imagerie et a permis d'émerger comme les adultes: les artefacts introduits lors de l'imagerie peutsouvent être détecté en comparant l'oeil imagé de ces adultes avec des yeux d'âge comparable mouches de la croix originale. En outre, les données de plusieurs séances d'imagerie doivent être comparés à vérifier comportements cellulaires. Enfin, immunofluorescence standard doit être utilisé pour déterminer si l'accord, la taille et le nombre de cellules dans les tissus de la scène appariés sont les mêmes.

Ectopique DCR-2 est fréquemment utilisé pour améliorer l'efficacité de l'ARNi. Cependant, en présence d'extra-utérine DCR-2, IC intercalation, la stabilisation de la niche et l'apoptose ont été occasionnellement 3 ° perturbé (données non présentées). Ainsi DCR-2 expression doit être utilisé avec prudence.

Le protocole décrit ici utilise GFP à l'étiquette jonctions adhérentes et d'évaluer la morphogenèse des cellules pigmentaires dans l'œil de chrysalide. Cette stratégie pourrait facilement être modifié à d'autres fins (par exemple pour évaluer photorécepteur morphogenèse). Pour une approche double étiquetage, UC supplémentairesTransgènes S qui étiquettent autres composants cellulaires d'intérêt (par exemple, des vésicules de secrétaire, réticulum endoplasmique, noyau) avec des balises non-GFP pourraient être incorporées. Cependant l'intensité et de la longévité de ces transgènes nécessiteront évaluation: DP, DsRed et mCherry, par exemple, se sont révélés être des étiquettes pauvres pour l'imagerie de l'oeil pupal pour les périodes prolongées requises pour capturer un patron de cellules de pigment (données non présentées). Si l'enquête comportements cellulaires rapides (par exemple de sécrétion) le protocole décrit ici pourrait facilement être modifiée pour la microscopie confocale de protéines fluorescentes appropriées.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b  Available on request from authors
Scotch double stick tape 3M 665
Black Sylgard dissection dish Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard Dow Corning SYLG184
Sylgard (Black) Dow Corning SYLG170
Glass petri dish Corning 7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide Fisher Scientific 12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip VWR 48393-172
Forceps  Fine Science Tools 91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper Fisher Scientific 05-713-336
Vaseline Fisher Scientific 19-086-291 Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe Fisher Scientific S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software Leica Microsystems

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References

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