Author Produced

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. J. Vis. Exp. (91), e52138, doi:10.3791/52138 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikrotubul (MT) artı-son-izleme proteinler (+ TIPler) MTS büyüyen artı uçlarına lokalize ve MT dinamiklerini 1,2 düzenler. MT dinamiklerini analiz etmek için en iyi bilinen ve + yaygın kullanılan ipuçları biri büyüyen tüm MT artı uçları bağlanır Sonu Binding Protein, EB1, ve böylece, MT polimerizasyonu 1 için bir göstergedir. Büyüme konilerinin içindeki EB1 davranışı bir çok çalışmalar bireysel MTlerin 1-3 analiz zaman tüketen ve önyargılı bilgisayar destekli, el-izleme yöntemlerini kullandık. Bizim yaklaşımımız, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin satın Aşağıdaki yazılım paketi, plusTipTracker kullanarak 4 MT dinamikleri küresel parametrelerini ölçmek için olduğunu. Bu yazılım floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz birleştiren bir MATLAB tabanlı, açık kaynak, kullanıcı-dostu paketidir. Burada, biz plusTipT kullanmak için protokol mevcutkültürlü Xenopus laevis büyüme konisi floresan etiketli + TIP kuyrukluyıldızların analizi için racker. Bununla birlikte, bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamiğini karakterize etmek için kullanılabilir.

Introduction

Bu yöntemin amacı, kantitatif mikrotübül (MT) ile ilgili bilgi, artı sona izleme proteini (+ uç) büyüme konileri canlı dinamikleri elde etmektir. MT + ipuçları MTS 9,10 artı uçları lokalize bir protein grubudur. Onlar polimerizasyon, felakete ve kurtarma oranları dahil olmak üzere MT dinamik istikrarsızlık 11, parametrelerini düzenlemek için fonksiyonları bir dizi yapmak. MT dinamiklerini analiz etmek için bir iyi kullanılan bir yöntem büyüyen MT spesifik olarak bağlanan artı-biter 1,12 + TIP EB1, davranışlarını takip etmektir. EB1 büyüyen MT birkaç diğer proteinleri işe bilinen artı-biter MT büyüme ve afet frekansı 15,16 hem teşvik, 13,14, ve son zamanlarda MT olgunlaşma faktörü 15 olarak kurulmuştur edilir.

Büyüme konilerinin içindeki MT dinamikleri pek çok çalışma EB1 localizati gibi, zaman içinde 1-3 EB1-GFP dinamikleri değişiklikleri ölçmek için el-izleme yöntemlerini kullanmışlardırMT ile artı uçları MT polimerizasyonu için bir markör olarak kullanılabilir. MT büyüme için bir vekil olarak EB1-GFP kuyrukluyıldızların incelenmesi için bir anahtar yararı MT dinamikleri bile önemli MT örtüşme bölgelerinde ölçülebilir olmasıdır. El-izleme EB1-GFP kuyrukluyıldızların yöntemi MT yararlı açılımlar sağlamıştır iken, zaman alıcı ve önyargılı olabilir, 1-3 davranışları. Önemli bilgileri kaçırabilir Ayrıca, anormal büyüme gibi koni davranışlar olasılıkla (el-izleme olduğunda genellikle gerekli) MTS sadece küçük bir alt kümesini analiz sitosköletal dinamikleri dakika vardiya, sonucudur.

Böylece, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin kazanılmasından sonra, yazılım paketi, plusTipTracker 4 kullanarak küresel MT dinamiği parametreleri ölçmek. Danuser Lab geliştirilen bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamikleri karakterize çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu, bize bir açık-kaynaker-dostu, floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz içerir MATLAB tabanlı bir paket. MT dinamikleri belirli parametreler bu yazılım tarafından hesaplanan uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, en yararlı parametreler (mikron / dakika) MT büyüme izleme hızı vardır, büyüme parça (saniye olarak) ömür boyu, ve (mikron) büyüme hat uzunluğu. Yazılım ("Software" altında) Danuser Lab web sitesinden doğrudan indirilebilir. Danuser Lab şu anda orijinal, stand-alone yazılım mevcut kalacak bir yazılım paketi olarak adlandırılan u-track 2.0, içine dahil edilmiştir + TIP izleme analizi için yeni bir arabirimi destekler iken. İki program arasındaki temel algoritmalar arayüzü ve analiz çıkışların tek bir farkla, (en azından 2014 gibi) aynıdır. Biraz MATLAB ve / veya hesaplama analizleri tecrübeleri acemi kullanıcı içinence, plusTipTracker otomatik istatistiksel parametre çıkışlar dahil olmak üzere daha kullanıcı dostu özelliklere sahiptir.

Burada, biz kültürlü Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri görüntüleri analiz etmek için adımları açıklar. Bu protokol MT dinamikleri 17 inceleyen bir son kağıt kullanılmıştır. Ayrıca Lowery ve ark bakın. 2.012 5 EB1-GFP ifade kültürleme büyüme konileri ilişkin ayrıntılı talimatlar için. Bu kağıt öncelikle büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri incelenerek odaklanırken, aynı protokol diğer hücre tipleri 17 için kullanılabilir. Tüm hücre tipleri için, çerçeveler arasındaki zaman aralığının en uygun + TIP takip 0.5-2 saniye arasında olmalıdır. Çerçeveler arasındaki kadar 4 saniyelik bir zaman aralığı mümkündür, ancak bu ek izleme hataları zaman aralığı sonuçları artmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol ve video daha ayrıntılı 4 yazılım paketi açıklayan orijinal kağıda bir arkadaşı, yanı sıra Danuser Lab web sitesinde yazılım indirme ile birlikte Teknik Rapor olarak hizmet içindir. Okuyucular yazılımını kullanarak ilgili ek sorular varsa dikkatle bu belgeleri inceleyecek teşvik edilmektedir.

1. öncesinde Görüntü Analizi

  1. TIFF (Tagged Image File Format) görüntü dosyaları bir dizi halinde her zaman atlamalı film dönüştürün. Birden fazla büyüme konileri / hücreleri belirli bir film varsa, ilk hasat her büyüme konisinin / hücre kendi resim dizisini oluşturmak için.
    Not: Bu gerekli değildir, her bölge-faiz (ROI) plusTipTracker içinde seçilebilir gibi. Ancak, daha küçük görüntü boyutlarını kullanarak hesaplama işleme hızını artırır, böylece görüntüde belirgin boşluk varsa, bu adım önerilir.
  2. Kendi her TIFF serisi kaydetMATLAB erişmek için ayarlanmış bir yol içindeki "resim" olarak adlandırılan klasör ("images" harf duyarlı olduğunu unutmayın). "Geçerli Klasör" penceresinde ilgili dosya dizini, yeni bir yol eklemek gezinmek için, dizin simgesine sağ tıklayın ve "Yol Ekle - Seçilmiş Klasörler ve Alt-Klasörler" seçeneğini seçin. Bu plusTipTracker yazılım klasörü yanı sıra, Path ilave edilmesi önemlidir.

2. plusTipGetTracks

Not: görüntü analizinde ilk adım, EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve mikrotübül dinamikleri parametrelerinin belirlenmesidir. Bu komut "plusTipGetTracks" 4 ile elde edilir.

  1. Analizi, açık MATLAB uygulamaya başlamak ve komut penceresi içine "plusTipGetTracks" yazın. Bu yeni bir iletişim kutusu görünmesine neden olur.
  2. "Up Yeni Projeler Set" üzerine tıklayın ve bir (veya mor seçine) Uygun "görüntüleri" klasörünü (veya "görüntü" klasörler) içeren dizinleri seçerek önceki TIFF görüntü serisi. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, bir dosya dizin (roi_1) ("resimler" tutan aynı klasörde) oluşturulur gelecekteki veri dosyalarını içerecek. Not: "Set Up Yeni Projeler" adım, ayrı bir oturum sırasında, vaktinden tamamlanabilir.
  3. "Son nokta üzerinde sağ tıklayın, bir çokgen seçin ve 'Mask oluşturun' üzerine tıklayın": Yeni bir pencere açılacaktır. "Tamam" düğmesine tıklayın. Seçilen görüntü serisinin ilk görüntü ekrana gelecektir. Tıklayın ve büyüme konisinin bütününü kapsayan bir çokgen oluşturmak için fareyi kullanın. Çift poligonu kapatmak için fareyi tıklayın.
  4. Poligon kapatıldı edildikten sonra, bir iletişim kutusu belirir: "Başka bir ROI seçmek istiyor musunuz?" Görüntü "Evet" seçeneğini analiz için başka bir büyüme konisi varsa; aksi halde sseçilen "Hayır".
  5. Hemen analiz edilecek projeleri seçin. "Projeleri Seç" tıklayın ve analiz etmek klasörü (roi_X) seçin.
  6. Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol tarafında proje (ler) seçin ve ekranın sağ tarafında bunları üzerinde taşımak. "Tamam" düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve "Kaydet" butonuna tıklayın için bir konum seçin.
  7. "Algılama", "İzleme" ve "Post-Processing" seçeneğini seçin. Bu seçimler yapıldıktan sonra, iletişim kutusunun sağ tarafında yapılandırılabilir olacak. Her seçeneği yapılandırın.
    1. Bu parametreler MT parça halinde tespit kuyruklu yıldızlar bağlamak için kullanılır. Takibi için bu kontrol parametrelerini seçmek için Ayrıntıları sayfalarında yazılım paketi indir eşlik Teknik Rapor PDF 9-10 dahil edilir; problemlerle karşılaşıldığında dikkatli eğer bu raporu okudum. EB1 Xenop olarak GFP kuyrukluyıldızları izleme amaçları içinBizi büyüme konileri, kullanmak laevis'den aşağıdaki Takip Ayarlar: Arama Radius Aralığı (piksel) 5-12, Minimum Alt Parça Uzunluğu (kare) 3; Maksimum Boşluk Uzunluğu (kare) 8; Maksimum Çekme Faktörü 0.8, Max açısı İleri 50, Max açı Geriye 10, dalgalanma Radius 2.5. Bu ayarlar, Şekil 1 'de gösterilmektedir.

    Not: Max Küçülme Factor "geri boşluklar" olarak tespit "geri boşluklar" sayısını azaltmak için ayarlanır parça bağlantılarda kalabalık koşulları ve olası hataları verilen, büyüme konilerinin bağlamında analiz etmek yararlı değildir. Büyüme konisi MTS büyümeleri ve çekinti ilave olarak, sık sık küçük translokasyon sergilemektedir ve bu kontrol ayarları artan bağlanma adımı sırasında bu artan hareket etmesini sağlar Buna ek olarak, her iki Çok İleri açı olarak Dalgalanma yarıçapı nispeten yüksek bir değere ayarlanmaktadır.
    1. İstediğiniz belirli görüntü alma ayarlarına bağlı Post-Processing Ayarlar doldurun.
    </ Li>
  8. Ayarları düzenlendikten sonra, "Başlat" üzerine tıklayın. Yazılım seçilmiştir hangisi ayarları çalışacaktır. Bu seçilen projeler ve bunların boyutları sayısına bağlı olarak, saat dakika sürebilir. Komutanlığı Pencere her fonksiyon için kalan tahmini süresini gösterir. PlusTipGetTracks adım tamamlandığında, Command Window "bitirdi!" Görüntüleyecektir
    Not: mikron (MT dinamikleri belirli parametreleri artık bu yazılım tarafından hesaplanmıştır uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, incelemek için en yararlı parametreler MT büyüme izleme hızı vardır / dakika), saniyede büyüme parça ömrü (), ve mikron büyüme hat uzunluğu ().

3. plusTipSeeTracks

Not: Şimdi mikrotübül parçaları tanımlanmış olduğundan, fonksiyon "plustipSeeTracks" iz görselleştirme 4 için kullanılır. Bu fonksiyon,mekansal MT dinamikleri haritalar ve hız filmler dahil görselleştirme için çoklu çıktıları sağlar, ancak burada, odak büyüme konisinin resimlerin üzerine bindirilir MT parçalarını göstermek için "Track Filmler" kullanarak yanlızca yapabilirsiniz. PlusTipGetTracks bir anda birden fazla film analiz ederken, plusTipSeeTracks bir seferde sadece tek bir film analiz edebilirsiniz.

  1. Komut penceresine "plusTipSeeTracks" yazın.
  2. Iletişim kutusu yüklendikten sonra, "Select Project" üzerine tıklayın. Görselleştirmek ve "Klasörü Seç" butonuna tıklayın projeyi içeren ana dizini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır: "görselleştirmek istediğiniz projeyi seçin". Görselleştirmek ve "Tamam" tıklayın dosyayı seçin.
  3. Sonra, "Select Kayıtlı ROI" üzerine tıklayın. Önceki adımda seçilen biri olarak aynı roi_X klasöre gidin ve "roiYX" adlı dosyayı seçin.
  4. W belirtmek için "Çıkış Dizin Seç" tıklayınBurada MATLAB parça görselleştirme dosyaları kaydeder. Not: Biz verilerin geri kalanını içeren aynı klasörü kullanmanızı öneririz.
  5. Seç "Parça Film Yap" ve ekran + TIP kuyruklu hesaplanan parça plusTipGetTracks tüm görüntüleyen görünecektir. Bu adım dosyasındaki "allTracks_X_X_X" in, bir film formatında izlenen zaman serisi kaydeder. Bir AVI olarak film kaydetmek için bir seçenek aksi varsayılan biçim bir Quicktime.mov dosyası olarak, orada.

4. plusTipGroupAnalysis

Not: Bu son fonksiyon analizi ve MT yol parametrelerinin karşılaştırılması için filmler grupları oluşturmak için kullanılır.

  1. Komut penceresine "plusTipGroupAnalysis" yazın. Elle karşılaştırmak için gruplarını seçmek için, ilk "hiyerarşi Auto grubu" de-seçin. Sonra, "Select projeler" üzerine tıklayın. Tüm roi_X klasörleri içeren ana dizinleri gidinanaliz etmek.
  2. Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol taraftan gruplar içerir ve ekranın sağ tarafına onları taşımak için tüm projelerinin seçin. "Tamam" düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve "Kaydet" butonuna tıklayın için bir konum seçin.
  3. Bir pencere çıkacaktır: "listeden birinci grubu seçiniz". "Tamam" düğmesine tıklayın. ListSelectGUI penceresi tekrar gösterecektir. Bu kez, bir araya toplanmış olmalıdır ilk gruba karşılık sadece bu dosyaları seçin. "Tamam" düğmesine tıklayın.
  4. Ardından, grup adını girin ve "Tamam" düğmesine tıklayın. Buna göre cevap ve grupları seçmeye devam "başka bir grup seçin?": Bir pencere açılacaktır. Bir pencere çıkacaktır: "grup listesini kaydetmek için bir konum seçin". Konuma gidin ve "Kaydet" butonuna tıklayın.
  5. Çıkış klasörler nerede olacak seçmek için "Select Output Directory" üzerine tıklayınsaklanır.
  6. Yapmak için grup analizi hangi tür seçin - MT parça yapılmalıdır her grup veya hücre analizi başına toplanmış olup olmadığını. Önerilen istatistiksel testler zaten belirlenir. Analizinde tüm parçaları dahil etmek de-seçin "filminin başında / sonunda parça çıkarın". Aksi halde, seçilen bu kutuyu sahip film başladığı ve bittiği gibi sürecinde herhangi MT büyüme şarkıları kaldırır.
  7. Grup Analizi Seçim yapıldıktan sonra, "gruplarını karşılaştırma" seçeneğini seçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada anlatılan canlı hücrelerin + TIP dinamiklerini ölçmek birkaç bilgi dosyaları sağlayacak bu yazılımı kullanarak.

Bu fonksiyon plusTipGetTracks (Şekil 1 'de gösterilen örnek ayarlar kullanılarak) parçaları tanımlar ve ardından + TIP parçaları ile ilgili parametreleri içerir. Yazılım elde ettiği bilgileri görüntülemek için, adım 2.2 oluşturulan roi_X dizine gidin. "Ustalık" klasörü tespit kuyrukluyıldızların gösteren görüntülerin bir dizi olan, "overlayImages" içerir. Kuyruklu algılama doğruluğunu gösterebilen görüntü analiz yazılımı kullanarak bu görüntüleri incelenmesi. "Meta" klasörünün de detaylı "projData" dosyası dahil + TIP kuyrukluyıldız istatistiklerine ilişkin bilgiler, yanı sıra "İstatistikler" dosyasını içerir. "Stats" dosyasını görüntülemek için, bir elektronik tablo uygulaması açık bir çalışma içine sürükleyin. Bu dosya hesaplamak içeriyorHer film (Şekil 2) d mikrotübül parametreleri. Yukarıda belirtildiği gibi, MT dinamikleri spesifik parametrelerle uzun bir liste MT büyüme iz hızı (mikron / dakika), (saniye) büyüme parça ömrü ve büyüme hat uzunluğu dahil, (ayrıntılar için Referans 4) Bu yazılım tarafından hesaplanır (mikron).

Işlevi plusTipSeeTracks dosyayı "allTracks_X_X_X" (Şekil 3) açılarak gözden geçirilebilir izlenen kuyruklu, bir film kaydeder.

Fonksiyon plusTipGroupAnalysis gruplar halinde birden fazla bireysel veri setleri birleştirir ve klasörleri her grup içindeki grupları ve bireysel parametreleri karşılaştırmak için histogramlar, arsa, ve elektronik tablolar dahil olmak üzere grup parametre veri içeren (hangi analiz seçilir alan bağlı adında Percell veya pooledData) oluşturur (Şekil 4).

Şekil 1 Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP kuyrukluyıldızların için kullanılan Şekil 1. PlusTipGetTracks ayarları. Bu rakam EB1-GFP analizi için kullanılan olabilir "Algılama", "İzleme" ve "Post-Processing" adımlar için özel ayarları gösterir Xenopus laevis büyüme konisi kuyrukluyıldızların. PlusTipTracker paket içinde mevcut plusTipParamSweepGUI aracı, diğer organizma modellerine ve / veya hücre tipi 7 için izleme ayarlarının optimize etmek için kullanılabilir.

Şekil 2
PlusTipGetTracks analizinden elde MT parametrelerinin Şekil 2. Screenshot. "Meta" klasörü, çalışan plusTipGetTracks tarafından oluşturulan, + TIP c ile ilgili bilgiler içerirOMET istatistikleri. Bir elektronik tablo uygulaması "Stats" dosyasını sürükleyerek, mikrotübül dinamikleri parametreler incelenebilir.

Şekil 3,
PlusTipSeeTracks analizinden elde MT parça film Şekil 3. Ekran Görüntüsü. PlusTipSeeTracks mikrotübül parça görselleştirme sağlar, ama aynı zamanda kullanıcı plusTipGetTracks alınan verilerin geçerliliğini görmek için izin vererek bir doğrulama aracı olarak da hizmet veriyor.

Şekil 4
PlusTipGroupAnalysis elde edilen MT parametreleri Şekil 4. Ekran Görüntüsü. PlusTipGroupAnalysis karşılaştırarak gruplar ve betwee bireysel parametreler için kullanıcıya basit bir yöntem sunuyorBirden fazla bireysel veri setleri birleştirerek ve bir elektronik tablo uygulamasında muayene edilebilir istatistik çıktı, üreterek her grup içinde n.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PlusTipTracker hızlı ve otomatik olarak, bir hücre ya da büyüme konisinin hemen hemen tüm görünür EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve MT parametreleri hesaplamak için basit bir grafik kullanıcı arabirimi sağlar. Diğer yayınlar (. Örneğin, Marx ve ark büyüme konileri 18 etiketlendi EB1 dinamikleri de kullanılan kantitatif analiz) yazılımları benzer tipte tasarımı bildirdi. Ama bu yazılım özgürce, açık kaynak tasarlama konusunda uzmanlaşmış Danuser Lab web sitesinden, indirilebilir anahtar hücre biyolojik topluma yararlı bir yazılım olduğu gibi, erişim kolaylığı benzersiz görünmektedir. MATLAB erişim gerekli iken, bir yazılımı kullanmak için bu bilgisayar uygulama ile tamamen aşina olması gerekmez. Ancak, kullanım kolaylığı için ele alınması gereken birkaç nokta vardır.

Her şeyden önce, Sof kullanırken ortaya en yaygın konulardan biriİlk kez tware ve bilgisayar uygulama dosyası yolu ile ilgilidir. Bu hata (". Cd kullanarak Hata - bir dize formatPath hata ... içermelidir Argüman" istemi ile) oluşursa, o zaman en kolay çözüm "görüntü" ile tüm bu plusTipTracker yazılımı yanı sıra dizin sağlamak için altdizinler aynı "MATLAB" dosya yolu hem de vardır. Bu "Program Files" dizinine değilse bu "Program Files" adında boşluk bir sorun olabileceği öne sürülmüştür gibi, en iyisidir. Bu konuyla ilgili olarak, bu plusTipTracker ilk plusTipGetTracks analizi hesaplanırken kullanılmıştır dosya yolunu kaydeder ve bu veri erişilen ve yazılımın başka bir bileşen tarafından istihdam edildiğinde gibi, bu dosya yolu muhafaza edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Fonksiyonlar plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks ve plusTipGroupAnalysis tüm c çalışırken, böylece orijinal kaydedilen dosya yolunu kullanın veBelirli bir film için tüm bu fonksiyonlar, başka yolu dosyaları taşıdıktan sonra, bir hata neden olur.

Takip plusTipGetTracks adımında başarısız olduğunda analiz sırasında meydana başka bir ortak hatadır. Resim serisi bir çerçeve saptanabilir kuyrukluyıldızların içeriyorsa bu ortaya çıkar. Bu tamamen analizini durdurmak ve post-processing meydana gelecektir. Devam etmek için analiz bu sorunu aşmak ve izin için kolay bir düzeltme, yanlış herhangi bir gerçek parça ile bağlantılı olmayacak bir alanda görüntü üzerinde sahte bir kuyruklu yıldız yaratmaktır. Ardışık kare az sayıda mevcut olmayan herhangi bir kuyrukluyıldız nihai analize filtre edileceği gibi, son parça parametreleri etkilemez.

Ortaya çıkabilecek bir diğer husus hatalı bir kuyruklu yıldız tespitidir. Bu genellikle adım 2.3 bölge-faiz seçim geliştirerek sabit olabilir. Bu aw hücrenin etrafında yakından ilgi bölge çizmek değil çizmek önemlidirdaha Ider bölge gereklidir. Yazılım kuyruklu yıldız tespiti sırasında kullanılan arka plan belirlemek için bu bölgeyi kullanır. Kuyrukluyıldız tespiti yine varsayılan ayarları ile birlikte alt-optimal ise, ayarları (adım 2.7 sırasında) plusTipGetTracks pencerede ayarlanabilir.

Herhangi bir analizden sonra, o plusTipSeeTracks kullanarak, göz tarafından otomatik parça bağlantıları doğrulamak için kritik öneme sahiptir. Takip ayarları yanlış pozitif veya yanlış negatif kuyruklu bağlantıların sayısını azaltmak için değiştirilmesi gerekebilir. Orijinal plusTipTracker belgelerine 4'ün yanı sıra ayarlarını optimize ilgili ayrıntılar için yazılım indirme eşlik Teknik Rapor PDF görmek. El izleme ile karşılaştırıldığında bu yazılımın performansı, daha önce nöronal olmayan hücrelerin 4 test edilmiştir. Büyüme konisi MTS, MT büyüme ve büzülmeye ek olarak, her yöne 17 sık translokasyonları sergileyen gibi büyüme koni, ancak biraz daha farklı bir sorun teşkil etmektedir. Bir issubüyük bir endişe bulunmamıştır E büyüme konisi sıkıca paketlenmiş MTlerin izleme güçlükleri 17 poz olup olmadığıdır. MTS yalnızca bir alt kümesi çözme ve bireysel EB1-GFP kuyrukluyıldızların sorunlu değildi izleme, uçları üzerinde EB1-GFP ile, büyüme fazında bulunmaktadır. Ancak unutulmamalıdır ki özellikle diğer omurgalı büyüme konilerinin göre, göreceli olarak geniş bir büyüme konisi boyutta (yaklaşık 10 mikron) arasında seçilen Xenopus laevis büyüme konileri ikinci Bu önceki çalışmalar. Bu büyük büyüme konileri kullanarak daha doğru EB1-GFP kuyrukluyıldız analizi sağlar.

Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP parçalarını analiz için bu yazılımın kullanımını ve doğruluğunu değerlendirmek için, biz özdeş bir veri serisi el takibi ile plusTipTracker kullanarak deneyim karşılaştırıldığında (veriler gösterilmemiştir). Süresi, el-iz sürdü EB1-GFP kuyrukluyıldızların 39 kuyruklu parça (ortalama büyüme konisi 1 dakika time-lapse SERI içindees her çerçeve arasında 2 saniye) ile yazılım iki dakika ile karşılaştırıldığında, iki saat fazla olmuştur. Iki yöntem ile elde parametreler (el-izleme için dakika başına 7.0 mikron karşı izleme Automated için dakikada 7.4 mikron) MT büyüme hızı için benzerdi. Ancak, büyüme ömrü ve uzunluğu, yazılım analizi (yaklaşık yarım zaman ve mesafeye göre) anlamlı olarak daha kısa parçalar yol açar. Bir kuyruklu yıldız ve odak dışı zamanla giderse bu yazılım tarafından bölünmüş olan büyüme parça kaynaklanmaktadır. Insan gözünün kolaylıkla aynı kuyrukluyıldız olduğunu tespit iken, yazılım değil. Bir çoklu şartları karşılaştırmak için yazılımı kullanılarak bu sorun olsa sorunlu değildir. Özdeş izleme parametreleri tüm koşullar için kullanılan (ve kuyrukluyıldızların birden koşullarında aynı oranda ve odak çıkmak olduğunu varsayarak) olduğundan, daha sonra göreceli yaşam süreleri ve uzunlukları hala karşılaştırma için oldukça yararlı ölçümlerdir. Otomatik analiz hatası sıçan gelinceES, bu görüntülerin kalitesi büyük ölçüde bağlıdır. Yüksek sinyal-gürültü filmlerde, misjoined veya yanlış parça yüzde tek haneli olduğu. Hatta (bireysel kuyrukluyıldızların hala gözle açıkça görülebilir, ancak arka plan gürültü büyüktür) düşük kaliteli filmlerde, hata oranları hala yazılımını kullanarak kaydedilen önemli zaman değer olduğunu (% 5-15) yeterince düşük hata maliyetleri. Bu, özellikle büyüme konilerinin analiz yüzlerce (koşul başına 60-8 büyüme konileri bir önceki çalışmada 17 analiz edildi) böyledir.

Bu yazılım sadece bu EB1-GFP gibi büyüyen MT uçlarına bağlanan + İPUCU kuyrukluyıldızların tespiti için tasarlanmış dikkat etmek önemlidir. Bağlantı ve izleme algoritmaları kuyrukluyıldızların yalnızca MT küçülen bağlanan bir floresan etiketli + TIP dinamiklerini analiz etmek için bu yazılımı kullanarak, MTS polimerize mevcut olduğunu beklediklerini verilen yanlış bilgilere yol açacaktır büyüyen uçlarında ek biterHesaplanan MT büyüme hızları ile ilgili.

Diğer tek-parçacık izleme yazılımı ile karşılaştırıldığında bu yazılımın eşsiz özelliklerinden biri, bu sadece polimerizasyon parametreleri, ama aynı zamanda çekme parametreleri hesaplamak için hesap bilinen MT davranışlar içine almasıdır. Bu yeni aynı yörünge doğrudan arkasında kurdu biriyle kayboldu bir EB1-GFP kuyrukluyıldız bağlayarak bu yapar (bu backgap veya bgap parça) denir. Bu algoritma HeLa hücreleri 4 gibi bazı hücre tipleri için iyi çalışıyor büyüme konileri MT dinamiklerini analiz ederken, o daha az etkili bir özelliktir. MT sık büyüme konisi aynı yolları (genellikle F-aktin demetleri boyunca takip) boyunca birbirini takip izler, ve bu yüzden bgap bağlantıları doğru olup olmadığını söylemek imkânsızdır çünkü. Bu nedenle, bu büyüme konisi bgap veri çıkışları kullanılması tavsiye edilmez.

Bu küçük uyarılar ve sorunlara rağmenplusTipTracker kullanırken dikkate alınması (ve çoğu herhangi bir otomatik görüntü işleme programı) gereken, bu yazılım zaman görece kısa bir miktarda EB1-GFP kuyruklu binlerce analiz etmek için çok yararlı bir araç olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
plusTipTracker software Danuser Lab http://lccb.hms.harvard.edu/software.html This software may be hosted by another website in the future.  If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site.
MATLAB software Mathworks http://www.mathworks.com/products/matlab/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 913-926 (2004).
  3. Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
  4. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
  5. Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
  6. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
  7. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
  8. Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
  9. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
  10. Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
  11. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  12. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
  13. Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
  14. Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
  15. Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
  16. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
  17. Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
  18. Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics