Isolasjon og berikelse av menneskelige Adipose-avledet stromalceller for Enhanced Osteogenesis

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zielins, E. R., Tevlin, R., Hu, M. S., Chung, M. T., McArdle, A., Paik, K. J., Atashroo, D., Duldulao, C. R., Luan, A., Senarath-Yapa, K., Walmsley, G. G., Wearda, T., Longaker, M. T., Wan, D. C. Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis. J. Vis. Exp. (95), e52181, doi:10.3791/52181 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

MERK: Alle pasientprøver ble oppnådd med informert samtykke, og eksperimentelle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 og # 9999).

1. Cell Isolasjon og kultur:

  1. Skaffe menneskelig subkutan fettvev fra friske kvinnelige pasienter som gjennomgår elektiv Lipoaspirasjon av magen, flanke, og / eller lår regionen under lokal / narkose. Sikre at Institutional Review Board (IRB) godkjenning er innhentet for protokollen for å isolere ASCs fra menneskelig vev, og følg forholdsreglene institusjonelle mens du arbeider med slike materialer.
  2. For å oppnå den SVF fra lipoaspirated fettvev, først vaske lipoaspirate tre ganger med like volumer av 1x steril fosfat-bufret saltvann (PBS). Nøye aspirer og kast den nederste vannlaget.
  3. Forberede collagenase fordøyelsen buffer: 0,075% Type I kollagenase i HanksBalanced Salt Solution (HBSS). Forbered FACS buffer: 2% FBS, 1% P188 og 1% Pen-Strep i PBS. Filtrere begge løsninger ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig 0,22 mikrometer porestørrelse rask flyt polyetersulfon filter.
  4. Å fordøye vasket fettvev, tilsett et likt volum av kollagenase fordøyelse buffer og plassere fordøyelsen fartøyet sikkert i et ristende vannbad i 60 minutter ved 37 ° C (ca. 180 vibrering / min).
    MERK: Det er best å bruke et større volum fordøyelsen fartøy enn nødvendig, da dette gir mulighet for maksimal fordøyelse under risting (dvs. 250 ml collagenase fordøyelsen buffer, 250 ml vasket fettvev i en 1L steril kolbe).
  5. Nøytraliser enzymatisk aktivitet ved tilsetning av et likt volum av FACS-buffer og som tillater å sitte ved RT i 5 min. Deretter sentrifuger ved 233 xg i 20 min ved 4 ° C.
  6. Nøye aspirer og kast supernatanten, tar seg ikke å forstyrre den high-density SVF pellet.
  7. Resuspender pellet i 5-10 ml RT rødcellelysebuffer, basert på pelletstørrelse. La løsningen å sitte ved RT i 5 min og sentrifuger ved 233 xg i 5 minutter ved RT.
  8. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten ved tilsetning av 5-10 ml av tradisjonell vekstmedia, basert på pelletstørrelse (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin-løsning [pen-strep]).
  9. Filtrer suspensjonen gjennom en 100 um nylon cellefilter for å fjerne cellulært avfall.
  10. Sentrifuger ved 233 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og kast supernatanten uten å forstyrre pelleten.
  11. Resuspender pelleten i 5 til 10 ml av tradisjonelle vekstmedia, basert på pelletstørrelse.
  12. Plasser 2 x 10 6 celler i en standard 15 cm kulturskål og etablere primære kulturer O / N ved 37 ° C / 21% O2, 5% CO2. Oppretthold ved sub-konfluent nivåer for å hindre spontan differensiering ved 37 ° C / 21% O2, 5% CO2 i vekstmedium.
    MERK: Cell tetthet i et fulltkonfluent 15 cm plate er ca 4-6 x 10 6 celler.

2. Farging

  1. Kultur ASCer i tradisjonelle vekstmedium ved 37 ° C / 21% O2, 5% CO2, i 36 timer før farging / sortering.
  2. Lift ASCs fra kulturplater ved hjelp Accutase (som per produsentens protokoll).
  3. Vask celler en gang med FACS-buffer (PBS med 2% FBS og 1% pen-strep).
  4. Sentrifuger ved 233 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  5. Kast supernatanten uten å forstyrre pelleten. Resuspender cellene i 0,5-1 ml FACS-buffer (avhengig av celletall og mengden av antistoff ønskelig).
    MERK: Volumet av cellesuspensjonen, i samsvar med FACS-antistoff produsentens anbefalinger, bestemmer antistoffkonsentrasjon. Imidlertid titrering av antistoff-konsentrasjon, ved hjelp av en startkonsentrasjon på 1: 100, er vanligvis anbefales hvis det er første gang å benytte et antistoff.
  6. Telle det totale antallceller ved hjelp av en hemocytometer.
  7. Reserve 100 ul aliquoter i 1,5 ml sentrifugerør som skal brukes for en unstained prøven og enkeltfargekontroller (i henhold til antallet fluorescerende antistoffer brukes).
  8. Legg de aktuelle fluoresceinmerkede monoklonale antistoffer (ved forhåndsbestemte konsentrasjoner, i henhold til produsentens anvisninger) og inkuberes i 20-30 min på is, skjermet mot lys.
    1. Å merke osteogene subpopulasjon: Fortynnet anti-CD90 (APC anti-human CD90 (Thy1)) eller anti-CD105 (FITC-anti-humant CD105 (endoglin)) i FACS-buffer til en konsentrasjon på 1:50.
    2. Å merke andre cellepopulasjoner (f.eks, blodkreft og endotelceller): Fortynn anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), og / eller anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) i FACS-buffer til en konsentrasjon på 1:50.
    3. Hvis du ikke bruker direkte konjugerte antistoffer, kan du bruke en biotinylert primær antistoff med en passende streptavidin-konjugert andreary antistoff, slik som Streptavidin PE-Cy7, ved en fortynning på 1: 100.
  9. Etter inkubering vaskes cellene to ganger: fyll rørene med FACS-buffer og sentrifuger ved 233 xg i 5 minutter ved 4 ° C, supernatanten aspirere.
  10. Suspender cellene i 400-500 mL FACS buffer og filterprøver gjennom en 70 mikrometer nylon celle sil for å fjerne celleklumper.
  11. Overfør merkede celler inn i FACS-rør med filter topp og holde prøvene på is i løpet av analysen.

3. fluorescensaktivert Cell Sorting

MERK: Følgende trinn mandat forkunnskaper i fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) eller ved hjelp av en dyktig tekniker.

  1. Bruke riktige FACS programvare, design analyse tomter å undersøke fremover scatter (FSC), side scatter (SSC), Phycoerythrin (PE) -Texas Rød, Pacific Blue, fluoresceinisotiocyanat (FITC), allofykocyanin (APC) og enhver annen fluorophore brukd å merke celler.
  2. Før lasting inn i cellesorterer, kort vortex hver prøve for å resuspendere cellene.
  3. Starte med analyse av unstained prøven for å sette portene for den totale cellepopulasjon, for å utelukke cellerester, og for å fastslå baseline autofluorescence.
  4. Legg propidiumjodid (PI) til de ufargede prøven og analysere det for å visualisere populasjonen av levende celler i løpet av den totale cellepopulasjon. Konstruer en gate rundt denne populasjonen.
  5. Analysere en ensfarget kontrollprøve for hver fluorokrom for å sette fluorescens kompensasjon.
  6. Analyser farget prøve å angi posisjonen for portene for sortering.
  7. Legg PI til farget prøven for å farge døde celler.
  8. Sortere de merkede cellepopulasjoner. Sortering i enten 1,5 ml sentrifugerør eller koniske rør (15 ml) inneholdende dyrkningsmediet.
  9. Manuelt opphøre sortering når den nødvendige mengde av celler er blitt oppnådd.
  10. Ossing FACS, utføre en renhet sjekk ved å analysere en liten del (f.eks., 500 celler) av den oppkjøpte cellepopulasjon.
    MERK: Dette trinnet bekrefter renheten av de sorterte cellepopulasjoner. Ideelt sett bør renheten være større enn 90-95%.
  11. Sentrifuger cellene ved 233 x g i 5 min ved 4 ° C umiddelbart etter fullføring av sortering og resuspender i 1 ml friskt medium inneholdende 10% FBS.
    MERK: Mengden av media som brukes kan økes basert på størrelsen av cellepelleten.
  12. Plate på gelatin-belagte plater til å forbedre cellenes levedyktighet. Avhengig endelige celleutbytte, plate 300000 celler per brønn i en 6-brønns plate, 100.000 celler per brønn i en 12-brønns plate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av CD90 som en markør for celler med øket Osteogensesis resulterer i isolering av et høyt anrikede populasjoner av humane ASCer (figur 1A, 1B). ASCs ble farget med Pacific Blue-konjugert anti-human CD45, FITC-konjugert anti-human CD105, og APC-konjugert anti-human CD90. Etter sortering, graden av renhet var høyere enn 98%, som kvantifisert ved postsorteringsanalyse.

Å definere grupper av celler basert på transkripsjon profiler som er tillatt for potensiell isolering av to nye subpopulasjoner. For å karakterisere osteogen potensialet av hver lovende undergruppe (CD90 + og CD105 lav), så vel som for den usorterte populasjonen in vitro, ble cellene dyrket i osteogene differensiering medium i 14 dager, som tidligere beskrevet 6,8,9. Alkalisk fosfatase farging (brukes for tidlig deteksjon av beindannelse 10) på dag 7 ble betydelig økt i CD90 + (Figur 2A). Dette ble observert både grovt og etter kvantifisering (Figur 2A). Tilsvarende, Alizarin Red farging (en test som benyttes for å detektere ekstracellulær matriks mineralisering og en metrikk for ende-terminal differensiering osteogene 9) på dag 14, viste at CD90 + ASCer var i stand til å mineralize en betydelig større mengde av ekstracellulær matriks (figur 2B). Isolerte ASCs beholde evnen til å gjennomgå osteogen differensiering etter sortering, men kan kreve et par dager for å komme seg. Det er viktig å utføre alle videre eksperimenter med lave passasje celler, som ASCer blir senescent under formering i kultur.

Figur 1
Figur 1: (A) Gates for cellestørrelse og kompleksitet ble trukket å utelukke cellerester og isolere en populasjon of enkeltceller for videre analyse. (B) FACS analyse av enkelt sortert CD90 (til venstre) og single-sortert CD105 (høyre) ASCs 36 timer etter ASC innhøsting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: (a) alkalisk fosfatase-farging (øverst) og kvantifisering (bunnen) av ASCer etter 7 dagers dyrking i differensieringsmediet osteogene (B) Alizarin rød farging (øverst) og kvantifisering av farging (bunnen) av ASCer etter 14 dager. av kultur i osteogen differensiering medium. CD90 + ASCs og CD105 lave celler viser økt alkalisk fosfatase farging og ekstracellulære matrise mineralisering i forhold til usorterte celler (* p <0,05, to-tailed studentenst-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foreløpig er fortsatt isolasjon av homogene subpopulasjoner av ASCs fra SVF av menneskelig fettvev en utfordrende om ønskelig mål. Isolering av pro-osteogene ASC subpopulasjoner er spesielt ønskelig, da slike celler kan brukes til å studere dannelsen og homeostase av skjelettvevet. Men den SVF av fettvev havner betydelig heterogenitet med hensyn til stamcelle kapasitet og differensiering potensial. 11 Den molekylære grunnlaget for denne heterogenitet kan ikke forstås fra sammenslåtte populasjoner av celler, og i stedet krever enkelt celle analyse. 12 Med denne tilnærmingen, overflatemarkører nært forbundet med det osteogene differensieringskapasitet ASCer kan identifiseres.

Den mest kritiske faktor for vellykket anrikning av ASCer, som beskrevet i den ovennevnte metode, er relatert til de antistoffer som anvendes for FACS. Man må være forsiktig for å velge et antistoff med en høy affinitet for cell-overflate markør i spørsmålet. Ideelt sett bør det være en primær konjugert antistoff i motsetning til et indirekte fargemetoden, som krever flere trinn og dermed økt mulighet for celledød, celle tap og feil avsetning. Videre kan mindre modifikasjoner i løpet av FACS øke cellenes levedyktighet. Disse omfatter sortering i et kjølig beholder, å holde cellene på is hele tiden, sortering celler i beholdere som inneholder kulturmedier, og også, plating de ervervede cellepopulasjoner på kulturplater, som har blitt forhåndsbelagt med 10% gelatin. Det er viktig å utføre en ettersorteringsrenhetsanalyse, for å sikre renheten av de sorterte cellene.

Denne teknikken er begrenset av tilgjengeligheten av FACS utstyr og kompetanse innen et anlegg. Videre, som de primære prøvene er heterogene, vil uttrykk for overflatemarkører endre på individuell basis. Som nevnt ovenfor, er det essensielt å utføre alle forsøkene med lave passasje celler, som ASCs bli senescent under forplantning i kultur. I tillegg er det kjent at ASCer oppviser en forskyvning i fenotypisk ekspresjon under in vitro-betingelser som kan endre stamcellebiologi. Således kan for klinisk translasjon, vil det være optimalt å oppnå en høyt renset cellepopulasjon for direkte eller celletransplantasjon poding til et stillas uten behov for in vitro kultiveringen. I tillegg til de store mengder lipoaspirate som må behandles for å isolere SVF kan være tyngende for dem ukjent med teknikken, som diskuteres og løses ved Zuk og kolleger i en fersk publikasjon 13. I henhold til fremgangsmåten beskrevet av zuk et al., Kan denne protokoll lett skaleres opp eller ned for å gi plass til volumet av lipoaspirate og kan tilpasses til å isolere ASCer fra fettvev erholdt gjennom mageoppstrammingsoperasjoner og andre lignende fremgangsmåter.

CD90 og CD105 har tidligere blitt identifisert så tidlig mesenchymale stilk cell markører, både i BM-MSC og ASC populasjoner. I samsvar med tidligere undersøkelser, representerte CD90 + -populasjonen omtrent 50% av den nylig isolerte SVF. 14 I motsetning til dette bare omtrent 5-10% av den opprinnelige SVF uttrykt CD105. 6. Spesielt, med suksessive passasjer, CD105 ekspresjon hurtig økes fra omtrent null til nesten allestedsnærværende uttrykk etter 4-7 dager i kultur. Det er kjent at ASCs utvise betydelig fenotypiske drift i løpet av in vitro ekspansjon, som kan endre biologi av stamceller. 15-17 Ideelt kliniske applikasjoner for stamceller ville innebære en øyeblikkelig bruk av renset celle populasjoner for direkte transplantasjon eller såing på et stillas , uten behov for in vitro kultiveringen. Prosentandelen av CD90 + celler kan variere mellom ulike lipoaspirate prøver i et fett depot avhengig opprinnelse eller aldersavhengig måte. Ikke desto mindre, ved hjelp av CD90 som en celleoverflatemarkør tillater anrikning ofa undergruppe av menneskelige ASCs med forbedret osteogen potensial. Denne metoden for osteogene anrikning har potensiale til å tjene som et nytt middel til å fremme hurtig og robust bendannelse i pasienter med kritiske størrelse skjelettdefekter. Vi rutinemessig observerer at omtrentlig celle yield fra standard lipoaspirate er 5 x 10 7 nukleære celler / 500 ml lipoaspirate hjelp av nevnte innhøstingen metoden, men som beskrevet ovenfor dette kan variere basert på fett depot opprinnelse eller pasient demografi. 18 Yoshimura og kolleger rapporterte at ASCs representerer 10-35% av befolkningen i nukleerte celler i SVF. 19 Derfor er det et betydelig potensial for direktesåing av et stillas for gjennomføring av benvev ingeniør strategier følgende osteogen berikelse av ASCs hjelp FACS.

Stamcellebasert tissue engineering for eksperimentelle og kliniske applikasjoner krever ofte høy-rene cellepopulasjoner. Andre high-gjennomstrømming metoder for rensing eksistere som enklere alternativer til FACS, omfatter panorering, komplement utarming, og magnetisk-aktivert celle sortering (MACS). Men i visse situasjoner, er FACS både nødvendig og fordelaktig: når isoleringen av høyrene subpopulasjoner er ønskelig, når markøren måloverflaten oppstår sjelden i cellepopulasjonen, eller når celler må separeres på grunnlag av varierende ekspresjonsnivåer av det samme overflate markør.

Ved å bruke både mikrofluidbasert enkelt celle transkripsjonen analyse og fluorescens-aktivert cellesortering, endoglin (CD105) og Thy-1 (CD90) ble funnet å være forbundet med forskjeller i ASC ekspresjon av osteogene gener. Statistisk analyse av encellede transkripsjons profiler vist at lavt uttrykk av CD105 og høyt uttrykt CD90 beskrive undergrupper av ASCs med økt osteogen kapasitet. Disse proteinene ble senere brukt til å berike for osteogene subpopulasjoner av celler derived fra menneskelig subkutant fettvev. 6,20

Sammen utgjør disse data illustrerer effektiviteten av sorterings ASCer basert på spesifikke celleoverflatemarkører som korrelerer med osteogent transkripsjonen aktivitet. Selv om det er mulig på denne tilnærmingen er vist her ved hjelp av CD90 og CD105 som eksempler, må videre analyse gjøres for å omfatte alle lovende kombinasjoner av overflateantigenet som uttrykket høyt korrelerer med osteogent transkripsjonen aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av forfatterne har en økonomisk interesse i noen av produktene, enheter eller narkotika som er nevnt i dette manuskriptet. Ingen av forfatterne har noen konkurrerende økonomisk interesse å rapportere.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Institutes of Health Research stipend R01-DE021683-01 og National Institutes of Health Research stipend R01-DE019434 til MTL; Howard Hughes Medical Institute Stipendiat til MTCDCW ble støttet av ACS Franklin Martin Fakultet Stipendiat, The Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, og Stanford University Child Health Research Institute fakultetet Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes Corning (Thomas Scientific) 2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement Gibco 10566-016
PBS, pH 7.4 Gibco 10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution Purdue  PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X Cellgro 21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin Gibco 16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution Stem Cell Technologies 7920
APC Mouse Anti-Human CD90 BD Pharmingen 559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) BD Pharmingen 561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)  eBioscience 48-9459-41
Anti-Human CD34 APC eBioscience 17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE eBioscience 12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7 eBioscience 25-4317-82
BD FACS Aria II instrument BD Biosciences
BD FACSDiva Software BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
  2. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
  3. Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
  4. Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
  5. Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
  6. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
  7. Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
  8. Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
  9. Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
  10. James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720 (2009).
  11. Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
  12. Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211 (2011).
  13. Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. e50585 (2013).
  14. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
  15. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  16. Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
  17. McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
  18. Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).
  19. Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
  20. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics