Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

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Jespersen, B., Tykocki, N. R., Watts, S. W., Cobbett, P. J. Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (95), e52324, doi:10.3791/52324 (2015).

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Abstract

Introduction

Die Disziplin der Pharmakologie ist die isolierte Gewebebad System seit über 150 Jahren verwendet. Die Vielseitigkeit dieses Systems hat Wissenschaftler erlaubt in der ganzen Welt, um Rezeptoren und Rezeptor-Signaltransduktion zu charakterisieren, mit dieser Erkenntnis, die die Grundlage von Therapien, die Millionen von Menschen mit Erkrankungen oder Störungen, wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Diabetes, gastrointestinalen Erkrankungen, Blasen behandelt wurden Dysfunktion, Asthma und Schluckstörungen, um nur einige zu nennen. Bis heute bleibt das isolierte Gewebebad eine wichtige Facette der Arzneimittelentwicklung und Grundlagenforschung, da es dem Gewebe als Gewebe funktionieren. In diesem JoVE Lektion wird ein formales Protokoll gemeinsam genutzt, um eine visuelle und virtuelle Experiment unter Verwendung der Daten aus einer isolierten Gewebebad Experiment, das isometrische Kontraktion misst, die Rezeptorcharakterisierung ermöglicht demonstrieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Gewebe eine lebendend als Ganzes funktioniert Gewebes mit einer physiologischen Ergebnis (Kontraktion oder Relaxation), die für den Körper ist. Es ist eine Synthese von Schritten (drug-Rezeptor-Wechselwirkung, Signaltransduktion, second messenger Erzeugung, Änderung in der glatten Muskulatur Erregbarkeit und Veränderung der Gewebefunktion). Während andere Techniken ermöglichen Studium jedem dieser Schritte (zB Radioligand für die Arzneimittelaffinität, die Messung der zweiten Boten-Bindung), ermöglicht die Integration aller dieser Schritte 1 das isolierte Gewebebad Technik. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Beibehaltung der Gewebefunktion ermöglicht die Berechnung der wichtigsten pharmakologischen Variablen, die in einem Gewebe gegen ein Mobil Einstellung mehr sinnvoll sind; es näher kommt, wie die untersuchten Medikamente würden im Körper als Ganzes zu arbeiten.

Protocol

HINWEIS: Alle in diesem Dokument beschriebenen Verfahren werden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Michigan State University gegründet geführt.

1. Systemvorbereitungs und Setup

  1. Achten 5 l physiologischer Kochsalzlösung (PSS), die die für eine Gewebebad Kontraktion Experiment, das bis zu 50 ml Gewebebäder verwendet benötigte Menge ist; siehe Tabelle 2 PSS Rezept. Berechnen insgesamt erforderliche Volumen durch die Anzahl der Gewebebädern Badumwälzungen und anschließende Multiplikation mit der Anzahl der erforderlichen Gewebe Wäschen.
    1. Verwenden Sie Tabelle 2 als Leitfaden für die Herstellung von PSS. Auflösen der Salze in etwa 4 l Wasser. HINWEIS: HPLC - Typ I Wasser wird empfohlen
    2. 8 ml 1 M CaCl 2 -Lösung (147 g / l Bei Verwendung des Dihydrat-Salz) zu der Lösung, so dass die Gesamtlösung ist 1,6 mM Calcium.
    3. Quanten sufficit PSS Lösung auf 5 L.
    4. Vorheizen Gewebebad System auf 37 ° C durch Einschalten der rezirkulierenden erhitztes Wasserbad. Critical Schritt: Jede Komponente des Systems ist mit Wassermantel, sicherzustellen, dass sie in Serien miteinander verbunden sind. Die Durchflussrichtung ist von entscheidender Bedeutung - dafür sorgen, dass Wasser fließt in jede Komponente auf dem niedrigsten Stacheldraht-Anschluss und bei der höchsten Stacheldraht Verbindung.
    5. Schalten Sie Datenerfassungssystem. Macht auf den Kraftaufnehmer mindestens 15 min vor dem Experiment zu temperieren.
      HINWEIS: Die meisten Kraftaufnehmer beschäftigen Dehnungsmessstreifen, die empfindlich auf Temperaturschwankungen sind und eine thermische Drift zunächst nach Spannung gesetzt wird.
    6. Starten Sie Software zur Datenerfassung und gewährleisten Zusammenhang mit Datenerfassungssystem. Bitte folgen Herstellung Anweisungen zur Aktivierung Datenaufzeichnung.
    7. Achten Sie darauf, die Kraftaufnehmer vor Gewebe im Gewebe Bad und vor Datenaufzeichnung gestartet platziert kalibriert; follow Anweisungen des Herstellers für die Kalibrierung.
    8. Schließen Sie das Gewebebad System zu einem 95% O 2/5% CO 2 für medizinische Zwecke Gasflasche und auf Gaslecks und dann das System drucklos.
    9. Füllen Sie die Gewebebad Behälter mit PSS und die Lösung Zeit, um eine optimale Temperatur zu erreichen. Prime das System und entfernen Sie Luftblasen im System und Schläuche.
    10. Prüfen Gewebebad Belüfter konsistente Lösung Belüftung, die die PSS-Puffer oxygeniert und liefert die Brownsche Bewegung, Medikamente, die im Gewebebad während des Experiments eingeführt wird verteilen gewährleisten. Stellen Sie sicher, Belüftung / Blasen nicht Gewebebewegung, die Datenaufzeichnungen stören verursachen; verringern Gasstrom nach Bedarf.
      HINWEIS: Die Gewebebad und Datenerfassungssystem sind nun bereit, das Experiment zu starten.

    2. Gewebepräparation

    1. Idealerweise sezieren Gewebe aus dem Tier unmittelbar vor der Verwendung und kann direkt into PSS.
      HINWEIS: Einige Gewebe können in PSS über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden, aber entsprechende Kontrollen muss getan werden, um Gewebefunktion nach längerer Lagerung zu validieren; siehe Abschnitt 6.
    2. Verwenden Sie die Aorta als das Gewebe in dieser Übung.
    3. Anesthetize die Ratte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts und legen Sie die Rattenrückenseite nach unten. Betäubung Bestätigen über eine Zehen Prise und dem Verlust der Reflexantwort auf diesen schmerzhaften Reiz.
      Hinweis: Dieses Protokoll verwendet 70 mg / kg Pentobarbital durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. Richtlinien des Instituts für Nager Anästhesie können abweichen.
    4. Erstellen eines Pneumothorax durch Herstellen eines Einschnitts mit einer Schere entlang der Membran an der Unterseite der Rippen. Dann setzen die Inzision von der Unterseite des Brustkorbs zum Sternum und halbieren.
    5. Präparieren Sie weg oder legen beiseite jene Organe, die an der Spitze der Wirbelsäule sind und suchen Sie die Aorta, die direkt entlang der Wirbelsäule liegt.
      HINWEIS: Diese step bietet eine klare Arbeitsraum zu sezieren die Aorta.
    6. Sever alle Verbindungen zu der Aorta; aus der Speiseröhre, der Lunge usw., und schneiden die Aorta senkrecht zur Wirbelsäule in der Ebene der Membran.
    7. Halten Sie das Aorta mit einer Pinzette und mit einer Schere die Aorta von der Wirbelsäule zu sezieren. Starten Sie die Dissektion in der unteren Membranfläche angrenzend an die Wirbelsäule und die Arbeit zum Herzen hin. Achten Sie darauf, zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um nicht ziehen oder zerren an der Aortagewebe, die das Gewebe schädigen können zu nehmen.
    8. Unmittelbar danach die Aorta in die vorbereitete Dissektion Schale mit PSS.
      HINWEIS: Dissektion der Aorta in Ringe am besten in einem Seziertisch Gericht, das einen schwarzen Silastic Stiftung hat getan. Dies ermöglicht die Verwendung von Drähten, die verwendet werden können, um die Aorta kanülieren und an der Schale befestigt werden, wodurch die Stabilität während der Dissektion Schale. Der schwarze Hintergrund bietet dagegen das Sezierung hilft. Es sollte bei Verwendung Kanülieren Drähte Endothels entnommen werdenial Zellschicht kann mit überschüssiger Reibung der Draht gegen das Lumen des Gefäßes entfernt werden können.
    9. Werfen Sie einen Draht und einen kleinen Winkel von 90 ° an einem Ende und drücken Sie den abgewinkelten Ende in das Silastic Grundlage, um den Führungsdraht zu verankern. Legen Sie die gesamte Aorta in der Dissektion Gericht.
    10. Halten Sie das Ende des Führungsdrahtes mit einer Pinzette, und dann sanft führen Sie das Kabel in das Lumen der Aorta.
    11. Verwenden einer Pinzette, und schieben Sie die Aorta auf den Draht. Wenn das freie Ende des Führungsdrahtes zu sehen ist, die Kurve der Draht vorsichtig und legen Sie das freie Ende in die Silastic Gründung der Schale, um das Gewebe zu stabilisieren.
    12. Mit kleinen Vannas Schere und Pinzette, entfernen Sie die perivaskulären Fettgewebe und alle anderen Fremdgewebe, Blutgerinnsel, usw., bis der thorakalen Aorta erscheint weiß und etwas faserig.
    13. Entfernen Sie die gereinigt Aorta aus Draht und mit einer Schere die Aorta in Ringe, die etwa 3-5 mm in der Breite sind abgeschnitten.
    14. Ein Aortaring auf einer von einem Paar von tiUSGABE Haken, indem Sie den Haken und mit einer Pinzette vorsichtig schieben Sie den Ring auf Haken. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Haken. Achten Sie darauf, um die Haken zu gewährleisten nicht verheddern; siehe Abbildung 3.
    15. Überprüfen Sie, dass jeder Haken hat eine andere Seidenfaden befestigt. Überprüfen Sie, ob ein Haken hat einen kleinen verknoteten Schleife aus Seide, die zur Befestigung an einer Glas- oder Edelstahlstange ermöglicht, während die andere ist eine 4.10 cm langes Stück Faden, der von Hand gebunden mit dem Kraftaufnehmer sein wird; siehe Abbildung 3.
      HINWEIS: Wenn die Aorta an den Haken befestigt ist, ist das Gewebe, bereit, in das Gewebebad angebracht zu werden; siehe Abbildung 3.
    16. Wiederholen Sie die Schritte von 2,14 bis 2,15, um eine zweite Aortenring im zweiten Gewebebad Kammer montieren.

    3. Die Gewebe Platzierung in Bath

    1. Man beachte, dass in diesem System werden die Gewebebädern selbst stationär sind. Zu dieser Zeit füllen die Gewebebäder mit warmen, belüfteten PSS und lassen Sie die Lösung zu kommen, um Temperature.
    2. Mit der Seidenfaden, binden eine der Haken an der Gewebepräparation mit dem Stift auf dem Edelstahlstange. Dieses Ende in das Gewebe Badkammer. Schließen Sie den Stab zu einem Ringständer und das andere Ende in der Färbung Gericht mit PSS gefüllt, um Gewebe in Puffer eingetaucht zu halten; siehe Abbildung 3.
      1. Setzen Sie den Stab und Gewebe im Gewebebad Kammer und stellen Sie sicher, das Gewebe ist vollständig in PSS eingetaucht und der Stab ist sicher; siehe Abbildung 3.
      2. Binden Sie die andere Naht auf den Kraftaufnehmer und stellen Sie sicher, um ein Durchhängen in der Naht zwischen dem Gewebe und den Kraftaufnehmer zu verlassen.
        HINWEIS: Dieser Durchhang wird durch Anpassung des Mikrometer entfernt werden; siehe Abbildung 3.
    3. Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer.

    4. Einstellen Passive Tension

    HINWEIS: Jedes Gewebe hat eine Länge (Lo), an der glatten Muskelzellen reagieren optimally. Vorversuche die optimale Streckziehspannung, welche erzielt diese Länge ist für jeden einzelnen Gewebetyp durchgeführt werden, zu prüfen, zu bestimmen. Die Brustaorta von Ratten hat eine optimale passive Dehnungsspannung von 4 g.

    1. Verwenden Sie die Mikrometer / Zahnstange und Ritzel, um die Spannung zu erhöhen, 2 g und warten auf das Gewebe zu Plateau zu erreichen. Sobald Plateau erreicht ist, erhöhen Spannung eine weitere 2 g und warten auf das Gewebe zur Stabilisierung.
      HINWEIS: In den Aortenringe, nachdem die Anfangsspannung von 2 g ist untergegangen und Plateau erreicht, sollte das Gewebe dann auf ~ 1,6 g entspannen. Eine zweite Anwendung von 2 g würde das Gewebe zu bringen ~ 3,6 g, aus dem das Gewebe wieder zu entspannen und die Spannung nimmt ab. Somit nach Zugabe von 4 g Gesamtspannung, sollte die Software angeben etwa 3,2 g Spannung.
    2. Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer.

    5. Die Gleichgewichtseinstellung und Arzneimittelherstellung

    1. Äquilibrieren Sie die Gewebe für60 min nach dem Auftragen passive Spannung auf das Gewebe.
    2. Während des Gleichgewichtsphase, waschen Sie die Gewebe alle 15-20 min. Lassen Sie das Gewebe Bad und ersetzen Sie die PSS mit PSS aus einem Reservoir erwärmt.
      HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Gewebe zu entspannen, die durch den Verlust der passive Spannung angedeutet ist.
    3. Während dieser Zeit der Zubereitung von Drogen für den Versuch, die mindestens 1.000 mal konzentrierter als die tatsächliche Konzentration in dem Bad benötigen, so dass nur ein kleines Volumen des Medikaments Lager benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.

    6. Erste Herausforderung

    1. Am Ende des Äquilibrierungsperiode, waschen das Gewebe ein letztes Mal, Daten speichern und wieder auf Null alle Eingänge.
    2. Wählen Sie einen Agonisten (Verbindung, die aktive Kontraktion verursachen wird), auf die das Gewebe reagiert.
      HINWEIS: In der Brustaorta von Ratten, die arteriellen glatten Muskeln aktiv zu einer alpha-adrenergen Rezeptor-Agonisten Vertrag aufgrund der Innervation derGewebe durch das sympathische Nervensystem. Ein adrenergen Agonisten nicht sinnvoll in Darmgewebe sein da adrenergen Agonisten verursachen Entspannung. In diesem Fall könnte ein Rezeptor-Agonisten, wie Acetylcholin (cholinergen Rezeptor) verwendet werden. Eine Alternative zu beiden Phenylephrin und Acetylcholin ist, eine Nicht-Rezeptor-Agonisten, wie hohen Kalium (K) als den ersten Auftrag. In der glatten Muskulatur arbeitet hohen K indirekt offenen Kalziumkanäle und damit als ein allgemeiner Index der glatten Muskulatur Integrität angesehen.
      1. Führen Sie die erste Herausforderung oder den Wake-up Herausforderung durch Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad. Um diese Konzentration in 50 ml Gewebebad zu erreichen, fügen Sie 50 ul einer 10 -2 M Phenylephrin Lösung.
        HINWEIS: 50 ul in 50 ml PSS ist ein 1/1000-Verdünnung, so dass die Endkonzentration 1,000x weniger als Lager oder 10 -5 M. Die Kenntnis der Menge und konsistente Pflege des Volumens innerhalb Gewebebad chamber ist entscheidend für die Bestimmung der endgültigen Arzneistoffkonzentration.
    3. Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad und erlauben die Kontraktion zu Spitze und dann Plateau, wenn die Steigung der Daten zu Null wird. Stellen Sie sicher, jeden experimentellen Ereignis post experimentelle Analyse helfen zu erfassen.
    4. Nach dem Hochplateau, waschen Sie die Agonisten gründlich durch Entleeren und Auffüllen des Gewebebad Kammer mit neuen PSS. Stellen Sie sicher, diese Ereignisse als auch aufzuzeichnen.
      ANMERKUNG: Eine Faustregel ist, dass die Konzentration des Agonisten in der Wanne verringert 10fach mit jeder Wäsche. Obwohl, kann mehr als 3-4 Wäschen notwendig sein, um das Gewebe wieder auf sein Gleichgewicht Grundlinientonus (Zug) zu bringen.
    5. Lassen Sie das Gewebe Rest zu Studienbeginn Ton für ~ 10 min, bevor Sie fortfahren.

    7. Experiment

    HINWEIS: Prazosin, ein alpha-adrenergen Rezeptor-Antagonist, wird dem Gewebebad Kammer eingebracht, um die Konzentration bzw. verschiebenonse Kurve auf Phenylephrin (PE); dies ist eine nachweisbare Antagonismus.

    1. Einem Bad, fügen dem Fahrzeug (H 2 O) in dem Prazosin wurde aufgelöst. Zum anderen, fügen Sie die entsprechende Konzentration von Prazosin. In diesem Fall werden 25 ul Fahrzeug einem Bad und 25 ul von 10 -5 M Konzentration von Prazosin zu der anderen, um eine 5 x 10 -9 M oder 5 nM Konzentration in dem Bad zu erreichen.
      Anmerkung: Während der Zugabe des Fahrzeugs unnötig erscheint in diesem Beispiel, ist es zwingend, so zu tun, als mit anderen Fahrzeugen, die eine potentielle vasoaktiven zu sein (beispielsweise DMSO, Ethanol, Acetat) haben. Fügen Sie die entsprechenden Fahrzeugs, auch wenn wenig Beweise gibt es für vasoaktive sein.
    2. Lassen Fahrzeug / Prazosin in den Bädern und nicht das Gewebe Waschen für 1 Stunde.
      1. Während Gewebe im Gleichgewicht, bereiten mehrere Konzentrationen von Agonisten (PE). Umfassen ein breites Spektrum von Konzentrationen von Konzentrationen entlocken keine Antwort (zB </ Em> 10 -9 M PE) zu Konzentrationen, die die maximale Reaktion (übertreffen zB 10 -4 M PE). Seit Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind logarithmisch in der Natur, machen sechs separate Stammlösungen von PE (10 -6 bis 10 -1 M) über Verdünnungsreihen von der 10 -1 M-Stammlösung. Sicherstellen, dass die für jede Konzentration benötigte Volumen etwas größer als das Dreifache des Gesamtvolumens für alle Bäder (dh> 300 ul) benötigt.
    3. Mit Hinzufügen Agonisten, wie in Tabelle 1 beschrieben.
      HINWEIS: Dieses Experiment wird eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf PE zu generieren; jede Iteration berücksichtigt die Menge der Substanz bereits an dem Bad zugesetzt. Zugänge auftreten, bis sie Kontraktion nicht mehr zu erhöhen, oder die gesamte Kurve ein Plateau erreicht hat.
      1. Fügen Sie jede Wirkstoffkonzentration einzeln, bis das Gewebe Schwelle erreicht ist.
      2. Wenn keine Änderung auftritt, fügen Sie den nächsten Konzentration in derSerie; siehe Tabelle 2.
        Anmerkung: Der Zeitpunkt dieser Zusätze hängt von der Agonist verwendet. Zum Beispiel, Noradrenalin und Phenylephrin Kontraktion entwickelt sich schnell, und sollte innerhalb weniger Minuten ein Plateau. Im Gegensatz dazu entwickelt Endothelin-1 Kontraktion langsam und nicht für fast 45 Minuten ein Plateau. Andere Experimente können auf dem Gewebe nach dem Aufbau einer Kurve, wie dies getan werden kann, solange wie (1) die Substanz auswäscht; und (2) gezeigt werden kann, dass das Gewebe wieder in den normalen Kontraktionsverhalten und wird nicht durch den vorhergehenden Stimulationen beeinflusst.

    8. Datenanalyse

    1. Achten Sie darauf, die Daten unmittelbar vor und nach einem Eingriff zu sparen (zB aufwachen oder Voll Kurve).
    2. Suche und den Gewebegrundlinie für jedes Gewebe Badkammer / Eingangskanal, der in der Datenanalyse helfen werden.
    3. Sobald die Grundlinie gesetzt wird, suchen Sie die maximale Reaktion für jede Konzentration, und notieren Sie die change von der Grundlinie. Nacheinander durch jede der Konzentrationen bewegen und notieren Sie die Grundlinienverschiebung.
    4. Graph der resultierenden Daten. Tun Sie dies in jedem Grafik-Programm.
      HINWEIS: Graph Pad Prism für Pharmakologen gestaltet, und dies ist für die Art des Experiments hier vorgestellt.

Representative Results

In Bezug auf Agonismus, kann die relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten in einem gegebenen Gewebe berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion (Abbildung 1) inkubiert.

Abbildung 2 präsentiert geändert Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten markiert die maximale Kontraktion durch PE erreicht markiert max, der ½ maximalen Kontraktion als solche markiert und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EG erreicht 50 -Werte können logistische Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet werden, verwendet.

Bei der Erzeugung und Interpretation dieser Ergebnisse ist es wichtig, sowohl niedrige als auch hohe Konzentrationen von Agonisten zu verwenden, um die Konzentration-Antwort-Kurve zu erstellen. Ohne genug Punkte, um eine stabile Basislinie und die maximale Hochebene zeigen, kann EC 50 und E MAX nur geschätzt werden. Dies wurde graphisch in diesem Beispiel gemacht. Computersoftware, die logistischen Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet, kann für die Kurvenanpassung und Berechnung von EC 50 Werte verwendet werden.

Figur 1
Abb. 1: Schematische Bad Tissue-Karikatur, die einen Ring von Gewebe in der doppelwandigen platziert, mit Wassermantel Gewebe bath. Puffer und Abfluss werden durch eine 3-Wege-Glashahn in die Basis der Kammer integriert geregelt. O 2 / CO 2 wird über einen Belüfter, der mit einer Dichtung des Lecks der PSS oder Gas zu verhindern abgedichtet eingeblasen wird. Umluft Eingang unter dem Ausgabe, um eine ordnungsgemäße Rückführung zu erhalten und die Bildung von Luftblasen, die Temperatur disregulation führen würde, zu verhindern.

Abbildung 2
Abb. 2: Brustaorta von Ratten + Endothel Die Abbildung zeigt vier getrennte Experimente (verschiedene Tiere und von verschiedenen Forschern auf verschiedenen Setups, wie durch unterschiedliche Farben dargestellt getan), die Fähigkeit von Prazosin, um eine PE-induzierten Kontraktion verschieben testen. Prazosin (5 nM) deutlich verschoben PE-induzierte Kontraktionskurve nach rechts in einer parallelen Weise.


Abbildung 3: Brustaorta von Ratten + Endothelium Graphical Schätzung der EC 50 Werte für PE in Abwesenheit (Fahrzeug) und Anwesenheit (Prazosin) des Antagonisten.. Grüne Linie (Gruppe C) nur markiert.

Salz MW (g / mol) 5 Liter FINAL mM
(Gramm)
NaCl 58,45 37,99 130
KCl 74,56 1,75 4.7
KH2PO4 136,1 0.8 1.18
MgSO4• 7H20 246,5 1,45 1.17
NaHCO3 84,21 6.25 14,9
Traubenzucker 180,16 5 5.5
EDTA 380 0,05 0,03

Tabelle 1: normale physiologische Salzlösung (PSS) Rezept Inhalt des bikarbonatgestützte PSS in diesem Experiment verwendet.. Eingeschlossen sind die Molekulargewichte aller Salze und die Menge an 5 l dH 2 O zugegeben, um die gewünschte Konzentration zu erzielen.

Die Konzentration im Bad Die Zugabe von Agonist zu Bad gemacht
1 x 10 -9 M 50 ml 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M 100 ml 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M 35 ml 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M 100 ml 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M 35 ml 1 x 10 -4 M
3 x 10 -7 M 100 ml 1 x 10 -4 M
1 x 10 -6 M 35 ml 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M 100 ml 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M 35 ml 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M 100 ml 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M 35 ml 1 x 10 -1 M

Tabelle 2:. Tissue Badezusatz Agonist-Konzentrationen Die Menge des Agonisten zu jedem Bad zu Pro hinzugefügt werdenperly konstruieren kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven. Die gewünschte Badkonzentration durch Zugabe von sequentiellen Mengen von steigenden Konzentrationen des Agonisten erreicht wird. Jedes hinaus berücksichtigt die Konzentration des Agonisten bereits im Bad vorhanden. Dies wird durchgeführt, um die Zunahme des Volumens im Gewebebad, das von unter Verwendung steigender Mengen von einer einzigen Konzentration des Agonisten führen würde minimieren.

Discussion

Die Messung der isometrischen Kraft als Forschungswerkzeug ist über 150 Jahre alt, aber es die prototypische Technik zur Charakterisierung Rezeptor in kontraktilen Gewebe 2 ist weiterhin. Die Leistungsfähigkeit dieser Technik besteht in ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit: durch Aufzeichnen Antworten durch zunehmende Konzentrationen eines Agonisten in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Antagonisten hervorgerufen, kann eine Vielzahl von Informationen über die pharmakologischen Eigenschaften eines jeden Medikaments Rezeptors abgeleitet werden, die bindet es 3-5. Experimente dieser Art sammeln auch Informationen über die Wettbewerbs versus nicht wettbewerbsfähig Natur der verwendeten Antagonisten sowie Rezeptorheterogenität und unspezifische Medikamentenwirkungen 6-8. Somit kann mit einfachen Permutationen dieser isolierten Gewebebad Experiment kann eine relativ vollständige pharmakologische Profil der Rezeptoren, Agonisten induzierten Muskelkontraktion Vermittlung erzeugt werden.

In Bezug auf Agonismus, the relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten eines bestimmten Gewebes kann berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion inkubiert. 2 stellt modifizierte Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten wurden mit der maximalen Kontraktion durch PE erreicht markiert als max markiert, die als solche gekennzeichnet ½ maximale Kontraktion und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EC50-Wert erreicht.

Leider hat die Verwendung Agonist abhängiger Parameters nur um festzustellen, Rezeptorbindungseigenschaften kann kompliziert sein 9. Idealerweise zusätzliche Experimente unter Verwendung von Rezeptor-Antagonisten erlauben die Berechnung von zwei wichtige Parameter, die Schlüssel zu definieren, die Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff und einem Rezeptor sind: -log 10 des Antagonisten Dissoziationskonstante (pK B) und der 10 -log des molaren Antagonist Konzentration notwendig, zwei-fache Rechtsverschiebung in der Konzentrations-Wirkungs-Kurve (pA 2) 10 auslösen. Sowohl K B und 2 pA Verstärkungs ihre Nützlichkeit aus der Tatsache, daß sie Agonisten-unabhängigen Werten, und konstant, selbst zwischen verschiedenen Geweben 11. Aus den Daten in Abbildung 2 kann pK B unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden, und basierend auf EC 50 -Werte anderswo berechnet:

EC 50 in Abwesenheit von Prazosin = 2 x 10 -8 M
EC 50 in der PreSinn von Prazosin = 7 x 10 -6 M

Lösen für K B in der folgenden Gleichung:
log (dr-1) = log [B] - log K B
Wo:
[B] = Antagonistenkonzentration, oder 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = Dosisverhältnis von EC50-Wert in Gegenwart von Antagonisten / EG 50 in Abwesenheit. Wenn es eine Verschiebung nach rechts, so wird dieser Wert größer als eins sein. Somit:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M oder 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Setzt man für [B] und dr:
log (350-1) = -8 - log K B
2,54 = -8 - log KB
pK B = 10,54

Dieser Wert für Prazosin ist konsistent mit den erhaltenen Werten, wenn Prazosin wirkt mit einem α 1 -adrenergen receptbzw. 12,13, was darauf hindeutet, daß der adrenerge Rezeptor vermitteln Kontraktion auf Phenylephrin ist das α 1 -adrenergen Rezeptor.

Mehrere Schritte sind kritisch für den Erfolg dieser Versuche. Gewebe muss in PSS nach der Sektion bleiben, um den Verlust der Lebensfähigkeit des Gewebes zu verhindern. Jede isometrische Muskelvorbereitung hat eine optimale Länge Spannungsbeziehung, die maximale Kraft vor dem Passiv Spannung 14,15 erzeugt. Für die in diesem Protokoll beschriebenen Experiment wurde eine optimale passive Spannung zuvor kurz Zugabe Schritten von 0,5 g passiver Spannung auf das Gewebe bestimmt. Das Gewebe sollte ohne Ton beginnen und dann nach 30 min Äquilibrierungspuffer wurde das Gewebe mit einer maximalen Konzentration von KCl (80 mM), die aktive Ton erzeugt in Frage gestellt. Dann wurde das Gewebe gewaschen und bis zur Grundlinientonus zurückzukehren. Nach 15 Minuten zu Beginn der Studie wurde eine weitere 0,5 g passive Spannung gesetzt und dieser Prozess wiederholt, bis ein Plateau vonaktive Spannung wurde mit zusätzlichen passiven Spannung erreicht. In Vorversuchen wurden 4 g insgesamt passive Spannung bestimmt, um eine maximale aktive Spannung Generation in Aortenringen erreichen, und somit diese Summe der Spannungen an die Ringe vor der Äquilibrierung gegeben. Verfahrenstechnisch ist es am besten vor passive Spannung Anwendung auf Null, sondern kann jederzeit vor dem Versuch erfolgen. Überdehnung Gewebe an jedem Punkt in dem Experiment oder Dissektion wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit des Gewebes und experimentellen Ergebnissen. Dies ist besonders dann wichtig, wenn Anordnen Gewebe in der Wanne, wie dieser Schritt hat die höchste Wahrscheinlichkeit übermäßige Dehnung. Ausreichendes Waschen, in Anzahl und Dauer ist für reproduzierbare Effekte erforderlich. Eine zweite Herausforderung zu früh nach einer ersten Herausforderung, vor oder Gewebe wurden zum Ausgangsspannung zurückgesendet werden, in abweichenden Reaktionen führen. Wenn Studium reversible Antagonisten / Inhibitoren sollten Gewebe nicht vor gewaschen, um zusätzlich Agonist, als inhibitor Konzentration verringert.

Es gibt bemerkenswerte Vorteile und Nachteile für den isolierten Gewebebad Assays.

Nachteile: Die Gewebe können unterschiedliche Grade der Beschädigung während der chirurgischen Entfernung oder der Platzierung der Ringe an den Haken zu erfahren. Da die Endothelzellen der inneren Auskleidung des Aortenrings muss darauf von der Platzierung des Rings an Haken ergriffen, um nicht diese Zellschicht zu beschädigen. Gewebe können auch deutlich unterschiedliche Zeitdauern, in denen sie lebensfähig Gewebebad sind, und dies hat zu ermitteln; nicht alle Gewebe gleich sind. In diesem Sinne kann Gewebe in ihrer Reaktionsfähigkeit im Laufe des Tages ändern, so dass Zeitkontrollen zu einem notwendigen Steuer für jedes Experiment. Ein gutes Beispiel dafür ist die Meerschweinchentrachea, die Kontraktilität maximal um 100% während einer typischen 8 h Experiment verbessert. Medikamente, die in Wasser schlecht löslich sind, kann in dem PSS auszufällen. Schließlich kumulative einnd nicht kumulative Zugaben von einem Medikament, das ein Agonist könnte zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, wenn Rezeptordesensibilisierung auf den Agonisten auftritt; Angiotensin-II ist ein solches Medikament, das schnelle Tachyphylaxie zeigt.

Vorteile: Einer der Hauptvorteile der Gewebebad-Experimente ist, dass es in Echtzeit; kann man den Versuch sehen, wie es sich entwickelt und kann schnell machen Schlussfolgerungen und nächste Schritte zu planen, sowie Fehlerbehebung während eines Experiments. Ein Experiment dauert einen Tag, um zu tun. Multiple Gewebe kann typischerweise von einem Tier hergestellt werden, so dass ein Tier als seine eigene Kontrolle dienen, und das erhöht die Festigkeit eines Experiments. Man kann auch das Gewebe von anderen Faktoren zu isolieren, so daß eine relativ reine Reaktion des Gewebes auf das Medikament zu testen. In vitro Experimente wie Gewebebad System ermöglichen auch die Verwendung einer kleinen Menge an Arzneimittel im Vergleich zu einem in vivo-Versuch.

Die hier beschriebene grundlegende experimentelle Design sein kannextensiv modifiziert, um die Aufnahme von zusätzlichen Parametern oder die Einführung von anderen externen Stimuli ermöglichen. Zum Beispiel Zugabe von Elektroden ermöglichen elektrisches Feld Stimulation der Nerven innervieren 16,17. Mit dem Zusatz von thermischer oder pH-Sonden können die Effekte von Temperatur und pH auf die kontraktilen Reaktionen gemessen 18,19 werden. Auf ähnliche Weise können Sauerstoff ganz oder teilweise mit N 2 auf Hypoxie induzierte Effekte zu bewerten ersetzt werden. Darüber hinaus können die gleichen Grundprinzipien der isometrischen Kontraktionsmessung in diesem Video verwendet, um Systeme, die die gleichzeitige Messung der isometrischen Spannung Entwicklung und Veränderungen der intrazellulären Calcium 20 gestatten zu entwickeln. Signaltransduktion wird auch leicht untersucht, da Systeme existieren, die eine Gewebeprobe während einer Reaktion schnell zu gefrieren, so dass die Aktivität eines Signaltransduktionsweges System kann biochemisch verifiziert werden.

Die Variation equipment die verwendet werden können, dies zu tun, ist enorm. Das ganze System, entweder von Hand gebaut oder automatisiert, können aus mehreren verschiedenen Unternehmen erworben werden. Die Gewebebäder und Gewebe-Halter im Sinne dieses Protokolls sind mundgeblasen (Gewebebäder) und von Hand gebaut (Inhaber) durch eine in-house Michigan State University Werkstätten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LabChart Software ADInstruments 7.2
PowerLab (4 channel)  ADInstruments ML760
QuadBridge (4 channel) ADInstruments ML112 ML112
Grass Adapter Cable ADInstruments MLAC11 MLAC11
Grass Force-displacement Transducer Grass Instrument Co FT03 FT03
Grass Transducer Cable Grass Instrument Co TAC-7 REV-1
BNC to BNC Cable ADInstruments MLAC01
IsoTemp 2100 Fisher Scientific IC-2100
Tissue Bath Multiple Sources 
Physiological Salt Solution PSS
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Ring Stand Humboldt MFG Co H-2122 7
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Tygon Tubing VWR Scientific 63010-100 R-3603
Hose Clamps Cole-Parmer Instrument Co 06832-08 SNP-8
50 ml Muscle Bath Eberhartglass Blowing Custom
250 ml Warming Chambers Eberhartglass Blowing Custom
Gas Dispersion Tube Ace Glass 7202-06 7202-02
Micrometer
Custom Stands
Three-prong Clamps VWR International Talon
S-connector VWR International Talon
Tissue Hooks Hand Made in House Custom
Tissue Dissection
Leica Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source Fisher Scientific 12562-36 12562-36
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Sylgard Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150 160-150
Splinter & Fixation Forceps George Tiemann & Co 160-55 160-55

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References

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