الهلام بولي أكريلاميد لInvadopodia وقوة الجر فحوصات على خلايا سرطان

1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

صلابة الميكانيكية في المكروية الورم تلعب دورا حاسما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة النشاط invadopodia وأكتوميوزين انقباض. باستخدام المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة)، invadopodia وقوة الجر فحوصات يمكن استخدامها لدراسة خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية في الاستجابة إلى matrix صلابة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تم أنسجة الورم جامدة تورط بقوة في تنظيم الهجرة الخلايا السرطانية والغزو. الهجرة الغازية من خلال الأنسجة عبر ربط وتيسره نتوءات الأكتين الغنية دعا invadopodia التي تحط proteolytically المصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد تبين النشاط Invadopodia أن تعتمد على صلابة ECM وسرطان الخلايا مقلص القوات مما يوحي بأن إشارات صلابة يمكن تنظيم هذه الهياكل التحت خلوية من خلال أكتوميوزين انقباض. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية يمكن ربط في المختبر باستخدام فحوصات invadopodia وقوة الجر بناء على المواد الهلامية بولي أكريلاميد (جزء من الكميات المسندة) من الجمود مختلفة. ورغم وجود بعض الاختلافات بين المقايسات، وهما بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة لخلق أجزاء من الكميات المخصصة عشرفي ويمكن أن تستخدم في كل من المقايسات ويسهل قابلة للتكيف مع الاحتياجات البيولوجية وتقنية محددة للمستخدم.

Introduction

وقد تم التعرف على صلابة من ECM-المرتبطة ورم باعتبارها عاملا هاما في سلوك القيادة الخبيث من خلال زيادة أكتوميوزين انقباض 1-3. بينما في المقام الأول تجلى هذا التأثير مع خلايا سرطان الثدي، وقد وجد مصفوفة الصلابة لتغيير خصائص الغازية من الخلايا المشتقة من مجموعة متنوعة من السرطانات 4-8 مما يشير إلى أن صلابة الورم قد تلعب دورا في نوع آخر من أنواع السرطان. على اختراق الأنسجة عبر وصلات هنا خلال الهجرة الغازية، وسرطان الخلايا تستخدم نتوءات الأكتين الغنية لاصقة المعروفة باسم invadopodia أن توطين proteinases أن تتحلل الوزراء البريطانى وECM 9. وتعتبر Invadopodia السمة المميزة للخلايا الغازية وقد تورطت في غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث 10،11. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن مصفوفة الصلابة يمكن تنظيم أرقام invadopodia وما يرتبط بها من تدهور ECM 4،12 من خلال ميوسين II النشاط والبروتينات mechanosensitive 12. نظرا إلىالعلاقة بين كثافة الورم والسرطان العدوانية 13،14، وتشير هذه النتائج إلى الآلية التي الخلايا السرطانية قد يستجيب لأنسجة الورم جامدة لقيادة الغزو والانبثاث من خلال أكتوميوزين انقباض.

في المختبر ECM صلابة وكثافة الأنسجة في الجسم الحي وقد ثبت أن تنظيم السلوك الغازية من الخلايا السرطانية 1،15-17. في حين أكتوميوزين انقباض يبدو أن المهم في هذه العملية، والصراع الدراسات الحالية حول ما إذا كان يرتبط قدرة النقيلي إلى زيادة أو نقصان القوات مقلص 6،18-20. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت هذه القوات التوسط مباشرة النشاط invadopodia 21. لقد وجدنا مؤخرا أن القوات مقلص الخلايا السرطانية كانت تعتمد على مصفوفة الصلابة وكانت التنبؤية لتدهور ECM التي كتبها invadopodia 5. وتشير هذه النتائج إلى أن قوات الخلوية قد تلعب دورا هاما في تطور السرطان عن طريق التوسط invadopodia ميلانالناقلية ردا على الخواص الميكانيكية للالمكروية الورم.

من أجل ربط خصائص الغازية ومقلص من الخلايا السرطانية ونحن تعديل بروتوكول لإنشاء جزء من الكميات المسندة مع الجمود المختلفة التي كانت تستخدم سابقا للتحقيق التي تعتمد على الصلابة النشاط invadopodia 4،12،22. قبل يشابك كيميائيا فبرونيكتين بلازما الإنسان في جميع أنحاء جزء من الكميات المسندة، وهذه الهلاميات المائية المعدلة ويمكن استخدام كأساس لكلا invadopodia والمقايسات قوة الجر لضمان أن الخلايا شهدت نفس الجمود في كلا التجربتين 5. في المقايسات invadopodia، توفر فبرونيكتين مجال ملزم الطبيعي لالجيلاتين لربط ECM مضافين إلى أجزاء من الكميات المخصصة للكشف عن تدهور المصفوفة. في المقايسات قوة الجر، توفر فبرونيكتين ليجند للالتصاق الخلوي المباشر للكشف عن نزوح المكروية المستخدمة لحساب قوات الجر الخلوية. هذه النتائج الأسلوب في ما طالبنا لينة، من الصعب،وجزء من الكميات المسندة الجامدة التي لا بد أن أطباق أسفل الزجاج ولها معاملات الرجوعية المرنة، E، من 1،023، 7،307، و22692 با 5 التي تغطي مجموعة من الخواص الميكانيكية وذكرت لالأنسجة الطبيعية والسرطانية 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد coverslips الزجاج لجزء من الكميات المسندة

  1. نظيفة 12 ملم coverslips مع مناديل الوبر منخفضة.
  2. لهب مم coverslips 12 و 14 ملم ساترة في microwell من كل 35 ملم الزجاج طبق أسفل عن طريق تمرير لهم من خلال لهب الموقد بنسن باستخدام الملقط.
  3. علاج microwells مع 200 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. نضح والهواء الجاف وmicrowells لمدة 30 دقيقة.
  5. علاج microwells مع 50-100 ميكرولتر من 3 aminopropyltrimethoxysilane لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. يتفاعل هذه المادة الكيميائية مع البلاستيك. وبالتالي، استخدام الماصات الزجاجية و لا ملء microwells تماما لتجنب الاتصال مع البلاستيك الطبق.
  6. غسل microwells مع الماء عالى النقاء لحوالي 10 دقيقة حتى يصبح aminopropyltrimethoxysilane-3 واضح.
  7. شطف microwells مع الماء عالى النقاء مرتين باستخدام زجاجة الضغط.
  8. غسل microwells مع 2 مل من الماء عالى النقاءدرجة حرارة الغرفة ر على الكرسي الهزاز وضعت في سرعة متوسطة (~ 1 هرتز) لمدة 10 دقيقة.
  9. نضح والهواء الجاف وmicrowells لمدة 30 دقيقة.
  10. علاج microwells مع 2 مل من 0.5٪ محلول غلوتارالدهيد في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز وضعت في سرعة متوسطة (~ 1 هرتز) لمدة 30 دقيقة.
  11. غسل microwells مع 2 مل من الماء عالى النقاء في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز وضعت في سرعة متوسطة (~ 1 هرتز) لمدة 10 دقيقة. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 30 دقيقة.
  12. microwells الجافة في زاوية حادة (60º أو أكثر) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تخزين أطباق لمدة 2 أشهر في dessicator ل.

2. إعداد جزء من الكميات المسندة لInvadopodia فحوصات

  1. ل1 مل حل PAA لينة (8٪ الأكريلاميد و 0.05٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 25 ميكرولتر من 2٪ BIS، و574 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 1).
  2. ل1 مل حل PAA الصلب (8٪ الأكريلاميد و 0.35٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 175 & #181؛ ل من 2٪ BIS، و 409 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 1).
  3. ل1 مل حل PAA جامدة (12٪ الأكريلاميد و 0.60٪ BIS)، والجمع بين 300 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 300 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 169 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 1).
  4. ديغا الحلول لمدة 15 دقيقة. إضافة 200، 215، و 230 ميكرولتر من 1 ملغ / مل فبرونيكتين بلازما الإنسان في الماء عالى النقاء لينة، من الصعب، وجامدة حلول PAA، على التوالي. لجميع الحلول، إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حمض الاكريليك N-hydroxysuccinimide (NHS) استر، 5 ميكرولتر من / فوق كبريتات الأمونيوم مل 100 ملغ، و 2 ميكرولتر من N، N، N '، N' tetramethylethylenediamine (TEMED ، الجدول 1). خلط مع pipetting لطيف وتجنب خلق فقاعات في الحلول.

PAA
(1 مل)
40٪
AA
(ميكرولتر)

(ميكرولتر)
عالى النقاء
ماء
(ميكرولتر)
1 ملغ / مل
FN
(ميكرولتر)
10 ملغ / مل
NHS استر
(ميكرولتر)
100 ملغ / مل
APS
(ميكرولتر)

TEMED
(ميكرولتر)
مطاط
معامل
(باسكال)
ناعم 200 25 574 200 1 5 2 1023
شاق 200 175 409 215 1 5 2 7307
جامد 300 300 169 230 1 5 2 22692

الجدول 1: العنصر voluوزارة التربية والعلم الناتجة معاملات الرجوعية المرنة لجزء من الكميات المسندة ينة، من الصعب، وجامدة المستخدمة في المقايسات invadopodia. AA = مادة الأكريلاميد، FN = فبرونيكتين، APS = فوق كبريتات الأمونيوم.

  1. ماصة 8.48 ميكرولتر من محلول PAA إلى مركز كل microwell.
    ملاحظة: هذا حجم ينتج نظريا PAA من 75 ميكرون في سمك.
  2. خفض بلطف الجانب ملتهب من 12 ملم ساترة إلى الحبرية في microwell باستخدام الملقط.
  3. السماح للحل PAA تقع إلى تتبلمر عن 15-30 دقيقة. تحقق البلمرة عن طريق التحقق من حل بقايا.
  4. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل طبق وإزالة 12 ملم coverslips مع ملاقط.
    ملاحظة: يتم 10X PBS في المختبر، وتتألف من 0.011 M KH 2 PO 1.54 M كلوريد الصوديوم، و0.056 M نا 2 هبو 4.
  5. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.

3. Pجبر جزء من الكميات المسندة لقوة الجر فحوصات

  1. ل1 مل حل PAA لينة (8٪ الأكريلاميد و 0.05٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 25 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 566 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 2).
  2. ل1 مل حل PAA الصلب (8٪ الأكريلاميد و 0.35٪ BIS)، والجمع بين 200 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 175 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 401 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 2).
  3. ل1 مل حل PAA جامدة (12٪ الأكريلاميد و 0.60٪ BIS)، والجمع بين 300 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 300 ميكرولتر من 2٪ BIS، و 161 ميكرولتر من الماء عالى النقاء (الجدول 2).
  4. ديغا الحلول لمدة 15 دقيقة. إضافة 200، 215، و 230 ميكرولتر من 1 ملغ / مل فبرونيكتين البلازما البشرية لينة، من الصعب، وجامدة حلول PAA، على التوالي. يصوتن 8 ميكرولتر من 200 نانومتر المجهرية الفلورسنت الحمراء (الإثارة / انبعاث 580/605 نانومتر) لمدة 30 ثانية. لكل حل، إضافة 8 ميكرولتر من 200 نانومتر المجهرية الفلورسنت الحمراء،1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حمض الاكريليك NHS استر، 5 ميكرولتر من / فوق كبريتات الأمونيوم مل 100 ملغ، و 2 ميكرولتر من TEMED (الجدول 2). خلط مع pipetting لطيف وتجنب خلق فقاعات في الحلول.

PAA
(1 مل)
40٪
AA
(ميكرولتر)

BIS
(ميكرولتر)
عالى النقاء
ماء
(ميكرولتر)
1 ملغ / مل
FN
(ميكرولتر)

الصغير المجالات
(ميكرولتر)
10 ملغ / مل
NHS استر
(ميكرولتر)
100 ملغ / مل
APS
(ميكرولتر)

TEMED
(ميكرولتر)
مطاط
معامل
(باسكال)
ناعم 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
شاق 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
جامد 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

الجدول 2: حجم العنصر وما ينتج عنها من معاملات الرجوعية المرنة لجزء من الكميات المسندة ينة، من الصعب، وجامدة المستخدمة في المقايسات قوة الجر AA = مادة الأكريلاميد، FN = فبرونيكتين، APS = فوق كبريتات الأمونيوم.

  1. ماصة 8.48 ميكرولتر من محلول PAA إلى مركز كل microwell.
    ملاحظة: هذا حجم ينتج نظريا PAA من 75 ميكرون في سمك.
  2. خفض بلطف الجانب ملتهب من اله 12 مم ساترة إلى الحبرية في microwell باستخدام الملقط.
  3. السماح للحل PAA تقع إلى تتبلمر عن 15-30 دقيقة. تحقق البلمرة عن طريق فحص بقايا حل.
  4. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل طبق وإزالة 12 ملم coverslips مع ملاقط.
  5. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.

4. إعداد ECM لInvadopodia فحوصات

  1. تسخين محلول الجيلاتين (1٪ الجيلاتين و 1٪ سكروز) إلى 37 درجة مئوية.
  2. علاج جزء من الكميات المسندة مع 150 ميكرولتر من محلول الجيلاتين لمدة 1 دقيقة ثم بعناية نضح من الجزء السفلي من microwells عندما عقد أطباق أسفل الزجاج في زاوية 45 درجة.
  3. تجف طبقة رقيقة المتبقي من الجيلاتين على أجزاء من الكميات المخصصة في microwells في زاوية حادة (60 درجة أو أكثر) لتحسين التجفيف لمدة 60 دقيقة.
  4. علاج microwells مع 2 مل من المبرد 0.5٪ حل غلوتارالدهيد على طم لمدة 15 دقيقة تليها درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  6. علاج microwells مع 2 مل من محلول بوروهيدريد الصوديوم لمدة 1 دقيقة. الاستفادة بلطف الأطباق على مقاعد البدلاء لإزالة الفقاعات التي تتشكل على سطح من الجيلاتين.
  7. نضح ويغسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  8. تمييع الحل فبرونيكتين البلازما البشرية FITC المسمى إلى 50 ميكروغرام / مل مع برنامج تلفزيوني 1X والطرد المركزي في 175،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إما شراء فبرونيكتين المسمى المتاحة تجاريا أو التسمية على النحو التالي:
    1. حل 5 ملغ من فبرونيكتين في 10 مل من العازلة بورات (170 ملي الصوديوم metaborate tetrahydrate و 40 مم كلوريد الصوديوم) ومكان في أنابيب غسيل الكلى.
    2. تسمية فبرونيكتين عن طريق وضع أنابيب في 200 مل من العازلة بورات تحتوي على 6 ملغ من FITC المنحل في درجة حرارة الغرفة على محرك مغناطيسيوضعت في أدنى الإعداد لمدة 1.5 ساعة في الظلام.
    3. Dialyze مع 500 مل من برنامج تلفزيوني 1X على محرك مغناطيسي وضعت في أدنى الإعداد لمدة 3 أيام في غرفة باردة مظلمة (4 ° C) مع اثنين من حجم التغيرات في اليوم.
    4. حساب FITC المسمى تركيز فبرونيكتين على أساس الكثافة البصرية من مأخوذة المخفف (1: 200) في 280 نانومتر و 493 نانومتر كما [OD 280 - (0.36 X OD 493)] / 1.4 أضعاف عامل التخفيف من 200 مرة 2 (والذي يمثل لالجلسرين تركيز فبرونيكتين في الخطوة التالية) مما أدى إلى وحدات ملغ / مل.
    5. Dialyze بين عشية وضحاها في حل الجلسرين 50٪ على محرك مغناطيسي وضعت في أدنى الإعداد بين عشية وضحاها في غرفة باردة مظلمة في 4 درجات مئوية).
  9. علاج microwells مع 150 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين FITC المسمى في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة في الظلام.
  10. نضح بعناية الحل فبرونيكتين المسمى FITC من الجزء السفلي من microwells عندما عقد أطباق أسفل الزجاج فيزاوية 45 درجة ومن ثم ملء الأطباق أسفل الزجاج مع 70٪ محلول الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في الظلام الثقافة هود خلية للتعقيم. كما شغل الزجاج الأغطية الطبق السفلي أو محو نظيفة مع مناديل الوبر منخفضة غارقة في الايثانول 70٪.
  11. غسل الأطباق أسفل الزجاج عن طريق ملء لهم مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X ليصبح المجموع 15 دقيقة.

5. إعداد والتصوير من Invadopodia فحوصات

  1. إضافة 25،000 الخلايا السرطانية في 2 مل من invadopodia المتوسطة (1: 1 DMEM وRPMI 1640 مع 5٪ مصل منخفض البروتين، و 10٪ مصل بقري جنيني، و 20 نانوغرام / مل من الطازجة وأضاف عامل نمو البشرة) إلى أطباق أسفل الزجاج و احتضان بين عشية وضحاها.
  2. نضح وعلاج microwells مع 2 مل من محلول بارافورمالدهيد 3.7٪ في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا.
  3. بعد اثنين يغسل سريعة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X، علاج microwells مع 2 مل من 0.1٪ تريتون X-100 حل في غرفة تيمبيrature في الظلام لمدة 5 دقائق إلى permeabilize الخلايا.
  4. بعد واحد غسل سريع مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X، علاج microwells مع 3٪ ألبومين المصل البقري عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة لمنع الخلايا.
  5. احتضان microwells مع 150 ميكرولتر من الماوس الأضداد المضادة للcortactin (1: 750) في عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة.
  6. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  7. احتضان microwells مع 150 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس 633 الأضداد (1: 500) و 546 phalloidin (1: 750) في عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة.
  8. غسل microwells مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع 15 دقيقة.
  9. إضافة ست قطرات من تصاعد المتوسطة لملء كل microwell، وتغطي مع 22 × 22 coverslips.
  10. cortactin الصورة والأكتين لتحديد invadopodia باستخدام الإثارة وانبعاث المرشحات من 632/647 نانومتر، و556/570 نانومتر، على التوالي، وذلك باستخدام عالية NA، 40X عدسة الغمر النفط على مجهر مقلوب واسعة المجال. وبالمثل، صورة فبرونيكتين لتحديد تدهور ECM باستخدام الإثارة وانبعاث مرشح من 492/518 نانومتر.

6. إعداد والتصوير من قوة الجر فحوصات

  1. إضافة 15،000 الخلايا السرطانية في 2 مل من invadopodia المتوسط ​​إلى الأطباق أسفل الزجاج واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. نضح المتوسطة في أطباق الزجاج السفلي واستبدالها مع 2 مل من L-15 متوسطة، مع نفس المكملات (5٪ منخفض البروتين مصل، و 10٪ مصل بقري جنيني، و 20 نانوغرام / مل من الطازجة وأضاف عامل نمو البشرة)، قبل -warmed إلى 37 درجة مئوية.
  3. احتضان الأطباق أسفل الزجاج في غرفة البيئية على مجهر مقلوب قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية مع رطوبة عالية لمدة 1 ساعة.
  4. خذ أربع مجموعات من الصور باستخدام NA عالية، 40X عدسة على المجهر واسعة المجال المقلوب مع مرحلة الآلي للاحتفال مواقف الخلوية:
    1. خلايا الصورة على لص من أجزاء من الكميات المخصصة باستخدام النقيض من المرحلة ("المرحلة" الصورة).
    2. الصورة المجهرية الفلورسنت باستخدام الإثارة وانبعاث المرشحات من 560/645 نانومتر من خلال التركيز قليلا تحت الخلايا حتى الطبقة الأولى من المجهرية في الجزء العلوي من جزء من الكميات المسندة تأتي في التركيز ("مشددا على" الصورة).
    3. وبالإضافة إلى ذلك، والتركيز على الجزء السفلي من جزء من الكميات المسندة (باستخدام المجهرية كعلامات) واتخاذ صورة ("أسفل" الصورة). ملاحظة: الغرض من هذه الصورة هو لتسجيل ض موقف للحصول على سمك PAA الفعلي في كل موقف لإجراء العمليات الحسابية قوة الجر كما هو موضح في ممثل النتائج.
    4. بعد تم الحصول عليها هذه الصور على مواقع متعددة، مزيج بلطف في 220 ميكرولتر من 10٪ تريتون-X الحل لإزالة الخلايا. المجهرية الصورة في الجزء العلوي من جزء من الكميات المسندة في كل موقف كما هو موضح سابقا ("لاغية" الصورة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في مقايسة invadopodia، وعادة ما حددت invadopodia التي كتبها colocalization من علامات مثل الأكتين وcortactin في الهياكل منقط داخل جسم الخلية (الشكل 1). كلا invadopodia مهينة بنشاط وغير مهينة يمكن الاعتماد، والتفريق عن طريق ما إذا كانت colocalized هذه الهياكل مع المناطق السوداء تفتقر إشارة الفلورسنت في فبرونيكتين FITC المسمى (الشكل 1). تحسب يدويا Invadopodia، ويتم تحديد تدهور ECM لكل خلية من العتبة هذه المناطق السوداء يدويا ضمن الخطوط العريضة للخلايا.

في مقايسة قوة الجر، يتم التقاط أربع صور في كل موقع الخلوي تميزت موقف المرحلة (الشكل 2). أولا، "مرحلة" و "وأكدت" تؤخذ الصور من كافة الخلايا في المصالح. يتم أخذ "أسفل" صورة PAA أيضا في كل موقف من أجل حساب سمك هيدروجيل. بعد إزالة رانه الخلايا، يتم أخذ "لاغية" صورة في كل موقف المرحلة ملحوظ. تشوهات في أجزاء من الكميات المخصصة تحسب على أساس التغيير في المواقف المكروية بين "شدد على" وصور "فارغة". ثم يتم استخدام هذه التشريد والخواص الميكانيكية للجزء من الكميات المسندة (E ونسبة بواسون يفترض 0.5) لحساب القوات الجر (الشكل 2). وتوجد عدة طرق مختلفة لحساب القوات الجر 24 استنادا إلى بعض صياغة الحل Boussinesq لانهائي المرونة نصف مساحة 25. في حين أن تفاصيل هذه التحليلات هي خارج نطاق هذا النص، قمنا البرامج المرخصة LIBTRC من ميخا ديمبو في جامعة بوسطن والذي يستخدم الطريقة الموصوفة سابقا لحساب القوات الجر 26. يعوض هذه الطريقة الحسابية خاص للسمك محدودة في حساباته وهو ما يتطلب سمك جزء من الكميات المسندة في كل موقف والتي تحسب على أساس ديfference في ض موقف "شدد على" وصور "القاع". العديد من المجموعات البحثية لديها برامج الحاسوب مماثلة متوفرة أو اختيار لكتابة البرامج الخاصة بها. وبالإضافة إلى ذلك، توجد طرق أخرى لحساب قوات الجر على أساس النهج رياضية مختلفة 24.

الشكل (1)
الشكل 1: فحص invadopodia يمكن استخدامها لتحديد invadopodia وما يرتبط بها من تدهور ECM الصور مضان مثال واسعة المجال من invadopodia في زنزانة SCC-61 (الرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية) على PAA الثابت مع 1٪ الجيلاتين وFITC-. فبرونيكتين المسمى. وعادة ما يتم تحديدها من قبل Invadopodia colocalization اثنين من علامات مثل الأكتين وcortactin (الأحمر والأزرق في الصورة تراكب، على التوالي). Invadopodia يمكن quantitated على حد سواء بنشاط والمهينة (colocalized مع المناطق السوداء تفتقرإشارة FITC كما الرمز بواسطة الأسهم الصفراء) وغير مهينة (الرمز بواسطة السهام البيضاء) جي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: فحص قوة الجر يمكن أن تستخدم لتحديد قوات الجر الخلوية الناتجة عن الهيكل الخلوي الأكتين من خلال تتبع تشريد المجهرية جزءا لا يتجزأ من جزء من الكميات المسندة مثال المرحلة ومضان الصور واسعة المجال لخلية SCC-61 على PAA الثابت (. "مرحلة")، والمجهرية مباشرة تحت الخلية في السطح العلوي للPAA ("أكد"). ويمكن أيضا صورة من الجزء السفلي من PAA أن تؤخذ في وقت لاحق لحساب سمك المحلي ("القاع"). بعد إزالة الخلايا، يتم أخذ صورة مرة أخرى من المكرويةالصورة على السطح العلوي من PAA ("باطل"). مواقف المكروية بين "وأكد" ويمكن تتبع الصور "فارغة" أن تسفر عن "حقل النزوح." ويمكن بعد نزوح المكروية والخواص الميكانيكية PAA أن تستخدم لحساب "حقل متجه الجر." الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ونحن نقدم وسيلة لافتعال أجزاء من الكميات المخصصة التي يمكن استخدامها كأساس لinvadopodia وقوة الجر المقايسات لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص. بينما جزء من الكميات المسندة منذ فترة طويلة تستخدم للنظر في الآثار صلابة على الخلايا وحساب القوات الجر 18،24،27، وهذا البروتوكول هو أول من وضع المقايسات متوازية على أساس جزء من الكميات المسندة بنفس الجمود لربط السلوكيات الخلوية الغازية ومقلص ردا على مصفوفة الخواص الميكانيكية. تفعيل صحيح لل coverslips من الأطباق أسفل الزجاج يضمن أن جزء من الكميات المسندة سوف تربط لهم وليس تؤتي ثمارها. بينما نحن وغيرنا قد اعتمد على الكواشف مثل سلفو-SANPAH وحمض الاكريليك NHS استر لربط الجيلاتين إلى السطح من أجزاء من الكميات المخصصة في الماضي 4،12،28، وجدنا أن هذه الأساليب لم تسفر عن الطبقات السطحية موحدة موثوق من فبرونيكتين . ولذلك، كان جزءا لا يتجزأ من فبرونيكتين وcrosslinked في جميع أنحاء أجزاء من الكميات المخصصة باستخدام حمض الاكريليك NHS استر كما يؤديهامن جانب جماعات أخرى 29،30. ومع ذلك، هناك حاجة إلى زيادة تركيزات فبرونيكتين من أجل العائد نفس كثافة يجند في أسطح أجزاء من الكميات المخصصة ينة، من الصعب، وجامدة 5. بالإضافة إلى ذلك، إدماج فبرونيكتين (ولكن ليس المجهرية) تخفيض الخواص الميكانيكية للأجزاء الكميات المخصصة ينة، من الصعب، وجامدة من 1،071، 9299، 28283 وبا 4 إلى 1،023، 7،307، و22692 با 5 على التوالي. ومع ذلك، هذه القيم معاملات الرجوعية المرنة خفض يزال شمل مجموعة من الأنسجة الطبيعية والسرطانية 23. معاملات الرجوعية تخزين جزء من الكميات المسندة يمكن بسهولة أن تقاس rheometry وتحويلها إلى معاملات الرجوعية المرنة 1،4.

في حين أن البروتوكول هو على التوالي إلى الأمام، وتخفيض وإزالة 12 ملم coverslips هي الخطوات الأكثر صعوبة وتتطلب الممارسة. التحدي الأكبر عندما خفض ساترة هو ضمان أن الحل PAA ينتشر بالتساوي دون أي فقاعات أو الرش. إزالة ساترة يتطلبمطرد من ناحية لكي لا تتلف 12 ملم ساترة، وأسفل الزجاج 14 ملم ساترة، أو PAA. وقد حاولنا الطلاء مسعور على 12 ملم ساترة للمساعدة في إزالة ولكن وجدت أن يتم ترك جزء من الكميات المسندة مع أنماط في سطحها. استخدام غيض غرامة ورقيقة، وملاقط على غرار مجداف لخفض وإزالة 12 ملم coverslips، على التوالي، ينصح بشدة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كمية الضوء تستخدم لصورة الخلايا يجب أن يكون الحد الأدنى منذ بعض أنواع الخلايا حساسة للضوء مركزة على المجهر. أيضا، تم استخدام L-15 متوسطة لفحوصات قوة الجر منذ ليست مجهزة غرفة البيئية لدينا على المجهر لدينا CO 2. بينما تم استخدام نفس ملاحق في وسائل الإعلام لinvadopodia وقوة الجر المقايسات في محاولة للحفاظ على الظروف نفسها، وDMEM RPMI 1640 يمكن أن تستخدم بدلا من L-15 إذا كان من الممكن التحكم في مستويات CO 2.

في حين تم اختيار حجم محلول PAA إلى y نظرياالمواد الهلامية درع بسماكة 75 ميكرون، سمك بهم تختلف عادة بين 30-60 ميكرومتر. ومع ذلك، هذا النطاق هو أعلى بكثير من قيمة في الخلايا التي يمكن الشعور صلابة الأساسية لل coverslips من الأطباق أسفل الزجاج 31. وبالإضافة إلى ذلك، سمك طبقة ECM تستخدم للكشف عن تدهور (الجيلاتين وفبرونيكتين FITC المسمى مضافين إلى جزء من الكميات المسندة) تم الإبلاغ سابقا حوالي 1 ميكرون في سمك 12؛ وبالتالي، هذه الطبقة رقيقة لا تحمي الخلايا من الجمود من جزء من الكميات المسندة. ومع ذلك، والحطام الصلبة، والشقوق، وتشوهات أخرى سواء في جزء من الكميات المسندة و / أو طبقة ECM يمكن أن تؤثر على خصائص الغازية ومقلص الخلوية الفردية. يمكن أن يكون سبب هذه المشاكل عن طريق نجسة coverslips 12 ملم التي يعرض الحطام في الهلاميات المائية، والتجفيف المفرط للالمواد الهلامية و / أو الجيلاتين، والطموح غير مكتمل من بوروهيدريد الصوديوم التي يمكن أن تترك الفقاعات التي تشوه طبقة ECM. ولذلك، يجب توخي الحذر عند اختيار مLLS للتصوير للتأكد من أنها لا تتأثر على نحو غير ملائم مخالفات المحلية في أسطح العينات.

تركيزات عالية نسبيا من فبرونيكتين في كل من أجزاء من الكميات المخصصة (مختلطة في في 200-230 ميكروغرام / مل) وطبقة ECM (مضافين على الجيلاتين في 50 ميكروغرام / مل) قد استخدمت. ومع ذلك، فإن تركيزات الفعلية على أي سطح لم يتم قياسها بشكل مباشر. في حين يظهر كل السطح المراد مشبعة فبرونيكتين، أنه من غير الواضح ما إذا كانت الخلايا تعاني نفس كثافة يجند الدقيقة بين المقايسات اثنين. لفحوصات قوة الجر، و 200 نانومتر المجهرية في التخفيف من 1: لقد أثبتت 125 الأمثل للتصوير. ومع ذلك، فمن الشائع جدا أن تجد مجموعات أخرى باستخدام المجهرية من أقطار أو التخفيفات مختلفة. في هذا النظام، عرض المجهرية أصغر الحركة البراونية داخل جزء من الكميات المسندة، في حين تسببت المجهرية أكبر الشقوق والتشوهات. هي الأكثر احتمالا هذه الملاحظات بسبب الخصائص الفيزيائية للجزء من الكميات المسندة (أي

وعموما، فإن العديد من هذه العوامل التجريبية يمكن تعديلها بناء على متطلبات المستخدم مثل أجزاء من الكميات المخصصة مع خصائص ميكانيكية مختلفة، الخلايا السرطانية مع اختلاف خصائص الغازية ومقلص، وأنظمة المجهري مع قدرات التصوير الأخرى. نسبة الأكريلاميد: BIS يمكن أن تختلف لإنتاج أجزاء من الكميات المخصصة مع معاملات الرجوعية المرنة مشابهة أو مختلفة ويشابك 27. حساسية المقايسات قوة الجر يمكن تعديلها لحساب لمختلف مستويات القوة الخلوية عن طريق تغيير صلابة و / أو المكروية مخففأيون. ويمكن أيضا fluorophores مختلفة يتم اختيار لالمناعي وفبرونيكتين وضع العلامات على أساس مواصفات المجهر. في حين FITC لا التبييض، هو مشرق جدا تدهور صنع ECM التعرف عليها بسهولة. ومع ذلك، والتصوير مضان من invadopodia والصغيرة المجهرية عادة ما يتطلب أهداف عالية NA للقرار الأمثل. وبالإضافة إلى ذلك، على حد سواء المقايسات لا يمكن أن يؤديها على coverslips الزجاج في لوحات جيدا. ومع ذلك، أطباق الزجاج السفلي هي أسهل بكثير لإعداد واستخدام جميع مراحل العملية التجريبية. في المستقبل، فإن الجمع بين هذه المقايسات في واحدة تسمح لرؤية مباشرة كل من تدهور ECM وتوليد القوة الخلوية. ومع ذلك، فإن العديد من التحديات الفنية تنشأ بما في ذلك التصوير الحي الخلية لinvadopodia وmicrobead التشريد، وزيادة التعرض للضوء الخلوي، وتبيض من فبرونيكتين FITC، وعما إذا كانت القوات الجر وtransduced تماما من خلال طبقة ECM fluorescently المسمى وعبر ربط إلى السطوح PAA .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد K25CA143412 (باريخ). ونود أن نعترف بأن وقدمت دعما إضافيا من قبل إدارة طب الأذن والحنجرة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Acknowledgements

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics