암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

Medicine

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Summary

종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

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Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

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Abstract

리지드 종양 조직 강하게 암 세포 이동 및 침입 조절에 연루되어왔다. 가교 조직을 통해 침략 마이그레이션은 단백질 가수 분해 세포 외 기질 (ECM)을 저하 invadopodia라는 굴지의 풍부한 돌출부에 의해 촉진된다. Invadopodia 활성은 강성 신호 액토 마이 오신 수축력을 통하여 이러한 세포 내 구조를 조절할 수 있음을 시사 ECM 강성 암세포 수축력에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 두 분석 사이에 변동이 존재하지만, 여기에 제시된 프로토콜 번째 PAAS를 만들기위한 방법을 제공한다AT는 두 분석에서 쉽게 사용될 사용자의 특정 생물학적 및 기술적 요구에 적응할 수있다.

Introduction

종양 관련 ECM의 강성 액토 마이 오신의 수축성 1-3을 증가시켜 악성 동작을 운전에 중요한 요소로 확인되었습니다. 이 효과는 주로 유방암 세포로 입증되었지만, 매트릭스 강성 암의 다른 유형에 중요한 역할을 할 수 있음 종양 강성을 제안 암 4-8 다양한 유래의 세포의 침입 특성을 변경하는 것으로 밝혀졌다. 침습성 마이그레이션 중 가교 결합 조직을 관통하도록, 암세포는 국소 적 ECM 9 저하 테이나 지역화 invadopodia라고도 액틴 풍부한 접착제 돌출부들을 이용한다. Invadopodia 침략 세포의 특징으로 간주되며 암세포 침윤 및 전이 10,11에 연루되어있다. 이전 작업은 매트릭스 강성이 invadopodia 번호를 조절할 수있는 것으로 나타과 미오신 II 활동과 mechanosensitive 단백질 (12)를 통해 ECM 저하 4,12 관련 지을 수 있고 있습니다. 주어진종양 및 암 밀도 공격성 13,14 사이의 상관은, 이러한 결과는 암 세포 액토 마이 오신 수축력 통해 침윤 및 전이를 구동하는 강성 종양 조직에 응답 할 수있는 메커니즘을 제시한다.

시험관 ECM 강성 및 생체 조직 밀도가 암세포의 침습 1,15-17 행동을 조절하는 것으로 나타났다. 액토 마이 오신 수축력이 과정에서 중요하게 나타나는 반면, 전이성 용량이 증가하는 상관 관계 또는 수축력 6,18-20을 감소 여부에 현재 연구 충돌합니다. 또한, 이러한 힘이 직접 invadopodia 활성 여부 (21)를 매개 알려지지 않았다. 우리는 최근에 암 세포의 수축력이 매트릭스 강성에 의존했고, invadopodia 5 ECM 저하의 예측 것을 발견했다. 이러한 결과는 셀룰러 힘 invadopodia 교류를 매개하여 암의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사종양 미세 환경의 기계적 특성에 대응 tivity.

암세포 (5)의 침입 및 수축 특성을 상관하기 위해, 우리는 이전에 의존 강성 invadopodia 4,12,22 활성을 조사하기 위해 사용 된 서로 다른 강성으로 PAAS 생성을위한 프로토콜을 개질. 화학적 PAAS 걸쳐 인간 혈장 피브로넥틴 가교함으로써, 하이드로 겔이 변형 된 세포는 모두 실험 5와 동일한 강성을 경험하도록 invadopodia 및 견인력 분석 모두에 대한 기준으로 이용 될 수있다. invadopodia 내 분석, 피브로넥틴 매트릭스 열화를 검출하기 PAAS에 포개어 ECM을 연결하기위한 젤라틴 천연 결합 도메인을 제공한다. 견인력 내 분석, 피브로넥틴 세포 견인력을 계산하는 데 사용되는 미세 변위를 검출하는 직접적인 세포 부착을위한 리간드를 제공한다. 우리가 하드, 소프트라는 것을이 Methods,정상 및 암 조직 (23)에 대해보고 기계적 특성의 범위에 걸쳐있는 파 5 1023, 7307 및 22692의, 유리 바닥 요리에 바인딩 및 탄성 계수, E가된다 엄격한 PAAS.

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Protocol

PaaS를위한 유리 Coverslips는 1. 준비

  1. 낮은 린트 물티슈 청소 12mm의 된 커버.
  2. 불꽃 12mm 커버 슬립과 핀셋을 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통해 전달하여 각 35mm의 유리 바닥 접시의 마이크로 웰의 14mm coverslip에.
  3. 실온에서 5 분 동안 0.1 N NaOH를 200 μL로 마이크로 웰 치료.
  4. 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조.
  5. 흄 후드에서 실온에서 10 분 동안 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란의 50 내지 100 μL로 마이크로 웰 치료. 이 화학 물질은 플라스틱과 반응; 따라서, 유리 피펫을 사용하여 플라스틱 접시와의 접촉을 피하기 위해 마이크로 웰 완전히 채워지지 않는다.
  6. 3 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란이 명확해질 때까지 약 10 분 동안 초순수와 마이크로 웰을 세척 할 것.
  7. 초순수 두 번 스퀴즈 병을 사용와 마이크로 웰을 씻어.
  8. 초순수의 2 ml로 마이크로 웰을 세척10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정에 로커 t 실온.
  9. 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조.
  10. 30 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정 로커에 실온에서 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액 2 ㎖와 함께 마이크로 웰 치료.
  11. 10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz에서) 설정 로커에 실온에서 초순수 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 30 분의 총 두 번 더 반복한다.
  12. 30 분 동안 가파른 각도 (60 ° 이상)에서 건조 마이크로 웰.
    참고 : 요리는 데시 케이 터 2 개월 동안 저장할 수 있습니다.

Invadopodia 분석 실험을위한 PaaS를 2. 준비

  1. 소프트 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.05 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 %의 BIS 25 μL, 및 초순수 574 μL (표 1)를 결합한다.
  2. 하드 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.35 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 %의 아크릴 아미드, 175 # 200 μL를 결합181; L ​​2 %의 BIS, 및 초순수 409 μL (표 1).
  3. 강성 PAA (12 % 아크릴 아미드 및 0.60 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 300 μL, 2 % BIS 300 μL, 및 초순수 169 μL (표 1)를 결합한다.
  4. 15 분 동안 용액을 탈기시킨다. 각각, 부드러운 하드, 단단한 PAA 솔루션에 초순수에 1 ㎎ / ㎖ 인간의 플라즈마 피브로넥틴의 200, 215, 230 μl를 추가합니다. 모든 용액의 경우, 10 ㎎ / ㎖ 아크릴산 N 히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 에스테르 1 μL, 100 ㎎ / ㎖의 암모늄 퍼 설페이트 5 μL, 및 N, N, N ', N'- 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED 2 μl를 추가 ; 표 1). 부드러운 피펫으로 혼합 및 솔루션에 거품을 만들지 마십시오.

PAA
(1 ml)에
40 %
AA
(μL)
2 %
(μL)
초순수

(μL)
1 ㎎ / ㎖
FN
(μL)
10 ㎎ / ㎖
NHS 에스테르
(μL)
100 ㎎ / ㎖
APS
(μL)

TEMED
(μL)
탄력있는
계수
(PA)
부드러운 (200) (25) (574) (200) (1) (5) 1,023
단단한 (200) (175) (409) (215) (1) (5) 7307
엄격한 (300) (300) 169 (230) (1) (5) 22692

표 1 : 성분 voluMES 및 invadopodia 분석법에 사용 부드럽고 단단한 경질 PAAS 위해 탄성률 얻어진. AA = 아크릴 아미드, FN은 피브로넥틴, APS는과 황산 암모늄 =를 =.

  1. 각 마이크로 웰의 중심에 PAA 용액 8.48 μL 피펫.
    참고 :이 볼륨은 이론적으로 두께 75 ㎛의 PAA를 산출한다.
  2. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 마이크로 웰의 물방울에에 12mm 커버 슬립의 골조면을 낮 춥니 다.
  3. 샌드위치 PAA 솔루션은 15 ~ 30 분 동안 중합 할 수 있습니다. 남은 솔루션을 확인하여 중합을 확인합니다.
  4. 각각의 접시에 1X PBS 2 ㎖를 추가하고 핀셋으로 12mm 된 커버를 제거합니다.
    참고 : 10 배 PBS는 실험실에서 만들어 0.011 M KH 2 PO 4, 1.54 M의 NaCl, 0.056 M 나 2 HPO 4로 구성되어있다.
  5. 5 분 동안 실온에서 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 세척한다. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.

3. P견인 힘 분석 실험을위한 PaaS를 배상

  1. 소프트 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.05 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 %의 BIS 25 μL, 및 초순수 566 μL (표 2)를 결합한다.
  2. 하드 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.35 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 % BIS 175 μL, 및 초순수 401 μL (표 2)를 결합한다.
  3. 강성 PAA (12 % 아크릴 아미드 및 0.60 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 300 μL, 2 % BIS 300 μL, 및 초순수 161 μL (표 2)를 결합한다.
  4. 15 분 동안 용액을 탈기시킨다. 각각, 부드러운 하드, 단단한 PAA 솔루션 1 ㎎ / ㎖ 인간의 플라즈마 피브로넥틴의 200, 215, 230 μl를 추가합니다. 초음파 처리 30 초 200 nm의 적색 형광 마이크로 스피어 (605분의 580 나노 미터의 여기 / 방출)의 8 μL. 각 솔루션의 경우, 200 nm의 적색 형광 마이크로 스피어의 8 μl를 추가10 ㎎ / ㎖ 아크릴산 NHS 에스테르 1 μL, 100 ㎎ / ㎖의 암모늄 퍼 설페이트 5 μL, TEMED 및 (표 2)의 2 μL. 부드러운 피펫으로 혼합 및 솔루션에 거품을 만들지 마십시오.

PAA
(1 ml)에
40 %
AA
(μL)
2 %
BIS
(μL)
초순수

(μL)
1 ㎎ / ㎖
FN
(μL)

마이크로 분야
(μL)
10 ㎎ / ㎖
NHS 에스테르
(μL)
100 ㎎ / ㎖
APS
(μL)

TEMED
(μL)
탄력있는
계수
(PA)
부드러운 (200) (25) (566) (200) 8 (1) (5) 1,023
단단한 (200) (175) (401) (215) 8 (1) (5) 7307
엄격한 (300) (300) (161) (230) 8 (1) (5) 22692

표 2 :. 성분 볼륨과 견인력 세이에 사용 부드럽고 단단한 경질 PAAS 위해 탄성률 얻어진 AA = 아크릴 아미드, FN은 피브로넥틴, APS는과 황산 암모늄 =를 =.

  1. 각 마이크로 웰의 중심에 PAA 용액 8.48 μL 피펫.
    참고 :이 볼륨은 이론적으로 두께 75 ㎛의 PAA를 산출한다.
  2. 조심스럽게 일의 골조 측면을 낮출핀셋을 사용하여 마이크로 웰의 물방울에에 전자 12mm coverslip에.
  3. 샌드위치 PAA 솔루션은 15 ~ 30 분 동안 중합 할 수 있습니다. 남은 솔루션을 확인하여 중합을 확인합니다.
  4. 각각의 접시에 1X PBS 2 ㎖를 추가하고 핀셋으로 12mm 된 커버를 제거합니다.
  5. 5 분 동안 실온에서 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 세척한다. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.

Invadopodia 분석 실험을위한 ECM 4. 준비

  1. 37 ° C에 젤라틴 용액 (1 % 젤라틴 1 % 자당)를 가열한다.
  2. 45 °의 각도로 유리 바닥 요리를 진행할 때 마이크로 웰의 바닥으로부터 신중 흡 인물을 1 분 동안 젤라틴 용액 150 μL로 PAAS 치료.
  3. 60 분 동안 건조를 최적화하기 위해 가파른 각도 (60 ° 이상)에서 마이크로 웰의 PAAS에 젤라틴의 나머지 얇은 층을 건조.
  4. i에서 냉장 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액 2 ㎖와 마이크로 웰 치료30 분 동안 실온에서 15 분 동안이어서 CE.
  5. 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  6. 1 분 동안 수소화 붕소 나트륨 용액 2 ml로 마이크로 웰 치료. 조심스럽게 젤라틴의 표면에 형성하는 거품을 제거하기 위해 벤치에 요리를 누르십시오.
  7. 대기음을 5 분 동안 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 씻어. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  8. 15 분 동안 4 ° C에서 175,000 XG에 50 μg의의 /의 1X PBS와 ml의 원심 분리기에 FITC 표지 인간의 플라즈마 피브로넥틴 솔루션을 희석. 시판 표시 피브로넥틴를 구입하거나 다음과 같이 레이블 :
    1. 투석 튜브의 보레이트 완충액 (170 mM의 나트륨 테트라 보레이트 40 mM의 염화나트륨)과 장소 10ml에 피브로넥틴 5mg을 녹인다.
    2. 자기 교반기에 실온에서 용해 FITC 6 ㎎을 함유하는 보레이트 완충액 200㎖에 배관을 배치하여 피브로넥틴 레이블어둠 속에서 1.5 시간 동안 가장 낮은 설정에서 설정합니다.
    3. 두 볼륨이 어두운 추운 방 (4 ° C)에서 3 일 동안 가장 낮은 설정으로 설정 자석 교반기에 1X PBS의 500 ml로 투석은 하루 변경됩니다.
    4. (1 : 200) 희석 된 분취 량의 광학 농도에 기초하여 계산 FITC 표지 된 피브로넥틴 농도가 280 nm 내지 493 nm에서의 AS는 [OD 280 - (0.36 X OD 493)] / 1.4 배 (200)의 2 배의 희석 인자는 (있는 계정 ㎎ / ㎖ 단위로 얻어진 다음 단계에서 피브로넥틴 농축 글리세롤) 미국.
    5. 4 ° C에서 하룻밤 어둡고 추운 방에서 가장 낮은 설정으로 설정 자석 교반기 50 % 글리세롤 용액에 하룻밤 투석.)
  9. 어둠 속에서 60 분 동안 실온에서 FITC 표지 된 피브로넥틴 용액 150 ㎕를 마이크로 웰과 치료.
  10. 에서 유리 바닥 요리를 들고 때 조심스럽게 마이크로 웰의 바닥에서 FITC 표지 피브로넥틴 솔루션을 대기음45 ° 각도는 다음 멸균 어두운 세포 배양 후드에서 10 분 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 유리 바닥 접시를 채운다. 또한 유리 바닥 접시 뚜껑을 채우거나 70 % 에탄올에 배어 낮은 보풀 물티슈로 닦아.
  11. 5 분 1X PBS로를 작성하여 바닥이 유리로 요리를 씻으십시오. 15 분 총 1X PBS 2 ㎖와 두 번 더 반복합니다.

Invadopodia 시험 법 5. 준비 및 이미징

  1. (1 DMEM 및 5 %의 낮은 단백질 혈청, 10 % 소 태아 혈청, 및 새롭게 추가 된 표피 성장 인자 20 ng를 / ㎖와 함께 RPMI 1640 1) 유리 바닥 마성 및 invadopodia 배지 2 ㎖로 25,000 암세포 추가 하룻밤 배양한다.
  2. 대기음 세포를 고정을 20 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액 2 ㎖와 함께 마이크로 웰을 처리하고.
  3. 1X PBS 2 ml의 두 빠른 세척 한 후, 방 템피에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액 2 ml로 마이크로 웰을 치료5 분 동안 어둠 속에서 rature는 세포를 Permeabilize 하시려면합니다.
  4. 1X PBS 2 ㎖로 세척 한 후 바로, 3 % 소 혈청 알부민이 60 분을 차단하는 세포에 대한 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액으로 마이크로 웰을 치료.
  5. 60 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액에서 : 마우스 항 cortactin 항체 (750 1) 150 μL와 마이크로 웰을 인큐베이션.
  6. 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  7. (500 1) 및 546 팔로이 딘 (1 : 750) 60 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액에 150 ㎕의 염소 항 - 마우스 항체 633 마이크로 웰을 인큐베이션.
  8. 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  9. 각각의 마이크로 웰을 작성하여 22 × 22 커버 슬립 커버하는 매체를 장착 여섯 방울을 추가합니다.
  10. 이미지 cortactin과 액틴이 647분의 632 나노 미터의 여기 및 방출 필터를 사용하여 invadopodia을 확인하고570분의 556 nm의, 각각, 와이드 - 필드 도립 현미경 높은 NA, 40X 오일 침지 렌즈를 사용. 마찬가지로, 화상 피브로넥틴 518분의 492 nm 인 여기 및 방출 필터를 사용하여 ECM 분해 동정을 행 하였다.

6. 준비 및 견인 힘 분석 실험의 영상

  1. 유리 바닥 요리에 invadopodia 매체의 2 ㎖에 15,000 암 세포를 추가하고 밤새 배양한다.
  2. 유리 바닥 요리 대기음 매체와 같은 보조제 (5 % 낮은 단백질 혈청, 10 % 소 태아 혈청, 및 새롭게 추가 된 표피 성장 인자 20 ng를 / ㎖), 사전에, L-15 배지 2 ㎖로 대체 37 ° C에 -warmed.
  3. 거꾸로 현미경 1 시간 동안 습도가 높은 37 ° C로 사전 평형에 환경 챔버의 유리 바닥 요리를 품어.
  4. 휴대 전화 위치를 표시하기 위해 높은 NA, 자동화 단계와 넓은 필드 거꾸로 현미경에 40 배 렌즈를 사용하여 이미지의 네 세트를 가지고 :
    1. 에에 이미지 세포위상차 ( "단계"화상)을 사용하여 (P)의 PAAS.
    2. PAAS 상단의 마이크로 스피어의 제 1 층까지 아래 셀 중심으로 약간의 645분의 560 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 형광 이미지의 초점이 미세하게된다 (화상 "스트레스").
    3. 또한, (마커로서 미소 구체를 사용하여) PAAS의 바닥에 집중하고 ( "바닥"화상)을 화상. 주 :이 이미지의 목적은 대표 결과에 기재된 견인력 계산을위한 각 위치에서의 실제 두께 PAA 얻을 Z 위치를 기록하는 것이다.
    4. 이러한 이미지가 여러 위치에서 획득 한 후, 부드럽게 세포를 제거하기 위해 10 % 트리톤-X 솔루션의 220 μL에 섞는다. 앞서 설명한 ( "널 (null)"이미지) 등의 각 위치에서 PaaS를 상단의 이미지 미소.

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Representative Results

invadopodia 분석에서, invadopodia은 전형적 전지 본체 내의 구조에 점 모양 cortactin 액틴과 같은 마커 (도 1)의 colocalization을함으로써 식별된다. 모두 적극적으로 저하 및 비 분해 invadopodia는 카운트 될 수 있으며, 이러한 구조는 FITC 표지 된 피브로넥틴 (도 1)에 형광 신호가없는, 검은 부분으로 colocalized 여부에 의해 구별된다. Invadopodia 수동 계산하고, 셀당 ECM 분해 수동 셀 내에 윤곽선이 검정색 영역을 임계 화에 의해 결정된다.

견인력 분석에서, 네 개의 이미지가 무대 위치 (그림 2)로 표시 한 각 세포의 위치에 캡처됩니다. 먼저, "상"및 이미지의 관심 대상의 모든 셀이 고려되고 "스트레스". PAA의 "바닥"이미지는 하이드로 겔 두께를 계산하기 위해 각 위치에서 가져온 것입니다. t를 제거한 후그는 세포를, "널 (null)"이미지가 표시된 각 단계의 위치에서 가져온 것입니다. PAAS의 변형 계산 "강조"와 "널 (null)"이미지 사이의 미세 위치의 변화를 기준으로합니다. 이러한 변위와 PaaS를 (0.5로 가정 E와 포아송 비)의 기계적 특성은 다음 견인력 (그림 2)를 계산하는 데 사용됩니다. 몇 가지 다른 방법은 무한 탄성 반 공간 (25)에 대한 Boussinesq 솔루션의 일부 제형에 따라 견인력 (24)를 계산하는 존재한다. 이러한 분석의 세부 사항이 텍스트의 범위를 벗어나는 동안, 우리는 견인력 (26)을 계산하기위한 이전에 설명한 방법을 사용 보스턴 대학의 미가 뎀보에서 LIBTRC 소프트웨어를 허가했다. 이 계산 방법은 특정 디에 기초하여 계산된다 각 위치에서 PAAS의 두께를 필요로 계산 과정에서 한정된 두께를 보상"스트레스"와 "아래"이미지의 z 위치에 fference. 많은 연구 그룹은 비슷한 컴퓨터 패키지가 사용 가능하거나 자신의 프로그램을 작성 선택합니다. 또한, 다른 방법은 상이한 수학적인 접근법에 기초하여 24 견인력을 산출하는 존재한다.

그림 1
도 1 : invadopodia 분석은 invadopodia과 연관된 ECM 열화를 식별 할 수 invadopodia 예 넓은 필드 형광 이미지를 SCC-61 (두경부 편평 세포 암종) 세포에 1 % 젤라틴 및 FITC-와 하드 PAA에. 표시 피브로넥틴. Invadopodia는 일반적으로 액틴과 cortactin 같은 두 개의 마커 (오버레이 이미지에 빨간색과 파란색, 각각)의 colocalization을 식별됩니다. Invadopodia는 다음과 같이 정량화 할 수 있습니다 모두 적극적으로 (검은 부분 부족 colocalized 굴욕FITC 노란색 화살표로 표시로 신호)과 흰색 화살표로 표시 이외의 굴욕 ()를 보내고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 견인력 분석은 (하드 PAA에 SCC-61 세포의 PAAS 예 와이드 필드 상과 형광 화상에 매립하는 미소 변위를 추적함으로써 액틴 세포 골격에 의해 생성 된 세포 견인력을 결정하는데 사용될 수있다 "단계")와 PAA의 상면에있는 셀 바로 아래에 미소 () "스트레스". PAA의 저부의 이미지는 이후 로컬 두께 ( "바닥")을 계산하기 위해 수행 될 수있다. 세포가 제거 된 후, 화상을 다시 촬영 마이크로 스피어PAA ( "NULL")의 상면에 발. 사이의 미세 위치는 "스트레스"와 "널 (null)"이미지를 산출하기 위해 추적 할 수 있습니다 "변위 필드를."미세 변위 및 PAA 기계적 특성은 다음 계산하는 데 사용할 수 있습니다 "견인 벡터 필드를." 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.

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Discussion

우리는 침습적 수축성 셀룰러 동작과 상관시킬 invadopodia 견인력 분석의 기초로서 사용될 수있다 PAAS을 제조하는 방법을 제시한다. PaaS를 오래 세포에 강성 효과를보고 견인력 18,24,27를 계산하는 데 사용되었지만,이 프로토콜은 매트릭스에 대한 응답으로 침략과 수축 세포 행동의 상관 관계를 같은 경직성와 PaaS를 기반으로 병렬 분석을 개발하는 최초 기계적 특성. 제대로 바닥이 유리로 요리 된 커버를 활성화하면 PaaS를 그들에 결합 떨어져 오지 않을 것을 보장한다. 우리가 다른 사람이 과거 4,12,28에 PAAS의 표면에 젤라틴을 바인딩 같은 술포 SANPAH 및 아크릴산 NHS 에스테르 시약에 의존 다하고 있지만, 이들 방법은 피브로넥틴 확실 균일 표면층을 생성하지 않았 음을 발견 . 실시 따라서, 피브로넥틴 아크릴산 NHS 에스테르를 사용하여 매립 PAAS 걸쳐 가교시켰다다른 그룹 (29, 30)에 의해. 그러나, 피브로넥틴의 농도 증가는, 경질 연질 및 경질 PAAS (5)의 표면에서 동일한 리간드 밀도를 수득하기 위해 필요 하였다. 또한, 피브로넥틴 (그러나 미소)의 혼입은 각각 5 파 1,023, 7,307, 1,071 및 22,692으로, 9,299, 28,283 및 파 (4)로부터, 경질 연질 및 경질 PAAS의 기계적 특성을 감소시켰다. 그러나, 이러한 감소 된 탄성 계수 값은 여전히 정상 및 암성 조직 (23)의 범위에 포함. PAAS의 저장 계수 쉽게 유변학 적 측정 및 탄성 계수 1,4로 변환 할 수 있습니다.

프로토콜이 감소 및 제거, 정직하고 있지만 12mm 된 커버는 가장 어려운 단계입니다과 연습이 필요합니다. 커버 슬립을 낮추는 가장 큰 문제는 PAA 솔루션은 모든 거품 튀는없이 균일하게 퍼져 있는지 확인하는 것입니다. 커버 슬립을 필요로 제거위해 꾸준한 손 12mm coverslip에, 유리 바닥 14mm coverslip에, 또는 PAA에 손상을주지합니다. 우리는 제거에 도움 12mm 커버 슬립에 소수성 코팅을 시도했지만 PaaS를 자신의 표면에 패턴으로 남아있는 것을 발견했다. 좋은 팁과 낮추고 12mm 된 커버를 제거하기위한 얇은, 패들 스타일 핀셋의 사용은 각각 좋습니다. 일부 세포 유형은 현미경에 집중 빛에 민감하기 때문에 또한, 화상에 사용하는 빛의 양이 세포가 최소화되어야한다. 우리 현미경 환경 적 챔버가 CO 2 장착되지 않기 때문에, 또한, L-15 배지 견인력 분석에 사용 하였다. 동일한 보충제 조건을 동일하게 유지하기위한 시도로 invadopodia 및 견인력 분석 용 매체에 사용 된 반면 CO 2 레벨이 제어 될 수 있다면, DMEM과 RPMI 1640 L-15 대신에 사용될 수있다.

PAA 용액 부피의 이론적 Y하도록 선택되었지만75 ㎛의 두께의 ield 겔은, 그 두께는 통상적으로 30 내지 60 μm의 사이에서 변화한다. 그러나,이 범위는 물론 세포 유리 접시 바닥 커버 슬립 (31)의 하부의 강성을 감지 할 수있는 값 이상이다. 또한, ECM 층의 두께는 이전에 대략 1 ㎛ 두께 12에보고 된 열화 (젤라틴 및 FITC 표지 된 피브로넥틴은 PAAS에 겹쳐) 검출하기 위해 사용; 따라서,이 얇은 층은 PAAS의 경직성에서 세포를 보호하지 않습니다. 그러나, 고체 파편, 균열, 및 PaaS를 및 / 또는 ECM 층 중 다른 기형은 개인 휴대 침략과 수축 특성에 영향을 미칠 수있다. 이러한 문제는 하이드로 겔, ECM 층을 변형하는 거품을 남길 수 겔 및 / 또는 과도하게 건조 젤라틴, 수소화 붕소 나트륨의 불완전한 흡인로 파편을 도입 부정한 12mm 커버 슬립에 의해 발생 될 수있다. CE를 선택할 때 따라서주의가 필요이미징을위한 재편 그들이 과도하게 시료의 표면에서 지역 불규칙성에 의해 영향을받지 않도록합니다.

사용하고 (50 ㎍ / ㎖의에서 젤라틴에 오버레이) ECM 층 (200 ~ 230 ㎍ / ㎖의에서 혼합) 모두 PAAS에 피브로넥틴의 상대적으로 높은 농도; 그러나, 표면 상에 하나의 실제 농도를 직접 측정되지 않았다. 각 표면은 피브로넥틴으로 포화 될 것처럼 보이지만 세포 두 검정 간의 똑같은 리간드 밀도를 경험할 여부 불분명하다. 견인력 분석법, 하나의 희석, 200 nm의 미립자 : 125이 최적 이미징을 입증했다. 그러나, 그것은 다른 직경 또는 희석액의 미소 구체를 사용하여 다른 그룹들을 아주 쉽게 찾아 볼 수있다. 큰 미소 균열 및 변형이 발생하는 동안 시스템에서, 더 작은 미립자는 PAAS 내의 브라운 운동을 표시. 이러한 관찰로 인해 PAAS의 물성을 가장 많이 사용하는 (즉,

전반적으로, 이들 실험은 많은 요인들 같은 다른 이미징 기능과 다른 기계적 특성을 갖는 PAAS 침습적 및 수축 특성을 가진 다양한 암세포 및 현미경 시스템으로 사용자의 요구 사항에 따라 조절 될 수있다. 아크릴 아미드의 비율 : BIS 유사하거나 상이한 탄성률 및 27 가교와 PAAS을 생성하도록 변화 될 수있다. 견인력 분석의 감도는 강성 및 / 또는 미세 구 dilut을 변경하여 다른 셀룰러 력 수준을 고려하여 조정될 수있다이온. 다른 형광 현미경은 또한 사양에 기초하여 면역 형광 및 피브로넥틴 라벨링을 위해 선택 될 수있다. FITC 표백제를 않지만, 꽤 밝은 만드는 ECM 저하 쉽게 식별된다. 그러나, invadopodia 작은 미소의 형광 이미징은 일반적으로 최적의 해상도 높은 NA 목표를 필요로한다. 또한, 두 분석은 웰 플레이트에서 커버 글라스에 수행 될 수있다. 그러나, 유리 바닥 요리 준비하고 실험 과정 전반에 걸쳐 사용하는 것이 훨씬 쉽다. 미래에는, 하나의 분석 방법으로 결합하면 ECM 분해 및 셀룰러 모두 구동력 발생의 직접적인 시각화를 허용한다. 그러나, 몇 가지 기술적 문제는 invadopodia 및 마이크로 비드 변위 라이브 세포 이미징, 빛에 증가 셀룰러 노출, FITC의 피브로넥틴의 표백을 포함하여 발생 및 것 견인 힘은 완전히 PAA 표면에 형광 연결된 크로스 표지 및 ECM 계층을 통해 형질 도입 여부 .

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Disclosures

이 작품은 상 수 K25CA143412에서 국립 보건원 (NIH)의 국립 암 연구소 (Parekh 씨)에 의해 지원되었다. 우리는 추가 지원이 이비인후과의 부서에서 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

Acknowledgements

저자가 공개하는 게 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

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References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

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