कैंसर की कोशिकाओं पर Invadopodia और कर्षण बल Assays के लिए polyacrylamide जैल

1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center
Medicine

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Summary

ट्यूमर microenvironment में यांत्रिक कठोरता invadopodia गतिविधियों में वृद्धि और सिकुड़ना actomyosin द्वारा घातक व्यवहार ड्राइविंग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। का प्रयोग polyacrylamide जैल (पास), invadopodia और कर्षण बल assays के कठोरता मैट्रिक्स के जवाब में कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक और सिकुड़ा गुणों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

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Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

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Abstract

कठोर ट्यूमर ऊतकों दृढ़ता से कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण को विनियमित करने में फंसाया गया है। पार से जुड़े ऊतकों के माध्यम से आक्रामक प्रवास proteolytically बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) नीचा कि invadopodia बुलाया actin के अमीर protrusions के द्वारा मदद की है। Invadopodia गतिविधि कठोरता संकेतों actomyosin सिकुड़ना के माध्यम से इन subcellular संरचनाओं को विनियमित कर सकते हैं सुझाव है कि ईसीएम कठोरता और कैंसर कोशिका सिकुड़ा बलों पर निर्भर होना दिखाया गया है। कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक और सिकुड़ा गुण अलग कठोर की polyacrylamide जैल (पास) पर आधारित invadopodia और कर्षण बल assays का उपयोग इन विट्रो में सहसंबद्ध किया जा सकता है। कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक और सिकुड़ा गुण अलग कठोर की polyacrylamide जैल (पास) पर आधारित invadopodia और कर्षण बल assays का उपयोग इन विट्रो में सहसंबद्ध किया जा सकता है। दो assays के बीच कुछ बदलाव मौजूद हैं, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल वें पास बनाने के लिए एक तरीका प्रदान करता हैपर दोनों assays में इस्तेमाल किया और आसानी से उपयोगकर्ता की विशिष्ट जैविक और तकनीकी आवश्यकताओं के लिए अनुकूलनीय रहे हैं किया जा सकता है।

Introduction

ट्यूमर जुड़े ईसीएम की कठोरता actomyosin सिकुड़ना 1-3 वृद्धि से घातक व्यवहार ड्राइविंग में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में पहचान की गई है। इस आशय मुख्य रूप से स्तन कैंसर की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया है, वहीं मैट्रिक्स कठोरता के कैंसर के अन्य प्रकार में एक भूमिका निभा सकता है कि ट्यूमर कठोरता के सुझाव के कैंसर 4-8 की एक किस्म से ली गई कोशिकाओं के आक्रामक गुणों को बदलने के लिए पाया गया है। आक्रामक प्रवास के दौरान पार से जुड़े ऊतकों घुसना करने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं को focally ईसीएम 9 नीचा करने के लिए proteinases स्थानीयकरण कि invadopodia रूप में जाना जाता actin के अमीर चिपकने वाला protrusions के उपयोग। Invadopodia आक्रामक कोशिकाओं की एक बानगी माना जाता है और ट्यूमर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस 10,11 में फंसाया गया है। पिछला काम मैट्रिक्स कठोरता invadopodia संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं कि दिखाया गया है और मायोसिन द्वितीय गतिविधि और mechanosensitive प्रोटीन 12 के माध्यम से ईसीएम गिरावट 4,12 संबद्ध किया गया है। दियाट्यूमर घनत्व और कैंसर आक्रामकता 13,14 के बीच संबंध, इन परिणामों के कैंसर की कोशिकाओं को actomyosin सिकुड़ना के माध्यम से आक्रमण और मेटास्टेसिस ड्राइव करने के लिए कठोर ट्यूमर ऊतकों का जवाब हो सकता है जिसके द्वारा एक तंत्र सुझाव देते हैं।

इन विट्रो ईसीएम कठोरता में और vivo ऊतक के घनत्व में कैंसर की कोशिकाओं को 1,15-17 के आक्रामक व्यवहार को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। Actomyosin सिकुड़ना इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, वहीं मेटास्टैटिक क्षमता में वृद्धि करने के लिए सहसंबद्ध या सिकुड़ा बलों 6,18-20 कमी आई है के रूप में वर्तमान अध्ययन संघर्ष। इसके अलावा, यह इन बलों सीधे invadopodia गतिविधि 21 मध्यस्थता चाहे अनजान बनी हुई है। हमने हाल ही में कैंसर सेल सिकुड़ा बलों मैट्रिक्स कठोरता पर निर्भर थे और invadopodia 5 से ईसीएम गिरावट के भविष्य कहनेवाला थे पाया। इन परिणामों के सेलुलर बलों invadopodia एसी मध्यस्थता से कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैंट्यूमर microenvironment के यांत्रिक गुणों के जवाब में tivity।

कैंसर की कोशिकाओं को 5 में से आक्रामक और सिकुड़ा गुण सहसंबंधी करने के लिए, हम पहले से कठोरता निर्भर invadopodia गतिविधि 4,12,22 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि विभिन्न कठोर साथ पास बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल संशोधित। रासायनिक पास भर में मानव प्लाज्मा फ़ाइब्रोनेक्टिन crosslinking करके, इन संशोधित हाइड्रोजेल कोशिकाओं दोनों प्रयोगों 5 में एक ही कठोर अनुभवी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए invadopodia और कर्षण बल assays के दोनों के लिए आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Invadopodia assays में, फ़ाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स गिरावट का पता लगाने के पास करने के लिए मढ़ा ईसीएम लिंक करने के लिए जिलेटिन के लिए एक प्राकृतिक बाध्यकारी डोमेन प्रदान करता है। कर्षण बल assays में, फ़ाइब्रोनेक्टिन सेलुलर कर्षण बलों की गणना करने के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्फीयर विस्थापन का पता लगाने के लिए सीधी सेलुलर आसंजन के लिए एक ligand प्रदान करता है। हम कड़ी मेहनत, मुलायम बुलाया है क्या में इस पद्धति का परिणाम है,और सामान्य और कैंसर के ऊतकों 23 के लिए सूचना दी यांत्रिक गुणों की सीमा अवधि जो पा 5 1023, 7307, और 22,692 की, गिलास नीचे बर्तन करने के लिए बाध्य है और लोचदार moduli, ई कर रहे हैं कि कठोर पास।

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Protocol

पास के लिए कांच coverslips के 1. तैयारी

  1. कम एक प्रकार का वृक्ष पोंछे के साथ स्वच्छ 12 मिमी coverslips।
  2. ज्वाला 12 मिमी coverslips और चिमटी का उपयोग कर एक लेम्प बर्नर लौ के माध्यम से उन्हें पारित करके प्रत्येक 35 मिमी गिलास नीचे पकवान की microwell में 14 मिमी coverslip के।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1 एन NaOH के 200 μl साथ microwells समझो।
  4. महाप्राण और हवा में 30 मिनट के लिए microwells सूखी।
  5. धूआं हुड में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3-Aminopropyltrimethoxysilane के 50-100 μl साथ microwells समझो। इस रसायन प्लास्टिक के साथ प्रतिक्रिया करता है; इसलिए, कांच pipettes का उपयोग करें और पकवान प्लास्टिक के साथ संपर्क से बचने के लिए पूरी तरह से microwells भर नहीं है।
  6. 3-Aminopropyltrimethoxysilane स्पष्ट हो जाता है जब तक लगभग 10 मिनट के लिए ultrapure पानी के साथ microwells धो लें।
  7. Ultrapure पानी में दो बार एक निचोड़ बोतल का उपयोग कर के साथ microwells कुल्ला।
  8. Ultrapure पानी एक के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धोएं10 मिनट के लिए एक मध्यम गति (~ 1 हर्ट्ज) पर सेट एक घुमाव पर टी कमरे के तापमान।
  9. महाप्राण और हवा में 30 मिनट के लिए microwells सूखी।
  10. 30 मिनट के लिए एक मध्यम गति (~ 1 हर्ट्ज) पर सेट एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 0.5% glutaraldehyde समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ microwells समझो।
  11. 10 मिनट के लिए मध्यम गति (~ 1 हर्ट्ज) पर सेट एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर ultrapure पानी के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धो लें। 30 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।
  12. 30 मिनट के लिए एक खड़ी कोण (60º या अधिक) पर सूखी microwells।
    नोट: व्यंजन dessicator में दो महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

Invadopodia Assays के लिए पास के 2. तैयारी

  1. मुलायम PAA (8% एक्रिलामाइड और 0.05% बीआईएस) के 1 मिलीलीटर समाधान के लिए, 40% acrylamide का 200 μl, 2% भारतीय मानक ब्यूरो के 25 μl, और ultrapure पानी के 574 μl (तालिका 1) गठबंधन।
  2. मुश्किल PAA (8% एक्रिलामाइड और 0.35% बीआईएस) के 1 मिलीलीटर समाधान के लिए, 40% एक्रिलामाइड, 175 & # 200 के μl गठबंधन181, एल 2% की भारतीय मानक ब्यूरो, और ultrapure पानी के 409 μl (1 टेबल)।
  3. कठोर PAA (12% एक्रिलामाइड और 0.60% बीआईएस) के 1 मिलीलीटर समाधान के लिए, 40% acrylamide का 300 μl, 2% भारतीय मानक ब्यूरो के 300 μl, और ultrapure पानी के 169 μl (तालिका 1) गठबंधन।
  4. 15 मिनट के लिए समाधान देगास। क्रमशः, मुलायम मुश्किल है, और कठोर PAA समाधान करने के लिए ultrapure पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल मानव प्लाज्मा फ़ाइब्रोनेक्टिन के 200, 215, और 230 μl जोड़ें। सभी समाधान के लिए, 10 मिलीग्राम / एमएल एक्रिलिक एसिड एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर की एक μl, एक 100 मिलीग्राम / एमएल अमोनियम persulfate के 5 μl, और एन, एन, एन ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED के 2 μl जोड़ने ; 1 टेबल)। कोमल pipetting के साथ मिक्स और समाधान में बुलबुले बनाने से बचें।

PAA
(1 मिलीलीटर)
40%
ए.ए.
(Μl)
2%
(Μl)
Ultrapure
वाटर
(Μl)
1 मिलीग्राम / मिलीलीटर
एफ एन
(Μl)
10 मिलीग्राम / मिलीलीटर
एनएचएस एस्टर
(Μl)
100 मिलीग्राम / मिलीलीटर
ए पी एस
(Μl)

TEMED
(Μl)
लोचदार
मापांक
(पा)
शीतल 200 25 574 200 1 5 2 1023
मुश्किल 200 175 409 215 1 5 2 7307
कठोर 300 300 169 230 1 5 2 22,692

तालिका 1: संघटक voluएमईएस और invadopodia assays में इस्तेमाल किया, मुलायम मुश्किल है, और कठोर पास के लिए लोचदार moduli जिसके परिणामस्वरूप। ए.ए. = एक्रिलामाइड, एफ एन फ़ाइब्रोनेक्टिन, ए पी = अमोनियम persulfate =।

  1. प्रत्येक microwell के केंद्र के लिए पर PAA समाधान के 8.48 μl पिपेट।
    नोट: यह मात्रा सैद्धांतिक रूप से मोटाई में 75 माइक्रोन का एक PAA पैदावार।
  2. धीरे चिमटी का उपयोग कर microwell में छोटी बूंद के लिए पर 12 मिमी coverslip के flamed ओर कम है।
  3. Sandwiched PAA समाधान 15-30 मिनट के लिए भाजन करने की अनुमति दें। बचे हुए समाधान की जाँच करके polymerization की जाँच करें।
  4. प्रत्येक पकवान 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें और चिमटी के साथ 12 मिमी coverslips निकालें।
    नोट: 10x पीबीएस प्रयोगशाला में की गई और 0.011 एम के.एच. 2 पीओ 4, 1.54 एम NaCl, और .056 एम ना 2 HPO 4 से बना है।
  5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धो लें। 15 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।

3. पीकर्षण बल Assays के लिए पास की मरम्मत

  1. मुलायम PAA (8% एक्रिलामाइड और 0.05% बीआईएस) के 1 मिलीलीटर समाधान के लिए, 40% acrylamide का 200 μl, 2% भारतीय मानक ब्यूरो के 25 μl, और ultrapure पानी के 566 μl (तालिका 2) गठबंधन।
  2. मुश्किल PAA (8% एक्रिलामाइड और 0.35% बीआईएस) के 1 मिलीलीटर समाधान के लिए, 40% acrylamide का 200 μl, 2% भारतीय मानक ब्यूरो के 175 μl, और ultrapure पानी के 401 μl (तालिका 2) गठबंधन।
  3. कठोर PAA (12% एक्रिलामाइड और 0.60% बीआईएस) के 1 मिलीलीटर समाधान के लिए, 40% acrylamide का 300 μl, 2% भारतीय मानक ब्यूरो के 300 μl, और ultrapure पानी के 161 μl (तालिका 2) गठबंधन।
  4. 15 मिनट के लिए समाधान देगास। क्रमशः, मुलायम मुश्किल है, और कठोर PAA समाधान करने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल मानव प्लाज्मा फ़ाइब्रोनेक्टिन के 200, 215, और 230 μl जोड़ें। Sonicate 30 सेकंड के लिए 200 एनएम लाल फ्लोरोसेंट microspheres (580/605 एनएम / उत्तेजना उत्सर्जन) के 8 μl। प्रत्येक समाधान के लिए, 200 एनएम लाल फ्लोरोसेंट microspheres की 8 μl जोड़ने10 मिलीग्राम / एमएल एक्रिलिक एसिड एनएचएस एस्टर की एक μl, एक 100 मिलीग्राम / एमएल अमोनियम persulfate के 5 μl, और TEMED (तालिका 2) के 2 μl। कोमल pipetting के साथ मिक्स और समाधान में बुलबुले बनाने से बचें।

PAA
(1 मिलीलीटर)
40%
ए.ए.
(Μl)
2%
भारतीय मानक ब्यूरो
(Μl)
Ultrapure
वाटर
(Μl)
1 मिलीग्राम / मिलीलीटर
एफ एन
(Μl)

माइक्रो क्षेत्रों
(Μl)
10 मिलीग्राम / मिलीलीटर
एनएचएस एस्टर
(Μl)
100 मिलीग्राम / मिलीलीटर
ए पी एस
(Μl)

TEMED
(Μl)
लोचदार
मापांक
(पा)
शीतल 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
मुश्किल 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
कठोर 300 300 161 230 8 1 5 2 22,692

तालिका 2:। संघटक मात्रा और कर्षण बल assays में इस्तेमाल किया, मुलायम मुश्किल है, और कठोर पास के लिए लोचदार moduli जिसके परिणामस्वरूप ए.ए. = एक्रिलामाइड, एफ एन फ़ाइब्रोनेक्टिन, ए पी = अमोनियम persulfate =।

  1. प्रत्येक microwell के केंद्र के लिए पर PAA समाधान के 8.48 μl पिपेट।
    नोट: यह मात्रा सैद्धांतिक रूप से मोटाई में 75 माइक्रोन का एक PAA पैदावार।
  2. धीरे वीं के flamed ओर कमचिमटी का उपयोग कर microwell में छोटी बूंद के लिए पर ई 12 मिमी coverslip के।
  3. Sandwiched PAA समाधान 15-30 मिनट के लिए भाजन करने की अनुमति दें। बचे हुए समाधान की जाँच करके polymerization की जाँच करें।
  4. प्रत्येक पकवान 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें और चिमटी के साथ 12 मिमी coverslips निकालें।
  5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धो लें। 15 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।

Invadopodia Assays के लिए ईसीएम 4. तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए जिलेटिन समाधान (1% जिलेटिन और 1% सूक्रोज) गर्मी।
  2. एक 45 डिग्री के कोण पर गिलास नीचे व्यंजन पकड़े जब microwells के नीचे से ध्यान से महाप्राण तो एक मिनट के लिए जिलेटिन समाधान के 150 μl के साथ पास समझो।
  3. 60 मिनट के लिए सुखाने अनुकूलन करने के लिए एक खड़ी कोण (60 डिग्री या अधिक) पर microwells में पास पर जिलेटिन की शेष पतली परत सूखी।
  4. मैं पर एक ठंडा 0.5% glutaraldehyde समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ microwells समझो30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के द्वारा पीछा किया 15 मिनट के लिए CE।
  5. 5 मिनट के लिए एक 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धो लें। 15 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।
  6. एक मिनट के लिए एक सोडियम borohydride समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ microwells समझो। धीरे जिलेटिन की सतह पर है कि फार्म बुलबुले को दूर करने के लिए बेंच पर बर्तन नल।
  7. महाप्राण 5 मिनट के लिए एक 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धोने और। 15 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।
  8. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 175.000 XG पर 50 माइक्रोग्राम प्रति / एक 1x पीबीएस के साथ मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज के लिए एक FITC लेबल मानव प्लाज्मा fibronectin समाधान पतला। या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेबल किया फ़ाइब्रोनेक्टिन खरीद या इस प्रकार के रूप में यह लेबल:
    1. डायलिसिस ट्यूबिंग में borate बफर (170 मिमी सोडियम metaborate tetrahydrate और 40 मिमी NaCl) और जगह के 10 एमएल में फ़ाइब्रोनेक्टिन की 5 मिलीग्राम भंग।
    2. एक चुंबकीय दोषी पर कमरे के तापमान पर भंग FITC के 6 मिलीग्राम से युक्त borate बफर के 200 मिलीलीटर में ट्यूबिंग रखकर फ़ाइब्रोनेक्टिन लेबलअंधेरे में 1.5 घंटे के लिए सबसे कम सेटिंग पर सेट करें।
    3. दो मात्रा के साथ एक अंधेरे ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में तीन दिनों के लिए सबसे कम सेटिंग पर सेट एक चुंबकीय दोषी पर एक 1x पीबीएस के 500 मिलीलीटर के साथ dialyze एक दिन बदलता है।
    4. (1: 200) पतला aliquots की ऑप्टिकल घनत्व के आधार पर गणना FITC लेबल फ़ाइब्रोनेक्टिन एकाग्रता 280 एनएम और 493 एनएम के रूप में [आयुध डिपो - 280 (0.36 एक्स आयुध डिपो 493)] / 1.4 गुना 200 बार 2 के कमजोर पड़ने कारक (जो खातों मिलीग्राम / एमएल इकाइयों में जिसके परिणामस्वरूप अगले चरण में फ़ाइब्रोनेक्टिन ध्यान केंद्रित ग्लिसरॉल) के लिए।
    5. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे ठंडे कमरे में सबसे कम सेटिंग पर सेट एक चुंबकीय दोषी पर एक 50% ग्लिसरॉल समाधान में रात भर dialyze।)
  9. अंधेरे में 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर FITC लेबल fibronectin समाधान के 150 μl साथ microwells समझो।
  10. पर गिलास नीचे व्यंजन पकड़े ध्यान से जब microwells के नीचे से FITC लेबल fibronectin समाधान महाप्राणएक 45 डिग्री के कोण और उसके बाद नसबंदी के लिए एक अंधेरे सेल संस्कृति हुड में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल समाधान के साथ गिलास नीचे बर्तन भरें। इसके अलावा गिलास नीचे पकवान पलकों को भरने या 70% इथेनॉल में भिगो कम एक प्रकार का वृक्ष पोंछे के साथ साफ साफ।
  11. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ उन्हें भरने के द्वारा गिलास नीचे बर्तन धो लें। 15 मिनट की कुल के लिए 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार दोहराएँ।

Invadopodia assays के 5. तैयारी और इमेजिंग

  1. (: 1 DMEM और 5% कम प्रोटीन सीरम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, और हौसले से जोड़ा epidermal वृद्धि कारक के 20 एनजी / एमएल के साथ 1640 RPMI 1) गिलास नीचे बर्तन करने के लिए और invadopodia मध्यम 2 मिलीलीटर में 25,000 कैंसर की कोशिकाओं को जोड़ें रातोंरात सेते हैं।
  2. महाप्राण कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक 3.7% paraformaldehyde के समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ microwells इलाज के लिए और।
  3. 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ दो त्वरित washes के बाद, कमरे Tempe में 0.1% ट्राइटन X-100 समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ microwells इलाज5 मिनट के लिए अंधेरे में rature कोशिकाओं permeabilize करने के लिए।
  4. 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक त्वरित धोने के बाद, 3% गोजातीय सीरम albumin 60 मिनट कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर अवरुद्ध समाधान के साथ microwells इलाज करते हैं।
  5. 60 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर अवरुद्ध समाधान में: माउस विरोधी cortactin एंटीबॉडी (750 1) के 150 μl साथ microwells सेते हैं।
  6. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धो लें। 15 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।
  7. (: 500 1) और 546 phalloidin (1: 750) 60 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर अवरुद्ध समाधान में बकरी के 150 μl विरोधी माउस 633 एंटीबॉडी के साथ microwells सेते हैं।
  8. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ microwells धो लें। 15 मिनट की कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।
  9. प्रत्येक microwell भरने और 22 एक्स 22 coverslips के साथ कवर करने के लिए बढ़ते मध्यम के छह बूँदें जोड़ें।
  10. छवि cortactin और actin 632/647 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग invadopodia की पहचान करने और556/570 एनएम, क्रमशः, एक व्यापक क्षेत्र उलटा माइक्रोस्कोप पर एक उच्च एनए, 40X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग। इसी तरह, छवि फ़ाइब्रोनेक्टिन 492/518 एनएम के एक उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग ईसीएम गिरावट की पहचान करने के लिए।

6. तैयारी और कर्षण बल assays के इमेजिंग

  1. गिलास नीचे बर्तन को invadopodia मध्यम 2 मिलीलीटर में 15,000 कैंसर की कोशिकाओं को जोड़ें और रातोंरात सेते हैं।
  2. गिलास नीचे बर्तन में महाप्राण मध्यम और उसी की खुराक (5% कम प्रोटीन सीरम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, और हौसले से जोड़ा epidermal वृद्धि कारक के 20 एनजी / एमएल), पूर्व के साथ, एल 15 मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ की जगह 37 डिग्री सेल्सियस के लिए -warmed।
  3. एक औंधा माइक्रोस्कोप 1 घंटे के लिए उच्च नमी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व equilibrated पर एक पर्यावरण कक्ष में कांच के नीचे व्यंजन सेते हैं।
  4. सेलुलर पदों को चिह्नित करने के लिए एक उच्च एनए, एक स्वचालित मंच के साथ एक व्यापक क्षेत्र उलटा माइक्रोस्कोप पर 40X लेंस का उपयोग कर छवियों के चार सेट लें:
    1. पर छवि कोशिकाओंचरण विपरीत ("चरण" छवि) का उपयोग कर पास के पी।
    2. पास के शीर्ष पर microspheres की पहली परत जब तक कोशिकाओं के तहत थोड़ा ध्यान केंद्रित करके 560/645 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर छवि फ्लोरोसेंट microspheres के ध्यान में आता है (छवि "पर बल दिया")।
    3. इसके अलावा, (मार्कर के रूप में microspheres का उपयोग करते हुए) पास की तह तक ध्यान केंद्रित करने और ("नीचे" छवि) एक छवि ले। नोट: इस छवि के प्रयोजन के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में वर्णित कर्षण बल की गणना के लिए प्रत्येक स्थिति में वास्तविक PAA मोटाई पाने के लिए Z-स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए है।
    4. इन छवियों को कई पदों पर अधिग्रहण किया गया है, के बाद धीरे कोशिकाओं को हटाने के लिए 10% ट्राइटन एक्स समाधान के 220 μl में मिश्रण। पहले से वर्णित ("अशक्त" छवि) के रूप में प्रत्येक स्थिति में पास के शीर्ष पर छवि microspheres।

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Representative Results

Invadopodia परख में, invadopodia आम तौर पर सेल शरीर के भीतर कबरा संरचनाओं में actin और cortactin तरह मार्कर (चित्रा 1) की colocalization द्वारा पहचाने जाते हैं। दोनों सक्रिय रूप से अपमानजनक और गैर अपमानजनक invadopodia गिना जा सकता है और इन संरचनाओं FITC लेबल फ़ाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 1) में फ्लोरोसेंट संकेत कमी काले क्षेत्रों के साथ colocalized कर रहे हैं कि क्या से भेदभाव कर रहे हैं। Invadopodia मैन्युअल रूप से गिने जाते हैं, और सेल प्रति ईसीएम गिरावट मैन्युअल रूप से कोशिकाओं की रूपरेखा के भीतर इन काले क्षेत्रों thresholding द्वारा निर्धारित किया जाता है।

कर्षण बल परख में, चार छवियों चरण स्थिति (चित्रा 2) द्वारा चिह्नित प्रत्येक सेलुलर स्थान पर कब्जा कर रहे हैं। सबसे पहले, "चरण" और छवियों ब्याज की कोशिकाओं के सभी के लिए लिया जाता है "पर बल दिया"। PAA की एक "नीचे" छवि भी हाइड्रोजेल मोटाई की गणना करने के क्रम में एक स्थान पर ले जाया जाता है। टी को हटाने के बादवह कोशिकाओं, एक "शून्य" छवि प्रत्येक चिह्नित चरण की स्थिति में ले लिया है। पास में विकृतियों गणना "पर बल दिया" और "शून्य" छवियों के बीच माइक्रोस्फीयर स्थिति में परिवर्तन के आधार पर कर रहे हैं। ये विस्थापन और पास (0.5 के रूप में ग्रहण ई और प्वासों अनुपात) के यांत्रिक गुणों तो कर्षण बल (चित्रा 2) की गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। कई अलग अलग तरीकों एक अनंत लोचदार आधी जगह 25 के लिए Boussinesq समाधान के कुछ निर्माण के आधार पर कर्षण बलों 24 की गणना के लिए मौजूद हैं। इन विश्लेषण का ब्यौरा इस पाठ के दायरे से बाहर हैं, हम कर्षण बलों 26 की गणना के लिए एक पहले से वर्णित विधि का उपयोग करता है, जो बोस्टन विश्वविद्यालय में मीका Dembo से LIBTRC सॉफ्टवेयर लाइसेंस प्राप्त किया है। यह विशेष रूप से कम्प्यूटेशनल विधि डि के आधार पर गणना की है, जो प्रत्येक स्थिति में पास की मोटाई की आवश्यकता है जो अपनी गणना में परिमित मोटाई के लिए क्षतिपूर्ति"जोर" और "नीचे" छवियों के Z स्थिति में fference। कई अनुसंधान समूहों समान कंप्यूटर संकुल उपलब्ध है या अपने स्वयं के कार्यक्रमों लिखने के लिए चुनते हैं। इसके अलावा, अन्य तरीकों अलग गणितीय दृष्टिकोण से 24 के आधार पर कर्षण बलों की गणना के लिए मौजूद हैं।

चित्रा 1
चित्रा 1: invadopodia परख invadopodia और संबद्ध ईसीएम गिरावट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है invadopodia का उदाहरण व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति छवियों को एक एस सी सी-61 (सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा) सेल में 1% जिलेटिन और FITC- के साथ एक मुश्किल PAA पर। लेबल वाले फ़ाइब्रोनेक्टिन। Invadopodia आम तौर पर इस तरह के actin और cortactin के रूप में दो मार्कर (ओवरले छवि में लाल और नीले, क्रमशः) की colocalization द्वारा पहचाने जाते हैं। Invadopodia रूप quantitated किया जा सकता है दोनों सक्रिय रूप से (काली क्षेत्रों कमी के साथ colocalized अपमानजनकFITC पीले तीर से चिह्नित संकेत के रूप में) और सफेद तीर से चिह्नित गैर अपमानजनक () आईएनजी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2:। कर्षण बल परख (एक कठिन PAA पर एक एस सी सी-61 सेल के पास उदाहरण व्यापक क्षेत्र चरण और प्रतिदीप्ति छवियों में एम्बेडेड microspheres की विस्थापन पर नज़र रखने से actin cytoskeleton द्वारा उत्पन्न सेलुलर कर्षण बलों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है "चरण"), और PAA के ऊपर की सतह पर सेल के तहत सीधे microspheres () "पर बल दिया"। PAA के नीचे की एक छवि भी बाद में अपने स्थानीय मोटाई ("नीचे") की गणना करने के लिए लिया जा सकता है। सेल निकाल दिया जाता है के बाद, एक छवि एक बार फिर microsphere के लिए लिया जाता हैPAA ("अशक्त") के ऊपर की सतह पर है। बीच microsphere पदों "पर बल दिया" और "शून्य" छवियों के एक उपज के लिए लगाया जा सकता है "विस्थापन क्षेत्र।" Microsphere विस्थापन और PAA यांत्रिक गुणों तो एक गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है "कर्षण वेक्टर क्षेत्र।" एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।

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Discussion

हम आक्रामक और सिकुड़ा सेलुलर व्यवहार सहसंबंधी invadopodia और कर्षण बल assays के लिए आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि पास fabricating के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। पास लंबे समय से कोशिकाओं पर कठोरता प्रभाव को देखो और कर्षण बलों 18,24,27 गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, वहीं इस प्रोटोकॉल मैट्रिक्स के जवाब में आक्रामक और सिकुड़ा सेलुलर व्यवहार सहसंबंधी एक ही कठोर के साथ पास के आधार पर समानांतर assays के विकसित करने के लिए सबसे पहले है यांत्रिक गुणों। ठीक से गिलास नीचे व्यंजन की coverslips को सक्रिय पास उन्हें करने के लिए बाध्य है और बंद नहीं आ जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है। हम और दूसरों के अतीत 4,12,28 में पास की सतह के लिए जिलेटिन बाध्य करने के लिए इस तरह के sulfo-SANPAH और एक्रिलिक एसिड एनएचएस एस्टर के रूप में अभिकर्मकों पर भरोसा किया है, वहीं हम इन तरीकों फ़ाइब्रोनेक्टिन की मज़बूती वर्दी सतह परतों का उत्पादन नहीं किया पाया कि । प्रदर्शन के रूप में इसलिए, फ़ाइब्रोनेक्टिन एक्रिलिक एसिड एनएचएस एस्टर का उपयोग कर एम्बेडेड और पास भर crosslinked किया गया थाअन्य समूहों 29,30 से। हालांकि, फ़ाइब्रोनेक्टिन की बढ़ती सांद्रता, मुलायम मुश्किल है, और कठोर पास 5 की सतहों पर ही ligand के घनत्व उपज के क्रम में आवश्यक थे। इसके अतिरिक्त, फ़ाइब्रोनेक्टिन (लेकिन नहीं की microspheres) का समावेश क्रमशः, पा 5 1023, 7307, और 22,692 करने के लिए 1071, 9299, और 28,283 पा 4 से, मुलायम मुश्किल है, और कठोर पास के यांत्रिक गुणों कम कर दिया। हालांकि, इन कम लोचदार moduli मूल्यों अभी भी सामान्य और कैंसर के ऊतकों 23 की रेंज घेर लिया। पास के संग्रहण moduli आसानी rheometry से मापा और लोचदार moduli 1,4 करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल कम करने और हटाने, सीधे आगे है जबकि 12 मिमी coverslips के सबसे कठिन कदम उठाए हैं और अभ्यास की आवश्यकता है। एक coverslip को कम जब सबसे बड़ी चुनौती PAA समाधान किसी भी बुलबुले या splashing के बिना समान रूप से फैलता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है। एक coverslip की आवश्यकता निकाला जा रहा हैआदेश में एक स्थिर हाथ 12 मिमी coverslip, गिलास नीचे 14 मिमी coverslip के, या PAA नुकसान नहीं करने के लिए। हम हटाने में सहायता करने के लिए 12 मिमी coverslip पर हाइड्रोफोबिक कोटिंग्स की कोशिश की लेकिन पास उनके सतहों में पैटर्न के साथ छोड़ दिया जाता है कि मिल गया है। ठीक टिप और कम करने और 12 मिमी coverslips दूर करने के लिए पतली, चप्पू शैली चिमटी का उपयोग करते हैं, क्रमशः, अत्यधिक की सिफारिश की है। कुछ प्रकार की कोशिकाओं खुर्दबीन पर केंद्रित प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं क्योंकि इसके अलावा, छवि के लिए प्रयोग किया जाता है प्रकाश की मात्रा कोशिकाओं को कम से कम किया जाना चाहिए। हमारे खुर्दबीन पर हमारे पर्यावरण कक्ष सीओ 2 के लिए सुसज्जित नहीं है, क्योंकि इसके अलावा, एल 15 मध्यम कर्षण बल assays के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक ही की खुराक स्थितियों में एक ही रखने की कोशिश में invadopodia और कर्षण बल assays के लिए मीडिया में इस्तेमाल किया गया है, जबकि सीओ 2 का स्तर नियंत्रित किया जा सकता है, तो DMEM और 1640 RPMI एल-15 के बजाय प्रयोग किया जा सकता है।

PAA समाधान की मात्रा सैद्धांतिक रूप से y के लिए चुना गया था जबकि75 माइक्रोन की मोटाई के साथ ield जैल, उनकी मोटाई आमतौर पर 30-60 माइक्रोन के बीच बदलती हैं। हालांकि, इस रेंज में अच्छी तरह से कोशिकाओं गिलास नीचे व्यंजन 31 coverslips के अंतर्निहित कठोरता समझ सकते हैं, जिस पर मूल्य से ऊपर है। इसके अलावा, ईसीएम परत की मोटाई पहले के रूप में लगभग एक माइक्रोन मोटाई 12 में सूचित किया गया गिरावट (जिलेटिन और FITC लेबल फ़ाइब्रोनेक्टिन पास करने पर मढ़ा) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया; इसलिए, इस पतली परत के पास की कठोर से कोशिकाओं को ढाल नहीं करता है। हालांकि, ठोस मलबे, दरारें, और पास और / या ईसीएम परत में या तो अन्य विकृति व्यक्ति सेलुलर आक्रामक और सिकुड़ा गुणों को प्रभावित कर सकते हैं। इन समस्याओं के हाइड्रोजेल, ईसीएम परत ख़राब है कि बुलबुले छोड़ सकते हैं जो जैल और / या जिलेटिन की अत्यधिक सुखाने, और सोडियम borohydride के अधूरे आकांक्षा में मलबे परिचय कि अशुद्ध 12 मिमी coverslips के कारण हो सकता है। सीई का चयन इसलिए, जब ध्यान रखा जाना चाहिएइमेजिंग के लिए LLS वे अनावश्यक रूप से नमूनों की सतहों में स्थानीय अनियमितताओं से प्रभावित नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए।

इस्तेमाल किया गया है और (50 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में जिलेटिन पर मढ़ा) ईसीएम परत (200-230 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से कम में मिश्रित) दोनों पास में फ़ाइब्रोनेक्टिन के अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता; हालांकि, या तो सतह पर वास्तविक सांद्रता सीधे मापा नहीं किया गया है। प्रत्येक सतह फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ संतृप्त किया जाना प्रतीत होता है जबकि कोशिकाओं दो assays के बीच एक ही सटीक ligand के घनत्व का अनुभव है, चाहे यह स्पष्ट नहीं है। कर्षण बल assays के लिए, एक के कमजोर पड़ने पर 200 एनएम की microspheres: 125 इमेजिंग के लिए इष्टतम साबित किया है। हालांकि, यह अलग व्यास या dilutions की microspheres का उपयोग अन्य समूहों को खोजने के लिए काफी आम है। बड़ा microspheres दरारें और विकृति के कारण होता है, जबकि इस प्रणाली में, छोटे microspheres, पास के भीतर ब्राउनियन गति का प्रदर्शन किया। इन टिप्पणियों के कारण पास के भौतिक गुणों की संभावना है (यानी

कुल मिलाकर, इन प्रयोगात्मक कारकों में से कई ऐसे अन्य इमेजिंग क्षमताओं के साथ विभिन्न यांत्रिक गुणों के साथ पास, आक्रामक और सिकुड़ा गुण बदलती के साथ कैंसर की कोशिकाओं, और माइक्रोस्कोपी प्रणाली के रूप में उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। acrylamide का अनुपात: भारतीय मानक ब्यूरो के समान या अलग लोचदार moduli और 27 crosslinking के साथ पास के उत्पादन के लिए अलग किया जा सकता है। कर्षण बल assays के संवेदनशीलता कठोरता और / या माइक्रोस्फीयर dilut बदलकर अलग सेलुलर बल के स्तर के लिए खाते में समायोजित किया जा सकता हैआयन। विभिन्न fluorophores भी माइक्रोस्कोप विशिष्टताओं के आधार पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ़ाइब्रोनेक्टिन लेबलिंग के लिए चुना जा सकता है। FITC ब्लीच करता है, यह काफी उज्ज्वल बनाने ईसीएम गिरावट आसानी से पहचाना है। हालांकि, invadopodia और छोटे microspheres की प्रतिदीप्ति इमेजिंग आमतौर पर इष्टतम समाधान के लिए उच्च एनए उद्देश्यों की आवश्यकता है। इसके अलावा, दोनों assays के अच्छी तरह से प्लेट में कांच coverslips पर प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, गिलास नीचे व्यंजन तैयार करने और प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान उपयोग करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं। भविष्य में, एक में इन assays के संयोजन ईसीएम गिरावट और सेलुलर बल पीढ़ी दोनों के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति होगी। हालांकि, कई तकनीकी चुनौतियों invadopodia और microbead displacements के लिए जीना सेल इमेजिंग, प्रकाश के लिए बढ़ा सेलुलर जोखिम, FITC फ़ाइब्रोनेक्टिन की विरंजन सहित उठता है, और होता कर्षण बलों को पूरी तरह से PAA सतहों के लिए fluorescently जुड़ा हुआ पार लेबल और ईसीएम परत के माध्यम से transduced कर रहे हैं कि क्या ।

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Disclosures

इस काम अवार्ड संख्या K25CA143412 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (पारेख) द्वारा समर्थित किया गया। हम अतिरिक्त समर्थन ओटोलर्यनोलोजी विभाग द्वारा प्रदान की गई थी कि स्वीकार करना चाहते हैं। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Acknowledgements

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

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