聚丙烯酰胺凝胶侵袭伪足和牵引力化验的肿瘤细胞

1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center
Medicine

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Summary

在肿瘤微机械刚性起着通过增加侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩驱动恶性行为了至关重要的作用。用聚丙烯酰胺凝胶(部分分配),侵袭伪足和牵引力测定可以被用于研究癌细胞的侵入性和收缩特性响应于矩阵刚性。

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Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

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Abstract

刚性肿瘤组织中一直强烈牵连在调节癌细胞的迁移和侵袭。通过交联组织侵袭性迁移是由肌动蛋白富突起称为侵袭伪足该蛋白水解降解细胞外基质(ECM)提供便利。侵袭伪足的活动已被证明是依赖于ECM的刚性和癌细胞收缩力表明刚性信号可以通过肌动球蛋白收缩调节这些亚细胞结构。癌细胞的侵袭性和收缩性能可在体外使用基于不同的刚性聚丙烯酰胺凝胶(分配数量)侵袭伪足和牵引力试验相关。癌细胞的侵袭性和收缩性能可在体外使用基于不同的刚性聚丙烯酰胺凝胶(分配数量)侵袭伪足和牵引力试验相关。而在两个测定之间一些变型存在,这里介绍的协议提供了用于第创建部分分配的方法在可以在两个测定中使用,并且很容易适应用户的特定生物和技术的需求。

Introduction

肿瘤相关的ECM的刚性已被确定为在通过增加肌动球蛋白收缩1-3找到恶性行为一显著因素。虽然这种效应已主要被证明与乳腺癌细胞,基质刚性已经发现改变从多种癌症4-8表明肿瘤刚度可以以其它类型的癌症中发挥作用的来源的细胞侵入性。渗透侵入迁移过程中,交联组织,癌细胞利用肌动蛋白丰富的被称为侵袭伪足的本地化蛋白酶来灶性降低ECM 9粘合突起。侵袭伪足被认为是侵入细胞的标志,并有牵连的肿瘤细胞浸润和转移10,11。以前的工作已经表明,基质刚度可以调节侵袭伪足数目和通过肌球蛋白II活性和机械敏感蛋白12相关的ECM降解4,12。鉴于肿瘤密度和癌症侵袭性13,14之间的相关性,这些结果表明通过该癌细胞可能响应刚性肿瘤组织通过肌动球蛋白收缩驱动侵袭和转移的机制。

在体外 ECM刚性和体内组织密度已显示调节癌细胞1,15-17侵袭行为。而肌动球蛋白收缩似乎是重要的在此过程中,目前的研究冲突,以转移能力是否相关,增加或减少收缩力6,18-20。此外,目前还不清楚是否这些力量直接介导侵袭伪足的活动21。我们最近发现,肿瘤细胞收缩力是依赖于矩阵的刚度和被预测ECM降解受侵袭伪足5。这些结果表明,蜂窝力可能通过介导侵袭伪足的交流在癌症发展中起重要作用tivity响应于肿瘤微环境的机械性能。

为了关联癌细胞5侵袭和收缩性能,我们修改了协议,用于创建分配数量与以前用于调查的刚性依赖的侵袭伪足的活动4,12,22不同的僵化。通过化学整个部分分配交联的人血浆纤连蛋白,这些修改后的水凝胶可以用作基础为侵袭伪足和牵引力试验,以确保细胞经历了同样的刚性在两个实验5。在侵袭伪足测定中,纤连蛋白提供了天然的结合域为明胶以重叠的ECM链接到部分分配给检测基质降解。在牵引力测定中,纤连蛋白提供的配体的直接的细胞粘连,以检测用来计算蜂窝牵引力微球的位移。这种方法会导致我们所谓的软,硬,和僵化的分配数量绑定到玻璃底菜,并有弹性模量,E,1023,7307和22692帕5的跨度报道了正常和癌变组织23机械性能的范围内。

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Protocol

1.准备盖玻片的分配数量

  1. 清洁12毫米盖玻片低棉绒抹布。
  2. 火焰12毫米盖玻片和14毫米盖玻片在35个毫米的玻璃底菜的微孔,通过使用镊子本生灯火焰传递它们。
  3. 对待微孔用200μl的0.1N NaOH中进行5分钟,在室温下进行。
  4. 吸液和空气干燥的微孔30分钟。
  5. 对待微孔用50-100微升3-氨基丙基三甲为10分钟,在室温下于通风柜。这种化学反应,用胶;因此,使用玻璃吸管,不填微孔完全避免与菜的塑料接触。
  6. 洗用超纯水微孔约10分钟,直到3-氨基丙基三甲变得清晰。
  7. 冲洗用的超纯水两次用挤压瓶的微孔。
  8. 用2毫升的超纯水洗涤微孔吨室温在摇杆定在一个中等速度(约1赫兹)10分钟。
  9. 吸液和空气干燥的微孔30分钟。
  10. 对待微孔用2ml 0.5%戊二醛溶液在室温下于一摇臂设置在中等速度(约1赫兹)30分钟。
  11. 在室温下于一摇臂设置以中速(约1赫兹)10分钟洗涤用2毫升的超纯水的微孔。重复2次以上,总共30分钟。
  12. 干微孔在一个陡峭的角度(60°或更大)30分钟。
    注:盘可以存储2个月在干燥器。

2.准备的PaaS的侵袭伪足测定

  1. 为软的PAA(8%丙烯酰胺和0.05%BIS)的1毫升溶液,结合加入200μl40%的丙烯酰胺,25微升的2%的BIS,以及574微升的超纯水( 表1)。
  2. 对于硬的PAA(8%丙烯酰胺和0.35%BIS)的1毫升溶液,结合加入200μl40%的丙烯酰胺,175#的181;升2%的BIS,和409微升的超纯水( 表1)。
  3. 为刚性的PAA(12%丙烯酰胺和0.60%BIS)的1毫升溶液,结合300微升40%的丙烯酰胺,300微升2%的BIS,以及169微升的超纯水( 表1)。
  4. 脱气15分钟的解决方案。在超纯水中添加200,215,和230微升的1毫克/毫升人血浆纤连蛋白的软,硬,和刚性的PAA溶液,分别。所有的溶液,加入1微升10毫克/毫升丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯,5微升100毫克/毫升的过硫酸铵,和2微升的N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED ; 表1)。混合轻轻吹打和避免解决方案产生气泡。

PAA
(1毫升)中
40%
AA
(微升)
2%
(微升)
超纯

(微升)
1mg / ml的
FN
(微升)
10毫克/毫升
NHS酯
(微升)
100毫克/毫升
APS
(微升)

TEMED
(微升)

系数
(PA)
200 25 574 200 1 2 1023
200 175 409 215 1 2 7307
严格 300 300 169 230 1 2 22692

表1:组分VOLUMES以及由此产生的弹性模量在侵袭伪足实验中使用的软,硬,和严格的分配数量。AA =丙烯酰胺,FN =纤连蛋白,APS =过硫酸铵。

  1. 吸取到每个微孔的中心8.48微升的PAA解决方案。
    注意:此卷理论上产生的75微米厚的PAA。
  2. 轻轻放下上使用镊子微孔液滴的12毫米盖玻片火烧面。
  3. 允许夹持的PAA溶液聚合15-30分钟。通过检查剩余的解决方案验证聚合。
  4. 加2ml的1×PBS中,以每个培养皿用镊子取出12毫米盖玻片。
    注:10倍PBS中是在实验室和0.011 M KH 2 PO 4,1.54 M氯化钠,和0.056,1M的Na 2 HPO 4组成。
  5. 用2ml的1×PBS在室温下洗涤​​微孔5分钟。重复2次以上,总共15分钟。

3. P部分分配的牵引力化验赔偿

  1. 为软的PAA(8%丙烯酰胺和0.05%BIS)的1毫升溶液,结合加入200μl40%的丙烯酰胺,25微升的2%的BIS,以及566微升的超纯水( 见表2)。
  2. 对于硬的PAA(8%丙烯酰胺和0.35%BIS)的1毫升溶液,结合加入200μl40%的丙烯酰胺,175微升2%的BIS,以及401微升的超纯水( 见表2)。
  3. 为刚性的PAA(12%丙烯酰胺和0.60%BIS)的1毫升溶液,结合300微升40%的丙烯酰胺,300微升2%的BIS,以及161微升的超纯水( 见表2)。
  4. 脱气15分钟的解决方案。添加200,215,和230微升的1毫克/毫升人血浆纤连蛋白的软,硬,和刚性的PAA溶液,分别。声处理8微升200nm的红色荧光微球(的六百零五分之五百八十零nm激发/发射)下30秒。对于每种溶液,加入8微升200nm的红色荧光的微球,1微升10毫克/毫升丙烯酸NHS酯,5微升100毫克/毫升的过硫酸铵,及2微升TEMED( 见表2)。混合轻轻吹打和避免解决方案产生气泡。

PAA
(1毫升)中
40%
AA
(微升)
2%
BIS
(微升)
超纯

(微升)
1mg / ml的
FN
(微升)

微球
(微升)
10毫克/毫升
NHS酯
(微升)
100毫克/毫升
APS
(微升)

TEMED
(微升)

系数
(PA)
200 25 566 200 8 1 2 1023
200 175 401 215 8 1 2 7307
严格 300 300 161 230 8 1 2 22692

表2:成分量和产生的弹性模量在牵引力试验使用的软,硬,和僵化的分配数量 AA =丙烯酰胺,FN =纤连蛋白,APS =过硫酸铵。

  1. 吸取到每个微孔的中心8.48微升的PAA解决方案。
    注意:此卷理论上产生的75微米厚的PAA。
  2. 轻轻放下日的火烧面Ë12毫米盖玻片上使用镊子微孔液滴。
  3. 允许夹持的PAA溶液聚合15-30分钟。通过检查剩余的解决方案验证聚合。
  4. 加2ml的1×PBS中,以每个培养皿用镊子取出12毫米盖玻片。
  5. 用2ml的1×PBS在室温下洗涤​​微孔5分钟。重复2次以上,总共15分钟。

4.准备ECM的侵袭伪足测定

  1. 加热该明胶溶液(1%明胶和1%的蔗糖),以37℃。
  2. 从微孔的底部保持在玻璃底培养皿以45°角时,治疗用150微升的明胶溶液的部分分配为1分钟,然后小心地吸出。
  3. 干明胶对部分分配剩余的薄层中的微孔在一个陡峭的角度(60°或更大),以优化干燥60分钟。
  4. 治疗用2毫升冷却的0.5%戊二醛溶液微孔i上CE为15分钟,随后室温下搅拌30分钟。
  5. 洗用2毫升的1×PBS的微孔5分钟。重复2次以上,总共15分钟。
  6. 对待微孔用2ml的1分钟加入硼氢化钠溶液中。轻轻拍打板凳上的菜肴以去除形成明胶的表面上的泡沫。
  7. 洗板微孔用2毫升1×PBS中5分钟。重复2次以上,总共15分钟。
  8. 稀释FITC标记的人血浆纤连蛋白溶液用一个1×PBS中50μg/ ml的和离心175000×g离心在4℃下进行15分钟。无论是购买市售的标记纤维连接蛋白或如下标注为:
    1. 溶解5毫克纤连蛋白在透析管10毫升硼酸盐缓冲液(170毫偏硼酸钠四水合物和40 mM氯化钠)和地点。
    2. 通过将在200毫升含有6毫克溶解FITC的硼酸盐缓冲液的管在室温下在磁力搅拌器上标记的纤连蛋白设定在1.5小时在黑暗中的最低设置。
    3. 用500毫升的1×PBS的磁力搅拌器上在黑暗的冷室(4℃)用2体积设定在最低设置3天透析改变了一天。
    4. (1:200)的基础上的稀释的等分试样的光密度计算的FITC-标记的纤连蛋白浓度在280纳米和493纳米[OD 280 - (0.36 X OD 493)] / 1.4倍的200次2稀释因子(占为甘油浓缩纤连蛋白中的下一个步骤)所得的以mg / ml单位。
    5. 在磁力搅拌器上过夜在黑暗的冷室,在4℃下设置在最低设置为50%的甘油溶液透析过夜。)
  9. 治疗与150微升,在室温下的FITC标记纤维连接蛋白溶液在黑暗中60分钟的微孔。
  10. 保持在玻璃底培养皿在时小心吸从微孔底部的FITC-标记的纤连蛋白溶液一个45°角,然后填以70%的乙醇溶液中的玻璃底培养皿在室温下放置10分钟,在黑暗的细胞培养罩进行杀菌。还填充玻璃底培养皿盖或浸泡在70%的乙醇的低掉毛抹布擦拭干净。
  11. 与1X PBS填补他们5分钟洗玻璃底菜。重复两次用2ml的1×PBS的总共15分钟。

5.准备侵袭伪足化验和影像

  1. 添加25000癌细胞在2ml侵袭伪足介质(1:1的DMEM和RPMI 1640,用5%的低蛋白质血清,10%胎牛血清,并新鲜加入表皮生长因子20纳克/毫升),以在玻璃底培养皿和孵育过夜。
  2. 抽吸和治疗用2ml在室温下在黑暗中的3.7%多聚甲醛溶液的微孔20分钟以固定细胞。
  3. 后两个快速洗涤用2ml的1×PBS中,治疗的微孔用2ml的0.1%的Triton X-100溶液,在室温坦佩叉涂抹在黑暗中5分钟,以透化细胞。
  4. 后1快洗用2ml的1×PBS中,治疗用3%牛血清白蛋白阻断在室温下溶液在黑暗中进行60分钟,以阻断细胞的微孔。
  5. 孵育150微升小鼠抗皮层蛋白抗体(1:750)的微孔阻塞,在室温下在黑暗中的溶液60分钟。
  6. 用2ml的1×PBS中5分钟洗微孔。重复2次以上,总共15分钟。
  7. 孵育微孔用150微升的山羊抗小鼠633抗体(1:500)和546鬼笔环肽(1:750),在封闭,在室温下在黑暗中的溶液60分钟。
  8. 用2ml的1×PBS中5分钟洗微孔。重复2次以上,总共15分钟。
  9. 加入6滴封固剂来填充每个微孔,盖上22×22盖玻片。
  10. 图像皮层蛋白和肌动蛋白使用647分之632nm激发和发射滤光片,以确定侵袭伪足和五百七十〇分之五百五十六纳米,分别使用高NA,40X油浸镜头上的宽视场倒置显微镜。同样地,图像纤连蛋白使用的五百一十八分之四百九十二纳米的激发和发射滤光器识别ECM降解。

6.制备及牵引力化验成像

  1. 在2毫升侵袭伪足中添加15000癌细胞玻璃底菜,并培育过夜。
  2. 用2ml的L-15培养基中,在玻璃底培养皿抽吸培养基并更换,具有相同的补充剂(5%低蛋白血清,10%胎牛血清,并新鲜加入表皮生长因子20纳克/毫升),预-warmed至37℃。
  3. 孵育在倒置显微镜预平衡至37℃的高湿度下1小时,在玻璃底培养皿中的环境室中。
  4. 就拿四套使用高NA,40X镜头上的宽视场倒置显微镜自动化阶段,以纪念蜂窝位置的图像:
    1. 对图像细胞P使用相衬(“阶段”的形象)将PAAS的。
    2. 使用六百四十五分之五百六十〇nm激发和发射滤光片由下将细胞略微聚焦直到微球在部分分配的顶部的第一层图像的荧光微球进入对焦(“紧张”的图像)。
    3. 此外,集中于部分分配(使用微球体作为标记)的底部,并拍摄图像(“底部”的图像)。注意:此图像的目的是记录的z位置,如代表结果说明得到的实际的PAA厚度在每个位置上用于牵引力的计算。
    4. 之后,这些图像已被收购的多个位置,轻轻在220微升的10%的Triton-X解决方案,混合,除去细胞。在部分分配的顶部在每个位置上如先前所述(“空”的图像)的图像的微球。

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Representative Results

在侵袭伪足测定中,侵袭伪足通常标识标记像肌动蛋白和皮层蛋白在细胞体中的点状结构( 图1)的共定位。既积极降解和非恶化侵袭伪足可以计数和由这些结构是否共定位与缺乏的FITC标记的纤连蛋白( 图1)的荧光信号的黑色区域是有区别的。侵袭伪足手动计数,而每个单元ECM降解由细胞的轮廓内手动阈值处理这些黑色区域来确定。

在牵引力测定中,四个图像被捕获在标记阶段的位置( 图2),每个蜂窝位置。首先,“阶段”和“紧张”图像被拍摄的所有感兴趣的细胞的。在PAA的“底部”的形象也考虑在每个位置,以便计算水凝胶的厚度。去除T后他的细胞,一个“空”的形象被采取在每个阶段的显着位置。在部分分配的变形是基于“强调”和“空”的图像之间在微球的位置的改变来计算。这些位移和将PAAS(E和泊松比假设为0.5)的机械性能,然后用于计算牵引力( 图2)。用于基于对一个无限弹性半空间25的Boussinesq溶液的一些制剂的牵引力24多种不同的方法存在。虽然这些分析的细节超出了本文的范围,我们从弥登博在波士顿大学,它使用的计算牵引力26先前描述的方法许可LIBTRC软件。这个特定的计算方法补偿了有限的厚度在其计算中,需要的部分分配的厚度在每个位置上是基于二计算fference在“强调”和“底”的图像的z位置。许多研究小组也有类似电脑包可供选择或自己写的程序。另外,其他的方法来计算基于不同的数学方法24牵引力存在。

图1
图1:侵袭伪足测定可用于鉴定侵袭伪足和相关的ECM降解侵袭伪足的实施例的宽视场荧光图像中的SCC-61(头颈部鳞状细胞癌)细胞上的硬的PAA,用1%的明胶和FITC-。标有纤维连接蛋白。侵袭伪足通常确定了两种标记物,如肌动蛋白和皮层蛋白(红色和蓝色的叠加图像,分别地)的共定位。侵袭伪足可定量既是积极降低(共定位与黑色区域缺乏荷兰国际集团FITC信号,并标示为黄色箭头)和非降解(用白色箭头)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:牵引力测定可用于通过跟踪嵌入微球的位移在一个SCC-61细胞的部分分配实施例宽视场相和荧光图像上的硬的PAA( 以确定由肌动蛋白细胞骨架生成蜂窝牵引力。 “相”),并直接在细胞下的微球在PAA的顶面(“强调”)。该PAA的底部的图像,也可以采取后计算出其局部厚度(“底部”)。该信元被取出后,一个图像被再次取微球体的s的临机(“空”)的顶表面上。微球之间的位置“,强调”和“空”的图像可以被追踪,以产生“位移场。”微球位移和PAA的机械性能可以被用来计算一个“牵引矢量场。” 请点击此处查看大图这个数字。

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Discussion

我们提出的用于制造部分分配,可以用来作为基础侵袭伪足和牵引力测定法来关联侵入性和收缩的细胞行为的方法。虽然部分分配额早已看惯了对细胞的刚性作用,并计算牵引力18,24,27,该协议是第一个开发基于分配数量与同一刚性平行检测,以响应矩阵相关侵入性和收缩的细胞行为机械性能。正确激活的玻璃底菜盖玻片确保分配数量将绑定到他们,不会脱落。虽然我们和其他人已经依靠试剂如磺基SANPAH和丙烯酸NHS酯结合的明胶的部分分配的表面,在过去4,12,28,我们发现,这些方法并没有产生纤连蛋白的可靠均匀的表面层。因此,纤连蛋白包埋并在整个交联部分分配使用丙烯酸NHS酯作为执行其他组29,30。然而,被要求以产生相同的配体密度在软,硬,和刚性部分分配5的表面纤连蛋白浓度的增加。另外,纤连蛋白(但不包括微球体)的掺入,减少了软,硬,和刚性部分分配的力学特性从1071,9299和28283帕4到1023,7307和22692帕5。然而,这些降低了弹性模量的值仍然包含正常和癌变组织23的范围内。的部分分配的储能模量可以很容易地通过流变测量并转换为弹性模量1,4。

而该协议是直线前进,从而降低并除去12​​毫米盖玻片是最困难的步骤并需要实践。降低盖玻片时,最大的挑战是要确保PAA方案向外扩散均匀无任何气泡或飞溅。删除盖玻片要求为了一个稳定的手,以不损伤12毫米盖玻片,玻璃底14毫米盖玻片,或PAA。我们曾尝试在12毫米盖玻片疏水涂料去除,以帮助,但发现部分分配留在其表面图案。采用精尖而薄,桨式镊子降低和拆除12毫米盖玻片,分别是强烈建议。此外,光的用于图像的量的细胞必须被最小化,因为某些类型的细胞,以集中光显微镜敏感。另外,L-15培养基用于牵引力试验,因为我们对我们的显微镜环境室没有装备对CO 2。而同样的补充剂被用于在媒体的侵袭伪足和牵引力试验,试图保持条件是相同的,DMEM和RPMI 1640可以使用的L-15,而不是如二氧化碳水平可以被控制。

而PAA溶液的体积被选为理论上ÿ屈服的凝胶的厚度为75微米,其厚度通常为30-60微米之间变化。但是,此范围是高于在该细胞可以感知的玻璃底培养皿31中的盖玻片的基本刚性的值。此外,对ECM层的厚度用来检测退化(明胶和FITC标记纤连蛋白覆盖在该部分分配)先前已被报道为约1微米厚12;因此,此薄层也不会从部分分配的刚性屏蔽细胞。然而,固体杂物,破解,并且无论是在分配数量和/或ECM层等畸形可能会影响个体细胞侵入和收缩性能。这些问题可以通过不洁12毫米盖玻片引入杂物进入水凝胶,过度干燥的凝胶和/或明胶,以及硼氢化钠不全抽吸其可以离开该变形的ECM层的气泡引起的。因此,必须注意选择CE时,要采取LLS用于成像,以确保它们不会过度地通过在样品的表面局部不规则性的影响。

相对高浓度的纤连蛋白中均部分分配(混合在200-230微克/毫升)和ECM层(50微克/毫升重叠在明胶)已经被使用;然而,实际的浓度任一表面上没有被直接测量。而每个表面上看起来与纤连蛋白是饱和的,也不清楚是否细胞遇到两种测定之间完全相同的配体密度。对于牵引力测定,200纳米微球的稀释度为1:125已经证明最佳成像。然而,这是很常见的发现使用不同直径或稀释的微球的其他基团。在这个系统中,更小的微球显示的部分分配内布朗运动,而较大的微球所造成的裂缝和畸形。这些观察是最有可能是由于部分分配的物理性质(

总的来说,许多这些实验因素可以根据用户的要求进行调整,例如部分分配具有不同的机械性能,癌细胞具有不同侵袭性和收缩性能,并且显微系统与其它的成像能力。丙烯酰胺的比率:BIS可以变化,以产生部分分配具有类似的或不同的弹性模量和交联27。牵引力测定的灵敏度可以通过改变刚度和/或微球体dilut进行调整,以考虑为不同的细胞力水平离子。不同的荧光团还可以选择用于基于显微镜规格免疫荧光和纤连蛋白标记。虽然FITC做漂白剂,它是相当光明的决策ECM降解容易辨认。然而,侵袭伪足和小微球的荧光成像通常需要高NA目标的最佳分辨率。此外,这两种测定法可以在玻璃盖玻片在孔板中进行。然而,玻璃底培养皿更容易制备和使用在整个实验过程。在将来,这些测定法结合成一个将允许两个ECM降解和细胞力产生的直接可视化。然而,一些技术挑战将出现包括活细胞成像的侵袭伪足和微珠位移,增加细胞暴露在光线中,FITC纤维连接蛋白的漂白,以及是否牵引力通过荧光标记和交联的ECM层的PAA表面完全转。

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Disclosures

这项工作是由美国国立卫生研究院在奖号K25CA143412美国国家癌症研究所(帕雷克)的支持。我们要感谢额外的支持是由耳鼻咽喉科提供。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。

Acknowledgements

作者什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

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References

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