Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center
Medicine

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Summary

Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.

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Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

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Abstract

Tejidos tumorales rígidos han sido fuertemente implicados en la regulación de la migración celular y la invasión del cáncer. La migración invasiva a través de tejidos reticulados se ve facilitada por los salientes de actina-ricos llamados invadopodios que proteolíticamente degradan la matriz extracelular (ECM). Actividad invadopodios ha demostrado ser dependiente de la rigidez ECM y célula de cáncer de fuerzas contráctiles que sugieren que las señales de rigidez pueden regular estas estructuras subcelulares a través de la contractilidad actomiosina. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas pueden ser correlacionados in vitro utilizando ensayos invadopodios y de la fuerza de tracción sobre la base de geles de poliacrilamida (PAA) de diferentes rigideces. Aunque existen algunas variaciones entre los dos ensayos, el protocolo presentado aquí proporciona un método para crear FCA ésimoa se puede utilizar en ambos ensayos y son fácilmente adaptables a las necesidades biológicas y técnicas específicas de los usuarios.

Introduction

La rigidez de la ECM asociado al tumor ha sido identificado como un factor significativo en la conducción de comportamiento maligno mediante el aumento de la contractilidad actomyosin 1-3. Mientras que este efecto se ha demostrado principalmente con células de cáncer de mama, la rigidez de la matriz se ha encontrado para alterar las propiedades invasivas de las células derivadas de una variedad de cánceres 4-8 lo que sugiere que la rigidez tumor pueden desempeñar un papel en otro tipo de cánceres. Para penetrar en los tejidos entrecruzados durante la migración invasivo, las células cancerosas utilizan protuberancias adhesivas actina-ricos conocidos como invadopodios que localizar proteinasas para degradar focalmente el ECM 9. Invadopodios se consideran una característica de las células invasoras y han sido implicados en la invasión de células tumorales y la metástasis 10,11. El trabajo previo ha mostrado que la rigidez de la matriz puede regular los números invadopodios y la degradación de ECM asociado 4,12 través de la miosina II actividad y proteínas mechanosensitive 12. Dado quecorrelación entre la densidad del tumor y la agresividad del cáncer 13,14, estos resultados sugieren un mecanismo por el cual las células cancerosas pueden responder a los tejidos tumorales rígidos para conducir la invasión y la metástasis a través de la contractilidad actomiosina.

En rigidez ECM vitro y en la densidad del tejido vivo se ha demostrado para regular el comportamiento invasivo de las células cancerosas 1,15-17. Mientras que la contractilidad actomyosin parece ser importante en este proceso, la corriente de conflicto estudios en cuanto a si la capacidad metastásica se correlaciona con aumento o disminución de las fuerzas contráctiles 6,18-20. Además, aún se desconoce si estas fuerzas median directamente la actividad invadopodios 21. Recientemente, hemos encontrado que las fuerzas contráctiles célula cancerosa dependían de la rigidez de la matriz y fueron predictivos de la degradación de ECM por invadopodios 5. Estos resultados sugieren que las fuerzas celulares pueden desempeñar un papel importante en la progresión del cáncer mediando invadopodios actividad en respuesta a las propiedades mecánicas del microambiente del tumor.

Para correlacionar propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas 5, modificamos un protocolo para la creación de FCA con diferentes rigideces que se utilizó anteriormente para investigar la actividad invadopodios rigidez dependiente 4,12,22. Por reticulación químicamente fibronectina plasmática humana en todo el FCA, estos hidrogeles modificados se pueden utilizar como la base para tanto invadopodios y los ensayos de fuerza de tracción para asegurar que las células experimentaron las mismas rigideces en ambos experimentos 5. En los ensayos de invadopodios, la fibronectina proporciona un dominio de unión natural para la gelatina para vincular el ECM superpuesto a la FCA para detectar degradación de la matriz. En los ensayos de fuerza de tracción, la fibronectina proporciona un ligando para la adhesión celular directa para detectar desplazamientos de microesferas utilizadas para calcular las fuerzas de tracción celulares. Este método resulta en lo que hemos llamado blando, duro,y PAA rígidos que están unidos a los platos con fondo de cristal y tienen módulos de elasticidad, E, de 1.023, 7.307 y 22.692 Pa 5 que abarcan la gama de propiedades mecánicas reportados para los tejidos normales y cancerosos 23.

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Protocol

1. Preparación de cubreobjetos de vidrio para FCA

  1. Clean 12 mm cubreobjetos con toallitas bajos pelusa.
  2. Llama el cubreobjetos mm 12 y el cubreobjetos de 14 mm en la cúpula de cada 35 mm de vidrio plato inferior pasándolos a través de un mechero Bunsen con unas pinzas.
  3. Tratar los micropocillos con 200 l de NaOH 0,1 N durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Aspirar y aire sequen los pocillos durante 30 minutos.
  5. Tratar a los pocillos con 50 a 100 l de 3-aminopropiltrimetoxisilano durante 10 min a temperatura ambiente en la campana de humos. Este producto químico reacciona con el plástico; por lo tanto, utilizar pipetas de vidrio y no llene los pocillos completamente para evitar el contacto con el plástico plato.
  6. Lavar los pocillos con agua ultrapura durante aproximadamente 10 min hasta que el 3-aminopropiltrimetoxisilano se vuelve claro.
  7. Lavar los pocillos con agua ultrapura dos veces utilizando un frasco.
  8. Lavar los pocillos con 2 ml de agua ultrapura unt temperatura ambiente en un agitador ajustado a una velocidad media (~ 1 Hz) durante 10 min.
  9. Aspirar y aire sequen los pocillos durante 30 minutos.
  10. Tratar los pocillos con 2 ml de solución de glutaraldehído al 0,5% a temperatura ambiente en un agitador ajustado a una velocidad media (~ 1 Hz) durante 30 min.
  11. Lavar los pocillos con 2 ml de agua ultrapura a temperatura ambiente en un agitador a velocidad media (~ 1 Hz) durante 10 min. Repetir dos veces más para un total de 30 min.
  12. Pocillos secos en un ángulo empinado (60º o más) durante 30 minutos.
    Nota: Los platos se pueden almacenar durante 2 meses en un desecador.

2. Preparación de la FCA para invadopodios ensayos

  1. Para una solución de la PAA suave (8% de acrilamida y 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 25 l de 2% BIS y 574 l de agua ultrapura (Tabla 1).
  2. Para una solución de la PAA duro (8% de acrilamida y 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 175 & #181; l de 2% BIS, y 409 l de agua ultrapura (Tabla 1).
  3. Para una solución de la PAA rígido (12% de acrilamida y 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 l de 40% de acrilamida, 300 l de 2% BIS, y 169 l de agua ultrapura (Tabla 1).
  4. Desgasificar las soluciones para 15 min. Añadir 200, 215, y 230 l de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano en agua ultrapura a las soluciones de PAA blandos, duros, y rígidas, respectivamente. Para todas las soluciones, añadir 1 l de / ml de éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida 10 mg (NHS), 5 l de un persulfato de amonio 100 mg / ml, y 2 l de N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED ; Tabla 1). Mezclar con pipeteo suave y evitar la creación de burbujas en soluciones.

PAA
(1 ml)
40%
AA
(L)
2%
(L)
Ultrapura
Agua
(L)
1 mg / ml
FN
(L)
10 mg / ml
NHS Ester
(L)
100 mg / ml
APS
(L)

TEMED
(L)
Elástico
Módulo
(Pa)
Suave 200 25 574 200 1 5 2 1023
Duro 200 175 409 215 1 5 2 7307
Rígido 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tabla 1: Ingrediente volumes y que resulta módulos elásticos para FCA blandos, duros y rígidos utilizados en los ensayos invadopodios. AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amonio.

  1. Pipetear 8,48 l de la solución de PAA en el centro de cada pocillo.
    Nota: Este volumen se obtiene teóricamente un PAA de 75 micras de espesor.
  2. Baje suavemente el lado flameado del cubreobjetos de 12 mm a la gota en el pocillo, en pinzas.
  3. Deje que la solución PAA intercalada para polimerizar durante 15-30 minutos. Verifique polimerización marcando la solución sobrante.
  4. Añadir 2 ml de 1x PBS a cada placa y retirar los cubreobjetos de 12 mm con pinzas.
    Nota: 10x PBS se produce en el laboratorio y compuesta por 0.011 M KH 2 PO 4, NaCl 1,54 y 0,056 M Na 2 HPO 4.
  5. Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x a temperatura ambiente durante 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min.

3. Preparación de FCA para la tracción de la Fuerza ensayos

  1. Para una solución de la PAA suave (8% de acrilamida y 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 25 l de 2% BIS y 566 l de agua ultrapura (Tabla 2).
  2. Para una solución de la PAA duro (8% de acrilamida y 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 l de 40% de acrilamida, 175 l de 2% BIS, y 401 l de agua ultrapura (Tabla 2).
  3. Para una solución de la PAA rígido (12% de acrilamida y 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 l de 40% de acrilamida, 300 l de 2% BIS, y 161 l de agua ultrapura (Tabla 2).
  4. Desgasificar las soluciones para 15 min. Añadir 200, 215, y 230 l de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano a las soluciones de PAA blandos, duros, y rígidas, respectivamente. Sonicar 8 l de 200 nm microesferas rojas fluorescentes (excitación / emisión de 580/605 nm) durante 30 segundos. Para cada solución, añadir 8 l de 200 microesferas fluorescentes rojas nm,1 l de ácido acrílico 10 mg / ml de éster de NHS, 5 l de una persulfato de amonio 100 mg / ml, y 2 l de TEMED (Tabla 2). Mezclar con pipeteo suave y evitar la creación de burbujas en soluciones.

PAA
(1 ml)
40%
AA
(L)
2%
BIS
(L)
Ultrapura
Agua
(L)
1 mg / ml
FN
(L)

Micro-esferas
(L)
10 mg / ml
NHS Ester
(L)
100 mg / ml
APS
(L)

TEMED
(L)
Elástico
Módulo
(Pa)
Suave 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Duro 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Rígido 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tabla 2:. Volúmenes de ingredientes y resultando módulos elásticos para FCA blandos, duros y rígidos utilizados en los ensayos de la fuerza de tracción AA = acrilamida, fn = fibronectina, APS = persulfato de amonio.

  1. Pipetear 8,48 l de la solución de PAA en el centro de cada pocillo.
    Nota: Este volumen se obtiene teóricamente un PAA de 75 micras de espesor.
  2. Baje suavemente el lado flameado del ªe 12 mm cubreobjetos sobre la gota en el pocillo, en pinzas.
  3. Deje que la solución PAA intercalada para polimerizar durante 15-30 minutos. Verifique polimerización comprobando solución sobrante.
  4. Añadir 2 ml de 1x PBS a cada placa y retirar los cubreobjetos de 12 mm con pinzas.
  5. Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x a temperatura ambiente durante 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min.

4. Preparación de ECM para invadopodios ensayos

  1. Calentar la solución de gelatina (gelatina al 1% y 1% de sacarosa) a 37 ° C.
  2. Tratar los FCA con 150 l de la solución de gelatina durante 1 min luego cuidadosamente aspirado desde el fondo de los pocillos al sostener los platos con fondo de cristal en un ángulo de 45 °.
  3. Se seca la capa fina restante de gelatina sobre las DAP en los micropocillos en un ángulo empinado (60 ° o mayor) para optimizar el secado durante 60 min.
  4. Tratar los pocillos con 2 ml de una solución fría de glutaraldehído 0,5% en iCE para 15 min seguido por temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x para una 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min.
  6. Tratar los pocillos con 2 ml de una solución de borohidruro de sodio durante 1 min. Golpee suavemente los platos en el banco para eliminar las burbujas que se forman en la superficie de la gelatina.
  7. Aspirar y lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x durante 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min.
  8. Se diluye una solución de fibronectina de plasma humano marcado con FITC a 50 g / ml con un PBS 1X y se centrifuga a 175.000 xg a 4 ° C durante 15 min. Cualquiera de adquirir comercialmente disponible fibronectina etiquetado o la etiqueta de la siguiente manera:
    1. Disolver 5 mg de fibronectina en 10 ml de tampón de borato (metaborato de sodio tetrahidratado 170 mM y NaCl 40 mM) y el lugar en tubos de diálisis.
    2. Etiqueta de la fibronectina mediante la colocación de la tubería en 200 ml de tampón de borato que contiene 6 mg de FITC disuelto a temperatura ambiente en un agitador magnéticofijado en la posición más baja de 1,5 horas en la oscuridad.
    3. Se dializa con 500 ml de una PBS 1x en un agitador magnético fijado en la posición más baja durante 3 días en una habitación oscura y fría (4 ° C) con dos volúmenes cambia un día.
    4. La concentración de fibronectina marcada con FITC calcular sobre la base de la densidad óptica de alícuotas diluidas (1: 200) a 280 nm y 493 nm como [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 veces el factor de dilución de 200 veces 2 (que representa para el glicerol concentración de la fibronectina en el paso siguiente) resulta en unidades de mg / ml.
    5. Dializar noche en una solución de glicerol al 50% en un agitador magnético fijado en la posición más baja durante la noche en una habitación fría oscuridad a 4 ° C.)
  9. Tratar los micropocillos con 150 l de la solución de fibronectina marcada con FITC a temperatura ambiente durante 60 min en la oscuridad.
  10. Aspirar cuidadosamente la solución de fibronectina marcada con FITC desde el fondo de los pocillos al sostener los platos con fondo de cristal enun ángulo de 45 ° y luego se llenan los platos inferiores de vidrio con solución de etanol al 70% a temperatura ambiente durante 10 min en una campana de cultivo de células oscuro para la esterilización. También llenar tapas de los recipientes de vidrio de fondo o limpiar con toallitas bajos pelusa empapado en etanol al 70%.
  11. Lave los platos con fondo de cristal, llenándolos con 1x PBS durante 5 min. Repetir dos veces más con 2 ml de PBS 1x para un total de 15 min.

5. Preparación e Imagen de invadopodios ensayos

  1. Añadir 25,000 células cancerosas en 2 ml de medio invadopodios (1: 1 DMEM y medio RPMI 1640 con 5% de suero baja en proteínas, suero bovino fetal al 10%, y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico recién añadido) a los platos de fondo de cristal y incubar durante la noche.
  2. Aspirar y tratar las microcubetas con 2 ml de una solución de paraformaldehído al 3,7% a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min para fijar las células.
  3. Después de dos lavados rápidos con 2 ml de PBS 1x, tratar los micropocillos con 2 ml de una solución de 0,1% de Triton X-100 en tempe habitaciónratura en la oscuridad durante 5 min para permeabilizar las células.
  4. Después de un lavado rápido con 2 ml de PBS 1x, tratar las microcubetas con 3% de albúmina de suero bovino solución de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min para bloquear las células.
  5. Incubar los pocillos con 150 l de anticuerpo de ratón anti-cortactin (1: 750) en solución de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min.
  6. Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x para 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min.
  7. Incubar los pocillos con 150 l de anticuerpo de cabra anti-ratón 633 de anticuerpos (1: 500) y 546 faloidina (1: 750) en solución de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 min.
  8. Lavar los pocillos con 2 ml de PBS 1x para 5 min. Repetir dos veces más para un total de 15 min.
  9. Añada seis gotas de medio de montaje para llenar cada pocillo y cubra con 22 x 22 cubreobjetos.
  10. Cortactin Imagen y actina para identificar invadopodios utilizando filtros de excitación y emisión de 632/647 nm y556/570 nm, respectivamente, utilizando una lente de inmersión en aceite de alta NA, 40X en un microscopio invertido de campo amplio. Del mismo modo, la imagen de fibronectina para identificar la degradación de ECM utilizando un filtro de excitación y emisión de 492/518 nm.

6. Preparación e Imagen de la fuerza de tracción Ensayos

  1. Añadir 15,000 células cancerosas en 2 ml de medio invadopodios a los platos con fondo de cristal y se incuba durante la noche.
  2. Aspirar medio en los platos de fondo de cristal y reemplazar con 2 ml de medio L-15, con los mismos suplementos (5% de suero baja en proteínas, suero bovino fetal al 10%, y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico recién añadido), pre -warmed a 37 ° C.
  3. Incubar los platos inferiores de vidrio en una cámara ambiental en un microscopio invertido pre-equilibrada a 37 ° C con alta humedad durante 1 hr.
  4. Tome cuatro conjuntos de imágenes con una alta NA, 40X lente de un microscopio de campo amplio invertida con una etapa automatizado para marcar posiciones celulares:
    1. Celdas de imagen sobre dep de los PAA utilizando contraste de fase ("fase" de la imagen).
    2. Image microesferas fluorescentes utilizando filtros de excitación y emisión de 560/645 nm, centrándose ligeramente por debajo de las células hasta que la primera capa de microesferas en la parte superior de la FCA entra en el foco ("estresados" imagen).
    3. Además, se centran en la parte inferior de la FCA (utilizando las microesferas como marcadores) y tomar una imagen (imagen "de abajo"). Nota: El propósito de esta imagen es para registrar la posición z para obtener el espesor PAA real en cada posición para el cálculo de la fuerza de tracción como se describe en resultados representativos.
    4. Después de estas imágenes han sido adquiridos en múltiples posiciones, mezclar suavemente en 220 l de solución al 10% de Triton-X para eliminar las células. Microesferas de la imagen en la parte superior de la FCA en cada posición como se describe anteriormente (imagen "nulo").

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Representative Results

En el ensayo de invadopodios, invadopodios se identifican típicamente por colocalización de los marcadores como la actina y la cortactin en estructuras punteadas dentro del cuerpo de la célula (Figura 1). Tanto la degradación de forma activa y no degradante invadopodios puede ser contado y se diferencian por si estas estructuras están colocalized con áreas negras que carecen de señal fluorescente en la fibronectina marcada con FITC (Figura 1). Invadopodios se cuentan manualmente, y la degradación de ECM por célula se determina por thresholding manualmente estas zonas negras dentro de contornos de las células.

En el ensayo de fuerza de tracción, cuatro imágenes son capturadas en cada localización celular marcada por la posición de fase (Figura 2). En primer lugar, "fase" y "subrayó" las imágenes son tomadas de todas las células de interés. Una imagen de "fondo" de la PAA también se toma en cada posición para calcular el espesor de hidrogel. Después de eliminar tque las células, una imagen "null" se toma en cada posición etapa marcada. Deformaciones en las DAP se calculan con base en el cambio en las posiciones de microesferas entre las imágenes "nulos" "estresado" y. Estos desplazamientos y las propiedades mecánicas de las DAP (E y el coeficiente de Poisson asumido como 0.5) se utilizan entonces para calcular las fuerzas de tracción (Figura 2). Existen varios métodos diferentes para el cálculo de las fuerzas de tracción 24 sobre la base de alguna formulación de la solución de Boussinesq para un espacio de un medio elástico 25 infinita. Si bien los detalles de estos análisis están más allá del alcance de este texto, hemos licencia de software LIBTRC de Miqueas Dembo en la Universidad de Boston que utiliza un método descrito anteriormente para el cálculo de las fuerzas de tracción 26. Este método de cálculo concreto compensa espesores finitos en sus cálculos que requiere el espesor de la FCA en cada posición que se calcula basándose en la diferenc en el z-posición de los e imágenes "estresados", "fondo". Muchos grupos de investigación tienen paquetes informáticos similares disponibles o eligen escribir sus propios programas. Además, existen otros métodos para el cálculo de las fuerzas de tracción basadas en diferentes enfoques matemáticos 24.

Figura 1
Figura 1: El ensayo invadopodios se puede utilizar para identificar invadopodios y la degradación de ECM asociado Ejemplo imágenes de campo amplio de fluorescencia de invadopodios en una célula SCC-61 (cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas) en un PAA duro con 1% de gelatina y FITC. fibronectina marcada. Invadopodios se identifican típicamente por colocalización de dos marcadores, como la actina y cortactin (rojo y azul de la imagen de superposición, respectivamente). Invadopodios se puede cuantificar como tanto activa Degradantes (colocalized con zonas negras faltaing señal FITC como se indica mediante flechas amarillas) y no degradante (indicado por flechas blancas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: El ensayo de fuerza de tracción se puede utilizar para determinar las fuerzas de tracción celulares generadas por el citoesqueleto de actina mediante el seguimiento del desplazamiento de microesferas incrustadas en la fase y de fluorescencia FCA Ejemplo imágenes de campo amplio de una célula SCC-61 en un PAA duro (. "fase"), y las microesferas directamente debajo de la celda en la superficie superior de la PAA ("estresado"). Una imagen de la parte inferior de la PAA también puede ser tomado para calcular más tarde su espesor local ("fondo"). Después se retira de la célula, una imagen está tomada una vez más de la microesferas en la superficie superior de la PAA ("nulo"). Posiciones de microesferas entre el "destacaron" y las imágenes "nulos" se pueden seguir para dar un "campo de desplazamiento." Desplazamientos de microesferas y las propiedades mecánicas de PAA se pueden utilizar para calcular un "campo vectorial tracción." Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Discussion

Se presenta un método para la fabricación de FCA que se pueden utilizar como la base para los ensayos de invadopodios y fuerza de tracción para correlacionar comportamientos celulares invasivas y contráctiles. Mientras FCA han sido utilizados para observar los efectos de rigidez en las células y calcular las fuerzas de tracción 18,24,27, este protocolo es el primero en desarrollar ensayos paralelos basados ​​en APA con las mismas rigideces correlacionar comportamientos celulares invasivos y contráctiles en respuesta a la matriz propiedades mecánicas. Activar correctamente los cubreobjetos de los platos con fondo de cristal asegura que las DAP se unirá a ellos y no sale. Mientras que nosotros y otros hemos basado en reactivos tales como sulfo-SANPAH y ácido acrílico éster de NHS de obligar a la gelatina a la superficie de las DAP en el pasado 4,12,28, hemos encontrado que estos métodos no producen capas superficiales fiable uniformes de fibronectina . Por lo tanto, la fibronectina se ha incrustado y reticulado en todo el PAA usando ácido acrílico éster NHS interpretadapor otros grupos 29,30. Sin embargo, se requirieron concentraciones crecientes de fibronectina a fin de producir la misma densidad de ligando en las superficies de los FCA blandos, duros, rígidos y 5. Además, la incorporación de fibronectina (pero no las microesferas) redujo las propiedades mecánicas de los PAA blandos, duros y rígidos de 1.071, 9.299 y 28.283 Pa 4 a 1.023, 7.307 y 22.692 Pa 5, respectivamente. Sin embargo, estos valores de módulos elásticos reducidos aún abarcaron la gama de tejidos normales y cancerosos 23. Módulos de almacenamiento de las DAP pueden ser fácilmente medidos por reometría y se convierten en módulos elásticos 1,4.

Mientras que el protocolo es sencillo, reduciendo y eliminando los 12 mm cubreobjetos son los pasos más difíciles y requieren práctica. El mayor reto al bajar un cubreobjetos es asegurar que la solución de PAA se extiende uniformemente sin burbujas o salpicaduras. Extracción de un cubreobjetos requiereuna mano firme con el fin de no dañar el cubreobjetos de 12 mm, el vidrio inferior 14 mm cubreobjetos, o la PAA. Hemos tratado de recubrimientos hidrófobos sobre el cubreobjetos 12 mm para facilitar la eliminación, pero se encontró que los FCA se quedan con patrones en sus superficies. El uso de punta fina y, pinzas finas de estilo paddle para reducir y eliminar los 12 mm cubreobjetos, respectivamente, es muy recomendable. Además, la cantidad de luz utilizada para la imagen de las células debe minimizarse ya que algunos tipos de células son sensibles a la luz concentrada en el microscopio. Además, se utilizó medio L-15 para los ensayos de la fuerza de tracción desde nuestra cámara ambiental en nuestro microscopio no está equipado para el CO 2. Mientras que se utilizaron los mismos suplementos en los medios para los ensayos de invadopodios y fuerza de tracción en un intento de mantener las condiciones de la misma, DMEM y RPMI 1640 podrían ser utilizados en lugar de L-15 si los niveles de CO2 pueden ser controlados.

Mientras que el volumen de la solución de PAA fue elegido para teóricamente ygeles ield con un espesor de 75 micras, sus espesores varían típicamente entre 30-60 micras. Sin embargo, esta gama es muy superior al valor en el que las células pueden sentir la rigidez subyacente de los cubreobjetos de los platos de fondo de vidrio 31. Además, el espesor de la capa de ECM utiliza para detectar la degradación (gelatina y fibronectina marcada con FITC superponerse a las DAP) se ha informado anteriormente como aproximadamente 1 micra de espesor 12; Por lo tanto, esta capa delgada no protege a las células de las rigideces de la FCA. Sin embargo, los desechos sólidos, grietas, y otras deformidades en cualquiera de las DAP y / o capa de ECM pueden afectar las propiedades invasivas y contráctiles celulares individuales. Estos problemas pueden ser causados ​​por cubreobjetos de 12 mm impuros que introducen los residuos en los hidrogeles, secado excesivo de los geles y / o gelatina, y aspiración incompleta de borohidruro de sodio que puede dejar burbujas que deforman la capa de ECM. Por lo tanto, se debe tener cuidado al seleccionar ceLLS para imágenes para asegurarse de que no se vean indebidamente influidas por las irregularidades locales en las superficies de las muestras.

Concentraciones relativamente altas de fibronectina en tanto la FCA (mezclado en al 200-230 g / ml) y la capa de ECM (superpuesto en la gelatina a 50 g / ml) se han utilizado; sin embargo, las concentraciones reales en cualquiera de las superficies no han sido medidos directamente. Mientras que cada superficie parece estar saturado con fibronectina, no está claro si las células experimentan las mismas densidades exactas de ligando entre los dos ensayos. Para los ensayos de fuerza de tracción, 200 microesferas nm a una dilución de 1: 125 han demostrado ser óptimo para la formación de imágenes. Sin embargo, es bastante común encontrar otros grupos utilizando microesferas de diferentes diámetros o diluciones. En este sistema, las microesferas más pequeñas muestran el movimiento browniano en el FCA, mientras que las microesferas más grandes causados ​​grietas y deformaciones. Estas observaciones son muy probablemente debido a las propiedades físicas de la FCA (es decir,

En general, muchos de estos factores experimentales se pueden ajustar en base a las necesidades del usuario, tales como las PAA con diferentes propiedades mecánicas, las células cancerosas con diferentes propiedades invasivas y contráctiles, y sistemas de microscopía con otras capacidades de imagen. La proporción de acrilamida: BIS se puede variar para producir FCA con módulos de elasticidad similar o diferente y reticulación 27. La sensibilidad de los ensayos de fuerza de tracción se puede ajustar para tener en cuenta diferentes niveles de fuerza celular cambiando la rigidez y / o microesferas dilutde iones. Diferentes fluoróforos también pueden ser elegidos para inmunofluorescencia y fibronectina etiquetado basado en las especificaciones de microscopio. Mientras FITC hace blanqueador, es bastante brillante degradación de la toma de ECM fácilmente identificable. Sin embargo, imágenes de fluorescencia de invadopodios y pequeñas microesferas normalmente requiere altos objetivos de NA para la resolución óptima. Además, ambos ensayos se pueden realizar en cubreobjetos de vidrio en placas de pocillos. Sin embargo, los platos de cristal inferior son mucho más fáciles de preparar y utilizar en todo el proceso experimental. En el futuro, la combinación de estos ensayos en un solo permitiría la visualización directa de tanto la degradación de ECM y la generación de fuerza celular. Sin embargo, varios desafíos técnicos surgirían incluyendo imágenes en vivo de células para invadopodios y microperlas desplazamientos, aumento de la exposición celular a la luz, blanqueo de la fibronectina FITC, y si las fuerzas de tracción están completamente transducidas a través de la capa de ECM marcada con fluorescencia y reticulado a las superficies de PAA .

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Disclosures

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el premio número K25CA143412 (Parekh). Nos gustaría reconocer que el apoyo adicional fue proporcionada por el Departamento de Otorrinolaringología. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Acknowledgements

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

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