Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center
Medicine

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Summary

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

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Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

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Abstract

Starre Tumorgewebe sind stark bei der Regulierung der Krebszelle Migration und Invasion verwickelt. Invasive Migration durch vernetzte Gewebe durch actin reichen Vorsprünge genannt invadopodia die proteolytisch die extrazelluläre Matrix (ECM) abzubauen erleichtert. Invadopodia Aktivität hat sich gezeigt, abhängig von ECM Steifigkeit und Krebszellenkontraktionskräfte darauf hindeutet, dass die Steifigkeit Signale können diese subzellulärer Strukturen durch Actomyosin Kontraktilität zu regeln sein. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Während einige Unterschiede zwischen den beiden Tests bestehen, die hier vorgestellte Protokoll liefert ein Verfahren für die Erstellung PAAs thbei in beiden Tests verwendet werden und sind leicht an die spezifischen biologischen und technischen Anforderungen des Benutzers.

Introduction

Die Steifigkeit des Tumor-assoziierten ECM wurde als wichtiger Faktor bei der Fahrt malignem Verhalten durch Erhöhung Actomyosin Kontraktilität 1-3 identifiziert. Obwohl dieser Effekt hauptsächlich bei Brustkrebszellen gezeigt hat Matrixsteifigkeit wurde gefunden invasiven Eigenschaften von Zellen, die aus einer Vielzahl von Krebs 4-8 darauf hindeutet, dass Tumor Steifigkeit kann in anderen Arten von Krebs eine Rolle spielen abgeleitet verändern. Vernetzte Geweben während invasiver Migration dringen, Krebszellen zu verwenden Aktin reiche Klebstoff Vorsprünge als invadopodia die Proteinasen zu lokalisieren, um die ECM 9 fokal verschlechtern bekannt. Invadopodia werden als ein Markenzeichen der invasiven Zellen und in Tumorzellinvasion und Metastasierung 10,11 in Verbindung gebracht. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Matrix Steifigkeit invadopodia Zahlen zu regulieren und die damit verbundenen Abbau ECM 4,12 durch Myosin II-Aktivität und mechanosensitive Proteine ​​12. Angesichts derKorrelation zwischen Tumordichte und Krebs Aggressivität 13,14 legen diese Ergebnisse einen Mechanismus, durch den Krebszellen um starre Tumorgeweben zu antworten Invasion und Metastasierung durch Actomyosin Kontraktilität fahren.

In vitro ECM Steifigkeit und in vivo Gewebedichte wurde gezeigt, dass invasive Verhalten von Krebszellen 1,15-17 regulieren. Während Actomyosin Kontraktilität scheint wichtig zu sein in diesem Prozess, aktuelle Studien Konflikt, ob metastasiertem Fähigkeit korreliert erhöht oder verringert Kontraktionskräfte 6,18-20. Darüber hinaus bleibt es unbekannt, ob diese Kräfte direkt vermitteln invadopodia Aktivität 21. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Krebszellen Kontraktionskräfte waren abhängig von Matrix Steifigkeit und waren prädiktiv für ECM Abbau durch invadopodia 5. Diese Ergebnisse legen nahe, dass zelluläre Kräfte können eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression durch Vermittlung invadopodia ac spielenvität als Reaktion auf die mechanischen Eigenschaften der Tumor-Mikroumgebung.

Um invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen 5 korrelieren, modifizierten wir ein Protokoll für die Erstellung von PAA mit unterschiedlichen Steifigkeiten, die früher verwendet wurde, um die Steifigkeit abhängige invadopodia Aktivität 4,12,22 zu untersuchen. Durch chemisch vernetzenden Humanplasmafibronektin gesamten PAAs können diese modifizierten Hydrogele als Grundlage sowohl für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, um sicherzustellen, dass Zellen erfahren die gleichen Steifigkeiten in beiden Experimenten 5. In den invadopodia Tests bietet das Fibronektin eine natürliche Bindungsdomäne für Gelatine, die überlagerte ECM an die PAA verlinken auf Matrixabbau zu erkennen. In der Zugkraft Tests bietet das Fibronektin einen Liganden für direkte zelluläre Adhäsion an Mikrosphären Verschiebungen verwendet werden, um zelluläre Zugkräfte berechnen zu erkennen. Dieses Verfahren führt zu, was wir weich, hart genannt,und starre PAA, die auf Glasboden Gerichte gebunden sind und Elastizitätsmodul, E, der 1023, 7307 und 22.692 Pa 5, die den Bereich der mechanischen Eigenschaften für den normalen und Krebsgewebe 23 berichtet erstrecken.

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Protocol

1. Herstellung der Glasdeckgläser für PAAs

  1. Reinigen 12 mm Deckgläser mit fusselarm Tücher.
  2. Flamme die 12 mm Deckgläser und der 14 mm Deckglas in der Mikrowell jedes 35 mm Glasbodenschale, indem sie durch einen Bunsenbrenner mit einer Pinzette.
  3. Behandeln Sie die Vertiefungen mit 200 ul 0,1 N NaOH für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Absaugen und Luft trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten.
  5. Behandeln Sie die Vertiefungen, die mit 50 bis 100 & mgr; l 3-Aminopropyltrimethoxysilan für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug. Diese Chemikalie reagiert mit Kunststoff; daher verwenden Glaspipetten und nicht die Vertiefungen füllen vollständig den Kontakt mit der Schale aus Kunststoff zu vermeiden.
  6. Waschen Sie die Vertiefungen, die mit hochreinem Wasser für etwa 10 Minuten, bis der 3-Aminopropyltrimethoxysilan deutlich.
  7. Spülen Sie die Vertiefungen, die mit hochreinem Wasser zweimal mit einer Spritzflasche.
  8. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml Reinstwasser eint Raumtemperatur auf einem Schüttler bei einer mittleren Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 10 Minuten gesetzt.
  9. Absaugen und Luft trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten.
  10. Behandeln die Vertiefungen mit 2 ml 0,5% ige Glutaraldehyd-Lösung bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei einer mittleren Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 30 Minuten gesetzt.
  11. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml hochreinem Wasser bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 10 Minuten eingestellt. Wiederholen zwei weitere Male für insgesamt 30 min.
  12. Trocken Vertiefungen in einem steilen Winkel (60º oder mehr) für 30 min.
    Hinweis: Geschirr kann für 2 Monate in einem Exsikkator aufbewahrt werden.

2. Herstellung von PAA für Invadopodia Assays

  1. Für eine 1-ml-Lösung des weichen PAA (8% Acrylamid und 0,05% BIS), vereinige 200 ul 40% Acrylamid, 25 ul 2% BIS, und 574 & mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1).
  2. Für eine 1-ml-Lösung von der Fest PAA (8% Acrylamid und 0,35% BIS), vereinige 200 ul 40% iges Acrylamid, 175 & #181; l von 2% BIS, und 409 & mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1).
  3. Für eine 1-ml-Lösung des starren PAA (12% Acrylamid und 0,60% BIS), vereinige 300 ul 40% iges Acrylamid, 300 ul 2% BIS, und 169 & mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1).
  4. Entgasen Sie die Lösungen für 15 Minuten. Geben Sie 200, 215, und 230 ul 1 mg / ml Humanplasmafibronektin in ultrareinem Wasser zu den weichen, harten und starren PAA-Lösungen auf. Bei allen Lösungen, fügen 1 ul 10 mg / ml Acrylsäure-N-Hydroxysuccinimid (NHS) -Ester, 5 ul einer 100 mg / ml Ammoniumpersulfat und 2 ul N, N, N ', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED ; Tabelle 1). Mischen Sie mit sanften Pipettieren und vermeiden, Blasen in Lösungen.

PAA
(1 ml)
40%
AA
(Ul)
2%
(Ul)
Ultrapure
Wasser
(Ul)
1 mg / ml
FN
(Ul)
10 mg / ml
NHS Ester
(Ul)
100 mg / ml
APS
(Ul)

TEMED
(Ul)
Elastisch
Modul
(Pa)
Weich 200 25 574 200 1 5 2 1023
Schwer 200 175 409 215 1 5 2 7307
Starr 300 300 169 230 1 5 2 22.692

Tabelle 1: Bestandteil volumes und resultierende Elastizitätsmoduli für weiche, harte und starre PAAs im invadopodia Assays verwendet. AA = Acrylamid, FN = Fibronectin, APS = Ammoniumpersulfat.

  1. Pipettieren Sie 8,48 ul des PAA-Lösung auf dem Zentrum von jeder Vertiefung.
    Hinweis: Dieses Volumen theoretisch ergibt eine PAA von 75 um in der Dicke.
  2. Senken Sie den geflammten Seite der 12 mm Deckglas auf die Tröpfchen im Mikrotiterplatten mit einer Pinzette.
  3. Zulassen des sandwich PAA Lösung für 15-30 min zu polymerisieren. Stellen Sie sicher, Polymerisation, indem Sie das übrig gebliebene Lösung.
  4. 2 ml 1x PBS zu jeder Schale und entfernen Sie die 12 mm Deckgläser mit einer Pinzette.
    Anmerkung: 10x PBS wird im Labor hergestellt und 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M NaCl und 0,056 M Na 2 HPO 4 zusammensetzt.
  5. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min.

3. PReparatur von PAA für Traction Force-Assays

  1. Für eine 1-ml-Lösung des weichen PAA (8% Acrylamid und 0,05% BIS), vereinige 200 ul 40% Acrylamid, 25 ul 2% BIS, und 566 & mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2).
  2. Für eine 1-ml-Lösung von der Fest PAA (8% Acrylamid und 0,35% BIS), vereinige 200 ul 40% iges Acrylamid, 175 ul 2% BIS, und 401 & mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2).
  3. Für eine 1-ml-Lösung des starren PAA (12% Acrylamid und 0,60% BIS), vereinige 300 ul 40% iges Acrylamid, 300 ul 2% BIS, und 161 & mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2).
  4. Entgasen Sie die Lösungen für 15 Minuten. Nach Zugabe von 200, 215, und 230 ul 1 mg / ml menschliches Plasma-Fibronektin zu den weichen, harten und starren PES-Lösungen sind. Mit Ultraschall 8 ul von 200 nm rot fluoreszierende Mikrosphären (Anregung / Emission von 580/605 nm) für 30 Sekunden. Für jede Lösung werden 8 ul von 200 nm rot fluoreszierende Mikrosphären,1 ul 10 mg / ml Acrylsäure-NHS-Ester, 5 ul einer 100 mg / ml Ammoniumpersulfat und 2 ul TEMED (Tabelle 2). Mischen Sie mit sanften Pipettieren und vermeiden, Blasen in Lösungen.

PAA
(1 ml)
40%
AA
(Ul)
2%
BIS
(Ul)
Ultrapure
Wasser
(Ul)
1 mg / ml
FN
(Ul)

Mikrosphären
(Ul)
10 mg / ml
NHS Ester
(Ul)
100 mg / ml
APS
(Ul)

TEMED
(Ul)
Elastisch
Modul
(Pa)
Weich 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Schwer 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Starr 300 300 161 230 8 1 5 2 22.692

Tabelle 2:. Ingredient und resultierend Elastizitätsmoduli für weiche, harte und starre PAAs der Zugkraft Assays verwendet AA = Acrylamid, FN = Fibronectin, APS = Ammoniumpersulfat.

  1. Pipettieren Sie 8,48 ul des PAA-Lösung auf dem Zentrum von jeder Vertiefung.
    Hinweis: Dieses Volumen theoretisch ergibt eine PAA von 75 um in der Dicke.
  2. Senken Sie den geflammten Seite th GentlyE 12 mm Deckglas auf die Tröpfchen im Mikrowell mit einer Pinzette.
  3. Zulassen des sandwich PAA Lösung für 15-30 min zu polymerisieren. Stellen Sie sicher, Polymerisation, indem übriggebliebene Lösung.
  4. 2 ml 1x PBS zu jeder Schale und entfernen Sie die 12 mm Deckgläser mit einer Pinzette.
  5. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min.

4. Herstellung von ECM für Invadopodia Assays

  1. Erhitze das Gelatine-Lösung (1% Gelatine und 1% Saccharose) auf 37 ° C.
  2. Behandeln Sie die PAA mit 150 ul der Gelatine-Lösung für 1 min vorsichtig absaugen vom Boden der Mikrovertiefungen beim Halten der Glasboden Gerichte zu einem Winkel von 45 °.
  3. Man trocknet die verbleibende dünne Gelatineschicht auf die PAA in die Vertiefungen in einem steilen Winkel (60 ° oder mehr), um das Trocknen für 60 min zu optimieren.
  4. Behandeln Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer gekühlten 0,5% Glutaraldehyd-Lösung auf ice für 15 Minuten, gefolgt von Raumtemperatur für 30 min.
  5. 5 min Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer 1 × PBS. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min.
  6. Behandeln Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer Natriumborhydrid-Lösung für 1 min. Klopfen Sie leicht Gerichte auf der Bank, um Blasen, die an der Oberfläche der Gelatine bilden zu entfernen.
  7. Aspirieren und waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer 1 × PBS für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min.
  8. Verdünne eines FITC-markierten Humanplasmafibronektin Lösung auf 50 ug / ml mit einer 1 × PBS und Zentrifugation bei 175.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Entweder kaufen kommerziell erhältlichen markierten Fibronektin oder beschriften Sie sie wie folgt:
    1. Man löst 5 mg Fibronektin werden in 10 ml Boratpuffer (170 mM Natriummetaborattetrahydrat und 40 mM NaCl) und in einen Dialyseschlauch.
    2. Etikett der Fibronektin durch das Schlauchsystem in 200 ml Boratpuffer, enthaltend 6 mg gelöstes FITC bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührerbei der niedrigsten Einstellung 1,5 Stunden in der Dunkelheit eingestellt.
    3. Dialyse mit 500 ml einer 1 × PBS auf einem Magnetrührer bei der niedrigsten Einstellung für 3 Tage in einem dunklen kalten Raum (4 ° C) mit zwei Lautstärke ändert sich täglich.
    4. Berechnen FITC-markiertem Fibronektin-Konzentration basierend auf der optischen Dichte des verdünnten Aliquots (1: 200) bei 280 nm und 493 nm als [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4-fache der Verdünnungsfaktor von 200 mal 2 (welche Konten für die Glycerin Konzentrieren des Fibronektin im nächsten Schritt), wodurch mg / ml-Einheiten.
    5. Dialyse über Nacht in einer 50% Glycerin-Lösung auf einem Magnetrührer bei der niedrigsten Einstellung über Nacht in einer dunklen kalten Raum bei 4 ° C eingestellt.)
  9. Behandeln Sie die Vertiefungen mit 150 ul des FITC-markiertem Fibronektin-Lösung bei Raumtemperatur für 60 min im Dunkeln.
  10. Sorgfältig absaugen FITC-markiertem Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Mikrovertiefungen beim Halten der Glasboden Gerichteein Winkel von 45 ° und dann füllen die Glasbodenschalen mit 70% Ethanol-Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer dunklen Zelle Kultur Haube für die Sterilisierung. Außerdem füllen Glasbodenschale Deckel oder wischen Sie mit fusselarm Tücher in 70% Ethanol eingeweicht.
  11. Waschen Glasbodenschalen, indem sie mit 1x PBS für 5 min. Wiederholen noch zweimal mit 2 ml 1x PBS für insgesamt 15 min.

5. Vorbereitung und Imaging von Invadopodia Assays

  1. Hinzufügen 25.000 Krebszellen in 2 ml invadopodia Medium (1: 1 DMEM und RPMI 1640 mit 5% proteinarme Serum, 10% fetales Rinderserum und 20 ng / ml frisch zugegeben epidermaler Wachstumsfaktor), um die Glasboden Geschirr und beimpft und über Nacht.
  2. Absaugen und behandeln die Vertiefungen, die mit 2 ml einer 3,7% Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 Minuten, um die Zellen zu fixieren.
  3. Nach zwei schnellen Waschungen mit 2 ml 1x PBS, behandeln die Vertiefungen, die mit 2 ml einer 0,1% Triton X-100-Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 5 min, um die Zellen zu permeabilisieren.
  4. Nach einem Schnellwäsche mit 2 ml 1x PBS, behandeln die Vertiefungen, die mit 3% Rinderserumalbumin blockiert Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 Minuten, um die Zellen zu blockieren.
  5. In Blockierungslösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 min: die Vertiefungen mit 150 ul Maus-Anti-Cortactin Antikörper (750 1) zu inkubieren.
  6. Mit 2 ml 1x PBS 5 min waschen Vertiefungen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min.
  7. Inkubieren der Vertiefungen mit 150 ul Ziegen-Anti-Maus-633-Antikörper (1: 500) und 546 Phalloidin (1: 750) in der Blockierungslösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 min.
  8. Mit 2 ml 1x PBS 5 min waschen Vertiefungen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min.
  9. Fügen Sie sechs Tropfen Eindeckmedium zu jeder Vertiefung zu füllen und decken mit 22 x 22 Deckgläser.
  10. Bild Cortactin und Aktin zu invadopodia identifizieren mit Anregungs- und Emissionsfilter von 632/647 nm und556/570 nm, mit einem hohen NA, 40X Ölimmersionslinse auf einem Weitwinkel-inversen Mikroskop. Ebenso Bild Fibronektin zu ECM Abbau identifizieren mit einer Anregungs- und Emissionsfilter von 492/518 nm.

6. Vorbereitung und Imaging von Traction Force-Assays

  1. In 15.000 Krebszellen in 2 ml invadopodia Medium zu den Glasboden Speisen und Inkubation über Nacht.
  2. Absaugen Medium in den Glasboden Speisen und ersetzen mit 2 ml L-15-Medium, mit den gleichen Ergänzungsmittel (5% Low-Protein-Serum, das 10% fötales Rinderserum und 20 ng / ml frisch hinzugefügt epidermaler Wachstumsfaktor), vorge -warmed bis 37 ° C.
  3. Die Glasbodenschalen in einer Umgebungskammer inkubieren auf einem umgekehrten Mikroskop auf 37ºC voräquilibriert mit hoher Luftfeuchtigkeit für 1 Stunde.
  4. Nehmen Sie vier Sätze von Bildern mit einem hohen NA, 40X-Objektiv auf einem Weitwinkel-inverses Mikroskop mit einem automatisierten Bühne, um zelluläre Positionen zu markieren:
    1. Bildzellen aufp der PAA mit Phasenkontrast ("Phase" Bild).
    2. Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen mit Anregungs- und Emissionsfiltern von 560/645 nm durch Fokussieren leicht unter den Zellen, bis die erste Schicht aus Mikrosphären an der Oberseite der PAAs scharf eingestellt ist ("gestresst" image).
    3. Außerdem konzentrieren sich auf den Boden der PAAs (unter Verwendung der Mikrokugeln als Marker), und nehmen ein Bild ("bottom" image). Anmerkung: Der Zweck dieses Bild wird auf den z-Position, um den tatsächlichen PAA Dicke an jeder Position für Zugkraft Berechnungen wie im Repräsentative Ergebnisse beschrieben erhalten aufzuzeichnen.
    4. Nachdem diese Bilder an mehreren Positionen erworben worden, vorsichtig mischen in 220 ul 10% Triton-X-Lösung zur Entfernung der Zellen. Bildmikrokugeln an der Oberseite des PAA an jeder Position, wie zuvor beschrieben ("null" image).

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Representative Results

Im invadopodia Assay werden invadopodia typischerweise durch Colokalisierung von Markern wie Actin und Cortactin bei punktförmigen Strukturen innerhalb des Zellenkörpers (1) identifiziert. Sowohl aktiv abzubauen und nicht-abbau invadopodia kann gezählt werden und werden dadurch bestimmt, ob diese Strukturen mit schwarzen Bereichen fehlt Fluoreszenzsignal im FITC-markiertem Fibronektin (Figur 1) kolokalisiert differenziert. Invadopodia manuell gezählt und ECM-Abbau pro Zelle wird durch die schwarzen Bereiche innerhalb Umrisse der Zellen manuell Schwellen bestimmt.

In der Zugkraft Assay werden vier Bilder in jeder zelluläre Lokalisation von Bühnenposition (Figur 2) gekennzeichneten erfasst. Erstens, "Phase" und "unterstrichen" Bilder werden von allen Zellen von Interesse genommen. Ein "bottom" Bild des PAA wird auch an jeder Position um Hydrogel Stärke berechnen übernommen. Nach dem Entfernen ter Zellen wird eine "null" Bild an jedem markiert Tischposition übernommen. Verformungen im PAA werden berechnet auf der Grundlage der Veränderung der Mikrokugelpositionen zwischen dem "gestresst" und "null" Bilder. Diese Verschiebungen und die mechanischen Eigenschaften der PAAs (E und das Poisson-Verhältnis als 0,5 angenommen) werden dann verwendet, um Zugkräfte (Abbildung 2) zu berechnen. Mehrere verschiedene Methoden existieren für die Berechnung der Zugkräfte 24 basierend auf irgendeiner Formulierung der Boussinesq-Lösung für eine unendliche elastischen Halbraum 25. Während die Details dieser Analysen gehen über den Rahmen dieses Textes haben wir LIBTRC Software von Micah Dembo an der Boston University, die eine zuvor beschriebene Verfahren für die Berechnung der Zugkräfte 26 verwendet lizenziert. Diese besondere Berechnungsverfahren kompensiert endlichen Dicke in seinen Berechnungen, die die Dicke des PAA an jeder Position erfordert, die berechnet wird basierend auf dem difference in der z-Position der "gestresst" und "unten" Bilder. Viele Arbeitsgruppen haben ähnliche Computer-Pakete zur Verfügung, oder wählen Sie, um ihre eigenen Programme zu schreiben. Darüber hinaus bestehen andere Verfahren zum Berechnen von Zugkräften auf der Grundlage unterschiedlicher Ansätze 24.

Figur 1
Abbildung 1: Das invadopodia Test kann in einer SCC-61 (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) Zelle auf einer Fest PAA mit 1% Gelatine und FITC- zur invadopodia und zugehörige ECM Abbau identifizieren Beispiel Weitfeld-Fluoreszenzbilder von invadopodia. beschriftet Fibronektin. Invadopodia werden typischerweise durch Kolokalisation von zwei Markern, wie Actin und Cortactin (rot und blau in der Überlagerungsbild bezeichnet) identifiziert. Invadopodia als quantifiziert werden sowohl aktiv abbau (kolokalisiert mit schwarzen Raum mangelting FITC Signal durch gelbe Pfeile bezeichnet) und nicht-abbauenden (durch weiße Pfeile gekennzeichnet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2: Die Traktionskraft-Assay kann verwendet werden, um zelluläre durch Aktinzytoskeletts erzeugten Zugkräfte durch Verfolgen der Verschiebung der eingebetteten Mikrokügelchen in der PAAs Beispiel Weitfeldphase und Fluoreszenzbilder von einem SCC-61 Zellen auf einer Fest PAA (bestimmen. "Phase"), und die Mikrokugeln direkt unter der Zelle an der Oberseite des PAA ("gestresst"). Ein Bild von der Unterseite der PAA kann auch getroffen werden, um später berechnet seine lokale Dicke ("bottom") werden. Nachdem die Zelle entfernt wird, wird ein Bild erneut der Mikrokugel getroffens an der Oberseite des PAA ("Null"). Microsphere Positionen zwischen der "betonte" und "null" Bilder können verfolgt werden, um eine Ausbeute "Verschiebungsfeld." Microsphere Verschiebungen und PAA mechanischen Eigenschaften können dann verwendet werden, um eine Berechnung "Traktion Vektorfeld." Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Zahl.

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Discussion

Wir stellen ein Verfahren zum Herstellen PAAs, die als Grundlage für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden kann, invasiv und kontraktilen zelluläre Verhalten korrelieren. Während PAAs seit langem verwendet, um an Steifigkeit Wirkungen auf Zellen und berechnet die Zugkräfte 18,24,27 ist dieses Protokoll das erste parallele Assays, die auf PAAs mit den gleichen Steifigkeiten zu entwickeln, die das Vordringen kontraktilen Zellverhalten in Reaktion auf Matrix korrelieren mechanische Eigenschaften. Richtig Aktivieren Sie die Deckgläser der Glasbodenschalen sicher, dass die PAA wird, um sie zu binden und nicht zustande. Zwar haben wir und andere auf Reagenzien, wie Sulfo-SANPAH und Acrylsäure-NHS-Ester verlassen, um Gelatine zu der Oberfläche der PAA in der Vergangenheit 4,12,28 binden, haben wir festgestellt, dass diese Verfahren nicht zuverlässig gleichförmige Oberflächenschichten von Fibronektin zu erzeugen . Daher wurde Fibronektin eingebettet und in der PAA vernetzte Acrylsäure-NHS-Ester durchgeführt, wievon anderen Gruppen 29,30. Jedoch wurden steigende Konzentrationen von Fibronektin um die gleichen Liganden Dichte an den Oberflächen der weichen, harten und steifen PAAs 5 Ausbeute erforderlich. Zusätzlich Einbeziehung von Fibronektin (aber nicht die Mikrosphären) reduziert die mechanischen Eigenschaften der weichen, harten und starren PAAs von 1071, 9299 und 28.283 Pa 4 bis 1023, 7307 und 22.692 Pa 5. Doch noch umfasste diese reduzierten Elastizitätsmodul-Werte der Bereich der normalen und Krebsgewebe 23. Speichermodule des PAA kann leicht durch Rheometrie gemessen und Elastizitätsmodul 1,4 umgewandelt werden.

Während das Protokoll ist geradlinig, Senken und Entfernen der 12 mm Deckgläser sind die schwierigsten Schritte und erfordert Übung. Die größte Herausforderung beim Absenken einer Deckglas ist es, sicherzustellen, dass die PAA-Lösung verteilt sich gleichmäßig und blasenfrei oder Spritzwasser. Entfernen eines Deck erforderteine ruhige Hand, um die 12 mm Deckglas, das Glasboden 14 mm Deckglas oder der PAA nicht beschädigen. Wir haben hydrophobe Beschichtungen auf der 12 mm Deckglas versucht, in die Entfernung zu erleichtern, fand aber, dass die Heranführungsberater sind mit Mustern in ihren Oberflächen hinterlassen. Die Verwendung von feiner Spitze und dünn, Paddel-Stil Pinzette zum Absenken und Entfernen der 12 mm Deckgläser bzw. wird dringend empfohlen. Darüber hinaus ist die Menge an Licht zur Abbildung der Zellen müssen minimiert werden, da einige Zelltypen sind empfindlich gegen konzentrierte Licht auf dem Mikroskop. Außerdem wurde L-15-Medium für die Zugkraft-Assays verwendet werden, da die Umweltkammer auf unserer Mikroskop ist nicht für den CO 2 ausgestattet. Während die gleichen Ergänzungen wurden in den Medien für die invadopodia und Zugkraft-Assays in einem Versuch verwendet werden, um den gleichen Bedingungen zu halten, könnte DMEM und RPMI 1640 anstelle von L-15 verwendet werden, wenn CO 2 Ebenen gesteuert werden kann.

Während das Volumen der PAA-Lösung gewählt, um theoretisch y wurdeield Gele mit einer Dicke von 75 um, ihre Dicke variiert typischerweise zwischen 30-60 um. Allerdings ist dieser Bereich deutlich über dem Wert, bei dem Zellen können die zugrunde liegenden Steifigkeit der Deckgläser der Glasbodenschalen 31 spüren. Darüber hinaus ist die Dicke der ECM-Schicht verwendet, um fest Abbau (Gelatine und FITC-markiertem Fibronektin überlagert auf der PAAs) wurde früher als etwa 1 & mgr; m in der Dicke 12 gemeldet; daher ist diese dünne Schicht nicht die Zellen zu schützen von den Steifigkeiten des PAA. Jedoch können feste Fremdkörper, Risse und andere Fehlbildungen entweder in der Heranführungsberater und / oder ECM-Schicht Einzelzell invasive und Kontraktionseigenschaften zu beeinflussen. Diese Probleme können durch unreine 12 mm Deckgläser, die Trümmer in den Hydrogelen, übermäßige Trocknung der Gele und / oder Gelatine und unvollständige Aspiration von Natriumborhydrid, die Blasen, die die ECM-Schicht verformen lassen kann einzuführen verursacht werden. Daher ist darauf zu achten bei der Auswahl ce genommen werdenlls zur Bildgebung, um sicherzustellen, dass sie nicht übermäßig durch lokale Unregelmßigkeiten in den Oberflächen der Proben beeinflusst.

Relativ hohe Konzentrationen von Fibronektin sowohl bei der PAA und der ECM-Schicht (auf die Gelatine überschichtet mit 50 & mgr; g / ml) (in um 200-230 & mgr; g / ml gemischt) verwendet worden; Die tatsächlichen Konzentrationen an jeder Oberfläche wurden nicht direkt gemessen. Während jede Oberfläche, die mit Fibronectin gesättigt sein scheint, ist es unklar, ob die Zellen erleben, exakt das gleiche Ligand Dichten zwischen den beiden Tests. Für die Zugkraft Assays 200 nm-Mikrokügelchen bei einer Verdünnung von 1: 125 wurden optimal für Abbildungs ​​bewährt. Es ist jedoch durchaus üblich, dass andere Gruppen mit Mikrokugeln mit unterschiedlichen Durchmessern oder Verdünnungen finden. In diesem System angezeigt kleineren Mikrobrownschen Bewegung innerhalb der PAAs, größere Mikrokugeln verursachte Risse und Deformationen. Diese Beobachtungen sind höchstwahrscheinlich auf die physikalischen Eigenschaften der PAAs (dh

Insgesamt viele dieser experimentellen Faktoren können basierend auf den Anforderungen des Anwenders, wie PAAs mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften, die Krebszellen mit unterschiedlichen invasive und Kontraktionseigenschaften und Mikroskopiesysteme mit anderen Bildgebungsfunktionen eingestellt werden. Das Verhältnis von Acrylamid: BIS variiert werden, um PAA mit ähnlichen oder unterschiedlichen Elastizitätsmodulen und Vernetzungs 27 zu erzeugen. Die Empfindlichkeit der Zugkraft Assays können zur Berücksichtigung von verschiedenen zellulären Kraftniveaus durch Veränderung der Steifigkeit und / oder Mikrosphären verd eingestellt werdenIonen. Verschiedene Fluorophore kann auch für die Immunfluoreszenz und Fibronektin Kennzeichnung auf Basis Mikroskop Spezifikationen ausgewählt werden. Während FITC tut bleichen, ist es ganz hell machen ECM Abbau leicht erkennbar. Allerdings Fluoreszenz-Imaging von invadopodia und kleine Mikrosphären erfordert in der Regel hohem NA Ziele für optimale Auflösung. Darüber hinaus können beide Tests auf Glasdeckgläschen in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Es sind jedoch auch Glasboden Gerichte viel einfacher herzustellen und zu verwenden in der gesamten experimentellen Verfahren. In der Zukunft, die Kombination dieser Tests in die man für die direkte Visualisierung der beiden ECM-Abbau und zellulären Krafterzeugung zu ermöglichen. Allerdings würden einige technische Herausforderungen ergeben sich auch Live Cell Imaging für invadopodia und Mikrokügelchen Verschiebungen erhöhte zelluläre Einwirkung von Licht, Bleichung des FITC Fibronektin, und ob Zugkräfte werden vollständig durch die fluoreszenzmarkierten und vernetzten ECM-Schicht auf die PAA Oberflächen transduzierten .

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Disclosures

Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl K25CA143412 (Parekh) unterstützt. Wir möchten Sie erkennen an, dass zusätzliche Unterstützung wurde von der Abteilung für HNO-Heilkunde zur Verfügung gestellt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Acknowledgements

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

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