Polyakrylamidgeler for Invadopodia og trekkraft Analyser på kreftceller

1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Mekanisk stivhet i svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i å drive ondartet oppførsel ved å øke invadopodia aktivitet og actomyosin kontraktilitet. Ved hjelp av polyakrylamidgeler (Paas), kan invadopodia og trekkraft analyser anvendes for å studere de invasive og kontraktile egenskaper av kreftceller i respons til matrise stivhet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stive tumorvev har vært sterkt implisert i regulering av kreftcelle migrering og invasjon. Invasiv migrasjon gjennom tverrbundet vev er tilrettelagt av aktin rike fremspring kalt invadopodia at proteolytisk forringer ekstracellulære matrise (ECM). Invadopodia aktivitet har vist seg å være avhengig av ECM stivhet og kreftcelle kontraktile krefter som tyder på at stivhet signaler kan regulere disse subcellulære strukturer gjennom actomyosin kontraktilitet. Invasive og kontraktile egenskaper av kreftceller kan være korrelert in vitro ved hjelp invadopodia og trekkraft analyser basert på polyakrylamidgeler (PaaS) av ulike stivheter. Invasive og kontraktile egenskaper av kreftceller kan være korrelert in vitro ved hjelp invadopodia og trekkraft analyser basert på polyakrylamidgeler (PaaS) av ulike stivheter. Mens noen variasjoner mellom de to analysene finnes, protokoll er presentert her tilveiebringer en fremgangsmåte for å lage Paas thpå kan brukes i begge analysene og kan enkelt tilpasses til brukerens spesifikke biologiske og tekniske behov.

Introduction

Stivheten av tumorassosierte ECM har blitt identifisert som en betydelig faktor i å drive malign oppførsel ved å øke actomyosin kontraktilitet 1-3. Selv om denne effekten har primært blitt demonstrert med brystkreftceller, har matriksen stivhet blitt funnet å endre invasive egenskaper av celler avledet fra en rekke forskjellige krefttyper 4-8 som tyder på at tumor stivhet kan spille en rolle i andre typer kreft. Å trenge krysskoblede vev under invasiv migrasjon, kreftceller utnytte aktin rike selvklebende utstikkere kjent som invadopodia at lokalisere proteinaser å fokalt degradere ECM 9. Invadopodia anses et kjennetegn på invasive celler og har vært involvert i tumorcelle invasjon og metastase 10,11. Tidligere arbeid har vist at matrise stivhet kan regulere invadopodia tall og tilhørende ECM degradering 4,12 gjennom myosin II aktivitet og mechanosensitive proteiner 12. GittKorrelasjonen mellom tumor tetthet og kreft aggressivitet 13,14, antyder disse resultatene en mekanisme som kreftceller kan svare til stive tumorvev for å drive invasjon og metastase gjennom actomyosin kontraktilitet.

In vitro ECM stivhet og in vivo vev tetthet er blitt vist å regulere invasiv opptreden av kreftceller 1,15-17. Mens actomyosin kontraktilitet synes å være viktig i denne prosessen, nåværende studier konflikt med hensyn til om metastatisk kapasitet er korrelert til økt eller redusert sammentrekkende krefter 6,18-20. Videre er det fortsatt ukjent om disse kreftene direkte megle invadopodia aktivitet 21. Vi har nylig funnet ut at kreftcelle kontraktile styrker var avhengig matrise stivhet og var prediktiv av ECM degradering av invadopodia 5. Disse resultatene tyder på at celle krefter kan spille en viktig rolle i cancerutvikling ved å mediere invadopodia activitet som reaksjon på de mekaniske egenskapene til tumormikromiljøet.

For å korrelere invasive og kontraktile egenskaper kreftceller 5, endret vi en protokoll for å skape PaaS med ulike stivheter som tidligere ble brukt til å undersøke stivhet avhengig invadopodia aktivitet 4,12,22. Ved kjemisk tverrbinding human plasma fibronektin hele Paas, kan disse modifiserte hydrogeler kan brukes som grunnlag for både invadopodia og trekkraft assays for å sikre at celler opplevde de samme stivheter i begge forsøk 5. I invadopodia analyser, gir fibronektinet en naturlig bindende domene for gelatin å knytte kledde ECM til PaaS å oppdage matriksdegradering. I trekkraft analyser, gir fibronektinet en ligand for direkte cellular heft å påvise mikro forskyvninger som brukes til å beregne cellulære trekkrefter. Denne metoden gir det vi har kalt myk, hard,og stive PaaS som er bundet til glassbunn retter og har elastiske moduli, E, av 1023, 7307 og 22692 Pa 5 som består av alt av mekaniske egenskaper som er rapportert for normale og cancervev 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av dekkglass for PaaS

  1. Clean 12 mm Dekk med lave lo våtservietter.
  2. Flame de 12 mm Dekk og 14 mm dekkglass i mikro av hver 35 mm glassbunn fatet ved å føre dem gjennom en Bunsen-brenner flammen bruker pinsett.
  3. Behandle mikrobrønnene med 200 ul 0,1 N NaOH i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Aspirer og luft tørke mikrobrønnene i 30 min.
  5. Behandle mikrobrønnene med 50-100 ul av 3-aminopropyltrimetoksysilan i 10 minutter ved romtemperatur i avtrekksskap. Denne kjemiske reagerer med plast; Bruk derfor glass pipetter og ikke fylle mikrobrønnene helt å unngå kontakt med parabolen plast.
  6. Vask mikrobrønnene med ultrarent vann i omtrent 10 min før den 3-aminopropyltrimetoksysilan blir klart.
  7. Skyll mikrobrønnene med ultrarent vann to ganger ved hjelp av en klemme flaske.
  8. Vask mikrobrønnene med 2 ml ultrarent vannt temperaturen på en vippe innstilt på en middels hastighet (~ 1 Hz) i 10 min rom.
  9. Aspirer og luft tørke mikrobrønnene i 30 min.
  10. Behandle mikrobrønnene med 2 ml 0,5% glutaraldehyd-oppløsning ved romtemperatur på en vippe innstilt på en middels hastighet (~ 1 Hz) i 30 min.
  11. Vask mikrobrønnene med 2 ml ultrarent vann ved værelsestemperatur på en vippe innstilt på middels hastighet (~ 1 Hz) i 10 min. Gjenta to ganger til i totalt 30 min.
  12. Tørre mikro på en bratt vinkel (60º eller høyere) for 30 min.
    Merk: Retter kan lagres i to måneder i et tørkeapparat.

2. Utarbeidelse av PaaS for Invadopodia Analyser

  1. For en 1 ml oppløsning av det myke PAA (8% akrylamid og 0,05% BIS), kombiner 200 ul av 40% akrylamid, 25 ul av 2% BIS, og 574 ul av ultrarent vann (tabell 1).
  2. For en 1 ml oppløsning av det harde PAA (8% akrylamid og 0,35% BIS), kombiner 200 ul av 40% akrylamid, 175 & #181; l av 2% BIS, og 409 ul av ultrarent vann (tabell 1).
  3. For en 1 ml oppløsning av det stive PAA (12% akrylamid og 0,60% BIS), kombiner 300 ul av 40% akrylamid, 300 ul av 2% BIS, og 169 ul av ultrarent vann (tabell 1).
  4. Avgasse løsninger for 15 min. Tilsett 200, 215, og 230 ul av 1 mg / ml human plasma fibronektin i ultrarent vann til den myke, harde og stive PAA løsninger, hhv. For alle løsninger, tilsett 1 pl av 10 mg / ml akrylsyre-N-hydroksysuccinimid (NHS) ester, 5 ul av en 100 mg / ml ammonium-persulfat, og 2 ul av N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED ; tabell 1). Bland med forsiktig pipettering og unngå å skape bobler i løsninger.

PAA
(1 ml)
40%
AA
(Pl)
2%
(Pl)
Ultra
Vann
(Pl)
1 mg / ml
FN
(Pl)
10 mg / ml
NHS Ester
(Pl)
100 mg / ml
APS
(Pl)

TEMED
(Pl)
Elastisk
Modulus
(Pa)
Soft 200 25 574 200 1 5 2 1023
Hard 200 175 409 215 1 5 2 7307
Rigid 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tabell 1: Ingrediens volumes og resulterer elastisitetsmoduler for myke, harde og stive PaaS brukes i invadopodia analyser. AA = akrylamid, FN = fibronektin, APS = ammoniumpersulfat.

  1. Pipettere 8,48 mL av PAA løsningen videre til midten av hver mikrobrønn.
    Merk: Dette volumet teoretisk gir en PAA på 75 mikrometer i tykkelse.
  2. Senk flammet side av 12 mm dekkglass på dråpen i mikro ved hjelp av en pinsett.
  3. La klemt PAA løsning å polymer for 15-30 min. Verifisere polymerisasjon ved å sjekke left løsning.
  4. Tilsett 2 ml 1x PBS til hver tallerken og fjerne de 12 mm dekkglass med pinsett.
    Merk: 10x PBS er laget i laboratoriet, og bestående av 0,011 M KH 2PO 4, 1,54 M NaCl og 0,056 M Na HPO 2 4.
  5. Vask mikrobrønnene med 2 ml av 1 x PBS i romtemperatur i 5 min. Gjenta to ganger for totalt 15 min.

3. Poppreisning av PaaS for trekkraft Analyser

  1. For en 1 ml oppløsning av det myke PAA (8% akrylamid og 0,05% BIS), kombiner 200 ul av 40% akrylamid, 25 ul av 2% BIS, og 566 ul av ultrarent vann (tabell 2).
  2. For en 1 ml oppløsning av det harde PAA (8% akrylamid og 0,35% BIS), kombiner 200 ul av 40% akrylamid, 175 ul av 2% BIS, og 401 ul av ultrarent vann (tabell 2).
  3. For en 1 ml oppløsning av det stive PAA (12% akrylamid og 0,60% BIS), kombiner 300 ul av 40% akrylamid, 300 ul av 2% BIS, og 161 ul av ultrarent vann (tabell 2).
  4. Avgasse løsninger for 15 min. Tilsett 200, 215, og 230 ul av 1 mg / ml human plasma fibronektin til den myke, harde og stive PAA løsninger, hhv. Sonikere 8 mL av 200 nm røde fluorescerende sfærer (eksitasjon / utslipp av 580/605 nm) for 30 sek. For hver løsning, legger 8 mL av 200 nm røde fluorescerende sfærer,1 pl av 10 mg / ml akrylsyre-NHS-ester, 5 ul av en 100 mg / ml ammonium-persulfat, og 2 ul TEMED (tabell 2). Bland med forsiktig pipettering og unngå å skape bobler i løsninger.

PAA
(1 ml)
40%
AA
(Pl)
2%
BIS
(Pl)
Ultra
Vann
(Pl)
1 mg / ml
FN
(Pl)

Mikrosfærer
(Pl)
10 mg / ml
NHS Ester
(Pl)
100 mg / ml
APS
(Pl)

TEMED
(Pl)
Elastisk
Modulus
(Pa)
Soft 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Hard 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Rigid 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tabell 2:. Ingredient volumer og resulterer elastisitetsmoduler for myke, harde og stive PaaS brukes i trekkraft analyser AA = akrylamid, FN = fibronektin, APS = ammoniumpersulfat.

  1. Pipettere 8,48 mL av PAA løsningen videre til midten av hver mikrobrønn.
    Merk: Dette volumet teoretisk gir en PAA på 75 mikrometer i tykkelse.
  2. Senk forsiktig flammet siden av the 12 mm dekk videre til dråpe i mikro bruker pinsett.
  3. La klemt PAA løsning å polymer for 15-30 min. Verifisere polymerisasjon ved å sjekke left løsning.
  4. Tilsett 2 ml 1x PBS til hver tallerken og fjerne de 12 mm dekkglass med pinsett.
  5. Vask mikrobrønnene med 2 ml av 1 x PBS i romtemperatur i 5 min. Gjenta to ganger for totalt 15 min.

4. Utarbeidelse av ECM for Invadopodia Analyser

  1. Varm opp gelatinoppløsning (1% gelatin og 1% sukrose) til 37 ° C.
  2. Behandle Paas med 150 ul av den gelatinoppløsning i 1 min og deretter forsiktig aspireres fra bunnen av mikrobrønnene ved å holde glassbunn retter i en 45 ° vinkel.
  3. Tørk det gjenværende tynne lag av gelatin på Paas i mikrobrønnene ved en bratt vinkel (60 ° eller høyere) for å optimalisere tørking i 60 min.
  4. Behandler mikrobrønnene med 2 ml av en avkjølt 0,5% glutaraldehyd-løsning på ice i 15 minutter, fulgt av romtemperatur i 30 min.
  5. Vask mikrobrønnene med 2 ml av en 1 x PBS i 5 min. Gjenta to ganger for totalt 15 min.
  6. Behandle mikrobrønnene med 2 ml av en natriumborhydrid-løsning i 1 min. Banke forsiktig retter på benken for å fjerne bobler som dannes på overflaten av gelatin.
  7. Aspirer og vask mikrobrønnene med 2 ml av en 1 x PBS i 5 min. Gjenta to ganger for totalt 15 min.
  8. Fortynn et FITC-merket human plasma fibronektin løsning på 50 ug / ml med en 1 x PBS og sentrifuger ved 175 000 xg ved 4 ° C i 15 min. Enten kjøpe kommersielt tilgjengelig merket fibronektin eller merke det som følger:
    1. Oppløse 5 mg fibronektin i 10 ml borat buffer (170 mM natrium metaborate tetrahydrate og 40 mM NaCl) og plasser i dialyseslangen.
    2. Merke fibronektin ved å plassere røret i 200 ml boratbuffer inneholdende 6 mg FITC ble oppløst ved romtemperatur på en magnetrørerinnstilt på den laveste innstillingen i 1,5 timer i mørket.
    3. Dialyser med 500 ml av en 1 x PBS på en magnetisk rører innstilt på den laveste innstillingen i 3 dager i et mørkt kaldt rom (4 ° C) med to volum endres om dagen.
    4. Beregn FITC-merket fibronektin-konsentrasjon basert på den optiske tetthet av fortynnede prøver (1: 200) ved 280 nm og 493 nm [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 ganger fortynning faktor på 200 ganger 2 (som utgjør for glyserol konsentrering av fibronektin i neste trinn) som resulterer i mg / ml enheter.
    5. Dialyser over natten i en 50% glycerol-løsning på en magnetisk rører innstilt på den laveste innstillingen over natten i et mørkt kaldt rom ved 4 ° C).
  9. Behandler mikrobrønnene med 150 ul av FITC-merket fibronektin oppløsningen ved værelsestemperatur i 60 min i mørket.
  10. Aspirere forsiktig FITC-merket fibronektin løsning fra bunnen av mikrobrønnene ved å holde glassbunn retter45 ° vinkel og deretter fylle glassbunn retter med 70% etanol løsning ved romtemperatur i 10 minutter i en mørk celle kultur hette for sterilisering. Også fylle glassbunn parabolen lokk eller tørk rent med lavt lo kluter dynket i 70% etanol.
  11. Vask glassbunn retter ved å fylle dem med 1 x PBS i 5 min. Gjenta to ganger med 2 ml av 1 x PBS i totalt 15 min.

5. Forberedelse og Imaging av Invadopodia Analyser

  1. Legg 25000 kreftceller i 2 ml invadopodia medium (1: 1 DMEM og RPMI 1640 sammen med 5% lav-proteinserum, 10% føtalt bovint serum og 20 ng / ml ferskt tilsatt epidermal vekstfaktor) til glassbunn og retter inkuberes over natten.
  2. Aspirer og behandle mikrobrønnene med 2 ml av en 3,7% paraformaldehyd-løsning ved romtemperatur i mørke i 20 minutter for å fiksere cellene.
  3. Etter to raske vaskinger med 2 ml av 1 x PBS, behandle mikrobrønnene med 2 ml av en 0,1% Triton X-100 oppløsning ved værelse temperatur i mørke i 5 min for å permeabilisere cellene.
  4. Etter en rask vask med 2 ml av 1 x PBS, behandle mikrobrønnene med 3% bovint serumalbumin blokkeringsløsning ved romtemperatur i mørke i 60 min for å blokkere celler.
  5. Inkuber mikro med 150 ul av mus anti-cortactin antistoff (1: 750) i blokkeringsløsning ved romtemperatur i mørke i 60 min.
  6. Vask mikrobrønner med 2 ml av 1 x PBS i 5 min. Gjenta to ganger for totalt 15 min.
  7. Inkuber mikro med 150 ul av geit-anti-mus antistoff 633 (1: 500) og 546 phalloidin (1: 750) i blokkeringsløsning ved romtemperatur i mørke i 60 min.
  8. Vask mikrobrønner med 2 ml av 1 x PBS i 5 min. Gjenta to ganger for totalt 15 min.
  9. Legg seks dråper montering medium å fylle hver mikro og dekk med 22 x 22 Dekk.
  10. Bilde cortactin og aktin å identifisere invadopodia hjelp eksitasjon og emisjonsfiltre av 632/647 nm og556/570 nm henholdsvis, ved hjelp av en høy NA, 40X oljeimmersjon objektiv på et bredt felt invertert mikroskop. Tilsvarende til bilde fibronektin identifisere ECM nedbrytning ved hjelp av en eksitasjon og emisjon filter av 492/518 nm.

6. Utarbeidelse og Imaging av trekkraft Analyser

  1. Legg 15000 kreftceller i 2 ml invadopodia medium til de glassbunn retter og inkuberes over natten.
  2. Sug medium i glassbunn retter og erstatte med 2 ml L-15 medium, med de samme kosttilskudd (5% lav-proteinserum, 10% føtalt bovint serum og 20 ng / ml ferskt tilsatt epidermal vekstfaktor), pre -warmed til 37 ° C.
  3. Inkuber glassbunn retter i et miljøkammer på et invertert mikroskop pre-ekvilibrert til 37 ° C med høy fuktighet i 1 time.
  4. Ta fire sett med bilder med en høy NA, 40X objektiv på et bredt felt invertert mikroskop med en automatisert scenen for å markere cellulære stillinger:
    1. Bilde celler på åp av PaaS bruker fasekontrast ("fase" bilde).
    2. Bilde fluorescerende mikrosfærer ved bruk av eksitasjons- og emisjonsfiltre av 560/645 nm ved å fokusere litt under cellene inntil det første laget av mikrokuler på toppen av Paas kommer i fokus ("stresset" image).
    3. I tillegg fokuserer på bunnen av Paas (ved hjelp av mikrokulene som markører), og ta et bilde ("bunnen" image). Merk: Hensikten med dette bildet er å registrere z-posisjon for å få den faktiske PAA tykkelse ved hver posisjon for trekkraft beregninger som beskrevet i Representative resultater.
    4. Etter disse bildene er kjøpt til flere posisjoner, forsiktig bland i 220 pl 10% Triton-X løsning for å fjerne celler. Bildemikrokuler på toppen av Paas ved hver posisjon som tidligere beskrevet ("null" image).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I invadopodia assay blir invadopodia vanligvis identifiseres ved colocalization av markører som aktin og cortactin ved punctate strukturer i cellelegemet (figur 1). Både aktivt nedbrytende og ikke-nedbrytende invadopodia kan telles og blir differensiert av om disse strukturene er colocalized sorte områder som mangler fluorescerende signal i FITC-merket fibronektin (figur 1). Invadopodia er manuelt tellet, og ECM nedbrytning per celle bestemmes ved manuelt terskel disse sorte områder innenfor konturene av cellene.

I trekkraften analysen, er fire bilder som tas ved hver posisjon som er merket med cellulær stadium posisjon (figur 2). Først "fase" og "stresset" bilder blir tatt av alle cellene av interesse. En "bunnen" bilde av PAA er også tatt ved hver posisjon for å beregne hydrogel tykkelse. Etter å ha fjernet than celler, er et "null" bilde tatt på hvert merket scenen posisjon. Deformasjoner i PaaS er beregnet basert på endringen i mikro stillinger mellom "stresset" og "null" bilder. Disse forskyvninger og de ​​mekaniske egenskaper av den Paas (E og Poissons tall antas som 0,5) blir så brukt til å beregne strekkrefter (figur 2). Flere forskjellige metoder finnes for beregning av strekkrefter 24 basert på noen formulering av Boussinesq løsning for en uendelig elastisk halv plass 25. Mens detaljene i disse analysene er utenfor rammen av denne teksten, har vi lisensiert LIBTRC programvare fra Micah Dembo ved Boston University som bruker en tidligere beskrevet metode for beregning av strekkrefter 26. Denne spesielle beregningsmetoden kompenserer for endelig tykkelser i sine beregninger som krever tykkelsen på PaaS på hver posisjon som er beregnet på grunnlag av difference i z-stillingen av "stressede" og "bunn" bilder. Mange forskningsmiljøer har lignende datamaskinen pakker tilgjengelig eller velger å skrive sine egne programmer. I tillegg har andre metoder finnes for beregning av strekkrefter basert på ulike matematiske tilnærminger 24.

Figur 1
Figur 1: invadopodia Målingen kan brukes til å identifisere invadopodia og tilhørende ECM nedbrytning Eksempel bredt felt fluorescens bilder av invadopodia i en SCC-61 (hode og nakke squamous cell carcinoma) celle på en hard PAA med 1% gelatin og FITC-. merket fibronektin. Invadopodia er vanligvis identifisert av colocalization av to markører som aktin og cortactin (rød og blå i overleggsbildet, henholdsvis). Invadopodia kan kvantifiseres som både aktivt nedverdigende (colocalized med sorte områder mangeling FITC signal som merket med gule piler) og ikke-nedverdigende (merket med hvite piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Den trekkraft Målingen kan brukes til å bestemme celletrekkrefter som genereres av aktin cytoskjelettet ved relativ forskyvning av mikrokulene innleiret i Paas Eksempel bredfelt fase- og fluorescens bilder av en SCC-61 celle på en hard PAA (. "fase"), og mikrokulene direkte under cellen på den øvre overflate av PAA ("stresset"). Et bilde av bunnen av PAA kan også tas for å senere å beregne den lokale tykkelse ("bunnen"). Etter at cellen er fjernet, er et bilde en gang tatt av mikros ved den øvre overflate av PAA ("null"). Mikro posisjoner mellom "stresset" og "null" bilder kan spores til å gi en "forskyvning felt." Mikro forskyvninger og PAA mekaniske egenskaper kan deretter brukes til å beregne en "traction vektorfeltet." Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en metode for å fabrikkere PaaS som kan brukes som grunnlag for invadopodia og trekkraft analyser for å korrelere invasive og kontraktile cellulære atferd. Mens PaaS har lenge vært brukt til å se på stivhet virkninger på celler og beregne trekkrefter 18,24,27, er den første til å utvikle parallelle analyser basert på PaaS med samme stivheter å korrelere invasive og kontraktile cellulære atferd i respons til matrise denne protokollen mekaniske egenskaper. Riktig aktivering glassene av glassbunn retter sikrer at PaaS vil binde seg til dem og ikke kommer av. Mens vi og andre har stolt på reagenser som sulfo-SANPAH og akrylsyre NHS-ester til å binde gelatin til overflaten av Paas tidligere 4,12,28, har vi funnet at disse metodene ikke frembringe en pålitelig jevn overflate lag av fibronektin . Derfor ble fibronektin innleiret og fornettet i løpet av Paas ved hjelp av akrylsyre NHS ester som utførtav andre grupper 29,30. Imidlertid, ble økende konsentrasjoner av fibronektin som kreves for å gi samme ligand tetthet ved overflaten av de myke, harde og stive Paas 5. I tillegg inkorporering av fibronektin (men ikke mikrokulene) redusert de mekaniske egenskapene til de myke, harde og stive PaaS fra 1071, 9299, og 28 283 Pa 4 til 1023, 7307, og 22 692 Pa 5, henholdsvis. Men disse reduserte elastisitetsmoduler verdier fremdeles omfattet området fra normale og cancerøse vev 23. Lagringsmoduler av PaaS kan lett måles ved rheometri og konvertert til elastisk moduli 1,4.

Mens protokollen er rett frem, senking og fjerne de 12 mm Dekk er de mest vanskelige trinn og krever praksis. Den største utfordringen når du senker et dekkglass er å sikre at PAA løsning sprer seg jevnt uten bobler eller sprut. Fjerne en dekk kreveren jevn hånd for å ikke skade 12 mm dekkglass, glassbunn 14 mm dekkglass, eller PAA. Vi har prøvd hydrofobe belegg på 12 mm dekk hjelp til å fjerne, men fant at PaaS sitter igjen med mønstre i deres overflater. Bruken av fine tips og tynne, padle-stil pinsett for å senke og fjerne de 12 mm Dekkhenholdsvis er sterkt anbefalt. I tillegg er mengden av lys som brukes til å bilde cellene skal bli minimalisert, siden noen celletyper som er følsomme for konsentrert lys på mikroskopet. Også, L-15 medium ble brukt for trekkraft analyser siden vår miljøkammer på vår mikroskop ikke er utstyrt for CO 2. Mens de samme kosttilskudd ble brukt i media for invadopodia og trekkraft analyser i et forsøk på å holde betingelsene de samme, kan DMEM og RPMI 1640 brukes i stedet for L-15 dersom CO2-nivået kan kontrolleres.

Selv om volumet av PAA-løsningen ble valgt til å teoretisk yield geler med en tykkelse på 75 um, deres tykkelser varierer typisk mellom 30-60 um. Imidlertid er denne serien godt over verdien på hvilke celler kan fornemme den underliggende stivhet i dekkglass av glass bunn retter 31. I tillegg tykkelsen av ECM sjikt anvendes for å detektere degradering (gelatin og FITC-merket fibronektin kledde videre til Paas) er tidligere blitt rapportert som omtrent 1 um i tykkelse 12; Derfor har dette tynne sjikt ikke beskytte cellene fra den stivheter av Paas. Imidlertid kan solid rusk, sprekker og andre misdannelser i enten PaaS og / eller ECM lag påvirke individuelle cellulære invasive og kontraktile egenskaper. Disse problemene kan være forårsaket av urene 12 mm Dekk som introduserer rusk inn hydrogelene, overdreven tørking av gels og / eller gelatin, og ufullstendig aspirasjon av natriumborhydrid som kan la bobler som deformeres ECM lag. Derfor må man være forsiktig når du velger cells for avbildning for å sikre at de ikke blir utilbørlig påvirket av lokale uregelmessigheter i overflatene av prøvene.

Relativt høye konsentrasjoner av fibronektin i både Paas (blandet på 200-230 pg / ml), og ECM lag (lagt oppå gelatin ved 50 ug / ml) er blitt anvendt; men de aktuelle konsentrasjoner på hver overflate har ikke blitt målt direkte. Mens hver overflaten ser ut til å være mettet med fibronektin, er det uklart om cellene opplever de samme ligand tettheter mellom de to analysene. For trekkraft assays, 200 nm mikrokuler ved en fortynning på 1: 125 har vist seg optimal for avbildning. Imidlertid er det ganske vanlig å finne andre grupper ved hjelp av mikrokuler med forskjellige diametere eller fortynninger. I dette systemet, mindre sfærer vises Brownske bevegelser innenfor PaaS, mens større sfærer forårsaket sprekker og misdannelser. Disse observasjonene er mest sannsynlig på grunn av de fysiske egenskapene til det Paas (dvs.

Samlet, mange av disse eksperimentelle faktorer kan justeres basert på brukerens behov som PaaS med ulike mekaniske egenskaper, kreftceller med varierende invasive og kontraktile egenskaper, og mikroskopi systemer med andre imaging evner. Forholdet mellom akrylamid: BIS kan varieres for å frembringe Paas med lignende eller forskjellige elastisitetsmoduler og tverrbindings 27. Følsomheten av trekkraften assays kan justeres til kontoen for ulike cellulære styrkenivåer ved å endre stivheten og / eller mikrokule dilution. Forskjellige fluoroforer kan også velges for immunfluorescens og fibronektin merking basert på mikroskop spesifikasjoner. Mens FITC gjør blekemiddel, er det ganske lyst making ECM degradering lett identifiserbare. Men fluorescens avbildning av invadopodia og små mikrosfærer krever vanligvis høye NA mål for optimal oppløsning. I tillegg kan begge analysene utføres på dekkglass i brønnplater. Men glassbunn retter er mye lettere å fremstille og anvende hele den eksperimentelle prosess. I fremtiden vil kombinere disse analysene i ett tillate for direkte visualisering av både ECM degradering og cellulær styrkegenerering. Imidlertid vil flere tekniske utfordringer oppstår inkludert levende celle bildebehandling for invadopodia og mikro forskyvninger, økt celle eksponering for lys, bleking av FITC fibronektinet, og om trekkrefter er helt omformet gjennom fluoresceinmerket og tverrbundet ECM lag til PAA overflater .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Number K25CA143412 (Parekh). Vi ønsker å erkjenne at ytterligere støtte ble gitt av Institutt for Øre. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.

Acknowledgements

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics