Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Glioblastoma (GBM) en sık görülen habis beyin tümörü ve daima ölümcüldür. Bakım kemoterapi ve radyoterapi non-spesifik standart ile birleştiğinde cerrahi rezeksiyon tamamen bu hastalığı 1 olan hastalarda en az 15 ay kasvetli prognoz sonuçlanan malign hücreleri ortadan kaldırmak için başarısız olur. Bunun aksine, immüno spesifik olarak tümör hücrelerini hedef alan için kesin bir yaklaşım sunmaktadır ve bu nedenle yan toksisite 2-4 riskinin azalması ile, yüksek ölçüde etkili bir tedavi platformu olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. T hücreleri kimerik antijen reseptörleri (arabaların) tümör immünoterapi için çok yönlü bir strateji sunmak ifade ex vivo mühendislik. Arabaların kompleks, tam uzunlukta, başlıca doku uyumu yerine, bir ya da daha fazla hücre içi T hücresi sinyal molekül (ler) ile bir antikorun hücre dışı değişken bölgesini füzyon tarafından üretilen (MHC) bir T hücresi reseptörü 5 -restricted. Antikor benzeri antijen Tanıma ve ödüller Bu modreaktif antijen spesifik T hücreleri tanımak ve MHC olmadığı halde tümör antijenlerine yanıt ve hemen hemen sonsuz bir antijen repertuar için uyarlanabilir edilmesi için, izin verir.

Tümör antijenlerinin çeşitli karşı tasarlanmış ARAÇ T hücreleri klinikte 6-9 preklinik etkinliğini ve üstün söz göstermiştir. Özellikle, GBM kapsamında, bir ARAÇ T hücresi platformu hedefleme epidermal büyüme faktörü reseptörü varyantı III (EGFRvIII), tümöre özel bir mutasyon hücre yüzeyi 10 üzerinde eksprese, gliom taşıyan farelere 11 ömrünü uzattığı gösterilmiştir. Çeşitlilikleri rağmen, ARAÇ adoptif tedavi klinik yarar tamamen bağlı tümör bağlantılı bağışıklık bastırma ve bağışıklık kaçırma 12-16 olarak oluşturulması ve in vivo olarak antijen-spesifik T hücrelerinin korunmasında zorluklar kısmen fark edilmemiştir. Immünoterapi ile bakım (SOC) standardını yararlanan potansiyel bu l birkaç üstesinden gelebilirtaklidi, hem klinik öncesi ve klinik ortamda gelişmiş etkinlik ile sonuçlanmaktadır.

Sonrası rezeksiyon GBM için SOC yüksek doz temozolomide (TMZ), bir DNA alkilleyici ajan 17, ve tüm beyin ışınlaması (TBI) oluşur 1. Bu tedaviler, tümör MHC ekspresyonunun 18-20 yukarı regülasyonu ve ölü tümör hücreleri 17,19,21,22 ile antijen dökülme ile tümör aşıları ile sinerji olduğu kabul edilir. Nitekim, klinik öncesi ortamda bağışıklık temelli tedaviler geliştirilmiş antitümör etkinliğine TMZ 20,23 veya 18,24 WBI potansiyel eklenmesi. Ayrıca, birçok non-spesifik sitotoksik kemoterapötik gibi, TMZ evlatlık tedavi platformları 27-29 host-klima aracı olarak kaldıraçlı olabilir sistemik lenfopeni 25,26, neden olduğu bilinmektedir. TMZ aracılı lymphodepletion bir ADOP artan etkinliğine yol açan antijen-spesifik T hücrelerinin frekansı ve fonksiyonunu artırmak için gösterilmiştirintrakranial tümörlere karşı 30 tif tedavi platformu. ARAÇ tedavisi bağlamında, lymphodepletion hem böylece anti-tümör aktivitesi 11,34 artırılması, endojen bastırıcı T hücreleri 31 sayısını azaltır ve sitokinlerin 33 için daha az rekabet ettirilerek homeostatik proliferasyonu 32 uyararak konakçı klima bir araç olarak hizmet eder. SOC bağlamında yeni evlat edinen tedaviler ve aşı platformları değerlendirilmesi etkinliğine ilişkin anlamlı sonuçlar çizim için kritik GBM SOC ve immünoterapi platformlar arasında sinerjik bir ilişki göz önüne alındığında.

Bu protokol, EGFRvIII pozitif tutan tümörler (tedavi zaman çizelgesi için bakınız Şekil 1) taşıyan farelerde TMZ ve WBI birlikte sıçangil EGFRvIII özgü ARAÇ T hücrelerinin üretimi ve damar içine uygulama için bir yöntem özetlemektedir. Kısaca, ARAÇ T hücreleri retroviral transdüksiyon tarafından ex vivo yapılır. İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T Hücreler daha sonra hasat edilmiş ve paralel olarak kültürlenir aktif sıçangil splenositlerin nakletmek için kullanılan virüs üretmek için (ARAÇ vektör ve PCL-Çevre plazmidleri içeren) bir DNA / lipid kompleksi kullanılarak transfekte edilir. ARAÇ üretimi sırasında, EGFRvIII pozitif intrakraniyal tümörleri taşıyan sıçangil ana klinik SOC kıyaslanabilir dozlarda parçalanmış tüm beyin X-ışını radyasyon ve sistemik TMZ tedavisi uygulanır. ARAÇ T hücreleri daha sonra lymphodepleted bilgisayarlar intravenöz teslim edilir.

Aşağıdaki prosedür, yedi ayrı haldeki evreler içinde tarif edilmektedir: Tümör taşıyan, Tümör taşıyan fareler (2) tüm beyin ışınlama, fareler (3) Transfeksiyonu için temozolomid (1) Uygulama (4) splenektomi ve T hücre hazırlanması, (5 Tümör taşıyan fareler için (6) CAR T hücre Kültür ve Hasat ve (7) CAR T hücre yönetimi) İletimi. Bu aşamalar 6-7 güne yayılan ve aynı anda yapılmaktadır birkaç adım oluşmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol 10 fareler 10 7 ARAÇ T hücreleri, her ile tedavi edilir bir deneysel tasarım dayanmaktadır. Bu durum, 10 8 ARAÇ T hücreleri gerektiği anlamına gelir; verim canlılığı kaybı hesabına 5 x 10 7 -1 x 10 8 tarafından abartılmıştır edilmelidir. Aşağıdaki protokol yaklaşık 200 x 10 6 hücre oluşturmak için ölçeklenir. Hücreler daha sonra, mevcut KR158B astrositom veya B 16 melanoma hücre hatları geliştirilen, 9 gün kurulmuş singeneik EGFRvIII pozitif kafatası içi tümörlerine sahip dişi C57BL / 6 farelerine damar içinden tatbik edilir. Buna paralel ARAÇ T hücresi üretimi ile, tümör taşıyan farelerin lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) ve WBI (16.5 Gy) klinik açıdan anlamlı dozlarda tatbik edilmektedir.

Fareler muhafaza ve Duke Üniversitesi Tıp Merkezi (DUMC) ile patojensiz şartlar altında yetiştirildi. Tüm hayvan deneyleri Duke Üniversitesi Kurumu tarafından onaylanan protokollere göre yapıldıEl Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC).

Tümör taşıyan fareler için temozolomidin 1. İdare

Gün ile 4 0:

  1. Farelerin sayısı enjekte edilecek hesaplayın ve yayılma (16.5 mi TMZ hesaba (örneğin, 30 farenin x 0,5 ml = 15 mi TMZ) ihtiyaç TMZ çözeltisi miktarını belirlemek ve bu birime 1.5 mi eklemek için 0.5 ile çarpın ).
  2. 3 mg bu toplam hacmi çarpın / ml gerekli liyofilize TMZ ağırlığını belirlemek için (örneğin, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). 50 ml'lik konik içine bu tartılır.
    DİKKAT: TMZ inhalasyon, sindirim ve gözlerle, cilt ile temasında ve mukozal membranlar tarafından toksiktir. Maruz kalma riskini azaltmaya yönelik öneriler için kurumun iş güvenliği ve / veya çevre sağlığı ve sağlıklı yaşam departmanı danışın.
  3. Dimetil sülfoksit hacmini belirlemek için 0.15 ile toplam hacmi çarpın (DMSO) (örn, 16.5 x gerekli0.15 = 2,475 mi DMSO). Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron filtre içinden DMSO Bu hacim (artı yayılma için hesap ilave 2 ml) içinde sterilize edilir. TMZ toz, steril DMSO 2,475 mL ekleyin.
  4. 10-15 dakika süre ile 65 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde, su içinde bir çanak içinde TMZ / DMSO çözeltisi yerleştirin. TMZ tamamen çözüldükten sonra çözelti, renk soluk sarı bir olmalıdır; Çözelti pembe olursa, o zaman TMZ parçalanır ve yeni bir solüsyon TMZ taze bir çok hazırlanmalıdır.
  5. Toplam hacmi (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml serum fizyolojik) tarafından 0.85 çarpılarak gerekli steril serum fizyolojik uygun hacmini hesaplayın. 50 ml'lik bir konik steril tuzlu su içinde 15 ml ilave edilir. TMZ DMSO, 65 ° C ısı tuzlu su içinde eritilmesi iken.
  6. Girdap TMZ / DMSO çözeltisi TMZ tozu tamamen çözündürüldü ve yavaş yavaş TMZ / DMSO çözeltisi ısıtılmış tuzlu su eklemek olduğundan emin olmak için.
  7. Hemen hazırlandıktan sonra, tam 15 x 1 ml tüberkülin syring yük4 gün yerleşik tümör taşıyan farelere tatbikat için TMZ çözeltisi ile es.
  8. Beş TMZ idarelerinin toplam 4 arasındaki günlerde 1 bu işlemi tekrarlayın.

Tümör taşıyan fareler 2. Tüm Beyin Işınlama

Gün 2 ile 4:

  1. X-ışını irradiator Güç ve ısınma tam gerilime izin verir. Uygun filtre yeri ve giriş doğru voltaj ve akım ayarları (Şekil 2A) olduğundan emin olun.
    NOT: irradiator ve dozimetre gerilim ayarları ve ızgara düzeni (Şekil 2A, B) Uygun belirlemek için önceden tesis edilmelidir.
  2. 5.5 Gy X-ışınlarıyla neden gerekli süreyi hesaplayın. X-ışınları 2 Gy / dk'lık bir hızda verilmektedir, örneğin, daha sonra 2.75 dakika 5.5 Gy toplam sağlamak için gereklidir. Giriş uygun zaman süresi.
    Not: Tablo 2 fare WBI bir ölçerleri sağlarİnsanlarda ND klinik benzerleri. Yüksek dereceli gliomlarda bağlamında, 60 Gy TBI (6 hafta boyunca 2 Gy fraksiyonları, 5 gün / hafta) parçalandı bakım klinik standart ve burada kullanılan kemirgen eşdeğer 16.5 Gy (Gy x 3 5.5) 'dir.
  3. 2 mi ketamin ve nihai çözelti, 10 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin olduğu şekilde, 1 ml ksilazin mi 17 tuzlu su ekleyerek sistemik anestezi için, ketamin / ksilazin taze bir çözelti hazırlayın.
  4. Fareler tartılır ve hayvanlar 100 mg / kg ve 10 mg / kg ksilazin ile ketamin dozu almış gibi vücut ağırlığının gramı başına karın içinden ketamin / ksilazin 10 ul yönetmek. Fareler tamamen uyuşturulmuş ve gözle görülür ketamin / ksilizin yönetiminin 2 dakika içinde nefes olmalıdır.
  5. Sedasyon hayvanlarda göz nemi korumak için, yavaşça her göz yapay gözyaşı merhem küçük bir miktar sürün.
  6. Kafaları en yüksek X-ray aldığı alanda konumlandırılmış şekilde ızgara üzerinde sedasyon fareler yerleştirintensit (Şekil 2B, C). Aşağı uygun olan boyundan kalkan organları sistemik X-ışını teslim (Şekil 2B) engellemek için kurşun boru büyüklüğünde.
  7. Izgara düzeni X-ışını demetinin odak noktasını gösteren lazer koordinat (0,0) olacak şekilde X-ışını altında konumlandırılmış fareler yerleştirin. X-ışını teslim başlayın.
  8. X-ışını teslim tamamlandığında, sıcak ısıtma yastığı irradyatör ve yerden hayvanları kaldırın. Hayvanlar sternum recumbence korumak için yeterli bilinci yerine kadar bilinçli hayvanlar ile sedasyon hayvanları ev etmeyin. Hayvanlar, sternum recumbence korumak geri uygun kafeslerinde bilinçli hayvanları yerleştirebilirsiniz kez.
  9. Radyasyon üç bölünmüş dozlarda olmak üzere toplam gün 3 ve 4 bu prosedürü yineleyin.

3. Transfeksiyon

Gün -1:

  1. Dulbecco M, 500 ml, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ilave edilerek D10 ortamı hazırlamakdeğişmemiş Eagle Ortamı (DMEM).
  2. 500 ml RPMI-1640 ortamı için 5,5 ml L-glutamin, 5.5 ml sodyum piruvat, 5.5 mi temel olmayan amino asitler ve 5,5 ml penisilin / streptomisin (pen / strep) ilave edilerek, T hücre ortamı (TCM) hazırlayın. Daha sonra, 2-merkaptoetanol ve 550 ul gentamisin 550 ul ilave edin. Son olarak, 50 mi FBS ekleyin.
  3. Hasat, in vitro kültürlenmiş HEK293T hücreleri ve D10 ortam içinde 7.5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona getirin.
  4. Levha 10 mi D10 ortamı ve 16 x 10 cm, poli-D-lisin (PDL) kaplı plakalar her HEK293T hücre süspansiyonu 1 ml.
  5. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edin.

Gün 0:

  1. Hücreleri transfecting önce 10 ml taze D10 en az 30 dakika Ortamı değiştirin.
  2. + 1 (= 17 + 16 1) 14.1 ng plakalar toplam sayısı ile çarpılarak transfeksiyon için gerekli olan vektör plazmidinin miktarı, PCL-Çevre vektörü ve lipozomal transfeksiyon reaktifi belirlemekvektör plazmid (14.1 x 17 = 239,7 mikrogram), 9.9 ug PCL-Eko vektörü (9.9 x 17 = 168,3 mikrogram) ve 60 ul lipozomal transfeksiyon reaktif (60 x 17 = 1.020 ul). Tüm reaktifler çözeltilerin hazırlanması önce oda sıcaklığında olmalıdır.
  3. Tüp A içinde iki boruyu, A ve B Etiket 239,7 ug vektör plazmidi ile (1.5 x 17) ile 168.3 mg PCL-Çevre vektörü eklemek indirgenmiş serum kartal ortamı (RS-MEM) modifiye ml olmuştur. Tüp B'de, (1.5 x 17) ml'lik RS-MEM 1020 ul lipozomal transfeksiyon reaktif ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ayrı ayrı A ve B inkübe edin.
  5. (1-2 saniye boyunca girdap ya da birkaç kez ters çevirin) hafifçe bir arada A ve B karıştırın ve lipid / DNA kompleksi oluşturmak üzere oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
  6. 10 cm'lik bir tabakta HEK293T hücrelere damla Lipid / DNA kompleksi damla ekleyin.
  7. 6-8 saat için 37 ° C'de inkübe veya gece (24 saat aşmayın).
  8. 6-8 saat kuluçkadan sonra viral üretim için taze TCM 12 ml orta yerine. Bu medya kaplamaT hücre transdüksiyonu için viral süpernatan olarak 2 gün kullanılacaktır.

4. splenektomi ve T-hücresinin hazırlanması

Gün 0:

  1. Dalak toplama süre ile buz üzerinde 50 ml konik ve yerine TCM 10 ml dökün.
  2. CO2 asfiksiyasyonu ve ikincil başları kesilerek hayvanların uygun sayıda Kurban: Talep hayvanlar Amerikan Veteriner Tıp Derneği kılavuzlar (en fazla 5 hayvan olabilir başına% 10-30 kafes hacim / dakikalık bir akış hızında CO2 alan bir kafeste solunum sonlandığı kadar ve bundan sonra iki dakika için) aynı anda kurban. CO 2 odasından hayvanları kaldırın ve başını kesmek.
    Not: Yaklaşık 4.5-5 x 10 7 splenositlerin verecek bir 6-12 haftalık dişi C57BL / 6 fare dalak biri. Burada, 4 dalakları yaklaşık 200 x 10 6 hücre hasat edilir.
  3. Sağ tarafı yukarı bakacak şekilde fareyi Lay, ve% 70 etanol ile sprey. Forseps ile, sol göğüs kafesi altında derinin ince bir kat kapmak ve makas ile hafif bir kesi kesti. Peel geri cilt, dikkatle forseps ile periton ince bir kat kapmak ve bir küçük boşluğu kesti.
  4. dalak düzleştirilmiş fasulye benzer bir küçük, ince uzun, koyu kırmızı bir organdır; ince çevreleyen bağ dokusu uzak keserek forseps ve tüketim ile dalak kapmak. Buz üzerinde TCM 10 ml içeren konik içine eksize dalak yerleştirin.
  5. 70 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden fazla dalak dökün ve tek bir hücre süspansiyonu üretmek için 5 ml'lik bir şırınga içinde bir kör ucu olan ezme ile ayrıştırılacaktır. İki dalak maksimum örgü süzgeç başına tasnif edilmiş olmalıdır.
  6. Dikkatle kalan splenositlerin toplamak için parçalanmalanna aşağıdaki süzgeç yıkamak için TCM küçük bir hacim kullanın. Bir tek hücre süspansiyonu halinde tüm ayrıştırılmış dalak havuzda toplayın. Bir yıkama bir TCM'nin ile 50 ml nihai hacim getirin10 dakika için 300 xg'de dönmeye d.
  7. 5 mi 10x lisis tamponu ile 45 ml steril suyun eklenmesiyle 1x lisis tamponu içinde bir çözeltisi hazırlandı. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırma, kırmızı kan hücreleri, 50 ml'lik konik dalak başına 1x lizis tamponu 5 ml tekrar süspansiyon pelet, ortadan kaldırmak için. 5 dalak aşan Eğer, bir 250 ml santrifüj tüp kullanın. 5 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde konik ya da santrifüj tüpü yerleştirin.
  8. Su banyosu parçalama reaksiyonu çıkarın ve 1 at TCM ekleyin: reaksiyonu nötralize etmek lizis tamponu ile 1 oranında. 10 dakika için 300 xg'de iplik yıkayın.
  9. Yukarı ve aşağı pipetleme TCM aspire süpernatant ve tamamen tekrar süspansiyon pelet (2 ml / dalak, 4 dalak için 8 ml toplam).
  10. 190 ul tripan mavisi (01:20 seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul ekleyerek hücreleri saymak. Toplam hücre sayısını elde etmek için 20 x 10 x 4, toplam hacmi (8 ml) dört kareli meydanlarından birinde elde edilen numarayı çarpın (örneğin, 125 hücre x 20 x 10 4 6 splenositleri).
  11. 2 ug / ml konkanavalin A (Con A) ve 50 lU / ml rekombinant insan interlökin-2 (rhlL-2) ile desteklenmiş TCM, 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda, hücrelere seyreltin. Bu durumda, 200 x 10 6 splenosit, 8 mi hücreleri, 200 ug ConA ve 5000 IU rhlL-2 92 ml ortamı eklenir.
  12. 4 x 10 6 hücre de her olmak için, 24-çukurlu doku kültürü tedavi levhaların her çukuruna 2 ml hücre ekleme (örneğin, hücre 100 mi, yaklaşık 4 plakayı gerektirir).
  13. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edin.

5. İletimi

1. Gün:

  1. Olmayan doku kültürü sayısı 2 ile hasat dalak numarası (8 plaka 4 dalak için gerekli olan) çarpılması suretiyle transdüksiyonu için gerekli olan, 24 oyuklu plakalar tedavi hesaplar.
  2. Daha sonra, yeniden birleştirici insan fibronektin parçası (RHFF) çözeltisi gerekli hacmi hesaplamakçarpılarak kat plakalarına gerekli (kuyuların toplam sayısı + 3) 0.5 ml x (8 tabak x 24 kuyu = 192 + 3 = 195) 0.5 ml = 97.5 ml x.
  3. 25 ug (97.5 x 25 = 2437,5 ug) ile toplam hacmi çarpılarak 25 ug / ml'lik bir konsantrasyonda RHFF içeren 97.5 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) hazırlayın. 97.5 ml PBS RHFF bu miktar ekleyin.
  4. Kat olmayan doku kültürü başına 0.5 ml PBS / RHFF çözeltisi ilave edilerek, 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi.
  5. 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.

Gün 2:

  1. Olmayan doku kültüründen, PBS / RHFF çözeltisi dökümü 24 oyuklu plakalar işlemden geçirildi.
  2. PBS içinde 1 ml / göz,% 2 sığır serum albümini (BSA) ilave edilir ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Sıkıca plaka upending tarafından BSA çıkarın. 2 ml PBS eklenerek yıkanır.
  4. 250 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, her HEK293T PDL plaka ortamı transfer ederek viral süpernatan toplamak ve 500 x g'de 10 dakika dönerler.
  5. Dikkatle viral SU aktarmakemin oluşmuş olabilecek hücre pelletini rahatsız etmemek için, tatlı bir 250 ml'lik santrifüj tüpüne pernatant.
  6. Nihai hacim RHFF kaplı oyuklara için gereken miktardan daha 3 mi daha gibi viral süpernatan taze TCM ekleyin. Örneğin, 192 RHFF kaplı oyuklara için, 192 + 3 ml = 195 mi, viral süpernatanın hacmi getirmek.
  7. 3 kez her iyi - hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 2 ile kuvöz ve tekrar süspansiyon kültüründe splenositlerin çıkarın. 250 ml'lik konik transfer. Bu adımı hızlandırmak yardımcı olacak transfer edilmeden önce bir steril hazne ile bir çok kanallı pipet kullanarak edin. Daha önce, 10 dakika boyunca 300 x g de tarif edilen ve sıkma sayısı.
  8. RhlL-2 ekleyin, viral süpernatanın 50 IU / ml'lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir. Örneğin, ekleme 50 x 195 = 9,750 IU viral süpernatant 195 ml-2 rhIL.
  9. 1 x 10 6 hücre / ml'de, viral süpernatan içinde yeniden süspanse splenositlerin
  10. RHFF kaplı 24 oyuklu plakalara / oyuk splenosit süspansiyonu 1 ml ilave edilir.
  11. Aşağıdaki ayarlara göre 90 dakika Spin: 770 xg, hızlanma = 4, fren / yavaşlama = 0, 32 ° C.
  12. 50 lU / ml rhIL-2 ile bir TCM çözelti hazırlayın. Örneğin, 10.000 IU rhlL-2 eklenerek 200 TCM solüsyon hazırlanır. Santrifüj işleminden sonra her bir oyuğa rhlL-2 / TCM 1 ml ilave edilir.
  13. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca kültür.

6. CAR T hücresi Kültür ve Hasat

Gün 3 ve 4:

  1. T hücreleri>% 80 izdiham elde ederse, hücreler (bu genellikle günde 3 ya da 4 gün gerçekleşir) bölünmüş olabilir. Hücreleri ayırmak için, hafifçe yukarı pipetleme ve her bir çukura 2-3 kez aşağı ve bir taze 24-yuvalı doku kültürü tedavi plakanın yeni kuyu içine her bir 1 ml hareket eder. Daha sonra, son hacmi, tüm kaynaklarda 2 mi olduğunu, her bir oyuğa bu 50 lU / ml IL-2 ile taze TCM 1 ml.
  2. Hücreler>% 80 izdiham ulaşmak yoksa, yavaş yavaş her üst medyanın 1 ml kapalı pipetle iyi bir buçuk medya değişikliği gerçekleştirmek. D kaçınınmedya çıkarırken alt yerleşmiş hücreler isturbing. RhIL-2 ml 50 IU / içeren taze TCM 1 ml ekleyin.

5. Gün:

  1. 250 ml'lik santrifüj tüpüne süspanse CAR T hafifçe yukarı pipetleme hücreleri ve her bir aşağı 3 kere transfer. 10 dakika için 300 xg'de hücreleri Spin.
  2. Pelet bozmadan Tamamen aspire süpernatant. İkinci bir zaman daha önce tarif edildiği gibi hücre sayımı ve PBS ile yıkayın, bir kez PBS ile yıkayın. Tipik bir ARAÇ T hücre verimi kuyu başına yaklaşık 1 x 10 6 hücre (8 plakaları x 24 kuyu = 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri) 'dir.
  3. 200 ug hacim içinde 1 x 10 7 bir enjeksiyon için 5 x 10 7 / ml'lik bir konsantrasyonda, PBS içinde yeniden süspanse hücreler (örneğin, 192 x 10 6 ARAÇ T hücreleri için, tekrar süspansiyon 3.84 ml PBS pelet yıkanmış).

Tümör taşıyan fareler 7. CAR T hücre İdaresi

5. Gün:

  1. Transpodamardan enjeksiyon için hayvan tesisine buz üzerinde oda sıcaklığı hücreleri. Yük 27 ile insülin şırınga içine 500-1000 ul - tüm kabarcıklar sınırdışı olmasını sağlamak 31 G iğne.
  2. Kuyruk dibinde bir fare tut ve tüp süzgeç olarak yerleştirin.
  3. Ven yukarı bakacak şekilde gergin kuyruk çekin, ve kuyruk ven paralel takarak damara iğne deri altında yaklaşık 1-2 mm kayma. Yavaş yavaş damara 200 ul sınırdışı. İğne doğru damar içine takılırsa, hacim kolayca akacak; Aksi takdirde orada direniş olacak ve iğne kuyruk kaldırılacak ve doğru-takılı yeniden gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ARAÇ T hücreleri EGFRvIII ARAÇ retroviral vektör 11 transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu vektör, MSGV1, murin stem hücre virüsü (MSCV) uzun terminal tekrarı, genişletilmiş öğürme bölgesi ve zarf ekleme sahası içeren SFGtcLuc_ITE4 vektörü 35, geliştirilmiş (bağlayıcı verici, SD, ve alıcı ekleme sa) ve viral edildi paketleme sinyali (ψ). Sıçangil CD8TM ile birlikte insan anti-EGFRvIII tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 139 ihtiva eden EGFRvIII ARAÇ CD28, 4-1BB ve CD3ζ hücre içi bölgeleri, alt-retroviral vektör Ncol mevkisi içine klonlandı (Şekil 3) .

Transdüksiyon sonra OTOMOBİL T hücreleri ölçülebilir ve akış sitometrisi ile fenotiplenebilmektedir. EGFRvIII ARAÇ T hücreleri (SA / PE), bir streptavidin-fıkoeritrin oluşan, 2 renkli bir panel ile görselleştirilebilir EGFRvIII türetilmiş multımer ve anti-CD3 FITC ile konjüge edilmiş biotynlated. Kültür ve transdüksiyon kor kullanmaocols rutin kemirgen splenositlerden (Şekil 4A) 11 55-70% arasında ARAÇ ifadesini gözlemlemek, burada nitelendirdi. Alternatif olarak, arabaların da keçi-anti-insan F (ab ') kullanılarak ifade lekeli olabilir olmuştur ilköğretim 2-biotin ve SA / PE ikincil antikorlar daha önce 36 nitelendirdi. ARAÇ T hücreleri, iki renkli ARAÇ paneline diğer floresan etiketli antikorlar ilave olarak fenotiplenebilmektedir. Örneğin, CD8 ve CD4 için boyama, CD4 + T hücreleri (Şekil 4B) ve% 20'si ise transduse SYR'lerinden% 70 CD8 + T hücreleri olduğunu göstermektedir. Bu sentezleme profiline sahip ARAÇ T hücreleri hali hazırda beyin trafik ve intrakranyal tümörleri tedavi etmek için gösterilmiştir.

Tablo 1:. Hayvanların ağırlığına göre ayarlandı Temozolomid doz Temozolomid doz, 60 mg / kg toplam dozda göre hesaplanmıştır.

Vücut ağırlığı Hacim
25 g 0.50 mi
0.48 mi
23 g 0.46 mi
22 g 0.44 mi
21 g 0.42 mi
20 g 0.40 mi
19 g 0.38 mi
18 g 0.36 mi
17 g 0.34 mi
16 g 0.32 mi
15 g 0.30 mi
14 g 0.28 mi
13 g 0.26 mi
12 g 0.24 mi
11 g 0.22 mi
D d # Kesirler YATAK SOC
16.5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52.5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tablo 2:. Klinik ilgili biyolojik eşdeğer radyasyon dozları Radyasyon dozları BED göre hesaplandı = D [1+ d / (α / β)], burada D = toplam doz, d = fraksiyonlara doz, ve α / β = 2). sıçangil konakçıya WBI olarak uygulanan toplam doz th açısından gösterilmiştire teslim fraksiyonel doz ve bu doz fraksiyonları tarafından modellenmiştir insan dozu. Model amaçlı, YATAK standart tedavi olduğu malignite de gösterilir.

Şekil 1,
Şekil 1:. Tümör taşıyan farelerin tedavi ve bakım kemoterapi eşzamanlı ex vivo ARAÇ nesil Standart ve tüm beyin ışınlaması için Timeline 4 gün tümör implantasyonu (A) sonra başlar. Bu zaman aralığında, ARAÇ T hücreleri üretilir ve kültürlü ex vivo (B) ve ana klima tam bir ders sonra teslim edilir.

Şekil 2,
Şekil 2: Düzen ve radyasyon teslimat için ayarları.X-ışınları, istenen doza ve (A), uygun olarak seçilmiş bir değişken süresi, 320 kV ve 10 mA değerinde bir dozimetri göre teslim edilir. X-ışını radyasyon odak alan dar bir 2,5 cm'lik bir alandır. (C) X-ışını demetinin bir uçtan görünüşünü göstermektedir; sedasyon hayvanların başları yüksek X-ışını yoğunluğunun alanında yalan şekilde bir ızgara (B) 'ye göre düzenlenir. Yaklaşık 4 hayvan bu ızgara düzeni (B, D) göre X-ışını yönetiminin bir ders sırasında irradiator altında olabilir. Kurşun boru WBI (D) maruz yalnızca başlarını bırakarak, vücudu korumak için kullanılır.

Şekil 3,
Şekil 3: Modifiye SFGtcLuc_ITE4 bir retroviral vektör, MSGV1, ARAÇ T hücrelerinin transdüksiyonu ve üretimi için kullanılmıştır.Sıçangil CD8TM CD28, 4-1BB ve CD3ζ hücre içi bölgeleri ile birlikte insan anti-EGFRvIII tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 139 ihtiva eden EGFRvIII ARAÇ parçası, LTR (murin stem hücre virüsü (MSCV) uzun terminal tekrarları ile kuşatılır ). ARAÇ ekin Memba genişletilmiş gag bölge ve zarf ekleme sitesi olan (bağlayıcı verici, sd, ve alıcısını splice, sa), ve viral ambalaj sinyali (ψ).

Şekil 4,
Şekil 4:. EGFRvIII arabaların T hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir transdüksiyon takip eden 48 saat, T hücreleri LEEKKGNYVVTDHC-K (biyotin) -NH2 / streptavidin ile-PE oluşan bir multımer kullanılarak EGFRvIII SYR'lerinden yüzey ekspresyonu için boyandı. Aynı donörden alınan Untransduced T hücreleri bir negatif kontrol olarak boyandı. Veri sta pozitif ARAÇ T hücreleri (y-ekseni) göstermektedirsentezleme 60.9% (A) bulunan bir T hücre markeri olarak CD3 + hücreleri üzerinde kapı PE-konjuge EGFRvIII multimer (x-ekseni) ile düzeyine getirildi. CD4-PerCP-Cy5.5 ve CD8-APC için boyanan ARAÇ T hücreleri 21.7 ve% 70.9,%, sırasıyla (B) bir ifadesi profili göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada anlatılan tedavi çizelgesi bakım, klinik standart modeli ve ARAÇ evlat edinen tedavisi için etkisini kaldıraç için tasarlanmıştır. ARAÇ T hücresi doz TMZ rejimleri ve radyoterapi uygulama vivo T hücre aktivitesi, lymphodepletion ve tümör öldürülmesi geliştirmek için modifiye edilebilir. TMZ rejimleri ana miyeloablasyon ile adoptif transfer hücreler 30 artmış genişleme elde etmek için arttırılabilir. Böylece SOC tümörisidal özelliklerini engellemeyi, - (6 Gy 4) Tek fraksiyonu total vücut ışınlaması (TBI) Ayrıca, TMZ lymphodepletive etkileri düşük doz değinmeyecek edilebilir. Burada uygulanan radyasyon rejimi 60 Gy biyolojik eşdeğer doz taklit; Ancak, kesirler ve fraksiyonel doz sayısı, diğer klinik dozlarda (Tablo 2) taklit etmek ayarlanmış olabilir. Önemlisi, SOC bizim modeli eksternal radyasyon tümör ve ma fokal teslim ziyade, TBI biyolojik eşdeğer doz kullanırrgins, sıklıkta klinikte kullanılmaktadır ve bu nedenle, tümöre radyasyon daha düşük bir dozu ve sağlıklı fare beyin toksisite artan bir riskine neden olabilir. Bu sınırlamalara rağmen, WBI bir klinik öncesi ortamda klinik radyoterapi modelleme için bir kabul görmüş bir teknik.

ARAÇ T hücre dozları artırılabilir veya tümör öldürme ve genel sağkalım 11 doz etkileri gözlemlemek için azaltılabilir. Buna ek olarak, tedavi ve teslim yolundan zamanlaması yönünden farklılıklar görmek için modifiye edilebilir. Örneğin, ARAÇ T hücreleri, tümör sahasında aktivitesi sağlamak için intrakranial teslim edilebilir. ARAÇ-pozitif T-hücrelerinin verimi transdüksiyonu etkinliğine bağlı olarak değişebilir. Başarılı iletimini emin olmanın bir yolu işlem boyunca yeşil bir flöresan protein (GFP) -kontrol gerçekleştirmektir. Bunu yapmak için, 1 HEK293T 10 cm PDL plaka kayşat T hücrelerinin tek bir oyuk GFP transfeksiyon ve dönüşüm kesme işlemleri için tahsis edilebilirgünlerde 3-5 GFP n. Transdüksiyon verimliliği önemli bir faktör, viral süpernatanın ilave edilmesi üzerine, T-hücresi aktivasyonunun ve çoğalmasının ölçüsüdür. Bu kültür ortamına ConA eklenerek elde edilmektedir, T hücresi aktivasyonu, bizim yöntemi arasındaki önemli bir farklılık dikkat ve CD3 ve CD28 monoklonal antikorlar agonisti ile elde klinik ortamda, olarak kullanılır. Ikinci rutin hastanın retroviral kalıt ARAÇ T hücrelerinin üretilmesi için kullanılmaktadır ve aynı zamanda murin T hücrelerinin transdüksiyonu başarılı olmakla beraber, daha önce ConA uyarımı daha iyi ve daha tutarlı transdüksiyon 37 yol açtığı tespit edilmiştir. Biz de genel ARAÇ T hücre verimi adımı 5.18 yapıldığında göre değişebilir olduğunu gözlemledik. Eğer kötü ARAÇ T hücre verimi yaşarsanız, derhal adım 5.17 yerine 5-6 saat inkübasyon için bekledikten sonra adımı 5.18 performans öneririz. Bu transdüksiyon etkinliğini etkileyebilir rağmen, önemli dif gözlemlemediğimBizim çalışmalarda ARAÇ yüzey ifadesinde farklar.

Transdüksiyon ardından, ARAÇ T hücreleri ölçülebilir ve akış sitometri fenotiplenir; Biz (SA / PE), bir streptavidin-fıkoeritrin oluşan, 2 renkli bir paneli ile EGFRvIII ARAÇ T hücreleri boyamak EGFRvIII türetilmiş multımer ve anti-CD3 biotynlated bayır. Alternatif olarak, arabaların da keçi-anti-insan F (ab ') kullanılarak ifade lekeli olabilir olmuştur ilköğretim 2-biotin ve SA / PE ikincil antikorlar daha önce 36 nitelendirdi. Biz rutin kemirgen splenositlerinin 11 55-70% arasında ARAÇ ifadesini gözlemlemek. Daha önce hali hazırda beyin trafik ve tümörlerin tedavisinde bu ARAÇ sentezleme profili ile T hücrelerinin bu teslim göstermiştir. TMZ- veya TBI kaynaklı lenfopeni ARAÇ-pozitif hücrelerin frekansı ve genel bir anti-tümör cevabı artırmak, adoptif transfer hücrelerinin klonal genişlemesini arttırır. ARAÇ T hücreleri a ile periferik kan boyanarak in vivo izlenebilirppropriate tetramer; Bu zaman ve ARAÇ T hücre fonksiyonu ve sebat ev sahibi klima etkileri üzerinde CAR T hücre sağkalım anlamak için yararlı bir tekniktir. Tetramer antijen reseptörü için kullanılabilir Alternatif olarak, bir flüoresan raportör ARAÇ vektör yapısına dahil edilebilir ya da ARAÇ T hücreleri etiketlenebilir, ex vivo karboksiflüoresein süksinimidil ester (CFSE) in vivo izlenmesi için uygulamadan önce.

Tümör modeli, immünoterapi platformu SOC rejimine bağlı olarak, adoptif tedavi ya da aşı ile birlikte uygulandığında klinik SOC toksisitesine neden olabilir. TMZ spesifik olmayan hücre öldürme sergileyen bir DNA alkilleyici ajan, ve doz sıçangil ana kilo kaybı ve hastalıklara yol açabilir yoğunlaştı. Yüksek doz ve WBI uzun parçacıklar hidrosefali neden olabilir. Ayrıca, güçlü aşı ve / veya adoptively transfer T hücre yanıtlarının gelen inflamatuar etkileri morbidite nedeniyle yol açabilirzehirli sitokin fırtınalar. Bu marazi hayvanlar üzerinde sistemik anestezi etkilerini dikkate almak da önemlidir. TMZ ve WBI önemli toksisite yol ise hayvanların sadece sedasyon ve küçük radyasyon dozunun verilmesi için 10 dakika süre ile immobilize edilmesi gerekir, daha sonra, ketamin / ksilazin dozlar 2- (ölüm riskini azaltmak için% 20-25 azaltılabilir 8 Gy).

Sunucu klima evlatlık transferi tüm immünoterapi platformları için önemlidir. Immünoterapi denemeleri genellikle SOC kapsamında değerlendirilir gibi, immünoterapilerin klinik öncesi değerlendirilmesi klinik senaryo özetlemek için bu ayar içinde yapılmalıdır. Biz burada lymphodepletive ve ARAÇ T hücrelerini kullanarak evlatlık tedavi ile SOC tümörisidal etkilerini yararlanarak bir örnek sunuyoruz. Bu rejim kombine SOC etkilerini değerlendirmek için diğer immünoterapi platformlara uygulanabilir güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363, (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364, (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21, (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14, (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119, (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365, (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20, (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71, (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63, (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66, (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16, (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171, (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A, (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15, (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62, (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25, (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65, (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18, (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173, (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23, (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116, (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3, (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17, (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26, (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8, (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22, (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110, (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202, (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33, (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16, (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23, (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34, (4), 343-352 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics