Generasjon av CAR T Cells for Adoptive Therapy i sammenheng med Glioblastoma Standard of Care

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Glioblastom (GBM) er den vanligste primære maligne hjernesvulst og er alltid dødelig. Kirurgisk reseksjon kombinert med ikke-spesifikk standardbehandling kjemoterapi og radioterapi unnlater å fullstendig eliminere maligne celler, noe som resulterer i en sturen prognose av mindre enn 15 måneder hos pasienter med denne sykdommen 1. I motsetning til dette, immunterapi gir en nøyaktig tilnærming for spesifikt å målrette tumorceller, og har således potensiale til å tjene som en meget effektiv behandling plattform med redusert risiko for sikkerhet toksisitet 2-4. T-celler konstruert ex vivo å uttrykke kimære antigen reseptorer (biler) har en allsidig strategi for svulst immunterapi. Biler blir generert ved å fusjonere det ekstracellulære variable region av et antistoff med en eller flere intracellulære T-celle signalisering molekyl (er), i stedet for en full-lengde hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) -restricted T-celle-reseptor 5. Denne modusen av antistoff-lignende antigen anerkjennelse ogden gjør det mulig for reaktive antigen-spesifikke T-celler til å gjenkjenne og reagere på tumorantigener i fravær av MHC og kan tilpasses for et nesten uendelig antigen repertoar.

CAR T-celler utviklet mot en rekke tumorantigener har vist preklinisk effekt og enestående løftet i klinikken 6-9. Nærmere bestemt, i sammenheng med GBM, en CAR T-celle-plattform målretting epidermal vekstfaktor-reseptor-variant III (EGFRvIII), en tumor-spesifikk mutasjon som uttrykkes på celleoverflaten 10, ble vist å forlenge overlevelsen i glioma-bærende mus 11. Til tross for sin allsidighet, men den kliniske nytten av CAR adoptiv terapi har ikke blitt fullt ut realisert, delvis på grunn av tumorassosiert immunsuppresjon og immununndragelser 12-16 samt utfordringer i å etablere og opprettholde antigen-spesifikke T-celler in vivo. Utnytte standard of care (SOC) med immunterapi kan potensielt overvinne flere av disse limitasjoner, noe som resulterer i økt effekt i både preklinisk og klinisk setting.

SOC for post-reseksjon GBM består av høydose temozolomid (TMZ), en DNA alkyleringsmiddelet 17, og hele hjernen bestråling (WBI) 1. Disse behandlingene antas å virke synergistisk med kreftvaksiner via oppregulering av svulst MHC uttrykk 18-20 og utgytelsen av antigener av døde kreftceller 17,19,21,22. Faktisk tillegg av TMZ 20,23 eller WBI 18,24 fører til økt antitumor effekt av immunbaserte behandlinger i preklinisk innstillingen. Videre, som mange ikke-spesifikke cytotoksiske kjemoterapeutika, gis TMZ kjent for å forårsake systemisk lymfopeni 25,26, noe som kan utnyttes som et middel til host-condition for adoptiv terapi plattformer 27-29. TMZ-mediert lymphodepletion har vist seg å øke frekvensen og funksjon av antigen-spesifikke T-celler, noe som fører til økt effekt av en adoptive behandlingsplattform mot intrakranielle svulster 30. I sammenheng med CAR terapi, serverer lymphodepletion som et middel til host-condition ved både å redusere antall endogene suppressor T-celler 31, og indusere homeostatic spredning 32 via redusert konkurranse for cytokiner 33, og dermed forsterke antitumor aktivitet 11,34. Gitt den synergistisk forhold mellom GBM SOC og immunterapi plattformer, evaluere nye adoptiv terapier og vaksineplattformer i sammenheng med SOC er avgjørende for å trekke meningsfulle konklusjoner om effekt.

I denne protokoll har vi skissere en fremgangsmåte for generering og intravenøs administrering av murine EGFRvIII CAR-spesifikke T-celler sammen TMZ og WBI i mus som bærer EGFRvIII-positive intrakranielle tumorer (se figur 1 for behandling linjen). Kort fortalt er CAR T-celler gjort ex vivo ved retroviral transduksjon. Humane embryonale nyre (HEK) 293T-celler transfektert ved hjelp av en DNA / lipid-kompleks (som inneholder CAR vektor og PCL-Eco plasmider) for å produsere virus, som deretter brukes til å transdusere aktiverte murine splenocytter som er høstet og dyrket parallelt. I løpet av CAR generasjon, er murine verter peiling EGFRvIII-positive intrakranielle svulster administreres fraksjonert hel-hjerne røntgenbestråling og systemisk TMZ behandling ved doser sammenlign til klinisk SOC. CAR T-celler blir deretter levert intravenøst ​​til lymphodepleted verter.

Følgende fremgangsmåte er beskrevet i syv separate faser: (1) Administrasjon av Temozolomide til Tumor-bærende mus, (2) Whole Brain Bestråling av Tumor-bærende mus, (3) Transfeksjon, (4) Splenektomi og T-celle Forberedelse, (5 ) Transduksjon, (6) CAR T-celle Kultur og Harvest og (7) CAR T-celle administrasjon til Tumor-bærende mus. Disse faser består av flere trinn som går over 6-7 dager, og utføres samtidig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er basert på en eksperimentell design hvor 10 mus behandles med 10 7 CAR-T-celler hver. Dette betyr at 10 8 CAR-T-celler vil være nødvendig; utbyttet skal være overvurdert med 5 x 10 7 -1 x 10 8 til konto for tap i levedyktighet. Følgende protokoll er skalert for å generere ca 200 x 10 6 celler. Cellene blir deretter administrert intravenøst ​​til hunn C57BL / 6-mus med 9 dagers etablerte syngeniske EGFRvIII-positive intrakranielle tumorer utviklet seg fra de eksisterende KR158B astrocytom eller B16 melanom-cellelinjer. Samtidig med CAR T-cellegenerering, er tumor-bærende mus administreres klinisk relevante doser av lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) og WBI (16,5 Gy).

Mus ble opprettholdt og oppvokst i henhold patogenfrie forholdene ved Duke University Medical Center (DUMC). Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller godkjent av Duke University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Administrasjon av Temozolomide til Tumor-bærende mus

Dag 0 til 4:

  1. Beregn det totale antall mus som skal injiseres, og multiplisere dette med 0,5 for å bestemme volumet av TMZ oppløsning som er nødvendig (f.eks, 30 muse x 0,5 ml = 15 ml TMZ) og tilsett 1,5 ml av dette volum for å ta hensyn til smitte (16,5 ml TMZ ).
  2. Multiplisere dette totale volum av 3 mg / ml for å bestemme vekten av lyofilisert TMZ nødvendig (for eksempel, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Veie denne inn i et 50 ml konisk.
    FORSIKTIG: TMZ er giftig ved innånding, svelging og kontakt med øyne, hud og slimhinner. Rådføre seg med institusjonens yrkesmessig sikkerhet og / eller miljø helse og velvære avdeling for anbefalinger om å redusere risiko for eksponering.
  3. Multiplisere det totale volum av 0,15 til å bestemme volumet av dimetylsulfoksid (DMSO) som er nødvendig (for eksempel 16,5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter sterilisere dette volumet av DMSO (pluss ytterligere 2 ml til står for spillover) gjennom et 0,2 mikrometer filter i en steril tube. Legg 2,475 mL sterilt DMSO til TMZ pulver.
  4. Plasser TMZ / DMSO-oppløsning i et beger med vann over en varm plate ved 65 ° C i 10-15 min. Når TMZ er fullstendig oppløst, bør løsningen blir blek gul i fargen; Hvis løsningen blir rosa, deretter TMZ brytes ned, og en ny løsning bør være forberedt med en frisk mye TMZ.
  5. Beregn passende volum av sterilt saltvann nødvendig ved å multiplisere 0,85 av det totale volum (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml saltvann). Tilsett 15 ml steril saltløsning til en 50 ml konisk. Mens TMZ løser seg opp i DMSO, varme saltvann til 65 ° C.
  6. Vortex TMZ / DMSO-løsning for å sikre at TMZ pulveret er fullstendig oppløst og tilsett langsomt varmet saltvann til TMZ / DMSO-løsning.
  7. Umiddelbart etter tilberedning, fullt laste 15 x 1 ml tuberkulinprøve Syringes med TMZ løsning for administrasjon til fire dagers etablerte svulst bærende mus.
  8. Gjenta denne prosedyren på dag 1 til 4 for totalt fem TMZ administrasjoner.

2. Hele hjernen bestråling av tumorbærende mus

Dager 2 til 4:

  1. Slå på X-ray irradiator og la den varmes opp til full spenning. Sørg for at riktig filter er på plass og innspill riktig spenning og gjeldende innstillinger (Figur 2A).
    MERK: dosimetri til stråle bør undersøkes på forhånd for å finne riktig spenningsinnstillinger og rutenettet (Figur 2A, B).
  2. Beregne lengden av tid som er nødvendig for å resultere i 5,5 Gy røntgenbestråling. Hvis for eksempel røntgenstråler blir levert med en hastighet på 2 Gy / min, og deretter 2,75 minutter er nødvendig for å gi en total på 5,5 Gy. Taste inn korrekt tid varighet.
    MERK: Tabell 2 gir mus WBI doser ennd deres kliniske ekvivalenter i mennesker. I sammenheng med høy klasse hjernesvulst, 60 Gy fraksjonert WBI (2 Gy fraksjoner, 5 dager / uke i 6 uker) er den kliniske standard vare, og den murine tilsvarende brukt her er 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Tilbered en frisk oppløsning av ketamin / xylazin for systemisk anestesi ved tilsetning av 2 ml ketamin og xylazin 1 ml til 17 ml saltoppløsning, slik at den endelige oppløsningen er 10 mg / ml ketamin og 1 mg / ml xylazin.
  4. Vei mus og administrere 10 ul av ketamin / xylazin intraperitonealt pr gram kroppsvekt, slik at dyrene får en dose av ketamin ved 100 mg / kg og 10 mg / kg xylazin. Mus bør være fullt bedøvet og synlig puste innen 2 min av ketamin / xylazin administrasjon.
  5. For å opprettholde oftalmisk fuktighet i bedøvede dyr, forsiktig gni en liten mengde kunstige tårer salve på hvert øye.
  6. Plasser bedøvet mus på nettet slik at hodene er plassert i området som mottar høyest X-ray itensity (figur 2B, C). Skjold organer fra halsen og ned med riktig størrelse føre slangen for å blokkere systemisk X-ray levering (figur 2D).
  7. Plassere plassert mus under røntgenstråle slik at laseren betegner det sentrale punktet i røntgenstråle er på koordinat (0,0) på rutenettet. Begynn X-ray levering.
  8. Når X-ray levering er fullført, fjerner dyr fra stråle og legg på en varm varmepute. Ikke huse bedøvede dyr med bevisste dyr til dyr har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternum recumbence. Når dyr kan opprettholde sternal recumbence, plasserer bevisste dyr tilbake i sine respektive bur.
  9. Gjenta denne fremgangsmåten på dagene 3 og 4 for en total av tre fraksjonerte doser av stråling.

3. Transfeksjon

Dag -1:

  1. Forbered D10 medier ved tilsetning av 50 ml føtalt bovint serum (FBS) til 500 ml av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
  2. Forbered T-cellemedium (TCM) ved tilsetning av 5,5 ml L-glutamin, 5,5 ml natrium-pyruvat, 5,5 ml ikke-essensielle aminosyrer, og 5,5 ml penicillin / streptomycin (penn / strep) i 500 ml RPMI-1640 medium. Deretter legger 550 pl 2-mercaptoetanol og 550 mikroliter gentamicin. Til slutt legger 50 ml FBS.
  3. Harvest in vitro dyrkede HEK293T celler og bringe til en konsentrasjon på 7,5 x 10 6 celler / ml i D10 media.
  4. Platen 10 ml D10 media og tilsett 1 ml HEK293T cellesuspensjon i hver av 16 x 10 cm poly-D-lysin (PDL) belagte plater.
  5. Inkuber over natten ved 37 ° C med 5% CO2.

Dag 0:

  1. Erstatte mediet med 10 ml frisk D10 minst 30 min før transfeksjon av celler.
  2. Bestemme mengden av vektor-plasmid, PCL-Eco vektor, og liposomal transfeksjon reagens som kreves for transfeksjon ved å multiplisere det totale antall plater + 1 (16 + 1 = 17) med 14,1 mikrogramvektorplasmid (14,1 x 17 = 239,7 mikrogram), 9,9 mikrogram PCL-Eco vektor (9.9 x 17 = 168,3 mikrogram), og 60 mikroliter liposomal transfeksjon reagens (60 x 17 = 1020 mL). Alle reagenser bør ha romtemperatur før forbereder løsninger.
  3. Etikett to rør A og B. I tube A, legg 239,7 mikrogram vektorplasmid og 168,3 mikrogram PCL-Eco vektor til (1,5 x 17) ML redusert serum endret ørn medium (RS-MEM). I tube B, tilsett 1020 mL liposomal transfeksjon reagens til (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Inkuber A og B hver for seg i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Bland A og B sammen forsiktig (vortex i 1-2 sek eller invertere flere ganger) og inkuberes i 20 min ved romtemperatur for å danne lipid / DNA-komplekset.
  6. Legg lipid / DNA kompleks fall lurt å HEK293T celler i 10 cm tallerken.
  7. Inkuber ved 37 ° C i 6-8 timer eller over natten (ikke over 24 timer).
  8. Etter 6-8 timers inkubasjon erstatte medium med 12 ml frisk TCM for virusproduksjonen. Dette belagt mediavil bli brukt på dag 2 etter viral supernatant for T-celle-transduksjon.

4. Splenektomi og T Cell Forberedelse

Dag 0:

  1. Hell 10 ml av TCM inn i en 50 ml konisk og legg på is for milt samling.
  2. Ofre riktig antall dyr ved CO 2 kvelning og videregående halshogging: Plasser dyr i et bur motta CO 2 ved en strømningshastighet på 10-30% bur volum / minutt, per American Veterinary Medical Association retningslinjer (ikke mer enn fem dyr kan være ofret samtidig) til respirasjon opphører og for to minutter etterpå. Fjerne dyr fra CO 2 kammer og halshogge.
    MERK: En milt av en 6-12 uke gammel kvinnelig C57BL / 6 mus vil gi ca 4,5-5 x 10 7 splenocyter. Her vil fire spleens høstes for ca 200 x 10 6 celler.
  3. Lå musa slik at høyre side vender opp, ogspray med 70% etanol. Med pinsett, ta en tynn hudfold under venstre brystkasse og skjær et lite stikk med saksen. Vipp av huden, forsiktig ta en tynn fold av bukhinnen med pinsett, og skjær et lite hulrom.
  4. Milten er en liten, avlang, mørk rød organ som ligner en flat bønner; delikat ta tak i milt med pinsett og avgifter ved å kutte bort den omkringliggende bindevev. Plasser det utskårede miltene inn i den koniske inneholdende 10 ml av TCM på is.
  5. Hell milter enn en 70 um maskecelle sil og disaggregert ved mose med den butte enden av innsiden av en 5 ml sprøyte for å generere en enkeltcelle-suspensjon. Maksimalt to spleens bør deles opp per sil.
  6. Bruk et lite volum av TCM å nøye vaske silen følgende dekomponering å samle eventuelle gjenværende splenocyter. Bassenget hele disaggregerte spleens inn en encellet suspensjon. Bring sluttvolumet til 50 ml med TCM for en vaske end spinne ved 300 xg i 10 min.
  7. Forbered en løsning av 1x lysisbuffer ved å tilsette 5 ml 10x lysisbuffer til 45 ml sterilt vann. For å fjerne røde blodceller, resuspender pelleten i 5 ml 1 x lyseringsbuffer per milt i en 50 ml konisk, blande godt ved forsiktig pipettering opp og ned. Dersom de overstiger fem spleens, bruker en 250 ml sentrifugerør. Plasser konisk eller sentrifugerør i et 37 ° C vannbad i 5 min.
  8. Fjern lysis reaksjonen fra vannbadet og tilsett TCM ved et 1: 1 forhold med lyseringsbuffer for å nøytralisere reaksjonen. Vask ved spinning ved 300 xg i 10 min.
  9. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i fullt TCM (2 ml / milt, 8 ml totalt 4 milter) ved å pipettere opp og ned.
  10. Tell cellene ved tilsetning av 10 ul av cellesuspensjonen til 190 ul trypanblått (1:20 fortynning). Multiplisere antall erholdt i en av de fire gitter kvadrater med 20 x 10 4 x totalt volum (8 ml) for å oppnå det totale celletall (f.eks, 125 celler x 20 x 10 4 6 splenocytes).
  11. Fortynn cellene til en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml i TCM, supplert med 2 ug / ml konkanavalin A (ConA) og 50 IU / ml rekombinant, humant interleukin-2 (rhIL-2). Derfor, for 200 x 10 6 splenocytes, tilsett 92 ml media til 8 ml celler, 200 mikrogram Cona, og 5000 IU rhIL-2.
  12. Tilsett 2 ml celler til hver brønn i 24-brønners vev-kultur-behandlede plater, slik at 4 x 10 6 celler i hver brønn (for eksempel 100 ml celler vil kreve ca 4 plater).
  13. Inkuber over natten ved 37 ° C med 5% CO2.

5. Transduksjon

Dag 1:

  1. Beregne antall ikke-vevskultur behandlede 24-brønners plater som trengs for transduksjon ved å multiplisere antall milter høstes av 2 (8 plater er nødvendig for 4 milter).
  2. Deretter beregner den nødvendige volum av rekombinant human fibronektin fragment (RHFF) løsningnødvendig for å belegge platene ved å multiplisere (totalt antall brønner + 3) x 0,5 ml (8 plater x 24 brønner = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Forbered 97,5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende RHFF ved en konsentrasjon på 25 ug / ml ved å multiplisere det totale volum av 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 ug). Legg denne mengden RHFF til 97,5 ml PBS.
  4. Belegge ikke-vevskultur behandlede 24-brønners plater ved tilsetning av 0,5 ml PBS / RHFF løsning per brønn.
  5. Inkuber over natten ved 4 ° C.

Dag 2:

  1. Dumpe PBS / RHFF løsning fra ikke-vevskultur behandlede 24-brønners plater.
  2. Tilsett 1 ml / brønn 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS og inkubert ved romtemperatur i 30 min.
  3. Fjern BSA ved å ta godt upending plate. Vask ved tilsetning av 2 ml PBS.
  4. Samle viral supernatant ved overføring av media fra hver HEK293T PDL plate inn i et 250 ml sentrifugerør og spinne 10 min ved 500 x g.
  5. Nøye overføre viral supernatant inn en frisk 250 ml sentrifugerør, å være sikker på ikke å forstyrre cellepelleten som kan ha blitt dannet.
  6. Legg frisk TCM til den virale supernatanten slik at sluttvolumet er 3 ml mer enn den mengde som er nødvendig for RHFF-belagte brønner. For eksempel, for 192 RHFF-belagte brønner, bringe volumet av viral supernatant til 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Fjern dyrkede splenocyter fra inkubatoren og resuspender ved forsiktig pipettering opp og ned 2-3 ganger i hver brønn. Overføre til en 250 ml konisk. Hvis du bruker en multikanalspipette, ved hjelp av en steril reservoar før overføring vil hjelpe fremskynde dette trinnet. Teller som tidligere er beskrevet, og sentrifugering ved 300 xg i 10 min.
  8. Legg rhIL-2 til viral supernatant til en konsentrasjon på 50 IU / ml. For eksempel legge 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml viral supernatant.
  9. Resuspendere splenocyter i viral supernatant på 1 x 10 6 celler / ml
  10. Tilsett 1 ml / brønn av splenocytt suspensjonen til RHFF-belagte 24-brønners plater.
  11. Spinn for 90 min etter følgende innstillinger: 770 xg, akselerasjon = 4, brems / retardasjon = 0, 32 ° C.
  12. Forberede en TCM løsning med 50 IE / ml rhIL-2. For eksempel, utarbeide en 200 TCM løsning ved å legge 10 000 IE rhIL-2. Tilsett 1 ml av rhIL-2 / TCM til hver brønn etter sentrifugering.
  13. Kultur over natten ved 37 ° C i 5% CO2.

6. CAR T-celle Kultur og Harvests

Dager 3 og 4:

  1. Hvis T-celler oppnå> 80% samløpet, kan cellene deles (dette skjer vanligvis etter dag 3 eller dag 4). For å splitte cellene forsiktig pipettér opp og ned i hver brønn 2-3 ganger, og flytte 1 ml fra hver brønn inn i nye brønner i en ny 24-brønners kultur-behandlet plate. Deretter, tilsett 1 ml frisk TCM med 50 IE / ml IL-2 til hver brønn slik at det sluttvolum er 2 ml i alle brønner.
  2. Hvis cellene ikke nå> 80% samløpet, utføre en halv media endring av sakte pipettere av 1 ml av media fra toppen av hver brønn. Unngå disturbing celler avgjort på bunnen mens du fjerner media. Tilsett 1 ml av frisk TCM inneholdende 50 IU / ml rhIL-2.

Dag 5:

  1. Suspender CAR T celler ved forsiktig pipettering opp og ned 3 ganger i hver brønn og overføring til en 250 ml sentrifugerør. Spinne celler ved 300 xg i 10 min.
  2. Helt aspirer supernatanten uten å forstyrre pellet. Vask en gang med PBS, telle celler som tidligere beskrevet, og vaske med PBS en gang. En typisk CAR T celle yield er ca 1 x 10 6 celler per brønn (8 plater x 24 brønner = 192 x 10 6 CAR T-celler).
  3. Resuspender celler i PBS ved en konsentrasjon på 5 x 10 7 / ml for en injeksjon av 1 x 10 7 i et volum på 200 ug (dvs. for 192 x 10 6 CAR-T-celler, vasket resuspender pelleten i 3,84 ml PBS).

7. CAR T-celle Administration å Tumor-bærende mus

Dag 5:

  1. Transport celler på is til dyr anlegg for intravenøs injeksjon. Last 500-1000 mL inn insulinsprøyte med 27-31 G nål, noe som sikrer at alle boblene er utvist.
  2. Ta tak i en mus ved haleroten og plasser i rør rainer.
  3. Trekk halen stramt med venen vendt oppover, og glir nålen ca 1-2 mm under huden inn i venen ved å sette den parallelt med halevenen. Sakte utvise 200 mL inn i venen. Hvis nålen er riktig satt inn i venen, vil volumet lett flyte inn; ellers vil det være motstand og nålen vil trenge å bli fjernet fra halen og satt inn igjen på riktig måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CAR T-celler er generert av transduksjon med EGFRvIII CAR retrovirusvektoren 11. Denne vektor, MSGV1, ble utviklet fra SFGtcLuc_ITE4 vektoren 35, som inneholder det murine stamcelle virus (MSCV) lange terminale gjentagelser, den utvidede gag regionen og konvolutten spleisesete (spleisedonor, sd, og spleise-akseptor, sa), og virus emballasje signal (ψ). Den EGFRvIII CAR inneholdende det humane anti-EGFRvIII enkelt-kjede variable fragment (scFv) 139, i tandem med muse-CD8TM, CD28, 4-1BB og CD3ζ intracellulære regioner, ble klonet inn i den retrovirale vektor nedstrøms Ncol området (Figur 3) .

Etter transduksjon, kan CAR T-celler kvantifiseres og fenotypiseres av flowcytometri. EGFRvIII CAR T-celler kan bli visualisert med en to-farge panel består av et streptavidin-fykoerytrin (SA / PE) -konjugert biotynlated EGFRvIII-avledet multimer og anti-CD3-FITC. Bruke kultur og transduksjon protocols beskrevet her, vi rutinemessig observere CAR uttrykk blant 55-70% av murine splenocytes (Figur 4A) 11. Alternativt kan biler også være farget for uttrykk ved hjelp av geit-anti-human F (ab ') 2-biotin primære og SA / PE sekundære antistoffer som har vært tidligere beskrevet 36. CAR-T-celler kan bli ytterligere fenotypiseres ved tilsetning av andre fluorescensmerkede antistoffer mot to-farge CAR panel. For eksempel farging for CD8 og CD4, viser at 70% av transduserte biler er CD8 + T-celler, mens 20% er CD4 + T-celler (Figur 4B). CAR-T-celler med dette uttrykk profil har vist seg å lett trafikk til hjernen og behandle intrakranielle tumorer.

Tabell 1:. Temozolomid dose basert på dyrets vekt temozolomid doser ble beregnet basert på en total dose på 60 mg / kg.

Kroppsvekt Volum
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
D d # Fraksjoner BED SOC
16.5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52.5 LGA
12 3 4 30 Møtte
16 2 8 32 Møtte

Tabell 2:. Klinisk relevante biologisk tilsvarende stråledoser Stråledoser ble beregnet i henhold til BED = D [1+ d / (α / β)], der D = total dose, d = fraksjonert dose, og α / β = 2). Totaldosen som WBI til musevert er vist i form av the brøk doser levert og human dose som er modellert av disse dose fraksjoner. For modellformål er malignitet som SENGEN er standard vare også vist.

Figur 1
Fig. 1: tidslinje for behandling av tumor-bærende mus, og samtidig ex vivo CAR generering standardbehandling kjemoterapi og hele hjernen bestråling begynner 4 dager etter tumor-implantering (A). I løpet av dette tidsintervallet, er CAR T-celler generert og kultivert ex vivo (B) og levert etter en full løpet av verts condition.

Figur 2
Figur 2: Layout og innstillinger for stråling levering.Røntgenbilder blir levert i henhold til en dosimetri av 320 kV og 10 mA, med en variabel varighet velges i henhold til den ønskede dose (A). Det sentrale området av røntgenstråling er en smal 2,5 cm område. Bedøvede dyr er ordnet i henhold til nettet (B), slik at deres hoder ligge i området av høy røntgenstråleintensiteten, (C) viser utsikten fra den ene ende av røntgenstråle. Ca 4 dyr kan være under stråle under ett kurs av X-ray administrasjon i henhold til dette rutenettet (B, D). Bly røret blir brukt til å skjerme kroppen, slik at bare hodet utsettes for WBI (D).

Figur 3
Figur 3: Den modifiserte SFGtcLuc_ITE4 retrovirusvektoren, MSGV1, ble brukt for transduksjon og generering av CAR T-celler The.EGFRvIII CAR innsats inneholder humant anti-EGFRvIII enkelt kjede variabel fragment (scFv) 139, i tandem med muse CD8TM, CD28, 4-1BB, og CD3ζ intracellulære regioner, er flankert av murine stamcelle virus (MSCV) lange terminale repetisjoner (LTR ). Oppstrøms av CAR innsats er den utvidede gag regionen og konvolutten spleisesete (spleisedonor, sd, og spleise-akseptor, sa), og det virale pakkesignalet (ψ).

Figur 4
Figur 4: EGFRvIII biler er uttrykt på overflaten av T-celler 48 timer etter transduksjon, ble T-celler farget for overflateekspresjon av EGFRvIII CAR ved hjelp av en multimer sammensatt av LEEKKGNYVVTDHC-K (biotin) -NH2 / streptavidin-PE.. Untransduced T-celler fra den samme donor ble også farget som en negativ kontroll. Data viser antall CAR T-celler (y-akse) positive for staining av PE-konjugert EGFRvIII multimer (x-aksen), separert på CD3 + -celler som en T-celle-markør, hvor ekspresjon ble funnet å være 60,9% (A). CAR-T-celler farget for CD4-PerCP-Cy5.5 og CD8-APC viser et uttrykk profil på 21,7% og 70,9%, henholdsvis (B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Behandlingen tidslinje som beskrives her er designet for å modellere klinisk standard for omsorg og utnytte dens virkninger for CAR adoptiv terapi. CAR T celle doser, TMZ regimer, og strålebehandling administrasjon kan bli endret for å forbedre in vivo T-celle aktivitet, lymphodepletion, og svulst drap. TMZ regimer kan økes for å gi verts myeloablasjon og økt utbygging av adoptivt overførte cellene 30. Videre kan lymphodepletive effekter av TMZ bli rekapitulert av lav-dose (4-6 Gy) enkelt-fraksjon total kroppsbestråling (TBI), for således å omgå de tumorici-dal egenskaper av SOC. Strålingen diett brukt her etterligner en biologisk ekvivalent dose på 60 Gy; kan imidlertid antall fraksjoner og brøk doser være innstilt på å etterligne andre kliniske doser (tabell 2). Viktigst, vår modell av SOC benytter biologisk ekvivalente doser av WBI, snarere enn ekstern strålebehandling levert fokalt til svulsten og margins, slik det ofte benyttes i klinikken, og dermed kan føre til en mindre dose av stråling levert til tumoren og en økt risiko for toksisitet til friske mus hjernen. Til tross for disse begrensningene, er imidlertid WBI en akseptert teknikk for modellering klinisk strålebehandling i en preklinisk setting.

CAR T celle doser kan økes eller reduseres for å observere dose effekter på svulst drap og total overlevelse 11. I tillegg kan tidspunktet for behandling og rute for levering bli modifisert for å vise forskjeller i effekt. For eksempel kan CAR T-celler bli levert intracranially å sikre aktivitet på tumorstedet. Utbyttet av CAR-positive T-celler kan variere avhengig av effektiviteten av transduksjon. En måte å sikre en vellykket transduksjon er ved å utføre et grønt fluorescerende protein (GFP) -kontroll gjennom hele prosedyren. For å gjøre dette, kan en HEK293T 10 cm PDL plate bli tildelt for GFP transfeksjon og transduksjon av en enkelt brønn av T-celler til uran for GFP på dager 3-5. En kritisk faktor i transduksjon effektivitet er omfanget av T-celleaktivering og proliferasjon ved tilsetning av viral supernatant. Vi noterer en viktig forskjell mellom foreliggende fremgangsmåte for T-celleaktivering, hvilket oppnås ved tilsetning av ConA i dyrkningsmediet, og som brukes i klinisk setting, oppnås ved CD3 og CD28 agonist monoklonale antistoffer. Selv om sistnevnte er rutinemessig brukt for å generere pasientretrovirale transduserte CAR T-celler og har også vært vellykket i transduksjon av murine T-celler, vi tidligere bestemt at ConA stimulering ført til bedre og mer konsistente transductions 37. Vi har også observert at den samlede CAR T-celle avkastning kan variere basert på når steg 5,18 utføres. Hvis du opplever dårlig CAR T celle yield, anbefaler vi har utført trinn 5,18 umiddelbart etter trinn 5.17 i stedet for å vente på 5-6 timers inkubasjon. Selv om dette kan påvirke effektiviteten av transduksjon, har vi ikke observert betydelig difskjeller i CAR overflate uttrykk i våre studier.

Etter transduksjon, kan CAR T-celler kvantifiseres og fenotypiseres av flowcytometri; vi flekken våre EGFRvIII CAR T-celler med en 2-farget panel består av et streptavidin-fykoerytrin (SA / PE) -konjugert biotynlated EGFRvIII-avledet multimer og anti-CD3. Alternativt kan biler også være farget for uttrykk ved hjelp av geit-anti-human F (ab ') 2-biotin primære og SA / PE sekundære antistoffer som har vært tidligere beskrevet 36. Vi rutinemessig observerer CAR uttrykk blant 55-70% av murine splenocytes 11. Vi har tidligere vist at levering av T-celler med denne CAR ekspresjon profil kan lett trafikk til hjernen og behandle svulster. TMZ- eller TBI-indusert lymfopeni forbedrer klonal ekspansjon av adoptivt overførte cellene, øker hyppigheten av CAR-positive celler og deres generelle antitumor respons. CAR-T-celler kan spores in vivo ved farging perifert blod med enppropriate tetramer; Dette er en nyttig teknikk for å forstå CAR T-celle overlevelse over tid og effekten av host-condition på CAR T-celle funksjon og utholdenhet. Alternativt, hvis ingen tetramer er tilgjengelig for antigen-reseptoren, et fluorescerende reporter kan inkluderes i CAR vektorkonstruksjon, eller CAR-T-celler kan merkes ex vivo med karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) før administrering in vivo for sporing.

Avhengig av tumormodell, immunoterapi plattform, og SOC regime, kan klinisk SOC administreres sammen med adoptiv terapi eller vaksiner føre til toksisitet. TMZ er en DNA-alkylerende middel som fører til ikke-spesifikk celledreping, og økte doser kan resultere i vekttap og sykelighet i murine verter. Høydose og lengre fraksjoner av WBI kan resultere i hydrocephalus. Videre kan inflammatorisk virkning fra sterk vaksine og / eller adoptiv overført T celle responser føre til sykelighet på grunngiftige cytokin storm. Det er også viktig å merke seg virkningene av systemiske anestesi på sykelige dyr. Hvis TMZ og WBI føre til betydelige toksisitet, deretter ketamin / xylazin doser kan reduseres med 20-25% for å redusere risikoen for dødelighet, som dyr trenger bare å bli bedøvet og immobilisert i 10 min for levering av små stråledoser (2- 8 Gy).

Host condition er kritisk for alle immunterapi plattformer som adoptiv overføring. Som immunterapi studier er ofte vurdert innenfor rammen av SOC, bør preklinisk vurdering av immunotherapies gjøres innen denne innstillingen til å rekapitulere den kliniske scenario. Vi presenterer her et eksempel på å utnytte lymphodepletive og tumorici-dal effekter av SOC med adoptiv terapi ved hjelp av CAR T-celler. Dette regime er et kraftig verktøy som kan anvendes for andre immunterapi plattformer for å evaluere effekten av kombinert SOC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363, (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364, (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21, (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14, (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119, (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365, (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20, (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71, (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63, (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66, (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16, (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171, (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A, (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15, (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62, (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25, (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65, (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18, (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173, (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23, (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116, (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3, (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17, (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26, (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8, (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22, (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110, (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202, (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33, (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16, (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23, (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34, (4), 343-352 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics