Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Glioblastoma (GBM) è il tumore maligno al cervello primario più comune ed è invariabilmente fatale. La resezione chirurgica accoppiato con standard di non-specifica delle cure di chemioterapia e radioterapia non riesce ad eliminare completamente le cellule maligne, con conseguente prognosi infausta di meno di 15 mesi in pazienti affetti da questa malattia 1. Al contrario, l'immunoterapia offre un metodo preciso per specifico le cellule tumorali, e quindi ha il potenziale per servire come piattaforma trattamento altamente efficace con un ridotto rischio di tossicità garanzie 2-4. Le cellule T progettati ex vivo per esprimere i recettori chimerici antigene (auto) offrono una strategia versatile per tumore immunoterapia. CAR vengono generati fondendo la regione variabile extracellulare di un anticorpo con la molecola di segnalazione uno o più cellule T intracellulare (s), al posto di un integrale complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) -restricted recettore delle cellule T 5. Questo modo di anticorpi come att antigeneon permette cellule T antigene-specifiche reattivi per riconoscere e rispondere ad antigeni tumorali, in assenza di MHC e possono essere adattati per un antigene repertorio virtualmente infinita.

Cellule T ingegnerizzate CAR contro una varietà di antigeni tumorali hanno dimostrato l'efficacia preclinica e promessa eccezionale nella clinica 6-9. In particolare, nel contesto di GBM, un CAR piattaforma di cellule T di targeting di crescita epidermico recettore del fattore di variante III (EGFRvIII), una mutazione specifica per tumore espresso sulla superficie delle cellule del 10, ha dimostrato di prolungare la sopravvivenza in glioma-cuscinetto topi 11. Nonostante la loro versatilità, tuttavia, il beneficio clinico di CAR terapia adottiva non è stato pienamente realizzato, in parte a causa immunosoppressione associata al tumore e l'evasione immune 12-16 e sfide nel creare e mantenere le cellule T antigene-specifiche in vivo. Sfruttando standard di cura (SOC) con immunoterapia può potenzialmente superare molti di questi limitazioni, con conseguente maggiore efficacia sia in ambito preclinico e clinico.

SOC per la post-resezione GBM consiste di temozolomide alte dosi (TMZ), un DNA agente alchilante 17, e tutta l'irradiazione cerebrale (WBI) 1. Questi trattamenti si presume di sinergizzare con i vaccini tumorali attraverso upregulation di tumore MHC espressione 18-20 e lo spargimento di antigeni da parte delle cellule tumorali morte 17,19,21,22. In effetti, l'aggiunta di TMZ 20,23 o 18,24 WBI porta a una maggiore efficacia antitumorale dei trattamenti a base immunitaria nel setting preclinico. Inoltre, come molti chemioterapici citotossici non specifici, TMZ è noto per provocare 25,26 linfopenia sistemica, che può essere sfruttato come mezzo di accoglienza condizionata per le piattaforme di terapia adottivi 27-29. Lymphodepletion TMZ mediata ha dimostrato di aumentare la frequenza e la funzione delle cellule T antigene-specifiche, con conseguente maggiore efficacia di un ADOPPiattaforma terapia tive contro i tumori intracranici 30. Nel contesto della terapia CAR, lymphodepletion serve come mezzo di host-condizionata sia la riduzione del numero di cellule T soppressori endogena 31, e indurre proliferazione omeostatica 32 attraverso concorrenza ridotta per citochine 33, migliorando così l'attività antitumorale 11,34. Dato il rapporto sinergico tra le piattaforme SOC e immunoterapia GBM, valutare nuove terapie adottivi e piattaforme vaccino nel contesto del SOC è fondamentale per trarre conclusioni significative per quanto riguarda l'efficacia.

In questo protocollo, delineiamo un metodo per la generazione e la somministrazione endovenosa di cellule murine CAR T specifiche per EGFRvIII accanto TMZ e WBI in topi portatori di tumori intracranici EGFRvIII-positivi (vedi Figura 1 per il trattamento temporale). Brevemente, le cellule T sono realizzati CAR ex vivo da trasduzione retrovirale. Rene embrionale umano (HEK) 293T cellule sono trasfettate con un complesso DNA / lipide (contenente il vettore CAR e plasmidi PCL-Eco) per produrre virus, che viene poi utilizzato per trasdurre splenociti murini attivate che vengono raccolte e coltivate in parallelo. Durante il corso della generazione CAR, ospita murine recanti tumori intracranici EGFRvIII-positivi vengono somministrati frazionata tutto il cervello a raggi X irradiazione e il trattamento sistemico TMZ a dosi paragonabili a SOC clinica. Cellule T auto sono poi consegnati per via endovenosa a host lymphodepleted.

La seguente procedura è descritta in sette fasi distinte: (1) La somministrazione di Temozolomide per tumore Mice, (2) irradiazione cerebrale totale di topi tumore-cuscinetto, (3) Transfection, (4) La splenectomia e T cellule Preparazione, (5 ) trasduzione, (6) Cultura celle CAR T e Harvest, e (7) la somministrazione di cellule T di topi CAR tumore-cuscinetto. Queste fasi sono costituite da diversi passaggi che si estendono 6-7 giorni e sono state compiute contemporaneamente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Questo protocollo si basa su un disegno sperimentale in cui 10 topi vengono trattati con 10 7 CAR cellule T ciascuno. Ciò significa che saranno necessari 10 8 cellule CAR T; il rendimento dovrebbe essere sovrastimata da 5 x 10 7 -1 x 10 8 per conto per la perdita di redditività. Il protocollo che segue viene scalato per generare circa 200 x 10 6 cellule. Le cellule sono poi somministrati per via endovenosa al femminile C57BL / 6 topi con 9 giorni stabiliti singenici tumori intracranici EGFRvIII-positivo, sviluppato dalle linee esistenti di cellule di melanoma KR158B astrocitoma o B16. In concomitanza con il CAR generazione di cellule T, i topi di tumore vengono somministrati dosi clinicamente rilevanti di lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) e WBI (16.5 Gy).

I topi sono stati mantenuti e allevati in condizioni esenti da organismi patogeni della Duke University Medical Center (DUMC). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla Duke University Istituzioneal Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. La somministrazione di Temozolomide per Mice tumore-cuscinetto

Giorni 0 a 4:

  1. Calcolare il numero totale di topi da iniettare e moltiplicare tale da 0,5 a determinare il volume di soluzione TMZ necessario (ad esempio, 30 topi x 0.5 ml = 15 ml TMZ) e aggiungere 1,5 ml di volume per tenere conto di ricaduta (16.5 ml TMZ ).
  2. Moltiplicate questo volume totale da 3 mg / ml per determinare il peso di liofilizzato TMZ necessario (ad esempio, 16,5 x 3 = 49.5 mg TMZ). Pesare questo in una conica da 50 ml.
    ATTENZIONE: TMZ è tossico per inalazione, ingestione e contatto con gli occhi, la pelle e le membrane mucose. Consultare la sicurezza dell'istituzione del lavoro e / o di salute ambientale e il reparto wellness per le raccomandazioni in materia di riduzione del rischio di esposizione.
  3. Moltiplicare il volume totale di 0,15 per determinare il volume di dimetilsolfossido (DMSO) necessaria (ad esempio, 16,5 x0,15 = 2.475 ml DMSO). Filtro sterilizzare questo volume di DMSO (più altri 2 ml per spiegare ricaduta) attraverso un filtro da 0,2 micron in una provetta sterile. Aggiungere 2,475 ml di DMSO sterile per la polvere TMZ.
  4. Posizionare la soluzione TMZ / DMSO in un becher di acqua su una piastra calda a 65 ° C per 10-15 min. Una volta TMZ è completamente sciolto, la soluzione dovrebbe diventare colore giallo paglierino; se la soluzione diventa rosa, allora il TMZ è degradata, e una nuova soluzione dovrebbe essere preparata con un nuovo sacco di TMZ.
  5. Calcolare il volume appropriato di soluzione salina sterile necessario moltiplicando 0,85 per il volume totale (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml di soluzione salina). Aggiungere 15 ml di soluzione salina sterile per un conica da 50 ml. Mentre TMZ sta dissolvendo in DMSO, saline di calore a 65 ° C.
  6. Vortex la soluzione / DMSO TMZ per garantire che la polvere TMZ è completamente sciolto e aggiungere lentamente salina riscaldata alla soluzione / DMSO TMZ.
  7. Immediatamente dopo la preparazione, caricare completamente 15 x 1 ml tubercolina syringes con la soluzione TMZ per l'amministrazione di quattro giorni stabiliti tumorali cuscinetto topi.
  8. Ripetere questa procedura nei giorni da 1 a 4 per un totale di cinque amministrazioni TMZ.

2. Whole Brain irradiazione dei topi tumore-cuscinetto

Giorni 2 a 4:

  1. Accendere il irradiatore X-ray e lasciarlo riscaldare-fino a piena tensione. Assicurarsi che il filtro appropriato è a posto e ingresso la tensione corretta e le impostazioni correnti (Figura 2a).
    NOTA: La dosimetria del irradiatore andrà stabilita anticipatamente per stabilire i provvedimenti impostazioni di tensione e layout a griglia (figura 2A, B).
  2. Calcolare la lunghezza di tempo che è necessario per provocare 5,5 Gy X-ray irradiazione. Ad esempio, se i raggi X vengono forniti ad una velocità di 2 Gy / min, poi 2,75 min è necessario fornire un totale di 5,5 Gy. Inserire la durata di tempo adeguato.
    NOTA: La tabella 2 fornisce il mouse WBI dosa unnd loro equivalenti clinico nell'uomo. Nel contesto di gliomi ad alto grado, 60 Gy frazionata WBI (2 frazioni Gy, 5 giorni / settimana per 6 settimane) è lo standard clinico di cura, e l'equivalente murino utilizzato è 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Preparare una soluzione fresca di ketamina / xylazina per anestesia sistemica aggiungendo 2 ml di ketamina e 1 ml a 17 ml xilazina soluzione salina in modo che la soluzione finale è di 10 mg / ml di ketamina e 1 mg / ml xylazina.
  4. Pesare topi e amministrare 10 ml di ketamina / xilazina intraperitoneale per grammo di peso corporeo tale che gli animali ricevono una dose di ketamina a 100 mg / kg e 10 mg / kg xilazina. I topi dovrebbe essere pienamente sedato e visibilmente la respirazione entro 2 minuti di somministrazione / xylazina ketamina.
  5. Per mantenere l'umidità oftalmica negli animali sedati, strofinare delicatamente una piccola quantità di lacrime artificiali unguento su ciascun occhio.
  6. Inserire topi sedati sulla griglia in modo tale che le teste sono posizionati nella zona che riceve il massimo raggi X intensity (Figura 2B, C). Corpi Shield dal collo in giù, con opportunamente dimensionate tubi di piombo per bloccare la consegna a raggi X sistemica (Figura 2D).
  7. Inserire topi posizionati sotto il fascio di raggi X in modo che il laser indica il punto focale del fascio di raggi X è al di coordinate (0,0) sul layout della griglia. Inizia consegna X-ray.
  8. Quando la consegna a raggi X, rimuovere gli animali dal irradiatore e posto su una piastra elettrica caldo. Non accogliere animali sedati con animali coscienti fino animali hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere prona sternale. Una volta che gli animali possono mantenere prona sternale, posizionare animali coscienti nel loro gabbie appropriate.
  9. Ripetere questa procedura nei giorni 3 e 4 per un totale di tre dosi frazionate di radiazioni.

3. Trasfezione

-1 ° giorno:

  1. Preparare supporti D10 aggiungendo 50 ml di siero bovino fetale (FBS) a 500 ml di Dulbecco Modified (DMEM).
  2. Preparare supporti di cellule T (TCM) con l'aggiunta di 5,5 ml di L-glutammina, 5,5 ml di piruvato di sodio, 5,5 ml aminoacidi non essenziali, e 5.5 ml Pencillin / di streptomicina (pen / strep) a 500 supporti ml RPMI-1640. Avanti, aggiungere 550 ml di 2-mercaptoetanolo e 550 ml gentamicina. Infine, aggiungere 50 ml di FBS.
  3. Harvest vitro cellule in coltura HEK293T e portare a una concentrazione di 7,5 x 10 6 cellule / ml nei media D10.
  4. La tavola 10 ml supporti D10 e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare HEK293T in ciascuno di 16 x 10 centimetri poli-D-lisina (PDL) piastre rivestite.
  5. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

Giorno 0:

  1. Sostituire i media con 10 ml D10 fresco almeno 30 minuti prima di trasfezione le cellule.
  2. Determinare la quantità di vettore plasmidico, PCL-Eco vettoriale, e liposomiale trasfezione reagente necessario per trasfezione moltiplicando il numero totale di piatti + 1 (16 + 1 = 17) 14.1 mgplasmide vettore (14.1 x 17 = 239,7 mg), 9.9 mg PCL-Eco vettore (9,9 x 17 = 168,3 mg), e 60 ml di reagente liposomiale trasfezione (60 x 17 = 1.020 ml). Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente prima di preparare soluzioni.
  3. Etichettare due provette A e B. In tubo A, aggiungere 239,7 mcg vettore plasmidico e 168,3 mg PCL-Eco vettore a (1,5 x 17) ML-siero ridotto modificato mezzo di Eagle (RS-MEM). Nel tubo B, aggiungere 1020 ml liposomiale trasfezione reagente (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incubare A e B separatamente per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Mescolare A e B insieme delicatamente (vortex per 1-2 sec capovolgere varie volte) e incubare per 20 min a temperatura ambiente per formare lipidi complessi / DNA.
  6. Aggiungere lipidi / DNA complesso goccia a goccia per le cellule HEK293T a 10 centimetri piatto.
  7. Incubare a 37 ° C per 6-8 ore o durante la notte (non superare 24 ore).
  8. Dopo 6-8 ore di incubazione, sostituire medie con 12 ml di TCM fresco per la produzione virale. Questo placcato supportisaranno utilizzati al Day 2 come surnatante virale per la trasduzione di cellule T.

4. La splenectomia e preparazione delle cellule T

Giorno 0:

  1. Versare 10 ml di TCM in una conica da 50 ml e posto in ghiaccio per la raccolta della milza.
  2. Sacrifica il numero appropriato di animali da CO 2 asfissia e decapitazione secondario: Posizionare gli animali in gabbia ricevere CO 2 ad una portata di 10-30% gabbia volume / minuto, secondo le linee guida American Veterinary Medical Association (non più di 5 animali possono essere sacrificato contemporaneamente) fino termina respirazione e per due minuti successivi. Rimuovere gli animali dalla camera di CO 2 e di decapitarlo.
    NOTA: Uno spleen di un 6-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 del mouse produrrà circa 4,5-5 x 10 7 splenociti. Qui, 4 milze saranno raccolte per circa 200 x 10 6 cellule.
  3. Posare il mouse in modo che il suo lato destro rivolto verso l'alto, espruzzare con il 70% di etanolo. Con le pinze, afferrare un sottile lembo di pelle sotto la gabbia toracica sinistra e tagliare una leggera incisione con le forbici. Rimuovere la pelle, afferrare con cura un sottile piega del peritoneo con una pinza, e tagliare una piccola cavità.
  4. La milza è un piccolo, allungato, organo rosso scuro che ricorda un fagiolo appiattita; delicatamente afferrare la milza con le pinze e le accise tagliando via il tessuto connettivo circostante. Posizionare le milze asportati nel conica contenente 10 ml di TCM su ghiaccio.
  5. Versare milze oltre un filtro 70 micron cella maglie e disaggregare da schiacciare con l'estremità smussata della parte interna di una siringa da 5 ml per generare una cella singola sospensione. Un massimo di due milze dovrebbe essere disaggregate per filtro a rete.
  6. Utilizzare un piccolo volume di TCM di lavare accuratamente il filtro seguente disaggregazione per raccogliere eventuali splenociti rimanenti. Piscina tutto milze disaggregati in una cella singola sospensione. Portare il volume finale di 50 ml con TCM per un lavaggio did girare a 300 xg per 10 min.
  7. Preparare una soluzione di tampone di lisi 1x aggiungendo 5 ml 10x tampone di lisi a 45 ml di acqua sterile. Per eliminare i globuli rossi, risospendere pellet in 5 ml di 1x tampone di lisi per milza in una conica da 50 ml, mescolando bene pipettando gentilmente su e giù. Se superiore a 5 milze, utilizzare un tubo da centrifuga da 250 ml. Inserire conica o tubo da centrifuga in un bagno d'acqua 37 ° per 5 minuti.
  8. Rimuovere la reazione lisi dal bagno di acqua e aggiungere TCM in un rapporto 1: 1 con tampone di lisi per neutralizzare la reazione. Lavare facendo girare a 300 xg per 10 min.
  9. Aspirare il surnatante e pellet completamente risospendere in MTC (2 ml / milza, 8 ml totale per 4 milza) pipettando su e giù.
  10. Contare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di sospensione cellulare a 190 ml blu trypan (1:20 diluizione). Moltiplicare il numero ottenuto in uno dei quattro quadrati reticolati da 20 x 10 x 4 volume totale (8 ml) per ottenere il numero totale di cellule (ad esempio, 125 cellule x 20 x 10 4 6 splenociti).
  11. Diluire le cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in TCM, supplementato con 2 ug / ml concanavalina A (ConA) e 50 UI / ml ricombinante umano interleuchina-2 (rhIL-2). Così, per 200 x 10 6 splenociti, aggiungere 92 ml di media per 8 ml cellule, 200 mcg Cona e 5.000 UI rhIL-2.
  12. Aggiungere 2 mL cellule in ciascun pozzetto 24 pozzetti tessuto-cultura piastre trattati, tale che 4 x 10 6 cellule sono in ogni pozzetto (es, 100 ml di cellule richiederanno circa 4 piastre).
  13. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.

5. Trasduzione

1 ° giorno:

  1. Calcolare il numero della cultura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti necessari per la trasduzione moltiplicando il numero di milza raccolte da 2 (8 piastre sono necessari per 4 milza).
  2. Successivamente, calcolare il volume richiesto di soluzione ricombinante frammento fibronectina umana (RHFF)necessario per lastre cappotto moltiplicando (numero totale di pozzi + 3) x 0,5 ml (8 piastre x 24 pozzi = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Preparare 97,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente RHFF ad una concentrazione di 25 ug / ml moltiplicando il volume totale da 25 mg (97,5 x 25 = 2437,5 mg). Aggiungi questa quantità di RHFF a 97,5 ml di PBS.
  4. Coat coltura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti aggiungendo 0,5 ml di soluzione PBS / RHFF per pozzetto.
  5. Incubare una notte a 4 ° C.

2 ° giorno:

  1. Dump soluzione PBS / RHFF dalla cultura non-tessuto trattato piastre da 24 pozzetti.
  2. Aggiungere 1 ml / pozzetto di albumina sierica bovina 2% (BSA) in PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  3. Rimuovere BSA saldamente ribaltare piatto. Lavare con l'aggiunta di 2 ml di PBS.
  4. Raccogliere surnatante virale trasferendo file multimediali da ogni HEK293T PDL piastra in una provetta da 250 ml centrifuga e spin 10 min a 500 x g.
  5. Trasferire accuratamente su viralepernatant in un fresco 250 ml tubo da centrifuga, assicurandosi di non disturbare il pellet che possono essersi formate.
  6. Aggiungere TCM fresco al surnatante virale tale che il volume finale è 3 ml più che la quantità necessaria per pozzi RHFF rivestite. Ad esempio, per 192 pozzetti RHFF rivestite, portare il volume del surnatante virale a 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Rimuovere splenociti coltivate dal incubatore e risospendere pipettando gentilmente su e giù 2 - 3 volte in ogni pozzetto. Trasferire in un conica 250 ml. Se si utilizza una pipetta multicanale, con un serbatoio sterile prima del trasferimento contribuirà ad accelerare questo passaggio. Conta come descritto in precedenza e far girare a 300 xg per 10 min.
  8. Aggiungere rhIL-2 per surnatante virale ad una concentrazione di 50 UI / ml. Ad esempio, aggiungere 50 x 195 = 9.750 UI a 195 ml di surnatante virale-2 rhIL.
  9. Risospendere splenociti di surnatante virale a 1 x 10 6 cellule / ml
  10. Aggiungere 1 ml / pozzetto di sospensione splenocyte a piastre da 24 pozzetti RHFF rivestite.
  11. Spin per 90 min in base alle seguenti impostazioni: 770 xg, accelerazione = 4, freno / decelerazione = 0, 32 ° C.
  12. Preparare una soluzione TCM con 50 UI / ml rhIL-2. Ad esempio, preparare una soluzione 200 TCM aggiungendo 10.000 UI rhIL-2. Aggiungere 1 ml di rhIL-2 / TCM a ciascun pozzetto dopo centrifugazione.
  13. Culture notte a 37 ° C in 5% CO 2.

6. CAR T cellule Cultura e Harvest

Giorni 3 e 4:

  1. Se le cellule T raggiungono> 80% di confluenza, le cellule possono essere divise (questo di solito avviene il giorno 3 o 4 giorni). Per dividere le celle, delicatamente pipettare su e giù in ciascun pozzetto 2-3 volte, e passare 1 ml da ogni pozzetto in nuovi pozzetti di una 24-pozzetti trattati tessuto-coltura fresco. Quindi, aggiungere 1 ml di TCM fresca con 50 UI / ml di IL-2 in ciascun pozzetto tale che il volume finale di 2 ml in tutti i pozzetti.
  2. Se le cellule non raggiungono> 80% di confluenza, effettuare un cambiamento mezza mezzi lentamente pipettando off 1 ml del supporto dalla parte superiore di ciascun pozzetto. Evitare disturbing cellule insediate sul fondo durante la rimozione dei media. Aggiungere 1 ml di TCM fresco contenente 50 UI / ml rhIL-2.

5 ° giorno:

  1. Risospendere le cellule T CAR pipettando gentilmente su e giù per 3 volte in ogni pozzetto e il trasferimento ad un tubo da centrifuga da 250 ml. Spin cellule a 300 xg per 10 min.
  2. Surnatante completamente aspirate senza disturbare pellet. Risciacquare una volta con PBS, contare le cellule come precedentemente descritto, e lavare con PBS una seconda volta. Una resa di cellule CAR T tipico è di circa 1 x 10 6 cellule per bene (8 piastre cellule x 24 pozzi = 192 x 10 6 CAR T).
  3. Risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di 5 x 10 7 / ml per una iniezione di 1 x 10 7 in un volume di 200 mg (per esempio, per 192 x 10 6 cellule T CAR, risospendere pellet lavate in PBS 3,84 ml).

7. CAR T cellule Administration per Mice tumore fruttiferi

5 ° giorno:

  1. Transpocellule rt sul ghiaccio per stabulario per iniezione endovenosa. Load 500-1000 ml in siringa da insulina con 27-31 G ago, assicurando che tutte le bolle vengono espulsi.
  2. Prendete un mouse alla base della coda e mettere in fermo tubi.
  3. Estrarre la coda tesa con la vena rivolto verso l'alto, e scivolare l'ago di circa 1-2 mm sotto la pelle nella vena inserendolo parallelo alla vena della coda. Lentamente espellere 200 microlitri nella vena. Se l'ago è correttamente inserito nella vena, il volume sarà facile flusso in; altrimenti ci sarà la resistenza e l'ago dovranno essere rimossi dalla coda e ri-inserito correttamente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellule T CAR sono generati dalla trasduzione con il EGFRvIII CAR vettore retrovirale 11. Questo vettore, MSGV1, è stato sviluppato dal vettore SFGtcLuc_ITE4 35, che contiene il virus cellule staminali murine (MSCV) lunghe ripetizioni terminali, la estesa regione gag e sito di splicing busta (splice donatore, sd, e splice accettore, sa), e virale Segnale di imballaggio (ψ). Il CAR EGFRvIII contenente l'anti-EGFRvIII catena singola frammento umano variabile (scFv) 139, in tandem con CD8TM murino, CD28, 4-1BB, e CD3ζ regioni intracellulari, è stato clonato nel vettore retrovirale a valle del sito NcoI (Figura 3) .

A seguito di trasduzione, le cellule T CAR possono essere quantificate e phenotyped mediante citometria a flusso. Cellule EGFRvIII CAR T possono essere visualizzati con un pannello a 2 colori composto da una streptavidina-ficoeritrina (SA / PE) -conjugated biotynlated multimero EGFRvIII-derivati ​​e anti-CD3 FITC. Utilizzando la cultura e trasduzione protocols qui descritte, abbiamo quotidianamente osserviamo espressione CAR tra 55-70% di splenociti murini (Figura 4A) 11. In alternativa, le automobili possono anche essere colorati per l'espressione utilizzando F capra-anti-umano (ab ') anticorpi secondari 2-biotina primaria e SA / PE che è stata precedentemente descritti 36. Cellule CAR T possono essere ulteriormente phenotyped con l'aggiunta di altri anticorpi fluorescente al pannello CAR bicolore. Ad esempio, la colorazione per CD8 e CD4 mostra che il 70% delle auto trasdotte sono cellule CD8 + T, mentre il 20% sono cellule CD4 + T (Figura 4B). Cellule CAR T con questo profilo di espressione hanno dimostrato di traffico facilmente al cervello e il trattamento di tumori intracranici.

Tabella 1:. Dose di Temozolomide in base al peso degli animali dosi temozolomide sono stati calcolati sulla base di una dose totale di 60 mg / kg.

Peso corporeo Volume
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0.46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0.42 ml
20 g 0.40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0.34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0.28 ml
13 g 0.26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0.22 ml
D d # Frazioni LETTO SOC
16.5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52.5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tabella 2:. Clinicamente rilevanti dosi di radiazioni biologicamente equivalenti dosi di radiazioni sono stati calcolati in base al BED = D [1+ d / (α / β)], dove D = dose totale, d = frazionata la dose, e α / β = 2). La dose totale somministrata come WBI all'host murino è mostrato in termini di the dosi frazionali consegnati e la dose che viene modellato da tali frazioni della dose. Per scopi modello, viene visualizzato anche il tumore per il quale il letto è standard di cura.

Figura 1
Figura 1:. Timeline per il trattamento di topi portatori di tumore e concorrente ex vivo generazione CAR standard di cure di chemioterapia e radioterapia totale dell'encefalo inizia 4 giorni dopo l'impianto del tumore (A). Durante questo intervallo di tempo, le cellule T CAR vengono generati e coltivate ex vivo (B) e consegnati dopo un ciclo completo di accoglienza condizionata.

Figura 2
Figura 2: layout e le impostazioni per la consegna di radiazioni.I raggi X sono forniti secondo un dosimetria di 320 kV e 10 mA, con una durata variabile scelta in relazione alla dose desiderata (A). Il campo focale di radiazione a raggi X è una stretta 2.5 zona centimetri. Animali Sedated sono disposte secondo la griglia (B) in modo che la testa si trovano nella zona di massima intensità di raggi X; (C) mostra la vista da un'estremità del fascio di raggi X. Circa 4 animali possono essere sotto l'irradiatore durante un corso di somministrazione X-ray secondo questa forma a griglia (B, D). Tubi piombo è usato per proteggere il corpo, lasciando solo loro teste esposte per WBI (D).

Figura 3
Figura 3: Il SFGtcLuc_ITE4 vettore retrovirale modificato, MSGV1, è stato utilizzato per la trasduzione e la generazione di cellule T CAR The.Inserto CAR EGFRvIII contenente l'anti-EGFRvIII singola catena frammento umano variabile (scFv) 139, in tandem con CD8TM murino, CD28, 4-1BB, e CD3ζ regioni intracellulari, è affiancata da virus murino di cellule staminali (MSCV) lunghe ripetizioni terminali (LTR ). A monte dell'inserto CAR sono la regione gag estesa e sito di splicing busta (splice donatore, sd, e Splice accettore, sa), e il segnale di confezionamento virale (ψ).

Figura 4
Figura 4: le auto EGFRvIII sono espresse sulla superficie delle cellule T 48 ore dopo la trasduzione, le cellule T sono state colorate per l'espressione di superficie di auto EGFRvIII utilizzando una multimero composto LEEKKGNYVVTDHC-K (biotina) -NH 2 / streptavidina-PE.. Cellule T non trasdotte dallo stesso donatore sono stati macchiati come controllo negativo. I dati mostrano il numero di cellule T CAR (asse y) positivi per stavorazio dal multimero PE-coniugato EGFRvIII (asse x), gated su cellule CD3 + come marcatore delle cellule T, in cui è stato trovato espressione sia 60,9% (A). Cellule CAR T colorate per CD4-PerCP-Cy5.5 e CD8-APC mostrano un profilo di espressione del 21,7% e 70,9%, rispettivamente, (B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La timeline trattamento qui descritto è stato progettato per modello standard clinico di cura e di sfruttare i suoi effetti per l'automobile la terapia adottiva. AUTO dosi T cellulari, regimi di TMZ, e l'amministrazione radioterapia possono essere modificati per aumentare in vivo l'attività delle cellule T, lymphodepletion, e tumore uccisione. Regimi TMZ può essere aumentata per produrre mieloablazione host e una maggiore espansione delle cellule adoptively trasferiti 30. Inoltre, gli effetti lymphodepletive di TMZ possono essere riepilogati da basse dosi (4-6 Gy) single-frazione irradiazione corporea totale (TBI), eludendo così le proprietà tumoricide di SOC. Il regime di radiazione applicata qui imita una dose biologicamente equivalente di 60 Gy; Tuttavia, il numero delle frazioni e dosi frazionali può essere sintonizzata per imitare altre dosi cliniche (Tabella 2). È importante sottolineare che il nostro modello di SOC utilizza dosi biologicamente equivalenti di WBI, piuttosto che la radioterapia esterna consegnato focally al tumore e margins, come è spesso utilizzato in clinica, e, quindi, possono portare a una dose minore di radiazioni somministrata al tumore e un aumento del rischio di tossicità a cervello di topo sano. Nonostante questi limiti, tuttavia, WBI è una tecnica accettata per la modellazione di radioterapia clinica in un ambiente preclinico.

AUTO dosi di cellule T possono essere aumentati o diminuiti di osservare gli effetti della dose sulla uccisione del tumore e la sopravvivenza globale 11. Inoltre, i tempi di trattamento e via di erogazione può essere modificato per visualizzare differenze di efficacia. Per esempio, le cellule T possono essere CAR consegnati intracranially per garantire l'attività nel sito del tumore. La resa di cellule T CAR-positivo può variare a seconda dell'efficienza di trasduzione. Un modo per garantire una trasduzione di successo è quello di portare una proteina fluorescente (GFP) -Control verde durante tutta la procedura. Per fare questo, 1 HEK293T 10 centimetri piastra PDL può essere assegnato per GFP trasfezione e trasduzione di un singolo pozzetto di cellule T di ghiaien per GFP nei giorni 3-5. Un fattore critico nella efficienza di trasduzione è la misura di attivazione delle cellule T e la proliferazione 'aggiunta di surnatante virale. Notiamo una differenza importante tra il nostro metodo di attivazione delle cellule T, che si ottiene con l'aggiunta di ConA al mezzo di coltura, e che utilizzato in ambito clinico, realizzato da anticorpi monoclonali agonisti CD3 e CD28. Anche se quest'ultimo è regolarmente utilizzato per la generazione di retrovirus trasdotte cellule T CAR paziente ed è stato anche il successo nella trasduzione di cellule T murine, abbiamo precedentemente determinato che la stimolazione ConA ha portato a migliori e più coerenti trasduzioni 37. Abbiamo anche osservato che CAR resa complessiva delle cellule T può variare in base a quando viene eseguita passo 5.18. Se si verificano scarsa resa delle cellule CAR T, si consiglia di eseguire passo 5.18 subito dopo il passaggio 5.17 invece di aspettare per l'incubazione di 5-6 ore. Anche se questo può influire sulla efficienza di trasduzione, non abbiamo osservato significative difrenze di espressione di superficie CAR nei nostri studi.

A seguito di trasduzione, le cellule T CAR possono essere quantificate e phenotyped mediante citometria a flusso; abbiamo macchiare le nostre cellule EGFRvIII CAR T con un pannello a 2 colori composto da una streptavidina-ficoeritrina (SA / PE) -conjugated biotynlated multimero EGFRvIII-derivati ​​e anti-CD3. In alternativa, le automobili possono anche essere colorati per l'espressione utilizzando F capra-anti-umano (ab ') anticorpi secondari 2-biotina primaria e SA / PE che è stata precedentemente descritti 36. Osserviamo regolarmente espressione CAR tra 55-70% di splenociti murini 11. Abbiamo precedentemente dimostrato che la consegna delle cellule T con questo profilo di espressione CAR può facilmente il traffico verso il cervello e il trattamento di tumori. Linfopenia TMZ- o TBI indotta aumenta espansione clonale delle cellule adoptively trasferiti, aumentando la frequenza delle cellule CAR-positivi e la loro risposta globale antitumorale. Cellule CAR T possono essere monitorati in vivo colorazione sangue periferico con l'unatetramero ppropriate; questa è una tecnica utile per comprendere CAR T sopravvivenza cellulare nel corso del tempo e gli effetti di accoglienza condizionata sulla funzione delle cellule T CAR e persistenza. In alternativa, se non tetramero è disponibile per il recettore per l'antigene, un reporter fluorescente può essere incluso nel costrutto vettore auto, o cellule T CAR può essere etichettato ex vivo con estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) prima della somministrazione in vivo inseguimento.

A seconda del modello di tumore, la piattaforma immunoterapia, e regime SOC, SOC clinica somministrata insieme terapia adottiva o vaccini può portare a tossicità. TMZ è un agente alchilante DNA che porta all'uccisione delle cellule non-specifica, e intensificato dosi possono provocare la perdita di peso e morbilità in ospiti murini. Ad alte dosi e frazioni prolungati WBI possono provocare idrocefalo. Inoltre, gli effetti infiammatori da forte vaccini e / o adoptively trasferiti risposte delle cellule T possono causare morbilità a causa ditempeste di citochine tossiche. E 'anche importante notare gli effetti dell'anestesia sistemica sugli animali morbose. Se TMZ e WBI portano a tossicità significative, poi ketamina / xilazina dosi possono essere ridotte del 20-25% per ridurre il rischio di mortalità, in quanto animali hanno bisogno solo di essere sedato e immobilizzato per 10 minuti per la consegna di piccole dosi di radiazioni (2- 8 Gy).

Host condizionata è fondamentale per tutte le piattaforme di immunoterapia che includono trasferimento adottivo. Come prove di immunoterapia sono spesso valutati nel contesto del SOC, valutazione preclinica di immunoterapie dovrebbe essere fatto all'interno di questa impostazione ricapitolare lo scenario clinico. Vi presentiamo qui un esempio di sfruttare la lymphodepletive e gli effetti tumoricide di SOC con la terapia adottiva utilizzando le cellule T CAR. Questo regime è un potente strumento che può essere applicato ad altre piattaforme immunoterapia per valutare gli effetti di SOC combinata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363, (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364, (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21, (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14, (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119, (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365, (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20, (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71, (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63, (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66, (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16, (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171, (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A, (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15, (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62, (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25, (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65, (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18, (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173, (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23, (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116, (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3, (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17, (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26, (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8, (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22, (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110, (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202, (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33, (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16, (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23, (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34, (4), 343-352 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics