Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Immunology and Infection

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Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

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Abstract

Introduction

Das Glioblastom (GBM) ist die häufigste primären bösartigen Gehirntumor und ist immer tödlich. Die chirurgische Resektion in Verbindung mit nicht-spezifischen Standardtherapie Chemotherapie und Strahlentherapie nicht vollständig zu beseitigen Krebszellen, was zu einer düstere Prognose von weniger als 15 Monaten bei Patienten mit dieser Krankheit ein. Im Gegensatz dazu bietet die Immuntherapie eine genaue Vorgehensweise für die gezielt Tumorzellen angreift und somit das Potenzial hat, als eine sehr effektive Behandlungsplattform mit reduzierten Risiko von Sicherheiten Toxizität 2-4 dienen. T-Zellen entwickelt, ex vivo, um auszudrücken, chimären Antigenrezeptoren (CAR) bieten eine vielseitige Strategie zur Tumor-Immuntherapie. Die Autos werden durch Fusionieren der extrazellulären variable Region eines Antikörpers mit einem oder mehreren intrazellulären T-Zelle-Signalmolekül (en), die anstelle einer Volllängen-Haupthistokompatibilitätskomplex erzeugt (MHC) restringierten T-Zell-Rezeptor 5. Diese Art der antikörperähnlichen Antigens Sie AnAuf ermöglicht reaktiven Antigen-spezifische T-Zellen zu erkennen und zu reagieren, um Tumorantigene in Abwesenheit von MHC und kann für eine praktisch unendliche Antigenrepertoire angepasst werden.

CAR-T-Zellen gegenüber einer Vielzahl von Tumorantigenen konstruiert wurden vorklinische Wirksamkeit und hervorragende Versprechen in der Klinik 6-9 gezeigt. Insbesondere im Zusammenhang mit der GBM eine CAR-T-Zell-Targeting-Plattform den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorvariante III (EGFRvIII), ausgedrückt ein Tumor-spezifische Mutation an der Zelloberfläche 10, wurde gezeigt, dass das Überleben in Gliom-tragenden Mäusen 11 verlängern. Trotz ihrer Vielseitigkeit jedoch der klinische Nutzen von CAR adoptive Therapie nicht vollständig realisiert worden ist, was zum Teil an Tumor-assoziierte Immunsuppression und Immunumgehung 12-16 sowie Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo. Aufbauend Standardtherapie (SOC) mit Immuntherapie kann potenziell zu überwinden mehrere dieser lImitationen, was zu einer erhöhten Wirksamkeit sowohl in der präklinischen und klinischen Einstellung.

SOC für post-Resektion GBM besteht aus hochdosiertem Temozolomid (TMZ), einem DNA-Alkylierungsmittel 17 und gesamte Gehirn Bestrahlung (WBI) 1. Diese Behandlungen gelten als mit Tumorvakzinen über Hochregulierung von Tumor-MHC-Expression von 18 bis 20 und das Vergießen von Antigenen durch toten Tumorzellen 17,19,21,22 Synergie. Tatsächlich ist die Zugabe von TMZ 20,23 oder 18,24 WBI führt zu verbesserten Antitumorwirksamkeit von immunbasierten Behandlungen in der präklinischen Einstellung. Ferner, wie viele nicht-spezifischen zytotoxischen Chemotherapeutika, TMZ ist bekannt, dass eine systemische Lymphopenie 25,26, die als Mittel zur Hostanlage für adoptive Therapie Plattformen 27-29 genutzt werden können verursachen. TMZ vermittelte lymphodepletion wurde gezeigt, dass die Häufigkeit und die Funktion von Antigen-spezifischen T-Zellen zu verstärken, was zu einer erhöhten Wirksamkeit eines ADOPtive Therapie Plattform gegen intrakranielle Tumore 30. Im Rahmen der CAR-Therapie dient lymphodepletion als Mittel zur Wirtsanlage sowohl durch die Reduzierung der Anzahl der endogenen Suppressor-T-Zellen 31 und 32 homöostatischen Proliferation induzierende über Einschränkungen des Wettbewerbs für Zytokine 33 und somit eine Verbesserung Antitumoraktivität 11,34. Angesichts der synergistische Beziehung zwischen GBM SOC und Immuntherapie-Plattformen, die Bewertung neuer Therapien und Adoptivimpfstoffplattformen im Rahmen der SOC ist von entscheidender Bedeutung für die Erstellung aussagekräftige Rückschlüsse auf die Wirksamkeit.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren für die Erzeugung und die intravenöse Verabreichung von murinen EGFRvIII spezifische CAR T-Zellen zusammen mit TMZ und WBI in Mäusen EGFRvIII-positive intrakraniellen Tumoren (siehe Abbildung 1 für die Behandlung Timeline). Kurz gesagt, werden CAR T-Zellen ex vivo durch retrovirale Transduktion gemacht. Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293T-Zellen werden mit einem DNA / Lipid-Komplex (enthaltend die CAR-Vektor und pCL-Eco-Plasmiden), um Viren, die dann verwendet wird, um aktivierten murinen Splenocyten, die geerntet werden und parallel kultivierten transduzieren erzeugen transfiziert. Im Verlauf der CAR Generierung werden murine Hosts Lager EGFRvIII-positiven intrakraniellen Tumoren in Dosierungen entsprechend der klinischen SOC verabreicht fraktionierte ganzen Gehirn Röntgenbestrahlung und systemischen TMZ Behandlung. CAR T-Zellen werden dann intravenös lymphodepleted Gastgeber geliefert.

Folgende Vorgehensweise wird in sieben getrennten Phasen beschrieben: (1) Die Verabreichung von Temozolomid an tumortragenden Mäusen, (2) Ganzhirnbestrahlung von tumortragenden Mäusen, (3) Die Transfektion, (4) Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung, (5 ) Transduction, (6) CAR T-Zell-Kultur und Ernte, und (7) CAR T-Zell-Verwaltung auf tumortragenden Mäusen. Diese Phasen bestehen aus mehreren Schritten, die 6-7 Tage dauern und gleichzeitig durchgeführt werden.

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Protocol

Dieses Protokoll basiert auf einem experimentellen Design, bei dem 10 Mäuse werden mit 10 7 CAR T-Zellen, die jeweils behandelt wurden. Das bedeutet, dass 10 8 CAR T-Zellen benötigt werden; die Ausbeute sollte von 5 x 10 -1 7 x 10 8 bis Konto für den Verlust der Lebensfähigkeit überschätzt werden. Das folgende Protokoll wird so skaliert, etwa 200 x 10 6 Zellen zu erzeugen. Die Zellen werden dann intravenös an weibliche C57BL / 6 Mäuse mit 9 Tage etabliert syngenen EGFRvIII-positiven intrakraniellen Tumoren verabreicht wird, von der bestehenden KR158B Astrozytom oder B16 Melanomzelllinien entwickelt. Gleichzeitig mit CAR T-Zell-Generation, sind tumortragenden Mäusen verabreicht klinisch relevanten Dosen von lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) und WBI (16,5 Gy).

Die Mäuse wurden gepflegt und unter pathogenfreien Bedingungen an der Duke University Medical Center (DUMC) gezüchtet. Alle Tierversuche wurden nach Protokollen von der Duke University Institution genehmigt durchgeführtal Animal Care und Verwenden Committee (IACUC).

1. Verabreichung von Temozolomid zur Tumor-tragenden Mäusen

Den Tagen 0 bis 4:

  1. Berechnen der Gesamtanzahl von Mäusen injiziert werden und sich vermehren, indem 0,5, um das Volumen benötigt werden (zum Beispiel 30 x Mäusen 0,5 ml = 15 ml TMZ) TMZ Lösung zu bestimmen, und 1,5 ml dieses Bandes um Spillover (16,5 ml TMZ Konto ).
  2. Multipliziert man diese Gesamtmenge von 3 mg / ml, um das Gewicht des lyophilisierten TMZ erforderlich zu bestimmen (beispielsweise 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Wiegen diese in ein konisches 50 ml.
    ACHTUNG: TMZ ist durch Einatmen, Verschlucken und Berührung mit den Augen, Haut und Schleimhäute giftig. Beraten Sie sich mit Arbeitssicherheit Institution und / oder Umwelt, Gesundheit und Wellness-Abteilung für Empfehlungen zur Verringerung des Risikos der Exposition.
  3. Multiplizieren das Gesamtvolumen von 0,15, das Volumen an Dimethylsulfoxid zu bestimmen (DMSO) benötigt wird (beispielsweise 16,5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter sterilisieren Volumen DMSO (plus eine zusätzliche 2 ml für Greifen ausmachen) durch ein 0,2 um-Filter in ein steriles Röhrchen. Fügen 2,475 ml sterilem DMSO zu der TMZ-Pulver.
  4. Legen Sie die TMZ / DMSO-Lösung in einen Becher Wasser über einer Heizplatte bei 65 ° C für 10-15 Minuten. Sobald TMZ vollständig aufgelöst ist, sollte die Lösung leicht gelb gefärbt werden; Wenn sich die Lösung rosa, dann wird die TMZ abgebaut und eine neue Lösung sollte mit einer frischen Menge TMZ hergestellt werden.
  5. Berechnen des geeigneten Volumens von steriler Kochsalzlösung durch Multiplizieren 0,85 durch das Gesamtvolumen (0,85 x 16.5 ml = 14,025 ml Salzlösung) benötigt. 15 ml sterile Kochsalzlösung in einem 50 ml konischen. Während TMZ Auflösen in DMSO, Wärmekochsalzlösung auf 65 ° C.
  6. Vortex die TMZ / DMSO-Lösung, um sicherzustellen, dass die TMZ Pulver vollständig gelöst und langsam erwärmt Salz zum TMZ / DMSO-Lösung.
  7. Unmittelbar nach der Herstellung, 15 x 1 ml Tuberkulin syring voll ladenes mit TMZ-Lösung für die Verabreichung an 4 Tage etabliert tumortragenden Mäusen.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang an den Tagen 1 bis 4 für insgesamt fünf TMZ Verwaltungen.

2. Ganzhirnbestrahlung von tumortragenden Mäusen

Den Tagen 2 bis 4:

  1. Schalten Sie das Röntgenbestrahlungsgerät und lassen Sie ihn warmlaufen, um die volle Spannung. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter in Kraft ist und Eingabe der richtigen Spannung und die aktuellen Einstellungen (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Die Dosimetrie des Bestrahlungs sollte im voraus erwiesen, um den entsprechenden Spannungseinstellungen und Grid-Layout (2A, B) zu bestimmen.
  2. Berechnen der Zeitdauer, die notwendig ist, um in 5,5 Gy Röntgenstrahlung führen. Wenn beispielsweise Röntgenstrahlen werden mit einer Rate von 2 Gy / min geliefert, dann 2,75 min notwendig, um insgesamt 5,5 Gy liefern. Geben Sie die entsprechenden Zeitdauer.
    HINWEIS: In Tabelle 2 sind Maus WBI dosiert einnd ihre klinische Mittel beim Menschen. Im Zusammenhang mit der hochgradigen Gliomen, 60 Gy fraktioniert WBI (2 Gy Fraktionen, 5 Tage / Woche für 6 Wochen) ist die klinische Pflegestandard und die murine Äquivalent verwendet hier 16,5 Gy (5,5 Gy × 3).
  3. Eine frische Lösung von Ketamin / Xylazin zur systemischen Anästhesie durch Zugabe von 2 ml Ketamin und 1 ml Xylazin und 17 ml Kochsalzlösung, so daß die endgültige Lösung 10 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin.
  4. Wiegen Mäusen und verwalten 10 ul Ketamin / Xylazin intraperitoneal pro Gramm Körpergewicht, daß die Tiere eine Dosis von Ketamin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg Xylazin empfangen. Mäuse sollten in vollem Umfang sediert werden und sichtbar innerhalb von 2 Minuten von Ketamin / Xylazin Verwaltung atmen.
  5. Um Augen Feuchtigkeit in sedierten Tieren zu erhalten, reiben Sie eine kleine Menge von künstlichen Tränen Salbe auf jedes Auge.
  6. Platzieren sediert Mäuse auf dem Gitter, so dass Köpfe werden in dem Gebiet, das die höchste Röntgen in empfängt positioniertIntensität (Abbildung 2B, C). Schild Körper vom Hals abwärts mit geeigneter Größe Bleirohr, um systemische Röntgen Lieferung (2D) zu blockieren.
  7. Platzieren positioniert Mäusen unter dem Röntgenstrahl, so dass die Laser bezeichnet den Brennpunkt des Röntgenstrahls an der Koordinate (0,0) auf dem Gitter-Layout. Beginnen Röntgen Lieferung.
  8. Wenn Röntgen Lieferung abgeschlossen ist, entfernen Tiere aus dem Bestrahlungsgerät und auf ein warmes Heizkissen. Sedierten Tieren mit wachen Tieren beherbergen Sie nicht, bis Tiere ausreichend wieder zu sich kam, um Brustbein recumbence halten. Wenn Tiere Brustbein recumbence halten, legen Sie wachen Tieren zurück in ihre entsprechenden Käfigen.
  9. Wiederholen Sie diese Prozedur an den Tagen 3 und 4 für insgesamt drei fraktionierten Dosen von Strahlung.

3. Transfektion

Tag -1:

  1. Bereiten D10 Medium durch Zugabe von 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 500 ml von Dulbeccos Modified Eagle-Medium (DMEM).
  2. Bereiten T Zellmedien (TCM) durch Zugabe 5,5 ml L-Glutamin, 5,5 ml Natriumpyruvat, 5,5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, und 5,5 ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) zu 500 ml RPMI-1640-Medium. Als Nächstes fügen 550 ul 2-Mercaptoethanol und 550 & mgr; l Gentamycin. Schließlich, fügen Sie 50 ml FBS.
  3. Ernte in vitro kultivierten HEK293T Zellen und bringen auf eine Konzentration von 7,5 x 10 6 Zellen / ml in D10 Medien.
  4. Platte 10 ml D10 Medien und 1 ml HEK293T-Zellsuspension in jede der 16 x 10 cm mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Platten.
  5. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2.

Tag 0:

  1. Tauschen Sie Medien mit 10 ml frischem D10 mindestens 30 Minuten vor Transfektion von Zellen.
  2. Bestimmung der Menge an Vektor-Plasmid pCL-Eco Vektor und liposomalen Transfektionsreagenz zur Transfektion erforderlich durch Multiplizieren der Gesamtzahl der Platten + 1 (16 + 1 = 17) von 14,1 & mgr;Vektorplasmid (14,1 x 17 = 239,7 & mgr; g) 9,9 & mgr; g pCL-Eco-Vektor (9,9 x 17 = 168,3 & mgr; g), und 60 ul liposomalen Transfektionsreagenz (60 x 17 = 1.020 & mgr; l). Alle Reagenzien werden bei Raumtemperatur vor der Herstellung von Lösungen sein.
  3. Beschriften Sie zwei Röhren A und B Rohr A, fügen 239,7 ug Vektorplasmid und 168,3 & mgr; g pCL-Eco Vektor (1,5 x 17) ml reduziert Serum modifiziertem Eagle-Medium (RS-MEM). In Rohr B, fügen Sie 1020 ul liposomalen Transfektionsreagenz auf (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Inkubieren A und B getrennt für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Mischen Sie A und B zusammen sanft (Vortex für 1-2 sec oder Invertzucker mehrmals) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur, um Lipid / DNA-Komplex zu bilden.
  6. Fügen Lipid / DNA-Komplex tropfenweise zu HEK293T-Zellen in 10-cm-Schale.
  7. Bei 37 ° C für 6-8 h oder über Nacht (24 h nicht überschreiten).
  8. Nach 6-8 h Inkubation ersetzen Medium mit 12 ml frischem TCM für die Virusproduktion. Diese vernickelt Medienwird an Tag 2 als viraler Überstand für T-Zell-Transduktion verwendet werden.

4. Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung

Tag 0:

  1. Gießen Sie 10 ml der TCM in einen 50-ml-Erlen und auf Eis für Milz Sammlung.
  2. Opfern Sie die entsprechende Anzahl der Tiere mit CO 2 Ersticken und Sekundär Enthauptung: Platz Tiere in einem Käfig Erhalt CO 2 mit einer Flussrate von 10-30% Käfigvolumen / Minute, je American Veterinary Medical Association Richtlinien (nicht mehr als 5 Tiere können sein geopfert gleichzeitig), bis die Atmung beendet und danach für zwei Minuten. Tiere entfernen aus dem CO 2 Kammer und enthaupten.
    HINWEIS: Eine Milz einer 6-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6-Maus wird etwa 4,5-5 x 10 7 Splenozyten ergeben. Dabei wird 4 Milzen etwa 200 x 10 6 Zellen geerntet werden.
  3. Legen Sie die Maus, so dass die rechte Seite nach oben zeigt, undSpray mit 70% Ethanol. Mit der Zange, schnappen Sie sich einen dünnen Hautfalte unterhalb der linken Brustkorb und schnitt einen leichten Schnitt mit der Schere. Ziehen Sie die Haut vorsichtig packen eine dünne Falte des Bauchfells mit einer Pinzette und schneiden Sie einen kleinen Hohlraum.
  4. Die Milz ist eine kleine, längliche, dunkelrote Organ, das einen abgeflachten Bohne ähnelt; zart greifen die Milz mit der Zange und Verbrauch durch Wegschneiden des umgebenden Bindegewebes. Platzieren Sie die Milzen herausgeschnitten, in den konischen, die 10 ml TCM auf Eis.
  5. Gießen Milzen über einem 70 um Sieb Zellsieb und disaggregieren durch Maischen mit dem stumpfen Ende der in einen 5-ml-Spritze, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Es können maximal zwei Milzen sollte pro Mesh Sieb aufgeschlüsselt werden.
  6. Mit einem kleinen Volumen von TCM sorgfältig waschen Sie das Sieb nach Disaggregation, um alle verbleibenden Splenozyten zu sammeln. Pool alle aufgeschlüsselte Milz in eine Einzelzellsuspension. Endvolumen auf 50 ml mit TCM für einen Wasch einerd bei 300 g für 10 Minuten zu drehen.
  7. Es wird eine Lösung aus 1x Lysepuffer durch Zugabe von 5 ml 10x Lysepuffer 45 ml sterilem Wasser. Um den roten Blutkörperchen, Pellet in 5 ml 1x Lysepuffer pro Milz in einem 50 ml konischen gut mischen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren beseitigen. Wenn mehr als 5 Milz, mit einem 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Platzieren konischen oder Zentrifugenröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min.
  8. Entfernen Sie die Lyse-Reaktion aus dem Wasserbad und fügen TCM bei einem 1: 1-Verhältnis mit Lysepuffer, um die Reaktion zu neutralisieren. Durch Spinnen bei 300 g für 10 Minuten waschen.
  9. Überstand entfernen und voll Pellet in TCM (2 ml / Milz, 8 ml insgesamt 4 Milz), die durch Auf- und Abpipettieren.
  10. Zählen von Zellen durch Zugabe von 10 & mgr; l der Zellsuspension in 190 ul Trypanblau (1:20 Verdünnung). Multiplizieren die in einer der vier Gitterquadrate von 20 x 10 4 x Gesamtvolumen (8 ml) erhaltenen Zahl, um die Gesamtzellzahl zu erhalten (beispielsweise 125 Zellen x 20 x 10 4 6 Milzzellen).
  11. Verdünnte Zellen auf eine Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml in TCM mit 2 ug / ml Concanavalin A (ConA) und 50 IU / ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2) ergänzt wird. So ist 200 x 10 6 Milzzellen, fügen Sie 92 ml Medium bis 8 ml Zellen, 200 ug ConA und 5.000 IE rhIL-2.
  12. 2 ml Zellen zu jeder Vertiefung der 24-Well-Gewebekultur-behandelten Platten, derart, daß 4 x 10 6 Zellen werden in jede Vertiefung (beispielsweise 100 ml der Zellen werden etwa 4 Platten erfordern).
  13. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2.

5. Transduction

1. Tag:

  1. Berechnen Sie die Anzahl der Nicht-Gewebekultur-behandelten 24-Well-Platten für die Weiterleitung benötigt, indem die Anzahl der Milz von 2 geerntet (8 Platten werden 4 Milz erforderlich) zur Verfügung.
  2. Als nächstes berechnen die benötigte Menge von rekombinantem Human-Fibronektin-Fragment (RHFF) Lösungzu beschichten Platten durch Multiplikation notwendig (Gesamtzahl der Vertiefungen + 3) x 0,5 ml (8 Platten x 24 Wells = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Bereiten 97,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend RHFF bei einer Konzentration von 25 ug / ml durch Multiplizieren der Gesamtmenge mit 25 & mgr; g (97,5 x 25 = 2437,5 & mgr; g). Fügen Sie diese Menge an RHFF auf 97,5 ml PBS.
  4. Coat Nichtgewebekultur behandelten 24-Well-Platten durch Zugabe von 0,5 ml PBS / RHFF Lösung pro Well.
  5. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.

Tag 2:

  1. Dump PBS / RHFF Lösung aus nicht-Gewebekultur-behandelte Platten mit 24 Vertiefungen.
  2. 1 ml / Vertiefung 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
  3. Entfernen BSA durch festes umstülpend Platte. Durch Zugabe von 2 ml PBS waschen.
  4. Sammeln viralen Überstand durch Übertragen von Medien voneinander HEK293T PDL Platte in ein 250 ml-Zentrifugenröhrchen und Spin 10 min bei 500 x g.
  5. Sorgfältig übertragen Virus supernatant in eine frische 250 ml Zentrifugenröhrchen, wobei Sie nicht auf das Zellpellet sich gebildet haben können stören.
  6. Frisches TCM dem viralen Überstand, so dass das Endvolumen von 3 ml über dem für RHFF beschichteten Vertiefungen benötigten Menge. Beispielsweise wird für 192 RHFF beschichteten Vertiefungen, bringe das Volumen der Virusüberstand zu 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Entfernen kultivierten Splenozyten aus dem Inkubator und Resuspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 2-3 mal in jede Vertiefung. In einen 250-ml-Erlen. Bei Verwendung einer Mehrkanalpipette, mit einem sterilen Behälter vor der Übertragung wird Ihnen helfen, diesen Schritt zu beschleunigen. Zählen Sie, wie oben beschrieben und Spin bei 300 g für 10 min.
  8. Hinzufügen rhIL-2 auf virale Überstand in einer Konzentration von 50 IU / ml. Fügen Sie beispielsweise 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml Virusüberstand.
  9. Resuspendieren Splenozyten in viralen Überstand bei 1 x 10 6 Zellen / ml
  10. 1 ml / Vertiefung von Splenozyten Suspension RHFF beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen.
  11. Spin für 90 min nach der folgenden Einstellungen: 770 xg, Beschleunigung = 4, Brems- / Verzögerung = 0, 32 ° C.
  12. Bereiten Sie eine TCM-Lösung mit 50 IU / ml rhIL-2. So bereiten Sie eine 200 TCM-Lösung durch Zugabe von 10.000 IE rhIL-2. 1 ml rhIL-2 / TCM jeder Vertiefung nach dem Zentrifugieren.
  13. Kultur über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2.

6. CAR T-Zell-Kultur und Ernte

Tag 3 und 4:

  1. Wenn T-Zellen zu erreichen> 80% Zusammenfluss können Zellen aufgeteilt werden (in diesem Fall in der Regel am Tag 3 oder Tag 4). So teilen Zellen vorsichtig pipettieren oben und unten in jeder Vertiefung 2-3 mal, und bewegen Sie 1 ml aus jeder Vertiefung in neue Vertiefungen einer frischen 24-Well-Gewebekulturplatte behandelt. Dann fügen Sie 1 ml frischem TCM mit 50 IU / ml IL-2 in jede Vertiefung, so dass endgültige Volumen ist 2 ml in alle Vertiefungen.
  2. Wenn Zellen nicht> 80% Konfluenz erreichen, führen Sie eine halbe Medienwechsel durch langsames Abpipettieren 1 ml Medium von der Spitze der jede Vertiefung. D vermeidenisturbing Zellen ließ sich auf den Boden, während der Beseitigung von Papier. 1 ml frischem TCM, enthaltend 50 IU / ml rhIL-2.

Tag 5:

  1. Resuspendieren CAR T-Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 3 mal in jede Vertiefung und in ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen. Spin-Zellen bei 300 g für 10 min.
  2. Komplett absaugen Überstand ohne störende Pellet. Einmal mit PBS zu waschen, zu zählen Zellen, wie zuvor beschrieben, und waschen mit PBS ein zweites Mal. Ein typisches CAR T-Zell-Ausbeute beträgt ca. 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung (8 x 24 Wells Platten = 192 x 10 6 CAR T-Zellen).
  3. Zellen in PBS bei einer Konzentration von 5 x 10 7 / ml für eine Injektion von 1 × 10 7 in einem Volumen von 200 & mgr; g (zB für 192 x 10 6 CAR T Zellen gewaschen Pellet in 3,84 ml PBS).

7. CAR T-Zell-Administration, um tumortragenden Mäusen

Tag 5:

  1. Transport Zellen auf Eis zu Tierhaltung zur intravenösen Injektion. Last 500-1000 ul in Insulinspritze mit 27 bis 31 G-Nadel, um sicherzustellen, dass alle Blasen ausgestoßen werden.
  2. Schnappen Sie sich eine Maus an der Basis des Schwanzes und setzen in Rohrrainer.
  3. Ziehen Sie den Schwanz mit der Vene nach oben gespannt, und gleiten Sie die Nadel etwa 1-2 mm unter die Haut in die Vene, indem Sie ihn in die Schwanzvene parallel. Langsam vertreiben 200 ul in die Vene. Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt, wird die Lautstärke leicht fließen in; sonst wird es Widerstand und die Nadel benötigt, um von dem Schwanz entnommen und vollständig wieder eingesetzt.

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Representative Results

CAR T-Zellen durch Transduktion mit dem EGFRvIII CAR retroviralen Vektor 11 erzeugt. Dieser Vektor, MSGV1 wurde vom SFGtcLuc_ITE4 Vektor 35, der die murine Stammzellen Virus (MSCV) langen terminalen Wiederholungen, die verlängerte gag-Region und Umschlag-Spleißstelle enthält entwickelt (Spleißdonorstelle, sd, und Spleißakzeptor, sa), und virale Verpackungssignal (ψ). Die EGFRvIII CAR enthaltend die humane anti-EGFRvIII scFv-Fragment (scFv) 139, zusammen mit murinem CD8TM, CD28, 4-1BB und CD3 & zgr intrazellulärem Regionen wurde in den retroviralen Vektor stromabwärts von der NcoI-Stelle kloniert (Figur 3) .

Nach Weiterleitung kann CAR T-Zellen quantifiziert und durch Strömungs phänotypisiert Zytometrie werden. EGFRvIII CAR-T-Zellen in einem 2-Farbtafel eines Streptavidin-Phycoerythrin enthalten (SA / PE) visualisiert werden -konjugiertem biotynlated EGFRvIII abgeleiteten Multimer und anti-CD3-FITC. Mit Hilfe der Kultur und Transduktion prothier beschriebenen ocols wir routinemßig beobachten CAR Expression unter 55-70% des murinen Splenocyten (4A) 11. Alternativ kann CAR für die Expression unter Verwendung von Ziege-anti-Mensch-F (ab ') angefärbt werden 2-Biotin primären und SA / PE sekundären Antikörpern, die bereits zuvor beschrieben 36. CAR T-Zellen kann durch die Zugabe von anderen fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen das Zwei-Farben-Auto-Panel phänotypisiert werden. B. Färbung für CD8 und CD4 zeigt, dass 70% der transduzierten Autos sind CD8 + T-Zellen, während 20% CD4 + T-Zellen (4B). CAR-T-Zellen mit diesem Expressionsprofil haben gezeigt, leicht Verkehr zum Gehirn und zu behandeln intrakraniellen Tumoren wurden.

Tabelle 1:. Temozolomid Dosis bezogen auf Tiergewicht Temozolomid Dosen wurden auf der Basis einer Gesamtdosis von 60 mg / kg berechnet.

Körpergewicht Volumen
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
D d # Brüche BED SOC
16,5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52,5 LGA
12 3 4 30 Erfüllt
16 2 8 32 Erfüllt

Tabelle 2:. Klinisch relevante biologisch äquivalente Strahlungsdosen Strahlendosen wurden gemß BED berechnet = D [1 + d / (α / β)], wobei D = Gesamtdosis, d = fraktionierte Dosis und α / β = 2). Die Gesamtdosis als WBI verabreicht, um die Mäuse-Host ist in Bezug auf tsde geliefert fraktionierten Dosen und die Dosis für den Menschen, die von diesen Dosisanteile modelliert wird. Für das Modellzwecken wird die Bösartigkeit, für die das Bett ist Standard der Versorgung ebenfalls angezeigt.

Figur 1
Fig. 1: Zeitachse für die Behandlung von tumortragenden Mäusen und gleichzeitig ex vivo CAR Generation Standard-Therapie Chemotherapie und Ganzhirnbestrahlung beginnt 4 Tage nach der Tumorimplantation (A). Während dieses Zeitintervalls werden CAR T-Zellen generiert und ex vivo kultiviert (B) und nach einer vollen Kurs der Hostanlage geliefert.

Abbildung 2
Abbildung 2: Layout und die Einstellungen für Strahlung Lieferung.Röntgenstrahlen gemäß einem der Dosimetrie von 320 kV und 10 mA geliefert wird, mit einer variablen Länge entsprechend der gewünschten Dosis (A) ausgewählt. Die Brenn Bereich der Röntgenstrahlung ist eine schmale 2,5 cm-Bereich. Sedierten Tieren werden nach der Raster (B), so daß die Köpfe liegen, in dem Bereich der höchsten Intensität der Röntgenstrahlung angeordnet ist, (C) zeigt die Ansicht von einem Ende des Röntgenstrahls. Etwa 4 Tiere können unter der Strahler bei einem Kurs von Röntgen Verwaltung nach diesem Raster-Layout (F, A) ist. Leitungsrohr verwendet wird, um den Körper zu schützen, so dass nur die Köpfe für WBI (D) ausgesetzt wird.

Figur 3
Abbildung 3: Die modifizierte SFGtcLuc_ITE4 retroviraler Vektor, MSGV1 wurde zur Transduktion und Erzeugung von CAR T-Zellen verwendet, die.EGFRvIII CAR-Einsatz, der das humane Anti EGFRvIII single chain variable Fragment (scFv) 139, im Tandem mit murinen CD8TM, CD28, 4-1BB und CD3 & zgr; intrazellulären Regionen von Maus-Stammzell-Virus (MSCV) Long Terminal Repeats flankiert (LTR ). Stromaufwärts des CAR Einsatz sind die erweiterten gag-Region und Umschlag Spleißstelle (Splice-Donor, sd, und Spleißakzeptor, sa), und das virale Verpackungssignal (ψ).

4
Abbildung 4: EGFRvIII Autos werden auf der Oberfläche der T-Zellen exprimiert wird 48 h nach einer Transduktion wurden die T-Zellen für die Oberflächenexpression von EGFRvIII Autos unter Verwendung eines Multimer LEEKKGNYVVTDHC-K (Biotin) -NH2 / Streptavidin-PE zusammensetzt gefärbt.. Transduzierten T-Zellen vom selben Spender wurden als Negativkontrolle angefärbt. Die Daten zeigen die Anzahl der CAR T-Zellen (y-Achse) positiv für staining vom PE-konjugierten EGFRvIII Multimer (x-Achse), auf CD3 + Zellen gated als T-Zell-Marker, wobei die Expression wurde zu 60,9% (A) sein. CAR T-Zellen für die CD4-PerCP-Cy5.5 und CD8-APC gefärbt zeigen ein Expressionsprofil von 21,7% und 70,9%, bzw. (B).

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Discussion

Die hier beschriebene Behandlung Timeline wurde konzipiert, um die klinische Behandlungsstandard modellieren und zu nutzen, ihre Auswirkungen für CAR Adoptiv Therapie. CAR T Zelldosen, TMZ Schemata und Strahlentherapie Verabreichung kann verändert werden, um in vivo T-Zell-Aktivität, lymphodepletion und Tumortötung zu erhöhen. TMZ Regimen erhöht werden, um Host Myeloablation und verstärkten Ausbau adoptiv transferierten Zellen 30 zu ergeben. Außerdem können die Auswirkungen der lymphodepletive TMZ durch niedrig dosierte rekapituliert werden (4-6 Gy) Single-Bruchganzkörperbestrahlung (TBI) und damit Umgehung der tumorzerstörenden Eigenschaften SOC. Die Strahlung Regime hier angewendet imitiert eine biologisch äquivalente Dosis von 60 Gy; jedoch kann die Anzahl der Fraktionen und fraktionierte Dosen eingestellt werden, um andere klinische Dosis (Tabelle 2) nachzuahmen. Wichtig ist, dass unser Modell der SOC nutzt biologisch äquivalenten Dosis von WBI, anstatt externe Strahlentherapie auf den Tumor und ma geliefert fokalrgins, wie es oft in der Klinik verwendet wird, und kann somit zu einem geringeren Dosis an den Tumor abgegeben Strahlung und einem erhöhten Risiko von Toxizitäten zu gesunden Gehirn der Maus führt. Trotz dieser Einschränkungen ist jedoch WBI eine anerkannte Technik zur Modellierung der klinischen Radiotherapie in einem präklinischen Einstellung.

CAR T-Zell-Dosis kann erhöht oder verringert, um die Dosis Auswirkungen auf Tumor Töten und das Gesamtüberleben 11 zu beobachten. Zusätzlich kann das Timing der Behandlung und Verabreichungsweg verändert werden, um Unterschiede in der Wirksamkeit zu sehen. Zum Beispiel können CAR T-Zellen intrakraniell geliefert werden, um die Aktivität am Ort des Tumors zu gewährleisten. Die Ausbeute an CAR-positive T-Zellen kann in Abhängigkeit von der Effizienz der Transduktion variieren. Ein Weg zur Gewährleistung einer erfolgreichen Transduktion indem ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -Steuerung während der Prozedur. Zu diesem Zweck kann ein HEK293T 10 cm PDL Platte für GFP Transfektion und Transduktion von einem einzigen und von T-Zellen, um Geröll zugeteiltn für GFP an den Tagen 3-5. Ein kritischer Faktor bei der Transduktionseffizienz ist das Ausmaß der T-Zellaktivierung und Proliferation durch Zugabe von Virusüberstand. Wir stellen fest, einen wichtigen Unterschied zwischen unserer Methode der T-Zell-Aktivierung, die durch die Zugabe von ConA zu dem Kulturmedium erreicht wird, und daß in der klinischen Umgebung durch CD3- und CD28-Agonist monoklonalen Antikörpern erreicht verwendet. Obwohl letzteres wird routinemäßig zur Erzeugung von Patienten retroviral transduzierten CAR T-Zellen verwendet und hat sich auch in Transduktion von Maus-T-Zellen erfolgreich, wir vorher festgestellt, dass ConA Stimulation führte zu besseren und konsequenteren Transduktionen 37. Wir haben auch festgestellt, dass insgesamt CAR T-Zell-Ausbeute auf, wenn der Schritt 5.18 wird durchgeführt, variieren. Wenn Sie schlechte CAR T Zellausbeute empfehlen wir die Ausführung von Schritt 5.18 unmittelbar nach Schritt 5.17 anstatt zu warten, für die 5-6 h Inkubation. Obwohl dies die Effizienz der Transduktion auswirken, haben wir nicht signifikant dif beobachtetKonferenzen in CAR Oberflächenexpression in unseren Studien.

Nach Weiterleitung kann CAR T-Zellen quantifiziert und mittels Durchflusszytometrie phänotypisiert werden; wir Fleck unserer EGFRvIII CAR T-Zellen mit einem 2-Farbtafel eines Streptavidin-Phycoerythrin enthalten (SA / PE) -konjugiertem biotynlated EGFRvIII abgeleiteten Multimer und anti-CD3. Alternativ kann CAR für die Expression unter Verwendung von Ziege-anti-Mensch-F (ab ') angefärbt werden 2-Biotin primären und SA / PE sekundären Antikörpern, die bereits zuvor beschrieben 36. Wir routinemäßig beobachten CAR Ausdruck zu 55-70% der murinen Splenozyten 11. Wir haben bereits gezeigt, dass die Lieferung von T-Zellen mit dieser CAR-Expressionsprofil kann leicht Verkehr an das Gehirn und Behandlung von Tumoren. TMZ- oder TBI-induzierte Lymphopenie verbessert klonalen Expansion adoptiv übertragenen Zellen und erhöht die Frequenz des CAR-positiven Zellen und deren Gesamtantitumor-Antwort. CAR T-Zellen in vivo durch Färbung peripheren Blut mit dem ein verfolgt werdenppropriate Tetramer; Dies ist eine nützliche Technik für das Verständnis CAR T-Zell-Überlebensrate im Laufe der Zeit und die Auswirkungen der Hostanlage auf CAR T-Zell-Funktion und Ausdauer. Alternativ, wenn keine Tetramer ist für die Antigenrezeptor zur Verfügung, ein fluoreszierendes Reporter kann im CAR Vektorkonstrukt enthalten sein oder CAR T-Zellen können beschriftet werden ex vivo mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) vor der Verabreichung für die in vivo-Tracking.

In Abhängigkeit von der Tumormodell, Immuntherapieplattform und SOC-Regime kann klinische SOC neben Adoptivtherapie oder Impfstoffe verabreicht, um Toxizitäten führen. TMZ ist ein DNA-Alkylierungsmittel, die unspezifische Zellabtötung führt, und intensiviert Dosen können in Gewichtsverlust und die Morbidität in murine Wirten führen. Hochdosierte und längere Bruchteile von WBI in Hydrocephalus führen. Darüber hinaus können entzündungshemmende Wirkung von starken Impfstoff und / oder adoptiv transferierter T-Zellreaktionen zu Morbidität aufgrund führentoxischen Zytokin Stürmen. Es ist auch wichtig, die Effekte der systemischen Narkose auf krankhafte Tiere. Wenn TMZ und WBI signifikante Toxizitäten führen, dann Ketamin / Xylazin Dosen von 20-25% (verringerte sich das Risiko der Sterblichkeit zu reduzieren, wie die Tiere müssen nur sediert und 10 Minuten für die Lieferung von kleinen Strahlendosen immobilisiert werden 2- 8 Gy).

Host Anlage ist von entscheidender Bedeutung für alle Plattformen, die Immuntherapie adoptiven Transfer umfassen. Immuntherapie Versuche werden oft im Rahmen von SOC ausgewertet sollte präklinische Bewertung von Immuntherapien in dieser Einstellung durchgeführt, um die klinische Szenario rekapituliert werden. Wir stellen Ihnen hier ein Beispiel für die Nutzung der lymphodepletive und tumoriziden Wirkung von SOC mit Adoptiv Therapie mit CAR T-Zellen. Dieses Regime ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um andere Immuntherapie Plattformen angewendet werden, um die Wirkungen einer kombinierten SOC auszuwerten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

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References

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