Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), taşıyıcıların Kaset (ABC) süper ailesinin ATP bağlayıcı bir benzersiz bir kanal oluşturan bir üyesidir. CFTR fosforilasyon ve nükleotid bağlı klorür kanal etkinliği sık bütün hücre sistemleri ve kesilen membran yamalar tek kanal olarak incelenmiştir. Birçok Kistik Fibroz-neden olan mutasyonlar bu aktiviteyi değiştirmek için gösterilmiştir. Arıtma protokolleri az sayıda yayınlanmış olsa da, kanal aktivitesini muhafaza eden bir hızlı yeniden oluşturma yöntemi ve saflaştırılmış bir sistem içinde nüfus kanalı etkinliğini incelemek için uygun bir yöntem, eksik edilmiştir. Burada hızlı yöntemler düzenlenmiş bir halid kanalı olarak etkinliğini muhafaza eden, lipid tanımlanan bileşimin proteoliposomes haline getirilerek, ve tam uzunluktaki CFTR proteininin işlevsel olarak yeniden tarif edilmiştir. Birlikte kanal aktivitesi olan yeni bir akı bazlı deneyde Bu yeniden oluşturma yöntemi için uygun bir sistemdirvahşi tip CFTR nüfus kanal özelliklerini ve hastalık yapıcı mutantlar F508del- ve G551D-CFTR okuyan. Özel olarak, yöntem, fosforilasyon, nükleotidler ve bu tür CFTR kanal aktivitesi üzerindeki kuvvetlendirici ve inhibitörleri olarak küçük moleküllerin doğrudan etkilerinin araştırılması yararlıdır. yöntem aynı zamanda, anyonik maddeler için başka membran kanal / taşıyıcıların çalışma için uygun.

Introduction

Akciğer, bağırsak, pankreas ve ter bezleri gibi dokularda epitel hücrelerinin apikal membranlar arasında Klorür taşıma öncelikle ABC Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR), bir ATP ve fosforilasyon-regüle üyesi (ATP aracılık 1 gözden membran proteinlerinin Kaset) C alt ailesini () Bağlayıcı. ABCC alt ailesinin diğer üyeleri gibi CFTR nükleotid-bağlayıcı etki tek mütevazı ATPaz aktivitesine sahip (NBDs), ara yüzünde oluşan iki nükleotid bağlama sahalarında ATP bağlanan bir geniş, çok geçişli bir integral membran proteinidir sitesi. Ancak, diğer ABCC alt familyası üyeleri aksine, CFTR eşsiz düzenlenmiş Cl kanalı olarak yerine aktif bir çözünen taşıyıcı olarak gelişmiştir.

Morbi giden CFTR neden Kistik Fibrozis, akciğerler, gastrointestinal sistem, pankreas ve üreme yolu da dahil olmak üzere birçok organı etkileyen bir hastalık mutasyonlar,Genç erişkinlerde dity ve ölüm. Akciğer hastalığı, genellikle iletken solunum yollarının yüzey epiteli üzerine CFTR fonksiyon kaybı neden olur Kistik Fibrozis erken mortalite ve çoğu durumda hesapları. siliyalı solunum epiteli apikal yüzeyinde sıvı tabakası değiştirmek için yüzey epiteli boyunca ve su hareketi - CFTR klorür kanal aktivitesinin eksikliği hem Cl azalmaya neden olur. Bu kirpikli solunum epitel hücrelerinin yeteneğini bozar viskoz havayolu yüzey sıvı sonuçlanır hava yollarının dışında etkin bir açık patojenler için. Sonuç olarak, çoğu CF hasta akciğer enfeksiyonu ve iltihabı nedeniyle akciğer hasarı atakları muzdarip.

Beklendiği gibi, normal bir CFTR proteininin etki mekanizmasının çalışmaları öncelikle kanal yolluk aktivitesinin detaylı elektrofizyolojik çalışmalar üzerinde duruldu. Tek kanallı çalışmalar bir pKa bağımlı Cl gibi doğrudan bu CFTR fonksiyonlarını göstermişlerdir- ATP düzenlenmiş kapısı 2 sahiptir kanalı. Çalışılmıştır herhangi bir tek bir kanal özellikleri dolayısıyla tüm CFTR kanallarının nüfus ve tek kanal yansıtıcı olup olmadığı detaylı elektrofizyolojik çalışmalar tek CFTR kanalları 1,3 bilgilerin büyük bir sağlamak, ancak endişe olabilir Sonuçlar her zaman makroskobik nüfusu çalışma yöntemleri ile birlikte düşünülmelidir. Saflaştınldı CFTR nüfus kanal aktivitesinin doğrudan tahlil hastalığa neden olan mutasyonlar ile bağlantılı moleküler bozukluğun ilişkin bilgi sağlar ve kimyasal modülatörleri tamir mutan CFTR proteini keşfini potansiyeline sahiptir. Bugüne kadar, Kistik Fibrozis 4 neden olduğu düşünülmektedir CFTR 1.900 farklı mutasyonlar aşan vardır. Kuzey Amerika ve Avrupa'da hastaların yaklaşık% 90'ında en az bir alleli bulunan büyük mutasyon, F508del-CFTR, protein hatalı katlanması yol açarendoplazmik retikulum 5 nci tutma. F508del-CFTR da arızalı kanal faaliyeti 6-9 dahil olmak üzere diğer sonuçları vardır. hücre yüzeyinden CFTR elde edilen olmaması şiddetli hastalık ile ilişkilidir. G551D-CFTR, daha az yaygın mutasyon, düzgün henüz katlanmış hücre yüzeyinde 6 bir klorür kanalı olarak işlevsiz olduğunu düşünülmektedir. küçük molekül düzelticisi ve güçlendiricileri gelişimi sırasıyla hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan bir katlama ve / veya hücre yüzeyine F508del-CFTR gibi mutantların kaçakçılığı ve güçlendirici düzeltilmesi veya bu gibi G551D mutasyonların kanal aktivitesini arttırma amacı vardır . 150 mg KF hastalarında> 6 yıl en az bir G551D ile her 12 saatte de kullanılan, VX-770); düzelticiler, VX-809 ve VX-661 (henüz hastalarda kullanımı, güçlendiricisi Kalydeco (ivacaftor onaylanmayan da -CFTR mutasyon ve daha yakın zamanda hastalar için G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P biriyleve G1349D. Kalydeco CF hastalığının 10 klinik önlemler, bu küçük molekülün eylem Ancak mekanizması zayıf hastalarda kullanılmak üzere FDA onayı sırasında anlaşılmıştır iyileştirilmesi güvenli ve sonuçları hem de.

CFTR saflaştırma yöntemleri bir avuç önce tamamlamak için önemli bir zaman uzunluğu gerekli çoğu 2,11-18 tarif edilmiştir. Son zamanlarda yayınlanan 19, özel bir hızlı saflaştırma ve yeniden çözme yöntemi Sf 9 hücre ifade sistemi içinde aşırı ifade CFTR için tarif edilmiştir ve tanımlanan lipid sistemleri bu saflaştırılmış protein CFTR oluşan bir popülasyon için bir CFTR halojenür kanal etkinliği test geliştirmek için kullanılmıştır moleküller. Tahlil CFTR fonksiyonu fosforilasyon, nükleotidler ve inhibitörlerinin bilinen etkilerini özetler. Sistem bir potansiyatör etkilerini sorgulamak için kullanılmıştır VX-770 / Kalydeco ağırlıkça (vahşi tip), F508del- ve G551D-CFTR ve ilk için gördüilaç için bir nüfus açısından CFTR ve nükleotidler ve küçük moleküller ile mutantların etkileşimi çalışmasında bu yöntemlerin kullanımını, uygulanabilir gösteren, bir ATP-bağımsız bir şekilde, kanal aktivitesini güçlendirmek için, CFTR proteini ile doğrudan etkileşime giren bir zaman protein hakkında klinik olarak ilgili sorulara cevap. yöntemler, başka potansiyatör molekülleri ve bunların türevleri 20, hem de protein 21 aktivitesine küçük bir molekül düzeltici etkilerini incelemek için kullanılmıştır.

Efflux deneyleri daha önce elektrotlar, radyoaktif izleyiciler ve florofor 22,23 kullanılarak bütün hücre tahlilleri, iyon seçici elektrotlar 24 ile zar vezikülleri dahil olmak üzere CFTR mutantlarının aktivitesini ve etkinliği üzerindeki CFTR modülatör bileşiklerinin etkilerini araştırmak üzere pek çok çalışmada kullanılmıştır ve radyoaktif izleyiciler 25 ile yeniden CFTR saflaştırılmış. Ancak thsaflaştırılmış yeniden CFTR çalışma iyon seçici elektrotlar e kullanımı ilk geçenlerde 19 bildirilmiştir. Mevcut yöntemin bir adaptasyonu yeniden ve Pseudomonas aeruginosa, ortak bir KF patogen içinde iki membran proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılmıştır. Iyodür akış ölçümleri ile birlikte saf hale alge dış zar proteininin yeniden oluşturulması, bu taşıyıcı 26 boyunca anyonik alginat salgılama için bir model desteklemek için kullanılmıştır. Sulandırma ve iyodür akış ölçümleri, bir model bu protein 27 ile bakteri iç zarı boyunca lipit bağlantılı oligosakarit translokasyon için bir H + -bağlı antiport mekanizması ileri sürdüler izin saflaştırılmış Wzx protein uygulanmıştır. Bir yerel bir alt-tabaka için beklenebilir daha Her iki durumda da iyodür daha düşük kapasite ile de olsa, anyonik alt-tabaka için bir vekil olarak kullanılmaktadır. yöntem c başka proteinler adaptasyon için uygunanyonik yüzeyler için ationic taşıma veya iletim yolları.

Burada bir hızlı saflaştırma prosedürü CFTR proteini ve tanımlanan lipid proteoliposomes içine yeniden tarif edilmiştir. hızlı yeniden oluşturma işlemi kolayca arıtılmadan kullanılan deterjan türü burada kullanılan yöntemler ile ayrıştığı ya da rekonstitüsyon işlem öncesinde uygun bir deterjan için değiştirilebilmesi şartıyla, diğer yöntemlerle arıtılır CFTR ile kullanım için uygun hale getirilebilir. Saflaştırılmış ve yeniden CFTR proteininin kanal aktivitesinin ölçülmesi için iyodür akış yöntemi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve bu yöntem kullanılarak elde edilen bazı tipik sonuçlar sunulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CFTR 1. Saflaştırma

NOT: Bu protokolde kullanılan ekipman ve malzeme listesi için Malzeme Tablosu ve Ekipmanları bakınız. Detaylı bir protokol Sf 9-bakulovirüs sentezleme sistemi 17,28 insan Wt-CFTR aşırı ifadesi ve mutantların ihtiyaç duyulmaktadır. CFTR aşırı ifade eden ve bu protokole göre Sf'ye 9 hücreleri topaklar hazırlamak.

  1. Kaba membran hazırlanması
    1. Taze elde edilir ya da standart hücre kültür olarak elde edilen aşırı eksprese eden bir C-terminali His 10 -tag ile wildtype-, F508del- veya G551D-CFTR proteini hücre 500 ml'lik bir kültürden bir dondurulmuş Sf 9 hücre pelletini çözülme daha önce 17,28 tanımladı. Hücre topakları, yaklaşık 5 ml'lik bir hacme ve yaklaşık 5 g ıslak ağırlığa sahip olacaktır.
    2. Süspanse Sf sağlanması, 4 ° C'de proteaz inhibitör kokteyli ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde 20 ml (PBS), pH 7.4 (1 tablet 50 ml solüsyon) içinde 9 hücreleri,Numune görsel homojen görünür ve hücrelerin hiçbir kümeleri kalır.
    3. Geçit başına 2 dakika boyunca 10.000 psi (tercihen 15.000-20.000 psi) az ulaşan bir yüksek basınçlı hücre Topu (Malzeme ve Ekipman Tablo) ile Hücreleri. Liziz ve 4 ° C 'de örnek tutun.
      1. Sonra hemen hücre Topu numuneyi yeniden lizis süre sonra buz üzerinde bir tüp içinde örnek toplayın. Tekrar parçalama işlemi 3 kez. % 10'dan daha az sağlam kalmasını sağlamak için bir mikroskop altında incelenmesi.
        Not: vb cam boncuklar gibi başka yöntemler lize hücrelerin, sıkı, ancak bir kullanıcı, diğer bir yöntem, uygun gelebilir, bu sistem için incelenmiştir edilmemiştir.
    4. 20 dakika boyunca 2000 x g'de yüksek hızlı santrifüj içinde 4 ° C'de santrifüje hücre parçalama malzemesi. Süpernatant toplayın ve pelet atmayın. 20 tüp arasında süpernatan bölün ve ultracen masa üstü 125,000 x g'de, 4 ° C'de 1 saat süre ile numuneler santrifüjtrifuge.
    5. Çıkarın ve kullanılana kadar az 2 ay boyunca -80 ° C de tüplerinde pelet ve mağaza peletler bozmamaya özen supernatant veya buz üzerinde muhafaza eden ve saflaştırılmadan devam edin.
  2. CFTR çözündürme
    1. 1-4 taze veya dondurulmuş Sf 9 Kaba membran pelet elde edilir ve Tampon 1, 1 ml her bir tekrar süspansiyon (% 2 fos -choline, tam bir tarifi için bakınız Tablo 1), buz üzerinde 4 ° C de, bir 25 G iğne ve 1 ile solüsyon kadar ml'lik şırınga görünür hücre zarı kümeleri olmadan gözle homojen olduğunu. Birden fazla topak çözündürülmüş olan yerlerde, aşama 1.3.2 numuneler havuzu, paralel olarak aşağıda, tek bir pelet talimatlarına göre her bir örnek tedavi etmek için devam etmektedir.
    2. 1 Tampon 2 ml 1 mini proteaz inhibitörü tablet çözülür (10 mM imidazol; bakınız Tablo 1) fos -choline 14 deterjan yoksun olan (proteaz inhibitörleri 10 katı daha sonra konsantrasyonlar olarakBu noktada tavsiye edilen seyreltme daha puan) ve yeniden süspanse ham membran pelet 100 ul (proteaz inhibitörleri bu noktada tavsiye edilen seyreltme altındadır) ekleyin. Ters çevirme ile 5 kez her 5 dakika karıştırılarak, 45-60 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.
    3. Santrifüj 125,000 x g ve 4 ° C'de 25 dakika boyunca masa üstü bir ultrasantrifüjdeki Kaba membran pelet yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. Çözünmüş CFTR içeren süpernatant, saklayın ve pelet atın.
  3. Kolon bağlayıcı, fosforilasyon ve elüsyon
    1. Nikel-NTA (nitrilotriasetik asit) agaroz bulamaç ya da Tampon 2, 1 ml eşdeğer reçine 400 ul yıkayın (10 mM imidazol; bakınız Tablo 1) deterjan yoksun olan, çözücü maddeyi ortadan kaldırmak ve 4 ° C'de tampon. Tekrar yıkama iki kez daha.
    2. (10 mM imidazol, Tablo 1 e bakınız), Tampon 2 ile 10 ml 'lik bir toplam çözündürülmüş CFTR, geri kalan proteaz inhibitörü (900 ul) ve nikel reçinesi (400 ul bulamaçtan) birleştirin ağırlıkarada tutarak bir ilave deterjan yoksundur. fos -choline 14 konsantrasyonu etkili bir şekilde (a / h) Bu adımda% 0.2 kadar seyreltilir. Birden çok boru varsa, çözündürülmüş CFTR, proteaz inhibitörleri, nikel-NTA reçinesi ve% 0.2 ihtiva eden tüm örnekler havuz (a / h) fos -choline-14 bu noktada. Nazik çalkalama ile 4 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Küçük bir tarama kolonu (Tablo 1) veya eşdeğer bir boş sütun CFTR proteaz inhibitörü nikel NTA çözeltiyi geçirin.
    4. Tampon 3 ilk pelet başına 4 ml ile, kolon içinde alıkonur ve nikel NTA reçinesi, yıkama (10 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) fos -choline 14 yoksun ama 1mM DDM (dodesil maltosit deterjan) içeren 4 ° C'de ilave edildi. DDM deterjan eklenmesi önemli ölçüde bu tamponun pH değiştirmez.
    5. 2500, protein kinaz A, katalitik alt birimi, cAMP-bağımlı U (p 25 ul MgATP (5 mM, nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, PKA-MgATP çözeltisi hazırlayınTablo 1) kolona, ​​Tampon 3 (10 mM imidazol + DDM 475 ul KA). Bir kapak ya da Parafilm ile sütunun alt ucunun kapatılmasını ve kullanılan her bir başlangıç ​​pelet için pKa MgATP çözeltisi 500 ul eklenmesiyle proteinin fosforile.
    6. PKA, nikel NTA reçinesi bütün yüzeyi ile temas emin olmak için hafif karıştırma ile 1 ml pipet her 2 dakikada kullanılarak reçinenin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ile 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (20 ° C) inkübe edilir.
    7. Kapağı çıkarın ve sütundan PKA / MgATP çözüm Zehir. Tampon 3 2 ml kolon yıkaması (10 mM imidazol + DDM; bakınız Tablo 1) 4 ° C'de ilave edildi.
    8. Izin kolona 4 ml tampon ilave edilerek 4 ° C'de, (bakınız Tablo 1, 50 mM imidazol + DDM) Tampon 4 ml bu sayı 4. Yıkama kolon deneyde kullanılan peletler çarpın bu sütunun yanında 4 ml lik ekleyerek yoluyla ve hemen akmaya.
    9. Tablo 1) geçen protein kolon kuruması için bir duraklama olmadan aynı anda, sütun içinden 1 ml kullanılan başlangıç ​​pelet başına 4 ° C 'de, ve tek bir tüp içinde saflandırıldı CFTR içeren tüm eluat toplar.
    10. 10 mi Tampon 6 arasında bir toplam, örneğin Malzeme ve Ekipman veya başka benzer bir cihaz, Tablo l'de tarif edildiği gibi (100.000 molekül ağırlıklı bir kesim) bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak imidazol ve düşük molekül ağırlıklı bozunma ürünlerinin ayrılması için protein örneği konsantre edin (75 mM ki + DDM; bakınız Tablo 1 2000 x g 'de santrifüj ile) ve 4 ° C, (non-iyodür akış deneyleri için Tamponu 7, 25 mM HEPES + DDM olarak Tablo 1) ya da 1mM DDM ihtiva eden tercih edilen bir başka tampon olabilir bakınız örnek kadar yaklaşık 20 dakika 200 ul ile elde edilebilirler. 10 ml örnek seyreltilir ve konsantrasyon adımı tekrarlanır.
      NOT: Bizim tecrübelerimize göre (yayımlanmamış), imidazol anlamlı INHICFTR ATPaz aktivitesi bitleri ve örnek fonksiyonel ölçümler için kullanılacak ise, en az iki kat seyreltme ve konsantrasyon ile bu aşamada çıkarılmalıdır.
    11. Konsantre arıtıldı CFTR toplayın. 1-2 gün içinde kullanıma kadar DDM tamponu mevcudiyetinde 4 ° C'de tutun veya sulandırma aşamasından hemen devam edin. Biz düşük aktivite gözlemlemek bizim deneyim gibi, saflaştırılmış protein dondurma etmeyin.

CFTR 2. Sulandırma

  1. Lipid Preparasyonu
    Not: CFTR başarılı Yumurta PC, POPC içine 2 yeniden edilmiştir: 1 Yumurta PC (ağırlık / ağırlık): POPC (1: 1 a / a) karışımı, veya PE bir karışımı: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (a / a).
    1. Iyodür akış deneyleri, kuru Yumurta PC 5 mg payreks bir ya da düz (non-borosilikat oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir argon gazı akışı altında (25 mg / ml stok, 200 ul, Malzeme ve Ekipman Tablo) ) cam tüp.
    2. 280 nm'de emicilik kullanılarak, bir ELISA, birssay veya başka bir yöntem olup, saflaştınlmış CFTR proteini numune konsantrasyonunun tahmin edilmektedir. 1 lipid oranı: 300-1: 3000 yeterli bir sinyal üretmek için (a / a) vahşi tipli CFTR iyodür akış deneyler için, bir protein kullanırlar. Akış aktivitesi tespit etmek için 1,200 (ağırlık / ağırlık): 200-1: Yaklaşık 1 lipid oranının: G551D- ve F508del-CFTR, bir protein kullanırlar.
    3. Her bir sistem için lipit oranı: Protein Optimize. Gerekli saflaştırılmış protein miktarını hesaplayın. = Tampon hacmi (protein gerekli çözeltinin hacmi) - 1 mi, örneğin, 1 ml 'lik bir son hacim için gerekli olan, 1 mM DDM ile tampon hacim hesaplanır.
      1. Kurutulmuş lipid 1 mM DDM ile istenilen tampon sisteminin hesaplanan hacim ekleme (ancak şu anda CFTR proteini katmayan) ve Parafilm ile cam tüp kapağı. Iyodür akış deneyler için, tampon 6 lipitleri tekrar süspansiyon (75 mM ki + DDM; bakınız Tablo 1). Diğer deneyler Tampon 8 tekrar süspansiyon için (25 mM HEPES + DDM, bkzTablo 1) ya da 1mM DDM ihtiva eden bir başka istenen iç tampon eklendi.
      2. Oda sıcaklığında 2 dakika vorteksleyin DDM tamponu içinde yağ ve süspansiyon yardımcı olmak için. Seçenek olarak ise, vorteks önce 1-2 dakika süre ile 37 ° C örnek ısıtın.
    4. Lipid film tüpü kenarlarında görünür hale gelene kadar 1 ml şırınga ve 25 G iğne ile oda sıcaklığında arka arkaya lipid süspanse edin. Ince kabarcıklar üretmek ve iyodür ve lipidlerin oksidasyonu yardımcı olur solüsyon içine hava enjekte kaçının.
    5. Parafilm içinde süspansiyon haline getirilmiş lipit bir sonikatör banyosu ihtiva eden bir buz içinde 20 sn kaymasının tüpü kapalı sonikasyon, ve daha sonra 1 dakika boyunca buz hemen aktarın. 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Yoğun sonication oksidasyon nedeniyle sarı iyodür çözümler döner. Bu nedenle aşırı sonikasyon kaçının. Renk değişiklikleri için örnek izleyin. Bir renk değişimi tespit edilirse, örnek atmak ve tekrar hazırlamak. nedeniyle bazı oksidasyonu renk değişikliğiiyodür, aynı koşullar altında lipid oksidasyonuna neden olur. Çözüm sonicating önce argon gazı ile tüp havayı yerinden lipid ve iyodür oksidasyonunu önlemeye yardımcı olur. Yoğun sonication kalitesiz veya numune kaybına neden çizik cam tüpler kırabilir.
    6. 1 ml'lik bir son hacim elde etmek için bir ses dalgalarına maruz bırakıldı, lipid numune için adım 2.1.3 hesaplanan arıtıldı CFTR hacim. 25 G iğne ile 1 ml şırınga ile tabanda 10 kez lipit ve deterjan çözeltisi ile protein karıştırın.
    7. Tüp döndürme ile 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir lipid ve protein numune 5 kez her 5 dakika karıştırın.
  2. Deterjan bağlayıcı sütun hazırlanması
    1. 1 ml hacim kapasiteli bir tek kullanımlık ticari deterjan bağlayıcı spin kolon (Malzeme ve Ekipmanları Tablo bakınız) elde edilir ve sütun akan başlamak için alt sekmesini kırmak.
    2. Depolama b çıkarmak için 2000 x g'de 2 dakika süre ile sütun santrifüjuffer ve bu tampon atın.
    3. Tampon 7 5 ml kolonuna (75 mM KI, Tablo 1 'e bakınız) ve daha sonra yıkama tamponu elüt edilmesi için 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Depolama tamponu tüm izlerini çıkarmak için 3 yıkamadan toplam Bu adım 2 kere daha tekrar edin. Tüm flow-through atın.
      NOT: Bu sütun yıkamak için kullanılan tampon DDM ya da başka bir deterjan içermeyen önemlidir. Sütun deterjan için sınırlı bir bağlanma kapasitesine sahip olan bir deterjan ihtiva eden bir tampon maddesi kullanıldığında, kolon protein lipit deterjan örnek deterjan kaldırılması etkisiz olacaktır.
    4. Dikkatle kolon reçinenin üst kısmına lipid deterjan protein, tüm numune 1 ml bir örnek ve oda sıcaklığında 2 dakika için sütunun üst kısmında örnek inkübe edilir.
    5. 2000 x g'de, 4 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin ve temiz bir 1.5 ya da 2 ml mikrofüj tüpüne bulutlu proteoliposome örnek ya da bir cam tüp toplamak ve Sam yerBuz üzerinde ple.
    6. Kolonun üstüne 200 Tampon 7 ul (75 mM KI, Tablo 1) ya da (deterjan olmadan) için diğer tampon çözeltisi ilave edilerek kolon içerisinde geri kalan proteoliposomes toplayın ve 2 dakika boyunca santrifüj adımı tekrarlanır.
    7. Bulutlu görünüyor eğer proteoliposome örnek ikinci eluatın ekleyin.
    8. Gece boyunca 4 ° C 'de örnek saklayın, ya da iyodür akış ölçümleri için hemen kullanılır.

Saflaştırılmış yeniden oluşturulmuş CFTR 3. iyodür dışarı atım Ölçümler

  1. Proteoliposomal zarı boyunca bir iyodür gradyan üretilmesi
    1. Tampon 9 Ön kabarma Sephadex G50 boncuklar (yaklaşık 5 g kuru boncuk 50 mi tampon maddesi içinde) veya arzu edilen dış Tampon, oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle ya da 4 ile (75 mM K-Glu potasyum glutamat, Tablo 1 e bakınız) gecede ° C.
    2. Tampon 9 doymuş 4 Sephadex G50 sütun hazırlayın ya da (75 mM K-Glu, Tablo 1 e bakınız)¾ en azından sütununda tam reçine yükleyerek küçük tarama sütunlarda tampon.
    3. Reçine aşırı tampon kaldırmak için 2.000 xg'de 4 dakika santrifüj. Santrifüjleme aşamasının sonunda kolonuna paketlenmiş hidratlanmış reçinenin yaklaşık 2.25 mi olmalıdır.
      NOT: Reçine hafifçe sulu ancak sıvı dalmış ve bir sonraki kısa sıkma tampon önemli hacimlerde Zehir olmamalıdır değil edilmelidir. Bu sütun reçine ne çok ıslak ne de çok kuru ve kullanıcı en başarılı tampon değişimi koşullarına aşina olmak için sütunları ile denemeniz gerekebilir olan proteoliposome numunenin başarılı elüsyondan için çok önemlidir.
    4. Dikkatlice 2,000 x g'de, 4 dakika boyunca, her bir sütun ve santrifüj üstüne proteoliposome örnek 125-150 ul ekle.
    5. Havuz proteoliposome iyodür efflux veya diğer deneylerde hemen kullanım için bir arada sıvı kısımlar.
      NOT: Her kolondan ses kabaca olmalı150 ul ve örnek biraz bulutlu, ancak orijinal numune daha az bulutlu olmalıdır. Büyük hacimler veya net eluatlar sütunları yeterince kurutulmuş değil, ya da çok fazla, sırasıyla kurutulmuş edilmiş ve başarılı bir iyodür akış deneyinde neden olmaz düşündürmektedir.
  2. Iyodür akış deneyi
    1. Yoğun bir de-iyonize su ile (Malzeme ve Ekipman Tablo) bir iyodür seçici mikro elektrot yıkayın ve daha sonra Tampon 10 deneyden önce 20 dakika süreyle kuluçkalayın (15 uM KI, bakınız Tablo 1). Deiyonize su ile tekrar kapsamlı elektrot yıkayın.
    2. Tampon 9 tahlilde kullanılır (10 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için 20 uM, tipik konsantrasyon) ilacın 150 ul ekle 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna Tamponu 9 ya da araç (75 mM K-Glu, Tablo 1 e bakınız) Küçük bir pire karıştırma çubuğu ile.
      1. Mevcut hava kabarcığı olmadığından emin olun. Sokak kaldırmak için bir pipet kullanınkabarcıklar. Bir ilaç çözeltisi kullanılıyorsa, göz içindeki son DMSO konsantrasyonu ((tipik olarak% 0.1-0.2 v / v)) en az% 1 (h / h) olduğundan emin olun.
    3. Tampon 9, Bölüm 3.1'de üretilmiş yeniden CFTR proteininin 150 ul ekle plakasının her bir oyuğuna 300 ul toplam hacim elde etmek için, ilaç ya da tampon maddesi ile bir oyuğa (75 mM K-Glu, bakınız Tablo 1).
    4. Bir karıştırıcı plaka üzerinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir ve 130 rpm'de (ya da yaklaşık olarak dörtte maksimum hızının bir orta hızda) karıştırılmıştır.
    5. Dikkatle ucu kuyunun dibine dokunmadan değil veya karıştırma çubuğu ile vurulduktan şekilde numune ile kuyuya iyodür seçici elektrot ucu yerleştirin. Referans elektrot, ayrı ise, iyi çözelti ile temas halinde olduğundan emin olun.
    6. Elektrot ile arayüzleri bir ev yapımı ya da ticari bilgisayar programı kullanarak Kayıt kopyalamaları (detaylar için Materyallerin Tablo ve Ekipmanları bakınız).Bir düşük geçiş filtresi içinden sinyal filtreleme ile 2 Hz'lik bir numune alma oranı, kullanın.
    7. Örnek kayıt sırasında düz ve sabit ya da yakınındaki yassı bir temel hat üretmek için 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
    8. 3 ul MgATP (KOH ile dH 2 O hazırlandı ve pH 7'ye ayarlandı, 100 mM stok, 1 mM nihai konsantrasyon) ilave örneğe proteini aktif hale getirmek için. ~ 5 dk yeni bir kararlı bir temel ulaşmak için bekleyin. Her zaman dış tampon pH değişiklikleri önlemek için kullanmadan önce nötr 100 mM MgATP stokunun pH ayarlamak.
    9. CFTR ile iyodür seçici iletkenlik tarafından üretilen potansiyel farkı değişiklikleri şant örnek (20 nM nihai konsantrasyon 2 uM) stok Valinomycin 3 ul ekle. En az 5 dakika süre ile bağlı CFTR aracılı iyodür akış aktivitesi azalan eğimi (mV azalma) kaydedin.
    10. , Proteoliposome lümeninde iyodür bindirme yeterli olduğundan emin olmak% 10 3 ul eklemek (h / h) Triton X-100 örnek. Significant ve ani iyodür salma yeterli iyodür tutucu 3.2.9 belirlenen eğim değişiklikleri daha çok CFTR aracılı etkinliği için sınırlayıcı bir faktör değildir, öyle ki veziküller sıkışıp olduğunu gösterir.
    11. Bu reaktiflerin tüm izlerini sonraki numunenin kirlenmesini önlemek için çıkarılmış olmak üzere ilaç veya Triton X-100 ile örnekleri tedaviden sonra de-iyonize su ile iyice elektrot ve bir karıştırma çubuğu yıkayın.
    12. Tamponu içinde nanomolar aralıkta 9 mikromolar seyreltilmiş KI bir seri yoğunluğunun hazırlanması (K-Glu tamponu, bakınız Tablo 1). Hazırlanan en yüksek konsantrasyonda 0 ilâ her bir konsantrasyonu için elektrot mV yanıtı kaydeder. Prob yanıtı (mV) molar iyodür konsantrasyonunun günlüğüne karşı çizilen bir standart eğri Construct. Serbest iyodür konsantrasyonuna akış deney sırasında prob mV tepkisini dönüştürmek için standart eğri kullanın.
      NOT: Bir kalibrasyon cur hazırlayınBir kullanıcı emin olana kadar haftalık olarak ziyaretinde ne kadar hızlı sistemi değişiklikleri tepkisi. Zamanla prob cevap ve hassasiyet bir sürüklenme olacaktır. Prob yaş olarak, yanıt düşer. Bu kısmen periyodik iç çözümler değişen ve kullanımdan sonra su prob ucunun geniş yıkama, prob yüzeyine moleküllerin muhtemel sınırları bağlılık tarafından iptal edilebilir.
    13. MgATP ilave edilmeden önce son 30 saniye boyunca her proteoliposome numune için zaman grafiği konsantrasyona hattının ortalama eğimi belirlemek ve Valinomycin ilave edilmesinden sonra, ancak, Triton X-100 ilave edilmeden önce. Bu örnek CFTR-aracılı iyodür akış etkinliğini belirlemek için Valinomycin bazal eğim çıkarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yazılı yayında tarif, arındırmak sulandırmak ve CFTR proteininin düzenlenmiş kanal aktivitesini ölçmek için yöntemler bulunmaktadır. 1a saflaştırma, yeniden ve iyodür akış prosedürleri için iş akışını göstermektedir. Iyodür akı yeniden oluşturma ve kanal Aktivite ölçümleri için yöntemler de ilgili video daha ayrıntılı olarak gösterilmektedir.

Proteoliposomes içine CFTR saflaştırma ve yeniden çözme

CFTR işlevsel Sf'ye yüksek seviyelerde wt ya da mutant CFTR cDNA'yı 2 ihtiva eden rekombinant bakulovirüs ile 9 hücreleri ifade edilebilir. Bir memeli ekspresyon sistemi ise CFTR olarak yüksek ifade seviyesi sağlamak için, S f 9 hücreleri bakulovirüs sistemi kullanılarak ifade edildi. CFTR üretimi toplam hücresel protein 17,28% 1 kadar yüksek olabilir. 9- bakulovirüs sistemi f S proteini çekirdek glikosilatlanmış ve avantajına sahiptirbu sistemde, kalite kontrol amaçlı CFTR ve mutantlar hücre yüzeyi üzerinde üretilebilir nispeten ılımlı şekildedir. On histidin etiketi nikel NTA için, bu etiketin afinitesi nedeniyle arıtılmasını sağlamak için karboksi terminalinde üzerine üretilmiştir. C-terminal etiketi kesildi CFTR protein ve verimleri ATPaz fonksiyonel CFTR proteini, tek kanal ve iyodür akış deneyleri 17,19,24,28,29 eş-arıtma önlemeye yardımcı olur. Ancak, burada tarif edilen saflaştırma protokolü de, N-terminal olarak etiketli CFTR için uygun olmalıdır.

Daha önce, bu CFTR proteini etkili bir şekilde oda sıcaklığında 15 de NaPFO (sodyum pentadecafluoro-oktanoat) kullanılarak Sf 9 plazma zar müstahzarları elde edilebilir olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, NaPFO duyarlılık düzgün katlanmış protein ve PFO çıkarmak için gerekli olan uzun süreli diyaliz korumaya elverişli, 4 ° C bir sıcaklık ile çökeltmek için rap için uygun değildikimlik saflaştırma ve yeniden çözme yöntemleri CFTR fonksiyonunun daha sonra deneylerde proteinin aktivitesini en üst düzeye çıkarmak üzere tasarlanmıştır. Dodesil-β-D-maltoside (DDİ) 3 de dahil olmak üzere deterjanlar (bir panelin bir değerlendirme - [(3-kolamidopropil) -dimetilamonyo] -1-propansülfonat (CHAPS), fos -choline 12 ve fos -choline 14 olduğunu göstermiştir fos -choline 14 Sf 9 zarlardan insan CFTR-His 10 çözünmesine en etkili olduğunu ve DDM (veriler gösterilmemiştir), deterjan çözeltisi içinde CFTR ATPaz aktivitesini muhafaza. Böylece fos -choline 14 deterjan ekstre etme aşaması etkili proteinin etkinliğinin muhafaza edilmesi için deterjan DDM için değişimi, ardından gerçekleştirilir.

(, Gümüş Leke Şekil 2) saflaştırma ve konsantrasyon sonrasında bir protein fraksiyonu olarak ana bileşen olarak bir ~ 150 kDa bandı ihtiva DDİ deterjan elde edilir. Bu molekül ağırlığı S <olarak ifade edilen insan CFTR tekabülem> f 9cells ve memeli hücrelerinde CFTR kompleks glikosilasyon karakteristik türlerini yoksun, SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. 150 kDa türleri, SDS-PAGE analizi ve gümüş lekeleme sonra yaklaşık olarak% 90 saf olduğu görülmektedir. M3A7 anti CFTR antikoru kullanılarak Western lekeleme NBD2 karşı bu fare monoklonal 150 kDa bandı (; leke Şekil 2) ile reaksiyona girdiğini onaylamaktadır. Bazı çalışmalarda, düşük molekül ağırlıklı bileşenlerin eser miktarlarda ~ 60 ° C'de, jeli üzerinde görünen küçük bantlar halinde mevcut olup, ~ 80 kDa (veriler gösterilmemiştir). M3A7 anti CFTR antikor 60 ve 80 kDa bantlar ile reaksiyona giren, diğer olmayan CFTR protein ile reaksiyona girmeyen (veriler gösterilmemiştir). Bu düşük molekül ağırlıklı bileşenlerin CFTR bozunma ürünleri eş arıtıldı C terminal His etiketi ile CFTR ile olduğunu göstermektedir. arıtma proteaz önleyicilerin varlığında yapıldı ve bu bileşenlerin saflaştırma prosedürü i önce hücrelerde mevcut olduğu görünürs seslendirdi. prosedürün konsantrasyon adımı, hemen hemen tüm kirletici düşük molekül ağırlıklı fragmanların kaldırır. CFTR bu noktada yeniden tesis edilebilir, ya da başka bir saflaştırma prosedürü ile ilgili protein, yeniden oluşturma protokolünde kullanılabilir.

Düzenlenen bir lipozom akı bazlı analiz, anyon seçici kanallar saflaştırılmış ve yeniden CFTR moleküllerinin bir nüfusun fonksiyonel sulandırma raporları

Saflaştınldı CFTR önemli bir kısmı, yukarıda yöntemler kullanılarak düzenlenmiş klorür kanalı olarak yeniden olup olmadığını belirlemek için, bir proteoliposomal halid akış deneyi (Şekil 1 B 'de şematik olarak gösterilen) içinde yeniden CFTR moleküllerinin popülasyonunun aktivitesi rapor geliştirildi. En kötü durum senaryosunda, yeniden CFTR moleküllerinin çoğunluğu yanlış katlanmış olan, bu moleküller bir iletkenlik görüşmek için başarısız olur, olursa, katyon ve anyon ayrımcılık başarısızve / veya kapı PKA fosforilasyonu ve nükleotid tarafından düzenleme eksikliği olacaktır. Lee ve ark., Bir zar proteini 30 oranında işlevsel olarak yeniden tahmin etmeye yöntem yayınlanmıştır.

(Yeniden CFTR yatağı) Boş lipozomlar (CFTR eksik) veya proteoliposomes KI (75 mM) ve ekstra-lipozomal iyodür ile yüklenir, bir jel filtrasyon kolonu boyunca lipozomlar geçirilerek potasyum glutamat (75 mM) ile, değiştirilebilir. KI proteoliposomes iyodür dışarı doğru eğimi oluşturmak üzere iyi içeren K-Glu (potasyum glutamat) ilave edilir ve akış bir iyodür duyarlı mikro elektrot 24 ile zamanla extraliposomal iyodür artışlar olarak izlenir yüklendi. mV sinyalinde bir azalmaya negatif yüklü iyodür sonuçlarının akış (sinyal daha negatif olur). Zaman içinde serbest iyodid konsantrasyonu çizildiği zaman, eğim ex iyodür bir artış göstermek için (Şekil 3 'de olduğu gibi) ters döneceğizamanla modu, harici çözelti.

K-Glu bu CFTR proteini geçmez bir anyon bir örneğidir olarak kullanılan şartlar altında gözenek önemli engelleme neden görünmüyor, geçirgen olmayan karşıt iyon olarak seçildi ve iyodür seçici ile girişime neden olmaz elektrot. Bir deney, bu kriterleri karşılaması koşuluyla, başka bir anyonu çevresinde optimize edilebilir. Yetmiş beş mM anyon konsantrasyonları ampirik tarif edilen koşullar altında deneyde ölçümü için iyi bir yakalama ve yeterli sinyalleri veren konsantrasyon olarak seçilmiştir. (, Kontrol izleri, Şekil 3) CFTR yeniden ise, iyodür yüklü proteoliposomes iyodür ilave edildikten sonra dış çözelti içine serbest aracılık veziküller deterjan ile geçirgen hale kadar esas itibariyle işlevsel olarak yeniden CFTR eksik iyodür yüklü lipozomlardan iyodür salınacaktır MgATP (1 mM), CFTR kanal ve Valinomycin açmak(20 nM), bir zar potansiyeli gelişimini önlemek için (Şekil 3A; protein için izleme bakınız: 1 lipid kütle oranı: 3000 (ağ / ağ)).

Valinomycin mevcut sistemde boş lipozom bütünlüğünü karıştırmayı değil yüksek konsantrasyon olarak ampirik seçildi konsantrasyonu degrade ve 20 nM konsantrasyonu aşağı, özellikle zarından potasyum taşırma bir iyonoforu olduğunu. Bu, her özel sistem için optimize edilmesi gerekebilir. Valinomycin ilave olmadan, hızlı bir şekilde düz seviyeye ulaşan bir kaç nM kısaltılmış iyodür salma olduğu (veriler gösterilmemiştir). Bu koşullar, aksi maksimum (Şekil 3A'da gibi) CFTR anyon kanal aktivitesini harekete geçirdiği bilinir, ancak bu önemli bir cevabın eksikliği, CFTR anyon seçimli gözenekten iyodür iletim kaynaklı intraliposomal pozitif şarj ani artışı yansıtır görünür hemen sınırlayıcı n devamValinomycin dahil değildir lı iyodür yayılması. Bu Valinomycin-aracılı tepki iyodür akış yeniden CFTR anyon seçiciliğini destekleyen, çünkü şarj birikimi önceki deneylerde sınırlı olduğunu doğrulamaktadır. CFTR Bu seçicilik yoksun olursa, potasyum iyodür ve hem böylece akı başlatmak için Valinomycin ihtiyacını ortadan kaldırmakla proteoliposomes gelen akıttığı mümkün olurdu.

Bu ilk zaman noktalarında ölçülen iyodür konsantrasyonları kullanılan iyodür algılama elektrot için optimal hassasiyet aralığında düşmek ampirik seçildi. Diğer iyodür elektrotlar kullanılması bu faktörlerin optimizasyonu gerektirebilir. Bir platoya ulaşıldıktan sonra, Triton X-100 proteoliposomes geçirgen ve kalan tuzak iyodür serbest bırakmak için ilave edilir. (Valinomycin ilave edilmesinden sonra en az 1 ila 2 de elde edilmiş), ilk iyodür ölçümleri farklı olarak, bu uç okumaları elektrot cali lineer aralığında olmadığındatitreşimlerin eğrisi (veriler gösterilmemiştir), bu şekilde CFTR proteini deneyinde lipozomların toplam sayısı ya da yüzde işlevsel olarak yeniden iyodür akış nisbetle aracılık edebilen bir yerde, örneğin, lipozomların fraksiyonunun kesin bir değerlendirme imkânsız kılmaktadır.

iyodür akışın oranı CFTR proteini molekülleri sayısı, açık olasılığını ve her CFTR kanalının üniter iletkenlik gösterir. Bu nedenle, iyodür effluks'un oranları sayısı ve her CFTR molekülünün açık olasılık bağlı olmalıdır. Tahmin lipozom başına CFTR molekülü sayısının arttırılması, bu sistemde test edilmiştir. lipide aktif (fosforile ve MgATP işlenmiş) CFTR proteini oranı 1 arasında değişen oranlarda, değişik: 300-1: 3000 (Şekil 3A) (a / a). proteoliposomes mevcut yeniden CFTR büyük miktarda, efflux büyük oranı tahmini t destekleyen, (ilave Valinomycin sonra 1-2 dakika arasında ölçülen)şapka atım hızları her lipozom CFTR moleküllerinin sayısına bağlıdır. Böylece bu yöntemin titizlik vurgulayarak, lipit oranları deneysel gün ve protein saflaştırma arasında tekrarlanabilir: akış hızı belli protein kullanılarak elde edilmiştir.

iyodür dışarıya akış hızı bu sulandırılmış sistemde CFTR kanalının açık olasılık ile ilgili görünmektedir. PKA tarafından yapılan fosforlaştırma (32 göre ve yorum) CFTR aktivasyonu 31 için gerekli olan zamanda, açık olasılığı düşüktür eksojen PKA tedavisi ile fosforile edilmemiş CFTR içeren veziküller iyodür efflux düşük bir oranı olacağı beklenmektedir . PKA, tedavi edilen proteoliposomes olarak, açık olasılık efflux çok daha büyük bir beklenen hızıyla sonuçlanır çok daha yüksek olacaktır. Bu sistemde, 1 mM MgATP mevcudiyetinde CFTR PKA ile tedavi için Uygulamada, iyodür dışarıya akış hızı valinomyc ilave edildikten sonra iki dakika için bir ölçülenyaklaşık dört CFTR proteini oranı MgATP değil, PKA (Şekil 3B) tabi kat mi. Bu bulgular akış hızı açık olasılık kanal ile ilgili hipotezini desteklemektedir. Pratikte, bu gibi elektrokimyasal bir itici güç olarak zamana bağlı değişiklikler gibi diğer faktörler, gözlenen akış aktivitesi etkileyecektir verilen olasılığını açmak için direkt olarak bu tahlilde aktivite karşılaştırma zor olabilir. Okuyucu bu testte detaylı tek kanallı aktivite kayıtları için bir yedek olmadığı uyarılır.

İlginç bir şekilde, tipik haliyle CFTR (Şekil 3B, C) ​​eksik lipozomlardan efflux önemli ölçüde daha büyük olan MgATP mevcudiyetinde "fosforlanmamış" protein iyodür efflux düşük oranda gözlenmektedir. Bu düşük oran, 33 saflaştırılmaya önce Sf 9 hücre ifade sistemi CFTR bazal fosforilasyonunu yansıtabilir. CFTR diğer sentezleme sisteminin gelişmesini saflaştırılmıştırMS bazal fosforilasyon farklı seviyelerde ve bu nedenle de farklı kalıcı etkinliğe sahip olabilir.

Sf'ye ancak F508del- ve G551D-CFTR için yakın türdeşlik 9 hücreleri, bu hızlı saflaştırma protokolü verimleri Wt-CFTR, yöntemi daha iyi bir zenginleştirme işlem olarak tarif edilmiştir. Bazı kirletici bantların CFTR antikorlarla reaksiyona giren ve hücre bozulması önce var gibi görünmektedir CFTR bozunma ürünlerini yansıtan birçok olan SDS-PAGE 19 ile gözlenmiştir. sulandırılması ve iyodür akış yöntemleri klinik olarak önemli mutant bu Zenginleştirilmiş için uygundur. (: Yaklaşık 1 lipid kütle oranı: 600 protein) ve G551D-CFTR (protein: Yaklaşık 1 lipid oranı: 300), Şekil 3D'de gösterildiği gibi, önemli bir iyodür akış F508del- hem de ölçülür. (: 1 lipit kütle oranı: protein 1.200) hem mutantlar Wt-CFTR daha düşük mutlak aktiviteye sahip iken, kantitatif olarak doğrudan örnekleri karşılaştırmak zorCFTR bozulma ürünleri ile kontamine olan mutantlar gibi doğru olamaz. Ancak F508del-CFTR ve G551D, hem bu yöntemlerle arıtıldı yeniden kurulmuş ve akış ölçümleri küçük molekül kuvvetlendirici (Şekil 4), beklendiği gibi yanıt ve daha titiz bir FOA saflaştırma yöntemi 19 ile arıtılmış protein içindeki kanal işlevini göstermek için tabi tutulmuştur.

Saflaştırılmış ve yeniden CFTR kanal etkinliği küçük molekül inhibitörleri ve güçlendiricileri modüle edilebilir

-172 34 inh CFTR tek kanal iletkenliği ölçümleri 35 CFTR klorür kanalların açık olasılığını inhibe etmek için ve diğer çalışmalar 22,36 CFTR aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir mevcut en özel CFTR inhibitörüdür. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, ilave Valinomycin sonra dışarıya akış hızı önemli ölçüde CFTR inh ile ön-muamele ile azaltılır ub> -172. Bu nedenle, saflaştırılmış ve yeniden CFTR moleküllerinin popülasyonunun kanal aktivitesi, bu deney, örneğin -172 inh önleyici bağ CFTR gibi modülatörlerinin raporlama aktivitesi etkilidir.

deney hem de küçük moleküllü güçlendiricisi tedavinin etkisinin incelenmesi için hassas ve son derece uygundur. Şekil 4'te gösterildiği gibi, test edilen üç CFTR genotipleri, bu cins olarak aktif küçük moleküllü güçlendiricileri tarafından kuvvetlendirilen Kalydeco / VX-770 ya da vrt-532 (Şekil 4C, G551D için gösterilen), inaktif bir analog iyodür efflux üzerinde herhangi bir etkiye sahip değildir, CFTR aktivitesi (F508del-CFTR için gösterilen, Şekil 4B). Deney güçlendiricisi konsantrasyonu bağımlılığı incelenmesi ve güçlendiricisi-aracılı CFTR aktivitesine ATP rolü ve fosforilasyon için geçerlidir.

27fig1highres.jpg "width =" 700px "/>
Şekil 1:. Bu yayında tarif edilen çalışma için deney tasarımı ve akışı (A) akışı (B) iyodür akış deneyi şematik olarak gösterir.. Panel B değiştirilmiş bir versiyonu aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, E .; ve Bear, CE Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) potansiyatörün VX-770 (Ivacaftor) bir Fosforilasyon bağımlı ama ATP-bağımsız Manner Mutant CFTR Arızalı Kanal Kapısı açar. 2012; 287: 36.639-36.649. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society.

Şekil 2,
Şekil 2:. CFTR hızlı saflaştırma prosedürü verimleri arıtıldı Wt-CFTR proteini gümüş, SDS-PAGE jel ve Batı lekeliaşırı ifade eden bir (His), 10-etiketli versiyonu (sırası ile 1 ug ve jel ve benek için 0.1 ug), saflaştırılmış insan Wt-CFTR DDM deterjan protein, S f izole 9 hücreleri M3A7 CFTR antikoru kullanılarak ern benek Protein. Wt-CFTR (>% 90 saf), kompleks glikosilasyon eksik bu protein için uygun, 150 kDa'da tespit edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, E .; ve Bear, CE Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) potansiyatörün VX-770 (Ivacaftor) bir Fosforilasyon bağımlı ama ATP-bağımsız Manner Mutant CFTR Arızalı Kanal Kapısı açar. 2012; 287: 36.639-36.649. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society.

Şekil 3,
Şekil 3: Iodide akış deneyi raporları saflaştırıldı ve yeniden CFTR proteini için kanal aktivitesini düzenlemektedir. (A) Saflaştınlmış ve fosforile Wt-CFTR proteininin yeniden kurulmuş: lipit oranlarını 1: 300 (a / a), 1: 1200 (w / w) ve 1: 3000 (w / w) için vezikül lümeninden iyodür akışını aracılık 1 mM MgATP ve 20 nM Valinomycin ilave edildikten sonra zaman içinde yığın banyosu. (ağırlık / hacim) Triton X-100 deney sonunda vezikül lümeninde iyodür tuzak proteoliposomes bültenleri geçirgenliği% 0.1 ek. (B) yeniden Wt-CFTR proteini için başlangıç ​​iyodür akış zaman süreci olmasaydı Önceden fosforile. (C), ilk iyodür akış oranları fonksiyonel CFTR proteini üzerinde gözlenen aktivitesinin bağımlılığını göstermektedir. Protein, PKA fosforilasyonu -172 (20 uM) inh CTTR CFTR inhibitörünün eklenerek engellendi önemli kanal aktivitesi için gereklidir. Veri ± SEM araçlardır; * P <0.05, *** p <0.0001 (D) Birden genotip ağırlıkça, F508del- ve kontrole karşı G551D-CFTR dahil iyodür akış deneyinde düzenlenmiş CFTR sinyallerini üretmek. Veri ± SEM araçlardır; * P <0.05; *** P <0.0004 vs kontrolü. Bu araştırma, (panel A, C ve D veri bölümleri), ilk Journal of Biological Chemistry yayınlanmıştır. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, E .; ve Bear, CE Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) potansiyatörün VX-770 (Ivacaftor) bir Fosforilasyon bağımlı ama ATP-bağımsız Manner Mutant CFTR Arızalı Kanal Kapısı açar. 2012; 287: 36.639-36.649. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society.

Şekil 4,
Şekil 4: küçük moleküller tarafından CFTR fosforilasyonu bağımlı potansiyasyon kullanılarak sorguya olabilirağırlıkça, F508del- ve G551D-CFTR için iyodür akış sistemi. (A) Ağırlıkça-CFTR sadece PKA-fosforile edilmiş halde, güçlendiricisi, VX-770 (10 uM) ile önemli ölçüde potansiye olduğunu açıkça göstermiştir. Veriler * p <, ortalama ± SEM olarak pKa VX-770., (B), VX-770 (10 uM), ancak inaktif bir analog V-09-1188 (10 uM), önemli ölçüde iyodür akışını güçlendiren ± 0.01 vs Fosforile F508del-CFTR aktivitesi. Veriler, ortalama ± SEM, n = 3 *** p <0.001 vs -VX-770 kontrolü. 10 uM vrt-532 ve VX-770 ile G551D-CFTR (c) belirginleşmesi. Veriler ortalama ± SEM, n = 5, ** p <0.001, *** p <0.0001 ve -VX-770 kontrolü. Bu araştırma (paneller ac) başlangıçta Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, E .; ve Bear, CE Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) potansiyatörün VX-770 (Ivacaftor) a Mutant CFTR Arızalı Kanal Kapısı açar Fosforilasyonunun bağımlı ama ATP-bağımsız Manner. 2012; 287: 36.639-36.649. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society.

r> ight "> 7.4
Tampon Isim Içindekiler pH Kullanarak pH'ı ayarlayın
Tampon 1 % 2 fos -choline 10 mM imidazol içinde% 2 (ağırlık / hacim) fos -choline 14 deterjan, 25 mM HEPES 7.4 Imidazol / hepes
Tampon 2 10 mM imidazol 10 mM imidazol, 25 mM HEPES (deterjan) 7.4 Imidazol / hepes
Tampon 3 10 mM imidazol + DDM 10 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodesil-β-D-maltozit 7.4 Imidazol / hepes
Tampon 4 50 mM imidazol + DDM 50 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodesil-β-D-maltozit 7.4 Imidazol / hepes
Tampon 5 600 mM imidazol + DDM 600 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodesil-β-D-maltozit 7.4 Imidazol / hepes
Tampon 6 75 mM KI + DDM 75 mM Kİ, 20 mM MOPS, 1 mM dodesil-β-D-maltozit 7.4 KOH
Tampon 7 75 mM Kİ 75 mM Kİ, 20 mM MOPS 7.4 KOH
Tampon 8 25 mM HEPES + DDM 25 mM HEPES, 25 mM NaCI, 1 mM dodesil-β-D-maltozit 7.4 HCI / NaOH
Tampon 9 75 mM K-Glu 75 mM K-Glutamat, 20 mM MOPS KOH / Glutamik asit
Tampon 10 15 mM Kİ 15 mM Kİ, 20 mM MOPS 7.4 KOH

Tablo 1: Tampon Tablosu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücresel aşırı ekspresyonu sistemleri çeşitli, tam uzunluktaki fonksiyonel CFTR izolasyonu için saflaştırma protokolleri sınırlı sayıda olmuştur. Bu ATP ve düzlemsel iki tabakalı, tek kanallı ölçümleri de dahil olmak üzere kanal fonksiyonunun doğrudan ölçümleri, aşağıdakileri içeren deneylerde son derece işlevseldir, Wt-CFTR veya orta miktarlarda F508del- ve G551D-CFTR yüksek zenginlikte hızlı saflaştırılmasına olanak tanımaktadır burada tarif edilen yöntem avantajlıdır, Küçük moleküllerin 19-21 çalışmalarına son derece alakalı olan sistemler ve CFTR nüfus kanal fonksiyonu gösterdi önlemler. saflaştırma yöntemi hızlı ve etkili bir yeniden oluşturma protokolü entegre, diğer yöntemlerden ancak saflaştırılan proteinin yanı sıra, bu yeniden oluşturma protokole bağlanmış saflaştırma deterjan Benzer çıkarılması için uygun olduğunu da temin edilebilir.

Exc gelen karmaşık ve zahmetli tek kanallı deneyler aksinekili membran yamaları, burada açıklanan yöntemler CFTR kanal fonksiyonu sağlam ama basit değerlendirme, izin ve benzersiz bu tedbir CFTR kanalları yerine bir veya birkaç moleküllerin daha büyük bir nüfusun işlevini bildirir. Membran yamaları içeren tekniklerin aksine, bu yöntem birleştiğinde arıtma işleminin etkinliği bağlı olarak ilişkili proteinlerin, yakın veya tam yokluğunda kanalda küçük molekül modülatörlerinin etkilerinin direkt değerlendirmesini sağlar.

Protokol kapsamında kritik adımlar

Protokolde belirtilen notları gibi anyon akı tahlil için CFTR fonksiyonel yeniden birkaç kritik adımlar, olmasına rağmen, protein optimizasyonu: CFTR yeniden sırasında lipit oranı anahtarıdır. Bu optimizasyon, her CFTR genotip için gereklidir.

Tekniğin Değişiklikler ve sorun

bazal mV restarif edildiği gibi hazırlanan numuneler ile iyodür akış deneyi sırasında kullanılan prob için ponse genellikle -20 mV ile -50 etmektir. Bu dizi önemli sapmalar numune ile ilgili sorunlar olabileceğini düşündürmektedir. Farklı üreticiler tarafından satılan diğer sondalar burada sağlanan yönergelere farklı olabilir. Istikrarlı bir temel elde edilemezse, artık deterjan veya inaktif, denatüre, kalitesiz protein iyodür için veziküller permeabilizing olabilir.

Başarısızlık araştırılmalıdır olan çok çeşitli sorunları yansıtmaktadır MgATP varlığında fosforlu CFTR içeren lipozomlar bağımlı iyodür akışını Valinomycin oranında önemli bir değişiklik tespit etmek. Bu konular şunlardır: kalitesiz, kısmen denatüre CFTR veya saf olmayan CFTR; yeniden sırasında deterjan eksik çıkarılması; Uygun olmayan bir protein: proteoliposomes lipid oranının; veya yetersiz Valinomycin eksik şarj dağılımını render ekledi.

benodide akış deneyleri, deney boyunca önceden fosforile edilmiş CFTR proteini (protokolde tarif edildiği gibi) ya da fosforlu CFTR kullanmak için esneklik sunar. Yeniden protein saflaştırma prosedürü esnasında fosforile değil ise, örnek MgATP ile PKA eklenerek, adım 3.2.7 de iyodür akış deney sırasında fosforile edilebilir. Bu durumda, temel bir protein yeterince Valinomycin ilavesiyle fonksiyonu ölçülmesinden önce, PKA enzim ile fosforile edilmiş olduğundan emin olmak için, en azından 5 dakika boyunca kaydedilir emin olun. Benzer sonuçlar, her iki metot ile elde edilmektedir.

Tedavisi sırasında modülatör molekülü daha sonra MgATP ilavesinden ve Valinomycin tarafından aktivitesi ölçümünde önce, 5 dakika boyunca, CFTR proteini ile etkileşime bırakıldı. En CFTR modülatörleri çok lipofilik olduğu için, CFTR proteini ile banyo ve denge derneğe ek arasındaki zaman alabilir. Tahlil th olmadan devam edemeze Valinomycin eklenmesi ve böylece hiçbir bilgi bu şekilde tahlil yaparak kaybolur. Kullanıcı proteini ile küçük molekülün etkileşiminin önce belli bir süre olabilir söz konusu olmadığı durumlarda, bu analiz, Valinomycin ilave edildikten sonra modülatörün akut eklenmesiyle gerçekleştirildi edilebilir başlangıç ​​hızı aşamasında ise hala ölçümü.

Tekniğin Sınırlamalar

Daha önce belirtildiği gibi, saflaştırılmış ve yeniden tam uzunlukta CFTR moleküllerinin bir popülasyonuna göre düzenlenmiş kanal aktivitesinin bu proteoliposomal akı bazlı analiz ile doğrudan aktivitesi ve değişiklikler ligandları sorgulamak için emsalsiz bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, yöntem, ligandların CFTR yoluyla akının ilerlemesini hızını değiştirmek içinden mekanizma fikir vermez olmasıyla sınırlıdır. İdeal olarak, saflaştırılmış ve yeniden CFTR proteoliposomal akı tahlili düzlemsel dudak ile birlikte kullanılmalıdırTek kanallı faaliyet id iki tabakalı çalışmaları. Bu kombinasyon, açık ve / veya kapalı konumda, yani ligandları bağlayan protein durumuna ilişkin bilgi temin edecektir.

Mevcut yöntemlere göre önemi

Önemli protein-protein yolu veya bozulması, bir modülatör üzerinden dolaylı olarak, örneğin kanal aktivitesi, değiştirmek için başka bir hücre bileşeni ile etkileşim küçük molekül modülatörleri karşı CFTR kanalı ile küçük moleküllerinin doğrudan etkileşiminin değerlendirilmesine ya da sinyalleme için yöntemler eksiktir etkileşimleri. iyodür akış yöntemi CFTR kanal aktivitesini modüle eden herhangi bir küçük molekül proteini ile doğrudan etkileşim göstermektedir. Ölçümlerin düşük verimlilik tavırlarına rağmen, küçük molekül potensiyatörler ve düzelticilerin CFTR doğrudan etkileşim çalışmak için bu benzersiz yöntemlerle önemli değer kalır. Birçok küçük gösteren molekülerBu akım CF araştırmanın en önemli itme gibi e modülatörleri, akademik gruplar ve klinik CF hastaları tedavi etmek için ilaç endüstrisi hem geliştirilme aşamasındadır. Burada tarif edilen yöntemler, bu moleküllerin en umut verici etki mekanizmasının geliştirilmesi ve doğrulama yardımcı olacağı tahmin edilmektedir.

Tekniğin Gelecek uygulamalar

Burada kullanılan metotlar da ilgili diğer proteinlere adaptasyonu için son derece uygundurlar. Gerçekten de tarif edilmiş yöntemlerde bir değişikliği iki P çalışma için kullanılmıştır aeruginosa membran proteinleri bu yöntemlerin yarar ve çok yönlülük gösteren, zarın 26,27 genelinde anyonik yüzeylerde hareketi karışmış. Ek anyon kanalları ve taşıyıcıların çalışmada Bunların kullanımı gelecekte beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar burada anlatılan saflaştırma yöntemlerinin geliştirilmesi sırasında Dr. Mohabir Ramjeesingh tavsiye kabul. Bu çalışmalar Sağlık Araştırması (CIHR) ve Kistik Fibrozis Kanada (CFC) Kanada Enstitüleri CEB İşletim Hibe tarafından desteklendi. PDWE CIHR ve CFC üzerinden Kardeşlik ödülleri kısmen desteklenmiştir. Yazarlar Kistik Fibrozis Vakfı Therapeutics (CFFT) tarafından düzeltici, kuvvetlendirici ve Dr. R. Köprülerin (Tıp Rosalind Üniversitesi ve Bilim) den inhibitör bileşiklerin ve dağıtım sağlanmasını kabul. Yazarlar ayrıca bakülovirüs sistemini kullanarak WT ve mutant CFTR proteini ifade Baylor Hücre Kültürü Tesisi (NIH hibe P30 CA125123) tarafından üstün hizmet kabul. inaktif VX-770 analog, V-09-1188, Vertex İlaç bir hediye oldu.

Acknowledgments

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50, (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68, (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2, (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148, (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148, (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419, (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270, (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267, (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4, (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327, (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54, (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21, (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78, (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8, (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418, (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3, (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4, (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75, (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387, (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268, (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271, (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110, (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136, (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89, (4), 417-425 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics