प्रवाह से leukocytes की भर्ती पर stromal कोशिकाओं के प्रभाव का विश्लेषण

Immunology and Infection

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Summary

प्रवाह से ल्यूकोसाइट्स भर्ती करने के लिए सूजन अन्तःचूचुक की क्षमता mesenchymal stromal कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हम प्रवाह से न्युट्रोफिल भर्ती का आकलन और mesenchymal stromal कोशिकाओं इस प्रक्रिया को विनियमित करने में खेलते हैं कि भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्राथमिक मानव कोशिकाओं को शामिल दो में इन विट्रो मॉडल का वर्णन है।

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Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

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Abstract

Stromal कोशिकाओं पड़ोसी endothelial कोशिकाओं के साथ पार बात के माध्यम से सूजन के दौरान ल्यूकोसाइट्स परिसंचारी की भर्ती को विनियमित। यहाँ हम सूजन endothelial कोशिकाओं द्वारा प्रवाह से न्यूट्रोफिल परिसंचारी की भर्ती के अध्ययन के लिए दो में इन विट्रो "संवहनी" मॉडल का वर्णन है। इन मॉडलों का एक प्रमुख लाभ vivo में घटित होता है, के रूप में आदेश ल्युकोसैट आसंजन झरना में हर कदम का विश्लेषण करने की क्षमता है। हम भी दोनों मॉडलों ल्युकोसैट भर्ती को विनियमित करने में, इस मामले mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) में stromal कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे का वर्णन।

प्राथमिक endothelial कोशिकाओं Ibidi microslides पर या 24 घंटे के लिए एक Transwell फिल्टर के विपरीत दिशा में सीधे संपर्क में मानव एमएससी के साथ अकेले या एक साथ सुसंस्कृत थे। संस्कृति 4 घंटे के लिए ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) के साथ प्रेरित और एक प्रवाह आधारित आसंजन परख में शामिल थे। Neutrophils के एक सांस perfused किया गया था4 मिनट के लिए अन्तःचूचुक पर। न्यूट्रोफिल और अन्तःचूचुक के साथ उनकी बातचीत बहने का कब्जा चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी।

दोनों मॉडलों में, साइटोकाइन उत्तेजना एक खुराक पर निर्भर तरीके से बह न्यूट्रोफिल के endothelial भर्ती में वृद्धि हुई। भर्ती neutrophils के व्यवहार का विश्लेषण रोलिंग में एक खुराक पर निर्भर कमी और अन्तःचूचुक के माध्यम से स्थानांतरगमन में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि देखी गई। सह संस्कृति में, एमएससी TNFα उत्तेजित अन्तःचूचुक को न्युट्रोफिल आसंजन दबा दिया।

हमारे प्रवाह आधारित आसंजन मॉडल प्रचलन से ल्युकोसैट भर्ती के प्रारंभिक चरणों की नकल। ल्यूकोसाइट्स के अलावा, वे इस तरह के उपचारात्मक प्रशासित एमएससी या परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं की भर्ती की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे बहुस्तरीय सह संस्कृति मॉडल एमएससी समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के लिए उनकी प्रतिक्रिया को संशोधित करने के अन्तःचूचुक के साथ संवाद पता चला है कि, alterineutrophils की भर्ती एनजी। इस तरह के मॉडल का उपयोग इसके अलावा अनुसंधान पूरी तरह से विभिन्न ऊतकों और शर्तों (भड़काऊ विकारों या कैंसर) से कैसे stromal कोशिकाओं को समझने सूजन के दौरान leukocytes की भर्ती को प्रभावित करने के लिए आवश्यक है।

Introduction

सूजन संकल्प 1,2 अनुमति देने के लिए सूजन के ऊतकों से तंग में ल्युकोसैट प्रविष्टि के नियमन और बाहर निकलने की आवश्यकता है कि सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण या ऊतक चोट करने के लिए एक सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया है। Endothelial कोशिकाओं (ईसी) कि लाइन रक्त वाहिकाओं, परिसंचारी leukocytes और ऊतक निवासी stromal कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक इस प्रक्रिया को तीन समन्वय के लिए आवश्यक है। हालांकि, leukocytes के अनियंत्रित भर्ती और उनके अप्रभावी निकासी पुरानी भड़काऊ रोगों 4 के विकास की आधारशिला हैं। स्वास्थ्य और रोग में ल्युकोसैट भर्ती की हमारी वर्तमान समझ अधूरा है और अधिक मजबूत मॉडल इस प्रक्रिया का विश्लेषण करने की जरूरत है।

पोस्ट-केशिका venules में संवहनी चुनाव आयोग के माध्यम से रक्त से leukocytes की भर्ती का समर्थन तंत्र अच्छी तरह 1,2,5 वर्णित किया गया है। परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स विशेष रिसेप्टर्स (जैसे, Vcam -1, ई selectin, पी selectin) द्वारा कब्जा कर रहे हैं, जोसूजन अन्तःचूचुक पर अप-विनियमित रहे हैं। ये क्षणिक बातचीत ल्यूकोसाइट्स सतह बाध्य chemokines और ल्यूकोसाइट्स 6- 11 द्वारा व्यक्त integrins सक्रिय करें कि लिपिड व्युत्पन्न मध्यस्थों (मूल में endothelial या स्ट्रोमल या तो) के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं। यह बदले में अन्तःचूचुक भर में और ऊतकों को 12- 15 में आसंजन और ड्राइव प्रवास स्थिर। ऊतक के भीतर, ल्यूकोसाइट्स उनके गतिशीलता, समारोह और अस्तित्व 16,17 कि प्रभावित स्ट्रोमल व्युत्पन्न एजेंटों के अधीन हैं भर्ती किया था। बढ़ती सबूत जोरदार संकेतों अगले के लिए भर्ती प्रक्रिया की स्थिति leukocytes के प्रत्येक चरण में प्राप्त किया है कि पता चलता है। हालांकि, ल्युकोसैट भर्ती के बारे में हमारी समझ अधूरा रहता है और बहुत कम ऊतक के भीतर घटकों को आकार देने ल्युकोसैट आंदोलन के बारे में जाना जाता है।

बर्मिंघम में हम से leukocytes की भर्ती का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो "संवहनी" मॉडल में कई विकसित किया है9,18,19 प्रवाह। अब हम ल्युकोसैट भर्ती की नाड़ी चुनाव आयोग अधिनियम के रूप में तत्काल नियामकों उनके स्थानीय microenvironment में परिवर्तन करने के लिए जवाब है कि समझते हैं। विशेष रूप से, ऊतक निवासी stromal कोशिकाओं को सक्रिय रूप से भर्ती तीन में उनकी भूमिका को प्रभावित करने के लिए पड़ोसी संवहनी चुनाव आयोग के साथ बातचीत के हिस्से में, भड़काऊ प्रतिक्रिया को नियंत्रित कर सकते। हम पहले विभिन्न stromal कोशिकाओं एक ऊतक विशेष ढंग से आसंजन और leukocytes के माइग्रेशन का समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता मिलाना पता चला है कि, और इन प्रभावों पुराने रोगों 13,16,20,21 में बदल हो गया है। इस प्रकार, stromal कोशिकाओं प्रत्येक भड़काऊ प्रतिक्रिया 22 के संदर्भ को परिभाषित ऊतक कि 'पता-कोड' की स्थापना। हाल ही में, हम अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न एमएससी (BMMSC) potently दोनों neutrophils की भर्ती में कमी करने के लिए अग्रणी, साइटोकिन्स के लिए चुनाव आयोग की प्रतिक्रिया नीचे विनियमित करने और 23 लिम्फोसाइटों कि प्रदर्शन किया है।

तंत्र शासनerning भर्ती elucidated इन विट्रो काफी हद तक अलगाव में एक एकल कोशिका प्रकार (उदाहरण के लिए, ईसी) या प्रोटीन को शामिल assays के लिए इस्तेमाल किया है। हालांकि, इन अध्ययनों को ध्यान में नहीं लेते स्थानीय ऊतक वातावरण के प्रभाव (यानी, stromal कोशिकाओं की उपस्थिति) leukocytes की भर्ती पर और ऊतकों में उनके बाद माइग्रेशन। यहाँ हम, stromal कोशिकाओं, विशेष रूप से mesenchymal कोशिकाओं स्टेम जिसमें दो प्रवाह आधारित विधियों (एमएससी) का वर्णन चुनाव आयोग 23 के साथ सह-सुसंस्कृत हैं। इस तरह के मॉडल हमें प्रवाह से ल्युकोसैट भर्ती समर्थन करने के लिए विशेष रूप से अपनी क्षमता में endothelial प्रतिक्रियाओं पर stromal सेल का प्रभाव है, जांच करने के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

1. अलगाव और संस्कृति प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं और mesenchymal स्टेम सेल की

  1. अलगाव और की संस्कृति मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC):
    1. कागज तौलिये के साथ एक ट्रे पर गर्भनाल रखो और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे। एक टिशू कल्चर हुड में रखें। दोनों सिरों पर नस और cannulate पहचानें। यह सुरक्षित करने के लिए cannulated अंत के आसपास एक केबल टाई रखें।
    2. पीबीएस एक सिरिंज का उपयोग कर के साथ शिरापरक रक्त बाहर धो लें। हवा के साथ सिरिंज भरें और हटाने के लिए और अवशिष्ट पीबीएस त्यागने के लिए नस के माध्यम से गुजरती हैं।
    3. और 10 मिलीग्राम / एमएल collagenase प्रकार आइए पिघलना 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता (कैल्शियम और मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ) पीबीएस में 01:10 पतला। दोनों cannulae भर रहे हैं जब तक नस में collagenase समाधान गुजरती हैं। दोनों सिरों पर cannulae पर clamps बंद करें।
    4. ऊतक के साथ ट्रे कवर और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए एक मशीन में रस्सी रखें।
    5. बाहर की हड्डी लोऔर इनक्यूबेटर की केबल संबंधों कस लें। एक मिनट के लिए धीरे कॉर्ड मालिश। 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ सेल निलंबन बाहर फ्लश और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा।
    6. हवा के साथ सिरिंज भरें और कदम 1.1.5 में इस्तेमाल एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीबीएस का संग्रह, दो बार किसी भी अवशिष्ट पीबीएस दूर करने के लिए नस के माध्यम से गुजरती हैं। आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. 1 मिलीलीटर पूरा चुनाव आयोग माध्यम में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली। चुनाव आयोग मध्यम 35 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन सल्फेट, 10 एनजी / एमएल मानव epidermal वृद्धि कारक, एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / hydrocortisone, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Amphotericin बी, और 20% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक M199 के होते हैं।
    8. एक 25 सेमी 2 फ्लास्क को चुनाव आयोग मध्यम और चुनाव आयोग निलंबन के 4 मिलीलीटर जोड़ें। अगले दिन पर मध्यम और फिर हर दो दिनों बदलें।
    9. चुनाव आयोग के एक cobblestone तरह आकारिकी (चित्रा 1Ai) दिखा रहे हैं। आसंजन assays के लिए, चुनाव आयोग आम तौर पर वे 100% संगम तक पहुँचने जब ​​(धारा 1.4 देख वरीयता प्राप्त कर रहे हैं
  2. मानव गर्भनाल से व्हार्टन जेली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (WJMSC) का अलगाव:
    1. ताजा गर्भनाल से या पहले से ही चुनाव आयोग को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि डोरियों से व्हार्टन जेली व्युत्पन्न एमएससी (WJMSC) पृथक। 5 सेमी लंबे टुकड़ों में गर्भनाल को काट। रक्त वाहिकाओं प्रकट करने के लिए अनुलंबीय प्रत्येक टुकड़ा काट (2 धमनियों [सफेद, कठोर] और एक नस [पीला, distended])।
    2. बाँझ कैंची और संदंश रक्त वाहिकाओं को हटाने और त्यागने का उपयोग करना। 3 मिमी 3 टुकड़े - 2 में सभी ऊतक में कटौती। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3 मिमी 3 टुकड़े - संदंश जगह 2 का उपयोग करना।
    3. 100 मिलीग्राम / एमएल शेयर collagenase प्रकार द्वितीय पिघलना और एक पतला: 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस में 100। 20,000 यू / एमएल शेयर hyaluronidase पिघलना और एक पतला: 400 collagenase समाधान में 50 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए।
    4. ऊतक टुकड़े युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब एंजाइमी कॉकटेल जोड़ें। ऊतक fragmen सेतेएक धीमी गति से रोटेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए टीएस।
    5. सेल निलंबन एक पतला: 5 पीबीएस में। एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 100 माइक्रोन ताकना फिल्टर रखें। 100 माइक्रोन ताकना फिल्टर पर सेल निलंबन डालो।
      नोट: ऊतक टुकड़े शेष फिल्टर पर बनाए रखा जाएगा और कोशिकाओं 50ml अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र किया जाएगा।
    6. फिल्टर त्यागें। आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। 12 एमएल पूरा WJMSC संस्कृति मध्यम (DMEM कम ग्लूकोज, 10% एफसीएस और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन मिश्रण) में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend WJMSC गोली।
    7. एक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में सभी कोशिकाओं बीज। 12 एमएल पूरा WJMSC संस्कृति के माध्यम से 24 घंटे के बाद मध्यम बदलें। 3 दिन - हर 2 मध्यम बदलें। दो सप्ताह के भीतर 80% संगम - प्रकोष्ठों 70 तक पहुंच जाना चाहिए। पैसेज WJMSC 70 तक पहुँच जाने पर - 80% संगम (धारा 1.4 देखें)।
  3. अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी (BMMSC) का विस्तार: पहले से 24 में वर्णित के रूप में मानव अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी (BMMSC) पृथक। एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म एमएससी मध्यम विकास (MSCGM) जोड़ें।
  4. 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर P2 BMMSC की एक शीशी पिघलना। MSCGM युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब BMMSC निलंबन जोड़ें। Pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला।
  6. 1 मिलीलीटर MSCGM में Resuspend कोशिकाओं और इस तरह के एक cellometer के रूप में एक रुधिरकोशिकामापी या एक डिजिटल सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  7. 12 एमएल MSCGM में 2 सेमी प्रति 6000 कोशिकाओं - 5000 के घनत्व पर 75 सेमी 2 संस्कृति बोतल में बीज कोशिकाओं। 12 एमएल MSCGM के साथ 24 घंटे के बाद मध्यम बदलें। 12 एमएल MSCGM साथ फ़ीड कोशिकाओं हर 2-3 दिनों के लिए।
  8. पैसेज BMMSC 70 तक पहुँच जाने पर - 80% संगम (धारा 1.4 देखें)। प्रकोष्ठों एक तंतुप्रसू आकारिकी (चित्रा 1Aii) दिखा रहे हैं।
  • चुनाव आयोग और एमएससी की टुकड़ी: 25 सेमी 2 संस्कृति बोतल से महाप्राण मध्यम। लगभग दो मिनट के लिए 0.02% EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें। महाप्राण EDTA और 2 मिलीलीटर trypsin जोड़ने (2.5 मिलीग्राम / एमएल)। खुर्दबीन के नीचे देखें कोशिकाओं दौर बन जब तक।
  • कोशिकाओं को अलग करने के लिए कुप्पी ठोकर। 8 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से जोड़कर trypsin निष्क्रिय, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब संस्कृति फ्लास्क और हस्तांतरण निलंबन के लिए (सेल प्रकार पर निर्भर HUVEC, BMMSC के लिए WJMSC और MSCGM के लिए DMEM के एलजी के लिए चुनाव आयोग के माध्यम)।
  • आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। नीचे वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला Aspirate और गोली resuspend।
    1. एमएससी, 3 मिलीग्राम संस्कृति के माध्यम में resuspend गोली की passaging के लिए। तीन अलग-अलग 75 सेमी 2 संस्कृति बोतल में 11 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम जोड़ें। (3 विभाजन 1) प्रत्येक संस्कृति फ्लास्क 1 मिलीलीटर सेल निलंबन जोड़ें। पैसेज WJMSC और सह संस्कृति assays में उपयोग करने से पहले BMMSC तीन बार (पी 3)।
    2. आसंजन assays में चुनाव आयोग या एमएससी बोने के लिए - धारा 2 और 3 देखें।
  • बर्फ़ीली एमएससी:
    1. पारित होने के तीन अलग एमएससी की धारा 1.4 में वर्णित है। 3 मिलीलीटर बर्फ ठंड CryoSFM में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend। 1.5 मिलीलीटर बर्फ ठंड cryovials में सेल निलंबन की पिपेट 1 मिलीलीटर aliquots। एक ठंड कंटेनर में cryovials रखो।
    2. -80 डिग्री सीओ / एन पर कंटेनर स्टोर। तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण। एमएससी के पिघलना शीशी (अनुवर्ती 1.3.1 कदम - 1.3.6)। 5 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम में Resuspend एमएससी एक 25 सेमी 2 फ्लास्क में और बीज (उपयुक्त WJMSC या BMMSC के लिए मध्यम चुनें)।
  • 2. Ibidi Microslides पर अंतर्कलीय-mesenchymal स्टेम सेल सह संस्कृतियों की स्थापना

    1. (; धारा 1.4 के रूप में ~ 1.5 x 10 6 कोशिकाओं) चुनाव आयोग का एक मिला हुआ 25 सेमी 2 फ्लास्क Trypsinize। Resuspend ईसी 380 μl MSCGM में (1 x 25 सेमी 2 फ्लास्क आसंजन assays के सभी सेल Ty के लिए दो 6 चैनल Ibidi microslides (~ 1.25 एक्स 10 5 / चैनल), बीज होगाPES) MSCGM में सुसंस्कृत हैं। प्रत्येक चैनल के लिए चुनाव आयोग के निलंबन के 30 μl जोड़ें (इस केशिका क्रिया के माध्यम से विकास के क्षेत्र को कवर किया जाएगा)। 1 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर Ibidi microslide सेते हैं और 5%।
    2. प्रत्येक चैनल के लिए 140 μl MSCGM जोड़ें और फिर इसे बंद aspirate। 3 washes के एक कुल के लिए दो बार दोहराएँ। 24 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 140 μl MSCGM और जगह जोड़ें और 5%।
    3. सह संस्कृतियों के लिए एमएससी (धारा 1.4) को अलग। एक रुधिरकोशिकामापी या एक cellometer का उपयोग कर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं। 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के लिए एमएससी की एकाग्रता को समायोजित करें।
    4. (मध्यम में चैनल का ही विकास क्षेत्र छोड़कर) Ibidi चैनलों से महाप्राण अतिरिक्त मध्यम। Ibidi चैनलों के लिए एमएससी निलंबन की 30μl जोड़ें। चैनल के विकास के क्षेत्र से अलग हो गया था कि मध्यम Aspirate और एमएससी निलंबन की एक और 30 μl जोड़ें। एक बार फिर दोहराना और फिर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 <में इनक्यूबेटर में Ibidi microslide जगह1 घंटे के लिए / उप>।
    5. प्रत्येक चैनल के लिए 140 μl MSCGM जोड़ें और फिर इसे बंद aspirate। 3 washes के एक कुल के लिए दो बार दोहराएँ। 24 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हर चैनल और जगह के लिए 140 μl MSCGM के अंतिम मात्रा जोड़ें और 5%।
    6. 1 एक्स 10 5 यू / एमएल शेयर TNFα पिघलना और एक पतला: 100 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता (समकक्ष करने के लिए ~ 10 एनजी / एमएल) के लिए MSCGM में 1000। 10 यू / एमएल प्राप्त करने के लिए MSCGM में 1:10 से 100 यू / एमएल TNFα गिराए द्वारा एक सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। एक यू / मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए MSCGM में 1:10 से 10 यू / एमएल TNFα पतला।
    7. परख करने से पहले 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर TNFα के साथ चैनल को समझो। साइटोकाइन इलाज के दौरान तापमान के उतार चढ़ाव मनाया न्युट्रोफिल भर्ती का पैटर्न बदल जाएगा। अनुपचारित चैनलों के लिए ताजा MSCGM जोड़ें।

    3. Endothelial-Mesenchymal फिल्टर पर सेल सह संस्कृतियों स्टेम की स्थापना

    1. धारा 1.4 में वर्णित के रूप में WJ या BMMSC अलग करें। गोली Resuspend1 मिलीलीटर MSCGM में। एक रुधिरकोशिकामापी या एक cellometer का उपयोग कर एक कोशिका गिनती कोशिकाओं प्रदर्शन करते हैं।
    2. अंतिम एकाग्रता MSCGM के 500 μl में 5 एक्स 10 5 एमएससी है कि इतनी मात्रा समायोजित करें।
    3. का प्रयोग बाँझ संदंश एक बाँझ बॉक्स में 6 अच्छी तरह से, 0.4 माइक्रोन पीईटी Transwell फिल्टर और जगह पलटना।
    4. फिल्टर की बाहरी सतह पर बीज 5 एक्स 10 5 एमएससी। 1 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर सेते हैं और 5%।
    5. फिल्टर की बाहरी सतह से मीडिया लीजिए। मीडिया में गैर पक्षपाती एमएससी की संख्या की गणना। 3 मिलीग्राम MSCGM युक्त मिलान 6 अच्छी तरह से थाली में बाँझ संदंश और जगह का उपयोग कर पुन: पलटना फिल्टर।
    6. फिल्टर (चित्रा 1 बी) की अंदरूनी सतह पर MSCGM के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 24 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रखें और 5%। (; धारा 1.4 के रूप में चित्रा 1Ai) चुनाव आयोग का एक मिला हुआ 25 सेमी 2 फ्लास्क Trypsinize।
    7. 8 मिलीलीटर MSCGM में चुनाव आयोग Resuspend (1 एक्स 25cm 2 फ्लास्क वाईडालूँगा बीज चार 6 अच्छी तरह से फिल्टर; ~ 5 एक्स 5 10 ईसी / फिल्टर)। झरझरा फिल्टर के ऊपर और नीचे से महाप्राण मध्यम। (फिल्टर नीचे) निचले सदन में 3 मिलीलीटर ताजा MSCGM जोड़ें। प्रत्येक फिल्टर के भीतरी सतह के लिए 2 मिलीलीटर चुनाव आयोग निलंबन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    8. महाप्राण मध्यम गैर पक्षपाती चुनाव आयोग से धो लें और ताजा MSCGM के साथ बदलने के लिए। पहली बोने एमएससी बिना भीतरी सतह पर कोशिकाओं बोने से समानांतर चुनाव आयोग मोनो-संस्कृति फिल्टर सेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं और 5% सीओ 2।
    9. चुनाव आयोग की monolayer मिला हुआ है और कोई अंतराल होता है कि जाँच करें। उप मिला हुआ monolayers आसंजन assays के (चित्रा 1 बी) के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।
    10. 1, 10, या 100 यू / एमएल TNFα साथ फिल्टर के ऊपरी और निचले कक्षों समझो (समकक्ष करने के लिए ~ 10 एनजी / एमएल) के चार घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (धारा 2 में वर्णित) परख करने के लिए पहले।

    Leukocytes की 4. अलगाव

    1. शिरापरक लोस्वस्थ स्वयंसेवकों और विभाज्य से तुरंत EDTA के ट्यूबों में खून। उलटें ट्यूबों धीरे मिश्रण करने के लिए।
    2. एक 10 एमएल में 2.5 मिलीलीटर Histopaque 1119 पर 1077 Histopaque परत 2.5 मिलीलीटर दौर ट्यूब तली। लेयर 5 मिलीलीटर Histopaque ढाल पर पूरे रक्त। आरटी पर 40 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. (एरिथ्रोसाइट परत के ऊपर) Histopaque 1077 और 1119 के इंटरफेस पर फसल परिधीय polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (PMN)। दौर ट्यूब तली एक 10 एमएल में रखें और PBSA के साथ 10 मिलीलीटर अप करने के लिए बनाते हैं। धीरे आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर ट्यूब और अपकेंद्रित्र पलटना।
    4. (; PBSA / वी डब्ल्यू) 0.15% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए (कैल्शियम और मैग्नीशियम क्लोराइड) के साथ 100 मिलीलीटर पीबीएस में 7.5% BSA समाधान 01:50 पतला। 10 मिलीलीटर PBSA में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend। आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. 1 मिलीलीटर PBSA में Resuspend। सेल निलंबन के 20 μl विभाज्य लो और 380 μl PBSA (01:20 कमजोर पड़ने) के लिए जोड़ें। एक रुधिरकोशिकामापी या एक cellometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। आवश्यक conce के लिए पतलाntration PBSA में (Transwell फिल्टर और Ibidi microslide के लिए 1 एक्स 10 6 / एमएल)। परख तक आरटी पर न्युट्रोफिल निलंबन बनाए रखें।

    5. प्रवाह प्रणाली कोडांतरण

    1. चित्रा 1C के रूप में दिखाया प्रवाह प्रणाली की स्थापना की। हीटर पर मुड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। एक 3-तरह के नल के लिए एक 20 मिलीलीटर सिरिंज (सवार निकालने के लिए) और एक 5 मिलीलीटर सिरिंज संलग्न। Micropore टेप का उपयोग Perspex चैम्बर के लिए नल संलग्न।
    2. उपाय और लगभग वाल्व और 3 तरह के नल के बीच की दूरी है कि सिलिकॉन 2/4 मिमी (मोटी) ट्यूबिंग का एक लंबा टुकड़ा काट। 03/01 मिमी (पतली) टयूबिंग की 10 मिमी लंबा टुकड़ा और मोटी ट्यूबिंग के एक छोर में डालने - एक 8 काटें। 3-तरह के नल पर मोटी ट्यूबिंग पक्ष संलग्न।
    3. इलेक्ट्रॉनिक 3 तरह microvalve के एक बंदरगाह पर पतली ट्यूबिंग अंत कनेक्ट। यह "धोने जलाशय है।" मोटी और पतली ट्यूबिंग के 8 मिमी लंबा टुकड़ा - एक 6 काटें।
    4. मोटी ट्यूबिंग के एक छोर में पतली ट्यूबिंग डालें। ATTमोटी ट्यूबिंग एक 2 मिलीलीटर सिरिंज पर अंत ach (सवार निकालने के लिए)।
    5. "नमूना जलाशय बनाने के लिए" इलेक्ट्रॉनिक microvalve पर एक बंदरगाह पर दो मिलीलीटर सिरिंज की पतली ट्यूबिंग अंत कनेक्ट। मापने और microvalve और माइक्रोस्कोप मंच के केंद्र के बीच की दूरी है कि पतली ट्यूबिंग का एक लंबा टुकड़ा काटने से फिल्टर प्रवाह चैम्बर के लिए वाल्व कनेक्ट करें।
    6. पतली ट्यूबिंग का अंत करने के लिए मोटी टयूबिंग की 10 मिमी टुकड़ा - microslide मॉडल के लिए, एक 8 देते हैं। मोटी ट्यूबिंग का अंत करने के लिए कनेक्टर के आकार का एक एल रखें। इस microslide से कनेक्ट करेगा। पतली ट्यूबिंग का अंत करने के लिए ट्यूबिंग जोड़ने Portex ब्लू लाइन दबाव नापने का यंत्र के 10 मिमी टुकड़ा - फिल्टर मॉडल के लिए, एक 8 देते हैं।
    7. Microvalve पर पतली ट्यूबिंग अंत रखें। इस धोने और नमूना जलाशयों के लिए आम उत्पादन होता है। PBSA साथ जलाशयों भरें। किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए उन के माध्यम से PBSA बह द्वारा प्रधानमंत्री ट्यूबिंग।
    8. एक 29 मिमी (50 एमएल) के गिलास के लिए दबाव नापने का यंत्र ट्यूबिंग संलग्न करेंyringe। 10 मिलीलीटर PBSA साथ भरने के द्वारा प्रधानमंत्री सिरिंज। ट्यूबिंग से जुड़ा अंत ऊपर की ओर का सामना कर रहा है, ताकि सिरिंज पलटना और सभी हवाई बुलबुले बाहर धक्का। 5 मिलीलीटर PBSA के साथ फिर से भरना।
    9. कांच सिरिंज के लिए अग्रणी दबाव नापने का यंत्र ट्यूबिंग का अंत करने के लिए मोटी टयूबिंग की 12 मिमी टुकड़ा - केवल microslide मॉडल के लिए, एक 10 देते हैं। मोटी ट्यूबिंग के अंत पर कनेक्टर के आकार का एक एल रखें। आसव / वापसी के लिए एक सिरिंज पंप में कांच सिरिंज रखें।
    10. 0.1 पेंसिल्वेनिया (Transwell फिल्टर) या 0.05 पेंसिल्वेनिया (Ibidi microslides) निम्न सूत्र का उपयोग करने के लिए वांछित दीवार कतरनी तनाव उत्पन्न करने के लिए आवश्यक फिर से भरना प्रवाह की दर (क्यू) (τ पास्कल में डब्ल्यू, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) की गणना:
      γ डब्ल्यू = (6.Q) / (क 2)
      τ = n.γ
      कहां डब्ल्यू = आंतरिक चौड़ाई और प्रवाह चैनल के एच = आंतरिक गहराई। एन = बह समाधान की चिपचिपाहट; PBSA एन = 0.7 mPa.s. है समानांतर थाली फिल्टर प्रवाह चैम्बर के लिए, चौड़ाई (डब्ल्यू) 4 मिमी और गहराई (ज) 0.133 मिमी है। घचैंबर के epth वजह से इस्तेमाल किया Parafilm के गैस्केट की मोटाई में अंतर करने के लिए थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। Ibidi microslide के लिए, चौड़ाई 3.8 मिमी है और गहराई 0.4 मिमी है।
      नोट: प्रवाह चैनल के आयाम, और कब्जा गतिशीलता में अंतर करने के लिए हम फिल्टर मॉडल 6 की तुलना में microslide मॉडल के लिए अलग कतरनी तनाव उपयोग के कारण।

    6. फिल्टर शामिल समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर की स्थापना

    1. एक धातु टेम्पलेट का उपयोग कर parafilm का एक टुकड़ा (कांच coverslip के रूप में एक ही आकार के) में कटौती। एक धातु टेम्पलेट का उपयोग कर (प्रवाह चैनल बनाने के लिए) Parafilm में एक 20 x 4 मिमी स्लॉट काट दिया। कांच coverslip पर प्रवाह चैनल चिह्नित करने के लिए गैसकेट का प्रयोग करें।
    2. कांच coverslip पर 6 अच्छी तरह से फिल्टर के किनारों संरेखित करें। फिल्टर प्रवाह चैनल चिह्नों को शामिल किया गया है कि यह सुनिश्चित करें। ध्यान से एक प्रकार 10A स्केलपेल का उपयोग फिल्टर काट दिया।
    3. ध्यान से, यह सुनिश्चित करने के लिए एक Parafilm के गैसकेट के साथ फिल्टर है कि कवर प्रवाह चैनलस्लॉट फिल्टर (चित्रा -1) के बीच में है। साफ ऊतक का एक टुकड़ा का प्रयोग करें और किसी भी बुलबुले बाहर धक्का।
    4. Perspex प्रवाह कक्ष के नीचे प्लेट के अवकाश में coverslip जगह। गैसकेट के शीर्ष पर शीर्ष Perspex थाली स्थिति और एक साथ प्लेट (चित्रा -1) पेंच।
    5. धोने बफर (PBSA) वाल्व के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए 3 तरह नल चालू करें। शीर्ष Persex थाली के इनलेट बंदरगाह के लिए दबाव नापने का यंत्र ट्यूबिंग कनेक्ट करें। बुलबुले के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रवाह चैनल के माध्यम से PBSA चलाएँ।
    6. Perspex थाली के आउटलेट बंदरगाह में सिरिंज पंप से दबाव नापने का यंत्र ट्यूबिंग कनेक्ट करें। फिर से भरना और प्रेस चलाने के लिए सिरिंज पंप सेट करें। चैंबर के ऊपरी प्लेट पर dripped गया है कि किसी भी PBSA साफ करें।
    7. एक औंधा चरण विपरीत खुर्दबीन के मंच पर चैम्बर रखें। फिल्टर के ऊपर चुनाव आयोग (चित्रा 1 बी) कल्पना करने के लिए ध्यान केंद्रित करने को समायोजित करें।

    7. फ्लो <के लिए Microslides स्थापना/ P>

    1. एक औंधा चरण विपरीत खुर्दबीन के मंच पर microslide रखें। एक चैनल के इनलेट पोर्ट में एल आकार का कनेक्टर से कनेक्ट करें। प्रवाह चैनल के माध्यम से PBSA चलाएँ।
    2. चैनल के आउटलेट बंदरगाह में सिरिंज पंप से कनेक्टर के आकार एल रखें। फिर से भरना और प्रेस चलाने के लिए सिरिंज पंप सेट करें। Microslide पर dripped गया है कि किसी भी PBSA साफ करें। चुनाव आयोग monolayer की कल्पना करने के लिए ध्यान केंद्रित करने को समायोजित करें।

    Leukocytes ओवर endothelial कोशिकाओं की 8. छिड़काव

    1. नमूना जलाशय में शुद्ध neutrophils के 2 मिलीलीटर रखो और 2 मिनट के लिए गर्म करने के लिए छोड़ दें। 2 मिनट के लिए PBSA साथ अन्तःचूचुक धो लें।
    2. अन्तःचूचुक अधिक न्यूट्रोफिल छिड़कना पर वाल्व मुड़ें। 4 मिनट के लिए न्युट्रोफिल सांस में वितरित करें। वाल्व को बंद करें और प्रयोग के शेष के लिए धोने के जलाशय से PBSA छिड़कना।
    3. इस चुनाव आयोग monolay बाधित करेगा के रूप में बुलबुले परख के दौरान किसी भी बिंदु पर प्रवाह चैनल के माध्यम से पारित नहीं है कि हवा सुनिश्चितएर और पक्षपाती neutrophils के कारण टुकड़ी।

    9. रिकॉर्डिंग न्युट्रोफिल कैद और व्यवहार

    1. रिकॉर्ड न्युट्रोफिल भर्ती या तो न्युट्रोफिल प्रवाह या बाद के छिड़काव के दौरान।
    2. प्रवाह चैनल के केंद्र में 10 क्षेत्रों - कम से कम 5 के सभी डिजिटल रिकॉर्डिंग कर। इनलेट बंदरगाह पर चैनल के किनारे करने के उद्देश्य से चलती है और बंदरगाह के बीच की पहचान करके चैनल के केंद्र को पहचानें।
      1. न्युट्रोफिल प्रवाह के दौरान रिकॉर्डिंग के लिए, एक मिनट के लिए एक ही क्षेत्र में हर 10 सेकंड की छवियों को ले लो। चैनल के साथ ले जाएँ और एक मिनट के लिए एक और क्षेत्र रिकॉर्ड है। सांस की अवधि के लिए दोहराएँ।
      2. (न्युट्रोफिल सांस के अंत के बाद आम तौर पर 2 मिनट) ल्युकोसैट व्यवहार का आकलन करने के लिए प्रवाह चैनल के केन्द्र नीचे 10 क्षेत्रों - पोस्ट-छिड़काव की रिकॉर्डिंग के लिए, 5 की 10 सेकंड रिकॉर्डिंग करते हैं। छवियों 10 सेकंड के अंतराल के भीतर हर दूसरा ले लो। इस प्रवाह से कब्जा है और अनुयायी neutro के व्यवहार के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता हैफिल्स का विश्लेषण किया जाना है।
      3. छवियाँ हर 30 सेकंड ले रही है, 5 मिनट के लिए कम से कम 10 transmigrated न्यूट्रोफिल युक्त एक भी क्षेत्र रिकार्ड। यह (ऊपर या अन्तःचूचुक के नीचे या तो) माइग्रेट कोशिकाओं के वेग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      4. 10 सेकंड के क्षेत्रों (आमतौर पर 9 मिनट के बाद छिड़काव) की एक और श्रृंखला रिकॉर्ड है। इस न्यूट्रोफिल समय endothelial monolayer के माध्यम से विस्थापित करने के लिए अनुमति देता है।
      5. सिरिंज पंप बंद करो और ट्यूबिंग को हटा दें। प्रवाह चैम्बर अलग करना और नमूना जलाशय और ट्यूबिंग कुल्ला। बाद में फिल्टर / microslide चैनलों के लिए दोहराएँ।

    ल्युकोसैट भर्ती और व्यवहार के 10 विश्लेषण

    1. 2 मिनट समय बिंदु पर 10 सेकंड की रिकॉर्डिंग के दौरान प्रत्येक क्षेत्र में neutrophils की संख्या की गणना। सभी कोशिकाओं में गिना जा क्रम में प्रथम, द्वितीय क्षेत्र में मौजूद होना चाहिए। देखने के क्षेत्र के दो पक्षों (जैसे, ऊपर / दाहिने हाथ की सीमा) पर क्षेत्र में आंशिक रूप से कर रहे हैं कि कोशिकाओं में शामिल किए गए हैंमायने रखता है, जब तक कि वे पूरे 10 सेकंड के लिए क्षेत्र में रहने के रूप में।
    2. क्षेत्र के प्रति पक्षपाती न्युट्रोफिल का मतलब संख्या की गणना। दर्ज मैदान की लंबाई और चौड़ाई को मापने। क्षेत्र के क्षेत्र की गणना करें। 1 2 मिमी में कितने क्षेत्रों वहाँ की गणना। 1 मिमी 2 में क्षेत्रों की संख्या से मतलब न्यूट्रोफिल गणना गुणा करें।
    3. Perfused neutrophils की राशि गुणा करके perfused neutrophils की कुल संख्या की गणना (जैसे, 2 एक्स 10 6 / एमएल * क्यू [जैसे, समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर के लिए 0.0999 मिलीग्राम / मिनट]) सांस की अवधि (जैसे, 4 मिनट )।
    4. पालन ​​किया है कि कोशिकाओं की कुल संख्या (पक्षपाती कोशिकाओं / मिमी perfused 2/10 6) निर्धारित करने के लिए perfused neutrophils की कुल संख्या से न्युट्रोफिल गिनती / 2 मिमी फूट डालो।
    5. पक्षपाती न्यूट्रोफिल मजबूती से पक्षपाती या (अनुपूरक वीडियो 1 और 2) transmigrated, चल रहे हैं कि क्या आकलन करें।
      1. एकन्युट्रोफिल रोलिंग चरण उज्ज्वल है और धीरे धीरे endothelial monolayer के साथ कदम होगा (1 - 10 माइक्रोन / सेक, पूरक वीडियो 1)।
      2. मजबूती से पक्षपाती कोशिकाओं या तो (यानी, रिकॉर्डिंग के दौरान चलती नहीं) या आकार परिवर्तन आया है और चुनाव आयोग की सतह (चित्रा 1Ei) पर पलायन कर रहे हैं स्थिर शेष, चुनाव आयोग की सतह के लिए चरण उज्ज्वल है और बाध्य कर रहे हैं।
      3. एक transmigrated न्युट्रोफिल अंधेरे और चुनाव आयोग परत (चित्रा 1Eii) नीचे चरण है।
    6. स्थिर और transmigrated, चल रहे हैं कि पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना। वैकल्पिक रूप से, न्यूट्रोफिल व्यवहार (- 10.7 चरणों 10.6 में वर्णित है) कुल आसंजन की गणना करने के लिए इस्तेमाल एक ही फार्मूला लागू करने के द्वारा अलग अलग व्यवहार प्रदर्शित कि कुल सेल नंबर के रूप में व्यक्त किया जा सकता है।
      1. मार्क एक रोलिंग न्युट्रोफिल के अग्रणी धार। 10 सेकंड के अनुक्रम के अंत में एक ही सेल के अग्रणी धार निशान। एक पंक्ति शर्त ड्रादो अंक समझना और सेल कूच किया है कि दूरी को मापने।
      2. सेल चल रहा है, जिसमें रिकॉर्डिंग (यानी, 10 सेकंड) की अवधि के द्वारा इस मूल्य फूट डालो। कोशिश करो और पूरे 10 सेकंड के अंतराल के लिए मैदान में हैं कि न्यूट्रोफिल का चयन करें।
    7. सतह (आकार बदल चरण उज्ज्वल) या अन्तःचूचुक (चरण अंधेरे) के नीचे से अधिक पलायन neutrophils के वेग की गणना करने के लिए (अनुपूरक वीडियो 2) रिकॉर्डिंग 5 मिनट का उपयोग करें।
      1. अनुक्रम की शुरुआत में माइग्रेट कोशिकाओं की एक रूपरेखा ड्रा और अनुक्रम भर में उनके आंदोलनों को ट्रैक। प्रत्येक कक्ष के लिए हर एक मिनट के अंतराल पर केन्द्रक की एक्स और वाई पदों के नोट करें। दूसरी छवि में मूल्यों से अनुक्रम की पहली छवि से एक्स और वाई स्थिति के मान को घटाना। इस पाइथागोरस प्रमेय पर आधारित है।
      2. तीसरा छवि से दूसरे छवि से मूल्यों को घटाना। इस क्रम में सभी छवियों के लिए यह करो। स्क्वायर टीवह एक्स और वाई मूल्यों और उन्हें एक साथ जोड़ें।
      3. वर्गमूल जिसके परिणामस्वरूप मूल्य। प्रत्येक मिनट के अंतराल पर गणना वेग के औसत से प्रत्येक कक्ष के लिए वेग की गणना। 10 ट्रैक न्यूट्रोफिल चले गए और मतलब वेग की गणना।

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    Representative Results

    प्रारंभ में, हम Ibidi microslide मॉडल (- 9 धारा 7) का उपयोग प्रवाह से neutrophils की भर्ती पर TNFα के साथ चुनाव आयोग उत्तेजक के प्रभाव का विश्लेषण किया। TNFα, किसी भी न्यूट्रोफिल endothelial monolayer का पालन थोड़ा अगर (2A चित्रा) के अभाव में। यह 25,26 बाध्यकारी समर्थन करने के लिए आवश्यक आसंजन अणु (selectins) या chemokines व्यक्त नहीं करते ईसी आराम / इलाज के रूप में, उम्मीद थी। इसके विपरीत, साइटोकाइन उत्तेजना काफी एक खुराक पर निर्भर ढंग (2A चित्रा) में अन्तःचूचुक को न्युट्रोफिल आसंजन वृद्धि हुई है। आसंजन सामान्य रूप से परख के पाठ्यक्रम पर स्थिर बनी हुई है। अनुपचारित अन्तःचूचुक को leukocytes के बंधन चुनाव आयोग सक्रिय कर रहे हैं या तो (यानी, संस्कृति की प्रक्रिया के दौरान LPS के साथ दूषित) और / या न्यूट्रोफिल अलगाव की प्रक्रिया के दौरान सक्रिय थे कि इंगित करता है। दरअसल, LPS ICAM-1 और कुलपति, ई selectin की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया हैपूर्वाह्न -1 उन्हें न्यूट्रोफिल बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए चुनाव आयोग की सतह पर 25-27।

    भर्ती neutrophils के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए जब हम आम तौर पर endothelial monolayer (चित्रा -2) के माध्यम से पलायन neutrophils के प्रतिशत में एक सहवर्ती खुराक निर्भर वृद्धि के साथ (चित्रा 2B) रोलिंग neutrophils के प्रतिशत में एक खुराक पर निर्भर कमी निरीक्षण करते हैं। TNFα उत्तेजना (1 यू / एमएल) न्यूट्रोफिल का एक बड़ा अनुपात की कम मात्रा से कम वे अन्तःचूचुक (चित्रा 2 बी) के शिखर सतह से जुड़े होते हैं दर्शाता है कि चरण उज्ज्वल दिखाई देते हैं। इसके विपरीत, 10 और 100 यू / एमएल (अधिक मात्रा) में भर्ती neutrophils के लगभग 40% इन कोशिकाओं endothelial monolayer के माध्यम से चले गए और अन्तःचूचुक (चित्रा -2) के नीचे हैं यह दर्शाता है कि दो मिनट में चरण अंधेरा दिखाई देते हैं। स्थानांतरगमन पहुँचने के मीटर के साथ, 2 मिनट - न्यूट्रोफिल 1 के भीतर चुनाव आयोग के माध्यम से विस्थापित करने में सक्षम हैं~ 10min के बाद छिड़काव 28 पर aximal स्तरों। यहाँ हम 9 मिनट पद छिड़काव (चित्रा -2) द्वारा 60% करने के लिए 2 मिनट में 40% से न्यूट्रोफिल स्थानांतरगमन में वृद्धि मनाया। न्यूट्रोफिल - हम (~ 3 माइक्रोन / सेक) रोलिंग या (12 माइक्रोन / मिनट ~ 10) पलायन के वेग पर TNFα एकाग्रता का कोई प्रभाव नहीं मनाया।

    फिल्टर आधारित मॉडल में, TNFα उत्तेजना Ibidi microslide मॉडल (चित्रा 3 ए) का उपयोग कर देखा है कि इसी तरह एक खुराक पर निर्भर तरीके से न्यूट्रोफिल आसंजन वृद्धि हुई है। प्रतिशत स्थानांतरगमन में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि (चित्रा -3 सी) मनाया गया whilst के व्यवहार के संदर्भ में, न्यूट्रोफिल रोलिंग, TNFα खुराक (3B चित्रा) से अप्रभावित था। प्रयोगों की इस श्रृंखला में हम न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन (चित्रा -3 सी) पर समय का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव मनाया।

    हम दो अलग अलग सह संस्कृति निर्माणों को उत्पन्न करने के लिए पर तरीकों, में से प्रत्येक प्रदान करते हैंजो विशिष्ट सवालों के जवाब देने के लिए तैयार है। Ibidi microslide मॉडल में, चुनाव आयोग और एमएससी एक दूसरे के साथ सीधे संपर्क में एक भी monolayer में सुसंस्कृत हैं। इस मॉडल को खून में एमएससी के चिकित्सीय इंजेक्शन के प्रभाव और चुनाव आयोग monolayer में उनके बाद के एकीकरण की जांच के लिए उपयोगी है। फिल्टर आधारित मॉडल में इसके विपरीत, चुनाव आयोग और एमएससी पास में फिल्टर के विपरीत दिशा में सुसंस्कृत, लेकिन जरूरी नहीं कि सीधे संपर्क में हैं। यह और अधिक बारीकी से endothelial कोशिकाओं रक्त वाहिका का प्रतिनिधित्व एक monolayer के गठन, और एमएससी subendothelial डिब्बे में रहने के साथ, ऊतक जैसा दिखता है। इस साइटोकाइन उत्तेजना के लिए चुनाव आयोग की प्रतिक्रिया पर ऊतक निवासी एमएससी के प्रभाव की जांच करने के लिए हमें की अनुमति देता है।

    अपने अनुभवों के आधार पर, हम चुनाव आयोग 100 यू / एमएल TNFα साथ प्रेरित कर रहे हैं जब अधिक से अधिक न्युट्रोफिल भर्ती और transendothelial प्रवास होता है कि निरीक्षण करते हैं। जैसे, हम एमएससी सह संस्कृति के प्रभाव की जांच करने के लिए इस एकाग्रता का इस्तेमाल किया हैप्रवाह से न्यूट्रोफिल के endothelial भर्ती पर। यहाँ, हम चुनाव आयोग, हालांकि, एमएससी के अन्य प्रकार के भी जांच की जा सकती जैसे WJMSC microslide और फिल्टर आधारित मॉडल का उपयोग कर के साथ सह-संस्कृति में BMMSC के लिए डेटा प्रस्तुत करते हैं। चुनाव आयोग अकेले सुसंस्कृत (चित्रा -4 ए) की तुलना में जब दोनों मॉडलों में BMMSC की उपस्थिति काफी चुनाव आयोग को न्युट्रोफिल आसंजन कम कर दिया। सह संस्कृति चुनाव आयोग पर अकेले या एमएससी (चित्रा 4 बी और सी) के साथ सुसंस्कृत मनाया रोलिंग और स्थानांतरगमन के समान स्तर के साथ भर्ती neutrophils के व्यवहार पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। इस प्रकार, एमएससी प्रवाह से न्युट्रोफिल भर्ती समर्थन करने के लिए उनकी क्षमता को दबा जो साइटोकाइन उत्तेजना, के लिए चुनाव आयोग की प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकते हैं।

    चित्रा 1
    चित्रा 1. चुनाव आयोग एमएससी सह संस्कृति की स्थापना और एक प्रवाह आधारित आसंजन परख का उपयोग न्युट्रोफिल भर्ती का विश्लेषण। (ए) (i) के प्राथमिक चुनाव आयोग और (ii) पारित होने के तीन BMMSC की मजबूत> सूक्ष्मछवि टिशू कल्चर बोतल पर हो। 6 अच्छी तरह से Transwell फिल्टर सम्मिलित करता है पर चुनाव आयोग और एमएससी के (बी) सूक्ष्मछवि सुसंस्कृत। छिड़काव प्रणाली (सी) आरेख उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया (मैं) दृढ़ता से पक्षपाती (एफए) और (ii) transmigrated (टीएम) न्यूट्रोफिल चुनाव आयोग को प्रवाह से भर्ती निम्नलिखित का प्रवाह। (डी) समानांतर थाली फिल्टर प्रवाह कक्ष की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ई) सूक्ष्मछवि 100 यू / एमएल TNFα के साथ प्रेरित । छवियां सी और डी के आण्विक जीवविज्ञान के तरीके में आंकड़े 2 और 3 से ले रहे हैं:। टी सेल तस्करी, 2010, स्प्रिंगर विज्ञान और व्यापार मीडिया से रज़ामंदी के साथ पीजी 53-54 28 इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।


    4 घंटे के लिए - (100 यू / एमएल 0) Ibidi microslides का उपयोग कर TNFα उत्तेजित चुनाव आयोग को प्रवाह से चित्रा 2. न्युट्रोफिल भर्ती चुनाव आयोग TNFα की बढ़ती सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया। Neutrophils के एक 4 मिनट सांस में 2 मिनट पर मूल्यांकन 0.05 फोनों के लिए। (ए) न्युट्रोफिल आसंजन पर चुनाव आयोग की monolayer अधिक perfused किया गया था। एनोवा न्युट्रोफिल आसंजन, पी <0.01 पर TNFα उपचार का एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया। न्युट्रोफिल व्यवहार 2 और 9 मिनट पर मूल्यांकन और (बी) रोलिंग या (सी) transmigrated थे कि पक्षपाती कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। एनोवा पक्षपाती न्यूट्रोफिल, पी <0.001 के व्यवहार पर TNFα उपचार का एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया। सी में, एनोवा transmigrated न्यूट्रोफिल पी <0.01 पर समय का एक महत्वपूर्ण दिखाया। डाटा एन = 3 प्रयोगों से ± SEM के मतलब कर रहे हैं। * पी <0.05 और **Dunnett के बाद परीक्षण द्वारा unstimulated (0 यू / एमएल) के चुनाव आयोग के नियंत्रण की तुलना में पी <0.01। ## पी <0.01 और ### Bonferroni के बाद से एक ही समय बिंदु पर एक यू / एमएल चुनाव आयोग की तुलना में पी <0.001 टेस्ट।

    चित्रा 3
    4 घंटे के लिए - (100 यू / एमएल 0) फिल्टर आधारित परख का उपयोग TNFα उत्तेजित चुनाव आयोग को प्रवाह से चित्रा 3. न्युट्रोफिल भर्ती चुनाव आयोग TNFα की बढ़ती सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया। Neutrophils के एक 4 मिनट सांस में 2 मिनट पर मूल्यांकन 0.1 फोनों के लिए। (ए) न्युट्रोफिल आसंजन पर चुनाव आयोग की monolayer अधिक perfused किया गया था। एनोवा न्युट्रोफिल आसंजन, पी <0.001 पर TNFα उपचार का एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया। न्युट्रोफिल व्यवहार 2 और 9 मिनट पर मूल्यांकन और (बी) रोलिंग या (सी) transmigrated थे कि पक्षपाती कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। सी में, एनोवा थानेदारन्युट्रोफिल स्थानांतरगमन, पी <0.05 पर समय और साइटोकाइन उपचार का एक महत्वपूर्ण प्रभाव से शादी की। डाटा एन = 3 प्रयोगों से ± SEM के मतलब कर रहे हैं। ** पी <0.01 और *** पी <Bonferroni डाक द्वारा एक ही समय बिंदु पर एक यू / एमएल चुनाव आयोग की तुलना में Dunnett के बाद परीक्षण। # पी <0.05 से unstimulated (0 यू / एमएल) के चुनाव आयोग के नियंत्रण की तुलना में 0.001 -टेस्ट।

    चित्रा 4
    TNFα उत्तेजित चुनाव आयोग BMMSC सह संस्कृतियों के लिए प्रवाह से चित्रा 4. न्युट्रोफिल भर्ती। BMMSC से पहले 4 घंटे के लिए 100 यू / एमएल TNFα साथ उत्तेजना के लिए 24 घंटे के लिए चुनाव आयोग के साथ सह सुसंस्कृत थे। Neutrophils के एक 4 मिनट सांस (ए, सी, ई) microslides के लिए 0.05 पा और (बी, डी, एफ) फिल्टर के लिए 0.1 पा पर चुनाव आयोग की monolayer अधिक perfused किया गया था। (एबी) न्युट्रोफिल आसंजन 2 मिनट में मूल्यांकन किया गया था। न्युट्रोफिल व्यवहार 2 और 9 मीटर की ऊंचाई पर मूल्यांकन किया गया थामें और (सीडी) रोलिंग या transmigrated (एफई) थे कि पक्षपाती कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। सी और डी में, एनोवा न्युट्रोफिल रोलिंग, पी <0.05 पर संस्कृति की स्थिति की एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया। और एफ में, एनोवा न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन, पी <0.05 पर समय का एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया। हालांकि, कोई महत्वपूर्ण मतभेद Bonferroni के बाद परीक्षण द्वारा अलग-अलग उपचार के बीच स्थानांतरगमन में मनाया गया। डाटा एन = 5 प्रयोगों से ± SEM के मतलब कर रहे हैं। * पी <0.05 बनती टी परीक्षण या Bonferroni के बाद परीक्षण द्वारा चुनाव आयोग मोनोकल्चर की तुलना में।

    न्युट्रोफिल रोलिंग वेग के पूरक 1 वीडियो विश्लेषण। एक Transwell फिल्टर पर सुसंस्कृत चुनाव आयोग 4 घंटे के लिए 100 यू / एमएल TNFα साथ प्रेरित किया गया। Neutrophils के एक सांस 4min के लिए चुनाव आयोग से अधिक perfused किया गया था। एक एकल 10 सेकंड क्षेत्र के प्रतिनिधि डिजीटल अनुक्रम दो लियामिनट के बाद छिड़काव। 10 सेकंड के अनुक्रम का शुरू से अंत तक एक भी रोलिंग न्यूट्रोफिल की स्थिति में परिवर्तन न्युट्रोफिल चल रहा है, जिस पर वेग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    न्युट्रोफिल प्रवास वेग के पूरक वीडियो 2. विश्लेषण। चुनाव आयोग एक Transwell फिल्टर पर सुसंस्कृत 4 घंटे के लिए 100 यू / एमएल TNFα साथ प्रेरित किया गया। Neutrophils के एक सांस में चार मिनट के लिए चुनाव आयोग से अधिक perfused किया गया था। एक भी 5 मिनट क्षेत्र के प्रतिनिधि डिजीटल अनुक्रम transmigrated neutrophils के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए। इस वेग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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    Discussion

    यहाँ हम सूजन अन्तःचूचुक द्वारा न्यूट्रोफिल परिसंचारी की भर्ती के अध्ययन के लिए दो में इन विट्रो "संवहनी" मॉडल का वर्णन है। इन मॉडलों का एक प्रमुख लाभ vivo में घटित होता है, के रूप में आदेश ल्युकोसैट आसंजन झरना में हर कदम का विश्लेषण करने की क्षमता है। हम पहले TNFα उत्तेजित चुनाव आयोग 9,29 के माध्यम से एक खुराक पर निर्भर करने के लिए न्युट्रोफिल आसंजन में वृद्धि हुई है और स्थानांतरगमन मनाया है। हम भी दोनों मॉडलों ल्युकोसैट भर्ती पर stromal कोशिकाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे का वर्णन। इधर, एमएससी एक Ibidi microslide में या एक झरझरा फिल्टर के विपरीत दिशा में चुनाव आयोग के साथ सह सुसंस्कृत थे। यह दोनों प्रकार की कोशिकाओं, जिससे एक-दूसरे के फेनोटाइप और प्रतिक्रिया को संशोधित करने, एक दूसरे के साथ संवाद करने की अनुमति देता है। हम एमएससी की उपस्थिति TNFα उत्तेजित चुनाव आयोग को न्युट्रोफिल आसंजन दबा दिया, कि यहाँ दिखाया गया है, और पिछले अध्ययनों 23 में है। इस stromal कोशिकाओं चुनाव आयोग प्रतिक्रिया को संशोधित इंगित करता है किबाद में साइटोकिन्स और करने के लिए ल्यूकोसाइट्स परिसंचारी की भर्ती बदल।

    ऊपर वर्णित मॉडल के अलावा, Cellix biochips, Bioflux प्लेटें और Glyotech समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों व्यावसायिक रूप अन्तःचूचुक संवर्धन और भर्ती के अवलोकन के लिए एक सतह प्रदान उपलब्ध है कि प्रवाह चैनल प्रणालियों रहे हैं। सभी प्रणालियों में, कुछ मापदंडों एन्दोथेलिअल संस्कृतियों की स्थापना और नीचे और पिछली रिपोर्टों 30,31 में डाला जाता है, जिनमें से कुछ का प्रवाह आधारित आसंजन assays के प्रदर्शन whilst विचार किया जाना चाहिए। साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है कि इस तरह के hydrocortisone के रूप में किसी भी विरोधी भड़काऊ एजेंट, संस्कृति और परख 18,29 की अवधि के लिए मध्यम से छोड़े गए किया जाना चाहिए। इन चुनाव आयोग monolayer को बाधित करेगा के रूप में चुनाव आयोग की संस्कृति दौरान प्रवाह चैनल में मौजूद कोई हवाई बुलबुले हैं कि यह सुनिश्चित microslide Ibidi का उपयोग करते समय। cytoki को endothelial monolayer की अखंडता की पुष्टि की जानी चाहिए से पहलेNE-उपचार, न्यूट्रोफिल बीएसए microslide / फिल्टर लेपित किया गया है, जहां monolayer में अंतराल करने के लिए बाध्य होगा। यह TNFα तापमान के प्रति संवेदनशील है और केवल 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिक से अधिक प्रभाव पड़ता है क्योंकि चुनाव आयोग साइटोकाइन उत्तेजना भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी आवश्यक है। (- 48 घंटा 1) 30,31 प्रवाह परख खुद के लिए, एक उपयुक्त धोने बफर का चयन करें, हम आम तौर पर लंबे समय तक assays के लिए बीएसए (0.15%) के साथ पूरक कम assays के (कम से कम 30 मिनट) और M199 माध्यम के लिए PBSA का उपयोग करें। अंत में इस प्रवाह की दर, हर्जाना चुनाव आयोग monolayer बाधित और पक्षपाती न्यूट्रोफिल को सक्रिय रूप परख के दौरान प्रवाह चैनल में मौजूद कोई हवाई बुलबुले हैं कि सुनिश्चित करते हैं।

    यहाँ वर्णित बहु सेलुलर इन विट्रो मॉडल का प्रमुख लाभ में से एक चुनाव आयोग और stromal कोशिकाओं के बीच में विवो बातचीत को दोहराने के लिए अपनी क्षमता है। यह vivo में विशिष्ट स्ट्रोमल घटकों के प्रभाव को अलग करने के लिए मुश्किल हैऔर एक नियंत्रित तरीके से उन्हें संशोधित करने के लिए। हमारे मॉडल में, stromal कोशिकाओं वे चुनाव आयोग के साथ संवाद करने और स्वास्थ्य और रोग में भड़काऊ प्रक्रिया को कैसे प्रभावित करती स्पष्ट करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, siRNA प्रौद्योगिकी का उपयोग कर हम पहले उनके प्रतिरक्षादमनकारी प्रभाव 23 के लिए सह संस्कृति दौरान एमएससी द्वारा आवश्यक आईएल -6 की है कि उत्पादन किया गया था दिखाया है। प्रत्येक मॉडल यानी विशिष्ट प्रश्न, ल्युकोसैट भर्ती पर ऊतक निवासी stromal कोशिकाओं (फिल्टर आधारित मॉडल) या उपचारात्मक प्रशासित stromal कोशिकाओं (Ibidi microslides और अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम) के प्रभाव को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दोनों ही मामलों में हम उनकी व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए और भर्ती 15,25 पर प्रभाव का आकलन करने के लिए चुनाव आयोग को stromal सेल का एक उपयुक्त अनुपात की स्थापना के लिए अलग stromal सेल प्रकार titrated है। इसी प्रकार संस्कृति के माध्यम से मॉडल में शामिल प्रत्येक कोशिका के प्रकार के साथ संगत होना चाहिए। हमारे हाथ में सह संस्कृतियों आम तौर पर stromal सेल मीटर में प्रदर्शन कर रहे हैंedium 11,18,23,31।

    फिल्टर आधारित मॉडल का उपयोग करना, हम पहले से विभिन्न stromal कोशिकाओं एक ऊतक विशेष ढंग से आसंजन और leukocytes के माइग्रेशन का समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता मिलाना कि और इन प्रभावों पुराने रोगों तीन में बदल बन दिखाया है। इस stromal कोशिकाओं को सक्रिय रूप से सूजन के ऊतकों से 24 leukocytes की भर्ती को विनियमित जो ऊतक विशेष "पता कोड" की स्थापना उस अवधारणा का नेतृत्व किया। इन मॉडलों को विशेष रूप से महान विस्तार में भर्ती के प्रारंभिक चरणों की जांच के लिए तैयार है लेकिन (ऊतक में दूर अन्तःचूचुक से, यानी) subendothelial अंतरिक्ष के भीतर बाद प्रवास का अध्ययन करने में असमर्थ रहे हैं। इस तरह के एक स्थिर कोलेजन जेल परख 12,32 के रूप में बहु सेलुलर, बहुपरती 3 डी निर्माणों भर्ती की इन बाद के चरणों के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त होगा।

    हमारे प्रवाह आधारित आसंजन मॉडल अत्यधिक बहुमुखी हैं। हम des हैन्युट्रोफिल भर्ती के संदर्भ में उनके उपयोग cribed, लेकिन अन्य ल्युकोसैट सबसेट एक समान तरीके से जांच की जा सकती है। हम भी चुनाव आयोग 23 से एमएससी परिसंचारी की भर्ती की जांच के लिए Ibidi microslide प्रणाली का इस्तेमाल किया है, और यह एक ही आसंजन झरना के माध्यम से होता है कि क्या ल्यूकोसाइट्स के लिए सूचना दी है। इसी तरह इन मॉडलों भर्ती और metastatic ट्यूमर सेल लाइनों का समावेश, और endothelial प्रतिक्रियाएं और ल्युकोसैट भर्ती पर उनके बाद प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, फिल्टर आधारित मॉडल स्वस्थ ऊतकों 13,21 और रोग 11,18,20 की साइटों से stromal कोशिकाओं (जैसे, fibroblasts, podocytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं) के विभिन्न प्रकार के शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह चुनाव आयोग और / या ल्यूकोसाइट्स पर के स्तर पर अभिनय ऊतक विशेष नियामक रास्ते के अध्ययन के लिए सक्षम होगा। सभी मामलों में बीमारी की स्थिति की एक श्रेणी में सामान्य नियामक प्रक्रियाओं के विघटन के पहचान करने के लिए जांच की जा सकतीऔर संभावित नए चिकित्सकीय लक्ष्य (जैसे आईएल -6 और TGFβ के रूप में) Y नियामक मध्यस्थों। जीर्ण सूजन के संदर्भ में इन एजेंटों कैंसर जीव विज्ञान में एक ट्यूमर को लक्षित करने की भर्ती चालू करने के लिए उनके उपयोग कल्पना कर सकता है, जबकि भर्ती प्रक्रिया बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

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    References

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