Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellule stromali regolano il reclutamento dei leucociti circolanti durante l'infiammazione attraverso il cross-talk con le cellule endoteliali vicine. Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti dalla portata dalle cellule endoteliali infiammate. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare il ruolo delle cellule stromali, in questo caso le cellule staminali mesenchimali (MSC), nel regolare il reclutamento dei leucociti.

Cellule endoteliali primarie sono state coltivate solo o insieme con MSC umana in contatto diretto sulla microslides Ibidi o su lati opposti di un filtro Transwell per 24 ore. Le colture sono state stimolate con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) per 4 ore e incorporati in un saggio di adesione a base di flusso. Un bolo di neutrofili è stato perfusosopra l'endotelio per 4 min. La cattura di fluire neutrofili e le loro interazioni con l'endotelio è stata visualizzata mediante microscopia in contrasto di fase.

In entrambi i modelli, citochine stimolazione aumentata endoteliale reclutamento di neutrofili scorre in modo dose-dipendente. Analisi del comportamento di neutrofili reclutati mostrato una riduzione dose-dipendente in rotolamento e un aumento dose-dipendente nella trasmigrazione attraverso l'endotelio. In co-coltura, MSC soppresso neutrofili all'endotelio TNF-stimolata.

I nostri modelli a base di adesione flusso imitano le fasi iniziali di reclutamento dei leucociti dalla circolazione. Oltre a leucociti, possono essere utilizzati per esaminare il reclutamento di altri tipi di cellule, come le cellule tumorali circolanti MSC o terapeuticamente somministrati. I nostri modelli di co-coltura multistrato hanno dimostrato che MSC comunicare con endotelio di modificare la loro risposta a citochine pro-infiammatorie, Altering il reclutamento dei neutrofili. Sono necessarie ulteriori ricerche utilizzando tali modelli per comprendere appieno le cellule stromali come di diversi tessuti e condizioni (malattie infiammatorie o il cancro) influenzano il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione.

Introduction

L'infiammazione è una risposta protettiva alle infezioni microbiche o lesioni dei tessuti che richiede stretta regolamentazione dell'entrata dei leucociti e l'uscita dal tessuto infiammato per consentire la risoluzione 1,2. Cross-talk tra cellule endoteliali (EC) che i vasi sanguigni linea, leucociti circolanti e cellule stromali tessuti residente è essenziale per coordinare questo processo 3. Tuttavia, l'assunzione incontrollata di leucociti e loro liquidazione inefficace alla base dello sviluppo delle malattie infiammatorie croniche 4. La nostra attuale comprensione del reclutamento dei leucociti in salute e malattia è insufficiente e sono necessari modelli più robusti per analizzare questo processo.

I meccanismi di sostegno al reclutamento dei leucociti dal sangue attraverso CE vascolare in venule post-capillari sono stati ben descritti 1,2,5. Leucociti circolanti vengono catturati dai recettori specializzati (ad esempio, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) chesono up-regolati su endotelio infiammata. Queste interazioni transitorie consentono leucociti di interagire con chemochine superficie vincolata e mediatori lipidici di derivazione (o endoteliali o stromali in origine) che attivano integrine espresse dai leucociti 6- 11. Questo a sua volta stabilizza adesione e le unità di migrazione attraverso l'endotelio e nel tessuto 12- 15. All'interno del tessuto, reclutati leucociti sono sottoposti a agenti stromali di derivazione che influenzano la loro motilità, funzione e la sopravvivenza 16,17. Una crescente evidenza suggerisce fortemente che i segnali ricevuti in ogni fase delle condizioni di processo di reclutamento dei leucociti per il prossimo. Tuttavia, la nostra comprensione di reclutamento dei leucociti rimane incompleto e molto poco si sa circa il movimento dei leucociti componenti shaping all'interno del tessuto.

In Birmingham abbiamo sviluppato diversi modelli in vitro "vascolari" per studiare il reclutamento dei leucociti daflusso 9,18,19. Ora capiamo che vascolare atto CE per quanto immediati regolatori di reclutamento dei leucociti rispondere ai cambiamenti nel loro microambiente locale. In particolare, le cellule stromali tessuti residenti possono regolare attivamente la risposta infiammatoria, in parte conversando con i paesi limitrofi CE vascolare di influenzare il loro ruolo nel reclutamento 3. Abbiamo precedentemente dimostrato che varie cellule stromali modulano la capacità di CE di sostenere l'adesione e la migrazione di leucociti in modo tessuto-specifico, e che tali effetti diventare alterato nelle malattie croniche 13,16,20,21. Così, le cellule stromali stabilire tessuto 'indirizzo codici "che definiscono il contesto di ogni risposta infiammatoria 22. Più recentemente, abbiamo dimostrato che il midollo osseo derivate MSC (BMMSC) potentemente down-regolare la risposta della CE alle citochine, portando ad una riduzione del reclutamento di neutrofili e linfociti 23.

I meccanismi govErning reclutamento chiarito in vitro hanno in gran parte utilizzato dosaggi incorporano un tipo singola cella (ad esempio, CE) o proteine ​​in isolamento. Tuttavia, questi studi non prendono in considerazione gli effetti dell'ambiente tessuto locale (cioè, la presenza di cellule stromali) sul reclutamento dei leucociti e la loro successiva migrazione nel tessuto. Qui si descrivono due metodi basati sul flusso in cui le cellule stromali, in particolare le cellule staminali mesenchimali (MSC), sono co-coltura con EC 23. Tali modelli consentono di esaminare l'effetto delle cellule stromali sulle risposte endoteliali, in particolare la loro capacità di sostenere il reclutamento dei leucociti dal flusso.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolamento e la coltura di cellule endoteliali umane primarie e cellule staminali mesenchimali

  1. Cellule isolamento e la coltura di umane ombelicali endoteliali vena (HUVEC):
    1. Mettere cordone ombelicale su un vassoio con carta assorbente e spruzzare con il 70% di etanolo. Mettere in una cappa coltura tissutale. Identificare la vena e cannulate ad entrambe le estremità. Posizionare una fascetta intorno alla fine cannulata per fissarlo.
    2. Lavare sangue venoso con PBS usando una siringa. Riempire la siringa con l'aria e passare attraverso la vena per rimuovere ed eliminare il residuo PBS.
    3. Scongelare 10 mg / ml di collagenasi tipo Ia e diluire 1:10 in PBS (con calcio e cloruro di magnesio) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Passare soluzione di collagenasi nella vena finché entrambe cannule sono riempiti. Chiudere i morsetti di cannule ad entrambe le estremità.
    4. Coprire il vassoio con il tessuto e spruzzare con il 70% di etanolo. Posizionare il cavo in un incubatore per 20 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
    5. Prendere il cavo fuoridell'incubatore e stringere fascette. Massaggiare il cavo delicatamente per 1 min. Lavare la sospensione cellulare con 10 ml di PBS e raccogliere in una provetta da centrifuga da 50 ml.
    6. Riempire la siringa con l'aria e passare attraverso la vena per rimuovere eventuali residui PBS due volte, raccogliendo il PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml utilizzato nel passaggio 1.1.5. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    7. Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml completo di media CE. Mezzo CE consiste di M199 supplementato con 35 mg / ml gentamicina solfato, 10 ng / ml fattore di crescita epidermico umano, 1 mg / ml idrocortisone, 2,5 ug / ml di amfotericina B, e siero fetale bovino 20%.
    8. Aggiungere 4 ml di terreno CE e la sospensione CE ad una beuta da 25 cm 2. Modificare il supporto il giorno successivo e poi ogni 2 giorni.
    9. CE presentano una morfologia ciottoli-simile (Figura 1AI). Per i saggi di adesione, CE sono generalmente seminato quando raggiungono il 100% di confluenza (vedere Sezione 1.4
  2. L'isolamento di cellule staminali mesenchimali gelatina di Wharton (WJMSC) da cordoni ombelicali umani:
    1. Isolare gelatina di derivazione MSC di Wharton (WJMSC) da cordoni ombelicali fresche o da cavi che sono già stati utilizzati per isolare CE. Tagliare il cordone ombelicale in 5 cm di lunghezza pezzi. Tagliare ogni pezzo longitudinalmente per rivelare i vasi sanguigni (arterie 2 [bianche, rigida] e 1 vena [giallo, distesa]).
    2. Utilizzando forbici sterili e pinze rimuovere i vasi sanguigni e scartare. Tagliare tutto il tessuto in 2 - 3 mm3 pezzi. Utilizzando pinze posto 2-3 mm 3 pezzi in una provetta da centrifuga da 50 ml.
    3. Scongelare 100 mg / ml di collagenasi di tipo II magazzino e diluite 1: 100 in 10 ml di PBS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Scongelare 20.000 U / ml di brodo ialuronidasi e diluire 1: 400 ad una concentrazione finale di 50 U / ml in soluzione di collagenasi.
    4. Aggiungere cocktail enzimatica nella provetta da centrifuga contenente i frammenti di tessuto. Incubare le frammentazione del tessutots per 5 ore a 37 ° C su un rotatore lenta.
    5. Diluire la sospensione cellulare 1: 5 in PBS. Inserire un filtro 100 micron pori in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Versare la sospensione cellulare sul filtro pori 100 micron.
      NOTA: frammenti di tessuto rimanente verrà trattenuto sul filtro e le cellule saranno raccolti nel tubo 50ml centrifuga.
    6. Eliminare il filtro. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 10 min a RT. Aspirare il surnatante e risospendere WJMSC pellet in 12 ml di mezzo completo di coltura WJMSC (DMEM bassa di glucosio, il 10% FCS e 100 U / ml di penicillina + 100 mg / ml di streptomicina mix).
    7. Seed tutte le cellule in 75 cm 2 tessuti pallone di coltura. Cambiare il medio dopo 24 ore con 12 ml di mezzo completo di coltura WJMSC. Sostituire media ogni 2 - 3 giorni. Le cellule devono raggiungere il 70 - 80% confluenza entro 2 settimane. Passage quando WJMSC raggiungere il 70 - 80% di confluenza (vedi Sezione 1.4).
  3. Espansione di midollo osseo derivate da MSC (BMMSC): Isolare umana MSC midollo osseo (BMMSC) come descritto in precedenza 24. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato medio di crescita MSC (MSCGM) in una provetta da centrifuga da 15 ml.
  4. Scongelare una fiala di p2 BMMSC mettendo in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 minuti. Aggiungere la sospensione BMMSC alla provetta contenente MSCGM. Mescolare bene pipettando.
  5. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante completamente.
  6. Risospendere le cellule in 1 ml MSCGM e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule digitale come un cellometer.
  7. Cellule seme in 75 centimetri 2 fiasche coltura ad una densità di 5.000 - 6.000 cellule per cm 2 in 12 ml MSCGM. Cambiare il medio dopo 24 ore con 12 ml MSCGM. Le cellule di alimentazione con 12 ml MSCGM ogni 2 - 3 giorni.
  8. Passage quando BMMSC raggiungere il 70 - 80% di confluenza (vedi Sezione 1.4). Le cellule presentano una morfologia fibroblastico (Figura 1Aii).
  • Distacco di CE e MSC: Aspirare media da 25 cm 2 palloni di coltura. Aggiungere 2 ml di 0,02% EDTA per circa 2 min. Aspirare EDTA e aggiungere 2 ml di tripsina (2,5 mg / ml). Vista al microscopio fino a quando le cellule diventano round.
  • Toccare il pallone per staccare le cellule. Disattivare la tripsina aggiungendo terreno di coltura 8 ml (a seconda del tipo di cellula, media CE per HUVEC, DMEM LG per WJMSC e MSCGM per BMMSC) al pallone cultura e la sospensione trasferimento in una provetta da centrifuga da 15 ml.
  • Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet come descritto di seguito.
    1. Per passaging di MSC, risospendere pellet in 3 ml terreno di coltura. Aggiungere 11 ml di terreno di coltura in tre distinti 75 centimetri 2 fiasche di coltura. Aggiungi sospensione cellulare 1 ml di ogni pallone di coltura (1: 3 split). Passage WJMSC e BMMSC 3 volte (P3) prima dell'utilizzo in saggi di co-coltura.
    2. Per seeding CE o MSC in saggi di adesione - vedi sezioni 2 e 3.
  • MSC congelamento:
    1. Al passaggio 3 Staccare MSC come descritto nella Sezione 1.4. Aspirare il surnatante e risospendere in 3 ml ghiacciata CryoSFM. Dispensare 1 ml della sospensione cellulare in 1,5 ml cryovials gelide. Mettere cryovials in un contenitore di congelamento.
    2. Conservare il contenitore a -80 ° CO / N. Trasferimento azoto liquido. Flacone Thaw di MSC (seguire i passaggi 1.3.1 - 1.3.6). Risospendere MSC in 5 ml terreno di coltura (scegliere terreno adeguato per WJMSC o BMMSC) e le sementi in un pallone a 25 cm2.
  • 2. Stabilire Stem Cell Co-culture-Endothelial mesenchimali on Ibidi Microslides

    1. Trypsinize un cm 2 fiasco di CE confluenti 25 (~ 1,5 x 10 6 cellule, come sezione 1.4). Risospendere CE in 380 ml ​​MSCGM (1 x 25 cm 2 pallone seminerà due microslides 6 canali Ibidi (~ 1,25 x 10 5 / canale), per tutti i saggi di adesione ty cellularepes sono coltivate in MSCGM). Aggiungere 30 ml di sospensione CE per ciascun canale (questo coprirà l'area di crescita attraverso l'azione capillare). Incubare Ibidi MicroSlide a 37 ° C e 5% CO 2 per 1 ora.
    2. Aggiungere 140 microlitri MSCGM per ogni canale e quindi aspirare via. Ripetere due volte per un totale di 3 lavaggi. Aggiungere 140 microlitri MSCGM e posto in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore.
    3. Per co-colture staccare MSC (Sezione 1.4). Eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un cellometer. Regolare la concentrazione di MSC di 1,5 x 10 5 cellule / ml.
    4. Aspirare eccesso medio dai canali Ibidi (lasciando solo la zona di crescita del canale in media). Aggiungere 30μl di MSC sospensione ai canali Ibidi. Aspirare il mezzo che è stato espulso dalla zona crescita del canale e aggiungere altri 30 ml di sospensione MSC. Ripetere ancora una volta e poi posizionare il MicroSlide Ibidi in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 </ Sub> per 1 ora.
    5. Aggiungere 140 microlitri MSCGM per ogni canale e quindi aspirare via. Ripetere due volte per un totale di 3 lavaggi. Aggiungere un volume finale di 140 microlitri MSCGM a ciascun canale e posto in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore.
    6. Scongelare 1 x 10 5 U / ml magazzino TNFa e diluito 1: 1000 in MSCGM ad una concentrazione finale di 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Eseguire una diluizione seriale diluendo 100 U / ml TNF da 1:10 in MSCGM per ottenere 10 U / ml. Diluire 10 U / ml TNFa da 1:10 in MSCGM per ottenere 1 U / ml.
    7. Trattare canali con TNFa a 37 ° C per 4 ore prima del test. Variazioni di temperatura durante il trattamento citochina altereranno i modelli di reclutamento dei neutrofili osservati. Aggiungi MSCGM fresco ai canali non trattati.

    3. Stabilire endoteliale-Cellule staminali mesenchimali da co-colture su Filtri

    1. Staccare WJ o BMMSC come descritto nella Sezione 1.4. Risospendere il pelletin 1 ml MSCGM. Eseguire un cellule conta delle cellule utilizzando un emocitometro o un cellometer.
    2. Regolare il volume in modo che la concentrazione finale è di 5 x 10 5 MSC in 500 ml di MSCGM.
    3. Con pinza sterile invertono 6-bene, 0,4 micron filtri PET Transwell e posto in una scatola sterile.
    4. Seme 5 x 10 5 MSC sulla superficie esterna dei filtri. Incubare filtri a 37 ° C e 5% CO 2 per 1 ora.
    5. Raccogliere supporti dalla superficie esterna del filtro. Contare il numero di non-aderenti MSC nei media. Re-invertito filtri utilizzando una pinza sterile e posto in un 6-pozzetti corrispondenza contenente 3 ml MSCGM.
    6. Aggiungere 2 ml di MSCGM sulla superficie interna del filtro (Figura 1B). Inserire in termostato a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore. Trypsinize un cm 2 fiasco di CE confluenti 25 (Figura 1AI, come sezione 1.4).
    7. Risospendere CE in 8 ml MSCGM (1 x 25 centimetri 2 fiasco wiseme ll quattro filtri 6 pozzetti; ~ 5 x 10 5 EC / filtro). Aspirare il terreno dalla parte superiore e inferiore dei filtri porosi. Aggiungere MSCGM 3 ml fresche nella camera inferiore (sotto il filtro). Aggiungere 2 ml di sospensione CE alla superficie interna di ciascun filtro. Incubare per 1 ora a 37 ° C e 5% CO 2.
    8. Aspirare medio lavare non aderente CE e sostituirlo con fresco MSCGM. Impostare filtri mono-cultura CE parallele seminando le cellule sulla superficie interna senza prima MSC seeding. Incubare O / N a 37 ° C e 5% CO 2.
    9. Controllare che il monostrato CE è confluente e non contiene spazi vuoti. Sub-monostrati confluenti non possono essere utilizzate per saggi di adesione (Figura 1B).
    10. Trattare le camere superiori e inferiori dei filtri con 1, 10, o 100 U / ml TNFa (equivalente a ~ 10 ng / ml) a 37 ° C per 4 ore prima del test (descritto nella Sezione 2).

    4. Isolamento dei leucociti

    1. Prendere venososangue di volontari sani e un'aliquota immediatamente in provette EDTA. Tubi capovolgere delicatamente per mescolare.
    2. Layer 2,5 ml HISTOPAQUE 1077 sul 2,5 ml Histopaque 1119 in un 10 ml a fondo tondo tubo. Layer 5 ml di sangue intero sul gradiente Histopaque. Centrifugare a 800 xg per 40 minuti a temperatura ambiente.
    3. Harvest neutrofili periferici polimorfonucleati (PMN) all'interfaccia di Histopaque 1077 e il 1119 (al di sopra del livello di eritrociti). Mettere in un 10 ml a fondo arrotondato da tubo e portare a 10 ml con PBSA. Capovolgere delicatamente provetta e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Diluire 7,5% soluzione BSA 1:50 100 ml PBS (con calcio e cloruro di magnesio) ad una concentrazione finale di 0,15% (w / v; PBSA). Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml PBSA. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    5. Risospendere in 1 ml PBSA. Prendete una un'aliquota 20 microlitri di sospensione cellulare e aggiungere 380 microlitri PBSA (diluizione 1:20). Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un cellometer. Diluire il conce richiestantration (1 x 10 6 / ml per i filtri Transwell e Ibidi MicroSlide) in PBSA. Mantenere la sospensione dei neutrofili al RT fino al dosaggio.

    5. Montaggio del Flow System

    1. Impostare il sistema di flusso come illustrato nella Figura 1C. Accendere il riscaldatore e impostare a 37 ° C. Attaccare una siringa da 20 ml (rimuovere lo stantuffo) e una siringa da 5 ml di un rubinetto a 3 vie. Attaccare il rubinetto alla camera Perspex con del nastro Micropore.
    2. Misurare e tagliare un lungo pezzo di silicio 2/4 mm (spessore) tubo che è circa la distanza tra la valvola e il rubinetto a 3 vie. Tagliare un 8 - lungo pezzo di 1/3 mm (sottile) tubo 10 mm e inserire in una estremità del tubo di spessore. Fissare il lato tubo di spessore sul 3-way rubinetto.
    3. Collegare l'estremità tubo sottile su una porta del elettronica microvalvola 3 vie. Questo è il "serbatoio di lavaggio". Tagliare un 6 - lungo pezzo di tubo spessi e sottili 8 mm.
    4. Inserire il tubo sottile in un'estremità del tubo di spessore. AttACH fine il tubo di spessore su una siringa da 2 ml (togliere il pistone).
    5. Collegare l'estremità tubo sottile della siringa 2 ml su una porta del microvalvola elettronica per rendere il "serbatoio campione". Collegare la valvola alla camera di flusso del filtro misurando e tagliando un lungo pezzo di tubo sottile che è la distanza tra il microvalvola e il centro del palco microscopio.
    6. Per il modello MicroSlide, collegare un 8 - mm pezzo di tubatura in 10 alla estremità del tubo sottile. Inserire un connettore a forma di L alla estremità del tubo di spessore. Ciò si connetterà al MicroSlide. Per il modello di filtro, collegare un 8 - mm pezzo di Portex Blue Line manometro 10 il collegamento di tubi alla estremità del tubo sottile.
    7. Posizionare l'estremità del tubo sottile sul microvalvola. Questa è l'uscita comune per il lavaggio e campione serbatoi. Riempire serbatoi con PBSA. Tubi Prime scorrendo PBSA attraverso di loro per eliminare eventuali bolle d'aria.
    8. Collegare il tubo manometro per 29 mm (50 ml) di vetro syringe. Prime la siringa riempiendo con 10 ml PBSA. Invertire la siringa in modo che l'estremità collegata al tubo rivolta verso l'alto e spingere fuori tutte le bolle d'aria. Riempire con 5 ml PBSA.
    9. Per solo il modello MicroSlide, collegare un 10 - piece 12 mm tubo di spessore alla estremità del tubo manometro porta alla siringa di vetro. Inserire un connettore a forma di L sulla estremità del tubo di spessore. Posizionare la siringa di vetro in una pompa a siringa per infusione / ritiro.
    10. Calcolare la portata di ricarica (Q) necessaria per generare la tensione di taglio parete desiderata (τ w in Pascal, Pa) di 0,1 (filtri Transwell) Pa o 0,05 (microslides Ibidi) Pa utilizzando le seguenti formule:
      γ w = (6.Q) / (wh 2)
      τ = n.γ
      Dove larghezza w = interna ed h = profondità interna del canale di flusso. n = viscosità della soluzione scorrevole; PBSA è n = 0.7 mPa.s. Per la camera di flusso filtro a piastra parallela, la larghezza (w) è di 4 mm e la profondità (h) è 0,133 millimetri. Il depth della camera può variare leggermente a causa di differenze di spessore della guarnizione Parafilm utilizzato. Per il MicroSlide Ibidi, la larghezza è di 3,8 mm e la profondità è di 0,4 mm.
      NOTA: A causa delle differenze nelle dimensioni del canale di flusso, e la dinamica di acquisizione usiamo diverse sollecitazioni di taglio per il modello MicroSlide rispetto al modello di filtro 6.

    6. Installazione della piastra Parallel camera di flusso Incorporando Filtri

    1. Tagliare un pezzo di Parafilm (le stesse dimensioni coprioggetto vetro) utilizzando un modello di metallo. Tagliare una fessura 20 x 4 mm nella Parafilm (per creare il canale di flusso) utilizzando un modello di metallo. Utilizzare la guarnizione per contrassegnare il canale di flusso sul vetrino di vetro.
    2. Allineare i bordi del filtro 6 pozzetti sul vetrino di vetro. Assicurarsi che il filtro copre le segnale per i canali di flusso. Asportare accuratamente il filtro con un bisturi di tipo 10A.
    3. Coprire con cura il filtro con una guarnizione Parafilm, assicurando che il canale di flussoslot è nel mezzo del filtro (Figura 1D). Usare un pezzo di panno pulito e spingere fuori tutte le bolle.
    4. Posizionare il coprioggetto nella cavità della piastra inferiore della camera di flusso Perspex. Posizionare la piastra superiore Perspex sopra la parte superiore della guarnizione ed avvitare le piastre insieme (Figura 1D).
    5. Girare il rubinetto a 3 vie per consentire tampone di lavaggio (PBSA) di fluire attraverso la valvola. Collegare il tubo Manometro alla porta di ingresso della piastra Persex superiore. Eseguire PBSA attraverso il canale di flusso per consentire il passaggio di bolle.
    6. Collegare il tubo manometro dalla pompa a siringa nella porta di uscita della piastra Perspex. Impostare la pompa a siringa per riempire e premere run. Pulire qualsiasi PBSA che ha gocciolato sulla piastra superiore della camera.
    7. Posizionare la camera sul palco di un microscopio invertito a contrasto di fase. Regolare la messa a fuoco per visualizzare il CE sopra i filtri (Figura 1B).

    7. Impostazione Microslides per flusso </ P>

    1. Posizionare il MicroSlide sul palco di un microscopio a contrasto di fase invertito. Collegare il connettore a L nella porta di ingresso di un canale. Eseguire PBSA attraverso il canale di flusso.
    2. Posizionare il connettore a forma L dalla pompa a siringa nella porta di uscita del canale. Impostare la pompa a siringa per riempire e premere run. Pulire qualsiasi PBSA che ha gocciolato sul MicroSlide. Regolare la messa a fuoco per visualizzare il monostrato CE.

    8. perfusione delle cellule endoteliali leucociti corso

    1. Mettere 2 ml di neutrofili purificati nel serbatoio del campione e lasciare scaldare per 2 min. Lavare l'endotelio con PBSA per 2 min.
    2. Girare la valvola ON per perfusione neutrofili su endotelio. Consegnare il bolo neutrofili per 4 min. Spegnere l'valvola e profumato PBSA dal serbatoio di lavaggio per il resto dell'esperimento.
    3. Assicurarsi che l'aria bolle non passano attraverso il canale di flusso in qualsiasi momento durante il test per evitare di falsare il monolay CEer e la causa il distacco di neutrofili aderenti.

    9. Registrazione neutrofili Capture and Behavior

    1. Record di reclutamento dei neutrofili sia durante il flusso di neutrofili o post-perfusione.
    2. Effettuare tutte le registrazioni digitali di almeno di 5 - 10 campi al centro del canale di flusso. Identificare il centro del canale spostando l'obiettivo di bordo del canale alla luce di ingresso e identificare il centro della porta.
      1. Per la registrazione durante il flusso dei neutrofili, prendere le immagini di un singolo campo ogni 10 sec per 1 min. Spostare lungo il canale e registrare un altro campo per 1 min. Ripetere l'operazione per la durata del bolo.
      2. Per la registrazione post-perfusione, effettuare la registrazione 10 sec su 5 - su 10 campi lungo il centro del canale di flusso per valutare il comportamento dei leucociti (tipicamente 2 minuti dopo la fine del bolo neutrofili). Prendere immagini ogni secondo entro l'intervallo di 10 sec. Questo permette di tempo sufficiente per la cattura da flusso e il comportamento neutro aderentephils da analizzare.
      3. Registrazione di un singolo campo contenente almeno 10 neutrofili trasmigrato per 5 minuti, prendendo immagini ogni 30 sec. Questo può essere usato per calcolare la velocità di cellule migrate (sopra o sotto l'endotelio).
      4. Registra un'altra serie di 10 campi sec (tipicamente 9 min post-perfusione). Questo permette neutrofili tempo di migrare attraverso il monostrato endoteliale.
      5. Arrestare la pompa a siringa e rimuovere il tubo. Smontare la camera di flusso e sciacquare il serbatoio del campione e il tubo. Ripetere per filtri successivi / canali MicroSlide.

    Analisi 10. di reclutamento dei leucociti e comportamento

    1. Contare il numero di neutrofili in ogni campo durante i 10 registrazioni sec al punto di tempo 2 min. Tutte le cellule devono essere presenti nel primo secondo campo per essere contati. Le cellule che sono parzialmente in campo su 2 lati (ad esempio, superiore frontiera / destra) del campo di vista sono inclusi ini conteggi, fintanto che rimangono nel campo per la piena 10 sec.
    2. Calcolare il numero medio di neutrofili aderenti per campo. Misurare la lunghezza e la larghezza del campo registrata. Calcolare l'area del campo. Calcola quanti campi ci sono in 1 mm 2. Moltiplicare la conta dei neutrofili media per il numero di campi in 1 mm 2.
    3. Calcolare il numero totale di neutrofili perfusi moltiplicando la quantità di neutrofili perfuso (ad esempio, 2 x 10 6 / ml * Q [ad esempio, 0,0999 ml / min per piastre parallele camera di flusso]) per la durata del bolo (ad esempio, 4 min ).
    4. Dividere la conta dei neutrofili / mm 2 per il numero totale di neutrofili perfusi per determinare il numero totale di cellule che hanno aderito (cellule aderenti / mm2 / 10 6 perfuso).
    5. Valutare se i neutrofili aderenti sono a rotazione, aderente o trasmigrato (Video complementare 1 e 2).
      1. Laneutrofili laminazione è fase luminosa e lentamente si muovono lungo il monostrato endoteliale (1 - 10 micron / sec; Video supplementare 1).
      2. Cellule saldamente aderenti sono fase luminose e legato alla superficie CE, sia rimanendo stazionario (cioè, non in movimento durante la registrazione) o hanno subito un cambiamento di forma e stanno migrando sulla superficie CE (Figura 1Ei).
      3. Un neutrofili trasmigrato è fase di buio e sotto il livello CE (Figura 1Eii).
    6. Calcolare la percentuale di cellule aderenti che sono a rotazione, fermo e trasmigrato. In alternativa, il comportamento dei neutrofili può essere espresso come numeri cellulari totali che presentano i diversi comportamenti applicando la stessa formula utilizzata per calcolare l'adesione totale (come descritto nei passaggi 10,6-10,7).
      1. Mark il bordo di neutrofili laminazione. Segnare il bordo anteriore della stessa cella al termine della sequenza di 10 sec. Disegnare una linea di scommessaween i punti 2 e misurare la distanza che la cella ha viaggiato.
      2. Dividere questo valore per la durata della registrazione in cui la cella è a rotazione (cioè, 10 sec). Prova e selezionare neutrofili che sono nel campo per l'intero intervallo di 10 sec.
    7. Per calcolare la velocità di neutrofili migrano sulla superficie (forma mutata luminoso fase) o sotto l'endotelio (fase di buio) utilizzare il 5 min registrazione (Video integrativa 2).
      1. Disegnare un contorno di cellule migrate all'inizio della sequenza e seguire i loro movimenti in tutta la sequenza. Rendere nota delle posizioni X e Y del centroide ad ogni intervallo di 1 minuto per ogni cella. Sottrarre valori della posizione X e Y dalla prima immagine della sequenza dei valori nella seconda immagine. Questo si basa sul teorema di Pitagora '.
      2. Sottrarre i valori della seconda immagine dalla terza immagine. Fate questo per tutte le immagini della sequenza. Piazza tha valori xey e aggiungerli insieme.
      3. Radice quadrata il valore risultante. Calcolare la velocità per ogni cella mediando le velocità calcolate a ogni intervallo minuti. Traccia 10 migrato neutrofili e calcolare la velocità media.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Inizialmente, abbiamo analizzato l'effetto di stimolare CE con TNF sul reclutamento di neutrofili dal flusso utilizzando il modello MicroSlide Ibidi (Sezione 7 - 9). In assenza di TNFa, poca o nessuna neutrofili rispettate monostrato endoteliale (Figura 2A). Questo è stato previsto, come non trattata / riposo CE non esprimono le molecole necessarie adesione (selectine) o chemochine per sostenere vincolante 25,26. Al contrario, citochine stimolazione aumentato significativamente neutrofili all'endotelio in modo dose-dipendente (Figura 2A). Adesione normalmente rimane stabile nel corso del test. Il legame di leucociti all'endotelio greggia indica che o il CE attivati ​​(cioè, contaminato con LPS durante il processo di coltura) e / o neutrofili sono stati attivati ​​durante il processo di isolamento. Infatti, LPS è stato dimostrato di aumentare l'espressione di E-selectina, ICAM-1 e VCAM-25-27 gennaio sulla superficie CE, permettendo loro di legarsi neutrofili.

    Quando si analizza il comportamento dei neutrofili reclutati abbiamo tipicamente osserva una riduzione dose-dipendente della percentuale di neutrofili rotolamento (Figura 2B) con una dose dipendente concomitante aumento della percentuale di neutrofili migrano attraverso il monostrato endoteliale (Figura 2C). Alle dosi inferiori di TNFa-stimolazione (1 U / ml) una proporzione maggiore di neutrofili apparire fase luminoso che indica che essi sono attaccati alla superficie apicale dell'endotelio (Figura 2B). Al contrario, a 10 e 100 U / ml (dosi superiori) circa il 40% dei neutrofili reclutati appaiono fase buio a 2 min indicando che queste cellule sono migrati attraverso il monostrato endoteliale e sono sotto l'endotelio (Figura 2C). I neutrofili sono in grado di migrare attraverso la CE entro 1 - 2 min, con la trasmigrazione raggiungendo mlivelli aximal a ~ 10 minuti post-perfusione 28. Qui abbiamo osservato un aumento di neutrofili trasmigrazione da 40% a 2 min a 60% in 9 min posta perfusione (Figura 2C). Abbiamo osservato nessun effetto di concentrazione TNF sulla velocità di rotolamento (~ 3 micron / sec) o la migrazione (~ 10 - 12 micron / min) neutrofili.

    Nel modello basato su filtri, TNFa-stimolazione aumentata neutrofili in modo dose-dipendente simile a quella osservata utilizzando il modello MicroSlide Ibidi (Figura 3A). In termini di comportamento, neutrofili laminazione era influenzata dalla dose di TNF (Figura 3B), mentre un aumento dose-dipendente in percentuale trasmigrazione è stato osservato (Figura 3C). In questa serie di esperimenti abbiamo osservato alcun effetto significativo di tempo su neutrofili trasmigrazione (Figura 3C).

    Noi forniamo metodi su come generare due differenti costrutti co-coltura, ciascuno diche è concepito per rispondere a domande specifiche. Nel modello MicroSlide Ibidi, CE e MSC sono coltivate in un singolo monostrato a diretto contatto tra loro. Questo modello è utile per esaminare l'effetto della iniezione terapeutico di MSC nel sangue e la loro successiva integrazione nel monostrato CE. Al contrario nel modello basato su filtri, CE e MSC sono coltivate su lati opposti del filtro in prossimità ma non necessariamente a contatto diretto. Questo assomiglia più strettamente tessuto, con le cellule endoteliali formano un monostrato che rappresenta il vaso sanguigno, e MSC residente nel vano subendothelial. Questo ci permette di esaminare gli effetti delle MSC tessuto residente sulla risposta della CE alla stimolazione di citochine.

    Sulla base delle nostre esperienze, si osserva che il massimo reclutamento dei neutrofili e la migrazione transendoteliale verifica quando CE sono stimolati con 100 U / ml TNF. Come tale, abbiamo usato questa concentrazione per esaminare l'effetto di MSC co-colturasul reclutamento endoteliale dei neutrofili dal flusso. Qui vi presentiamo i dati per BMMSC in co-coltura con EC utilizzando la MicroSlide e modelli basati filtro-es tuttavia, altri tipi di MSC possono essere esaminati, WJMSC. In entrambi i modelli la presenza di BMMSC significativamente ridotto neutrofili alla CE rispetto a CE coltura da solo (Figura 4A). Co-coltura aveva alcun effetto sul comportamento dei neutrofili reclutati, con livelli simili di rotolamento e trasmigrazione osservati il CE coltivate solo o con MSC (Figura 4B e C). Così, MSC può modificare la risposta comunitaria alla stimolazione di citochine, che sopprime la loro capacità di sostenere il reclutamento dei neutrofili dal flusso.

    Figura 1
    Figura 1. Stabilire EC-MSC co-coltura e l'analisi dei neutrofili reclutamento usando un test di adesione a base di flusso. (A) (i) primario CE e (ii) il passaggio 3 BMMSC coltivato su fiasche coltura dei tessuti. (B) Micrografia del CE e MSC coltivate su 6 e inserti filtro Transwell. (C) Schema del sistema di perfusione utilizzato per generare flusso. (D) Rappresentazione schematica della camera piastra di flusso Filtro parallelo. (E) Micrografia di (i) saldamente aderente (FA) e (ii) trasmigrata (TM) neutrofili seguenti assunzioni dal flusso CE stimolate con 100 U / ml TNFa . Immagini C e D sono tratte da figure 2 e 3 in Metodi di biologia molecolare:. La tratta delle cellule T 2010, pg 53-54 28 per gentile concessione di Springer Science Business Media e Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.


    . Figura 2. neutrofili reclutamento dal flusso di TNF-stimolato CE utilizzando microslides Ibidi CE sono state stimolate con concentrazioni crescenti di TNF (0 - 100 U / ml) per 4 ore. A 4 min bolo di neutrofili è stato perfuso sul monostrato CE a 0,05 Pa. (A) neutrofili valutato a 2 min. ANOVA ha mostrato un effetto significativo del trattamento TNFa su neutrofili, p <0,01. Comportamento neutrofili è stata valutata a 2 e 9 min ed espressa come percentuale di cellule aderenti che erano (B) laminazione o (C) trasmigrata. ANOVA ha mostrato un effetto significativo del trattamento TNFa sul comportamento del neutrofili aderenti, p <0.001. In C, ANOVA ha mostrato una significativa del tempo su trasmigrata neutrofili p <0.01. I dati sono media ± SEM di n = 3 esperimenti. * P <0,05 e **p <0,01 rispetto al non stimolato (0 U / ml) di controllo CE, dal post-test di Dunnett. ## p <0,01 e ### p <0,001 rispetto al 1 U / ml CE allo stesso punto tempo Bonferroni post test.

    Figura 3
    . Figura 3. neutrofili reclutamento dal flusso di TNF-stimolato CE mediante saggio basato filtro-CE sono state stimolate con concentrazioni crescenti di TNF (0 - 100 U / ml) per 4 ore. A 4 min bolo di neutrofili è stato perfuso sul monostrato CE a 0,1 Pa. (A) neutrofili valutato a 2 min. ANOVA ha mostrato un effetto significativo del trattamento TNFa su neutrofili, p <0.001. Comportamento neutrofili è stata valutata a 2 e 9 min ed espressa come percentuale di cellule aderenti che erano (B) laminazione o (C) trasmigrata. In C, ANOVA shosposare un effetto significativo di tempo e di trattamento citochine sulla trasmigrazione neutrofili, p <0,05. I dati sono media ± SEM di n = 3 esperimenti. ** P <0.01 e *** p <0.001 rispetto al non stimolato (0 U / ml) di controllo CE Dunnett post-test. # P <0,05 rispetto al 1 U / ml CE allo stesso punto tempo Bonferroni postale -test.

    Figura 4
    Figura 4. neutrofili reclutamento dal flusso EC-BMMSC co-colture TNF-stimolate. BMMSC erano co-coltura con EC per 24 ore prima della stimolazione con 100 U / ml TNF per 4 ore. A 4 min bolo di neutrofili è stato perfuso sul monostrato CE a 0,05 Pa per (A, C, E) microslides e 0,1 Pa per (B, D, F) filtri. (AB) neutrofili è stata valutata in 2 min. Comportamento dei neutrofili è stato valutato a 2 e 9 me espressa come percentuale di cellule aderenti che erano (CD) o laminazione (EF) trasmigrata. In C e D, ANOVA ha mostrato un effetto significativo di condizioni di coltura su neutrofili laminazione, p <0,05. In E e F, ANOVA ha mostrato un effetto significativo del tempo su trasmigrazione neutrofili, p <0,05. Tuttavia, differenze significative sono state osservate nella trasmigrazione tra i singoli trattamenti da post-test di Bonferroni. I dati sono media ± SEM di n = 5 esperimenti. * P <0.05 rispetto alla monocultura CE paired t-test o post-test di Bonferroni.

    Video complementare 1. Analisi dei neutrofili velocità di rotolamento. CE coltivati ​​su un filtro Transwell sono state stimolate con 100 U / ml TNFa per 4 ore. Un bolo di neutrofili è stato perfuso sul CE per 4 min. Rappresentante sequenza digitalizzata di un singolo campo 10 sec preso 2post-perfusione min. Il cambiamento di posizione di un singolo neutrofili laminazione dall'inizio alla fine della sequenza 10 sec può essere usato per calcolare la velocità alla quale il neutrofili sta rotolando.

    Video complementare 2. Analisi dei neutrofili velocità di migrazione. CE coltivate su filtro Transwell sono state stimolate con 100 U / ml TNFa per 4 ore. Un bolo di neutrofili è stato perfuso sul CE per 4 min. Rappresentante sequenza digitalizzata di un singolo campo 5 minuti per tracciare il movimento di neutrofili trasmigrato. Questo può essere usato per calcolare la velocità.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti da endotelio infiammata. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Abbiamo già osservato un aumento dose-dipendente in neutrofili adesione e la trasmigrazione attraverso TNF-stimolata CE 9,29. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare gli effetti delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti. Qui, MSC stati co-coltura con CE in MicroSlide Ibidi o su lati opposti di un filtro poroso. Questo permette entrambi i tipi cellulari per comunicare tra loro, modificando in tal modo reciprocamente fenotipo e la risposta. Abbiamo dimostrato qui, e in studi precedenti 23, che la presenza di MSC soppressa neutrofili di TNFa-stimolata CE. Ciò indica che le cellule stromali modificano la risposta CEdi citochine e successivamente altera il reclutamento dei leucociti circolanti.

    Oltre ai modelli sopra descritti, Biochips Cellix, piastre Bioflux e Glyotech piastra parallela camere di flusso sono commercialmente sistemi di canali di flusso disponibili che forniscono una superficie per la coltura endotelio e osservando assunzione. In tutti i sistemi, alcuni parametri devono essere considerati mentre istituisce culture endoteliali ed eseguendo i saggi di adesione a base di flusso, alcuni dei quali sono evidenziati di seguito e nelle precedenti relazioni 30,31. Eventuali agenti anti-infiammatori, come l'idrocortisone, che possono influenzare le risposte citochine dovrebbero essere omessi dal mezzo per la durata della cultura e dosaggio 18,29. Quando si utilizza il Ibidi MicroSlide garantire che non vi siano bolle d'aria presenti nel canale di flusso durante la cultura della CE come questi saranno disturbare il monostrato CE. L'integrità del monostrato endoteliale dovrebbe essere confermata prima cytokine-trattamento, come neutrofili si legano alle lacune nella monostrato in cui la BSA ha ricoperto la MicroSlide / filtro. È anche essenziale assicurare che CE sono mantenuti a 37 ° C per tutta la citochina stimolazione poiché TNFa è sensibile alla temperatura e ha solo l'effetto massimo a 37 ° C. Per il saggio flusso stesso, selezionare un tampone di lavaggio appropriata, di solito utilizziamo PBSA per saggi brevi (meno di 30 minuti) e M199 di media integrati con BSA (0,15%) per i saggi più lunghi (1-48 h) 30,31. Infine, assicurarsi che non vi siano bolle d'aria presenti nel canale di flusso durante il saggio come questo interrompe la portata, danneggia il monostrato CE e attiva neutrofili aderenti.

    Uno dei principali vantaggi dei modelli multi-cellulari in vitro qui descritti è la loro capacità di replicare le interazioni in vivo tra CE e le cellule stromali. È difficile isolare gli effetti dei componenti stromali specifiche in vivoe modificare in modo controllato. Nei nostri modelli, le cellule stromali possono essere manipolati per chiarire il modo in cui comunicano con CE e influenzano il processo infiammatorio in salute e malattia. Ad esempio, utilizzando la tecnologia siRNA abbiamo precedentemente dimostrato che la produzione di IL-6 da MSC durante la co-coltura era necessario per i loro effetti immunosoppressivi 23. Ogni modello può essere utilizzato per affrontare questioni specifiche, cioè l'effetto delle cellule dei tessuti residente stromali (modello basato filtro) o cellule stromali terapeuticamente amministrati (microslides Ibidi e altri sistemi disponibili in commercio) per il reclutamento dei leucociti. In entrambi i casi abbiamo titolato diversi tipi di cellule stromali per garantire la sostenibilità e di stabilire un adeguato rapporto tra cellule stromali di CE per valutare gli effetti di assunzione 15,25. Analogamente mezzo di coltura deve essere compatibile con ogni tipo cellulare incorporato nel modello. Nelle nostre mani co-colture sono in genere eseguite in cellule stromali medium 11,18,23,31.

    Utilizzando il modello basato su filtri, abbiamo precedentemente dimostrato che varie cellule stromali modulano la capacità di CE di sostenere l'adesione e la migrazione di leucociti in modo tessuto-specifico e che questi effetti si alterano in malattie croniche 3. Ciò ha portato al concetto che le cellule stromali stabilire tessuto-specifiche "codici di indirizzo", che regolano attivamente il reclutamento dei leucociti al tessuto infiammato 24. Questi modelli sono progettati specificamente per esaminare le fasi iniziali di reclutamento in grande dettaglio, ma non sono in grado di studiare la successiva migrazione all'interno dello spazio subendoteliale (cioè lontano dalla endotelio nel tessuto). Multi-cellulari, costrutti 3D multistrato, come un gel di collagene statica test 12,32 sarebbe più appropriato per studiare queste ultime fasi di reclutamento.

    I nostri modelli di adesione flow-based sono molto versatili. Abbiamo desCribed loro utilizzo nel contesto di reclutamento di neutrofili, ma altri sottoinsiemi di leucociti possono essere studiate in modo simile. Abbiamo usato anche il sistema MicroSlide Ibidi per indagare il reclutamento di far circolare MSC da EC 23, e se ciò avviene attraverso la stessa cascata adesione riportato per leucociti. Allo stesso modo questi modelli potrebbero essere utilizzati per esaminare il reclutamento e l'inserimento di linee di cellule tumorali metastatiche, e le loro conseguenti effetti sulle risposte endoteliali e il reclutamento dei leucociti. In alternativa, il modello basato su filtro potrebbe essere adattato per incorporare diversi tipi di cellule stromali (ad esempio, fibroblasti, podociti, cellule muscolari lisce) da tessuti sani 13,21 e siti di malattia 11,18,20. Ciò consentirebbe lo studio di vie di regolazione tessuto-specifici che agiscono a livello del relativa CE e / o leucociti. In tutti i casi l'interruzione dei processi normativi normali in una serie di condizioni di malattia può essere esaminato per identificare kemediatori normativi y (come IL-6 e TGFβ) e potenziali nuovi bersagli terapeutici. Nel contesto di infiammazione cronica questi farmaci potrebbero essere utilizzati per spegnere il processo di reclutamento, mentre nella biologia del cancro si potrebbe immaginare il loro uso per attivare assunzioni per colpire il tumore.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7, (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91, (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6, (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164, (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82, (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142, (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6, (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28, (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39, (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85, (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131, (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7, (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187, (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48, (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54, (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52, (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43, (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88, (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193, (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26, (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31, (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136, (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317, (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40, (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics